UNIVERSIDADNACIONALAUTNOMADEMXICO

INSTITUTODEBIOTECNOLOGA

MtodosfisicoqumicosenBiotecnologa

Trabajodeinvestigacin

CROMATOGRAFADEFASEREVERSA

Presentan M.enC.EdgarErnestoEsquivelSoto Q.F.B.LidiaIreneLealGuadarrama

Cromatografadefasereversa

JUNIO2004 CUERNAVACA,MORELOS

Cromatografadefasereversa

CONTENIDO

INTRODUCCIN TEORADELACROMATOGRAFADEFASEREVERSA Lafaseestacionaria Retencindemodomixto Lafasemvil

Elucinporgradiente

Parmetroscromatogrficos Factordecapacidad Eficiencia Selectividad Resolucin Cromatografaporsupresininica Cromatografasecuencial Arreglopositivonegativo Arreglonegativopositivo Arreglonegativonegativo Arreglopositivopositivo APLICACIONESDELACROMATOGRAFADEFASEREVERSA Purificacindebiomolculas Purificacindeprotenasypptidosnaturales Purificacindepptidosyprotenasrecombinantes Purificacindepptidosobtenidospordigestionesenzimticas Purificacindepptidossintticos

Cromatografadefasereversa Purificacindeoligonucletidossintetizadosqumicamente Purificacinagranescala Desalado Anlisiscuantitativo Normalizacinderea Calibracinconestndarexterno Calibracinconestndarinterno Adicindeestndar

Cromatografadefasereversa ALGUNOSASPECTOSPARAELDESARROLLODEUNANLISISDE CROMATOGRAFADEFASEREVERSA Naturalezaqumicadelafaseestacionaria Tamaoyformadepartcula Tamaodelacolumna VelocidaddeFlujo Temperatura Solventes Desnaturalizacin Gradientedeelucin Acondicionamientodecolumna Preparacindelasmuestras Limpiezadelacolumna Almacenamientodecolumna Resolucindeproblemas EQUIPODEHPLC Sistemasparaeltratamientodelosdisolventes Sistemasdebombeo Sistemasdeinyeccindelamuestra Columnas
Tiposderellenodelacolumna

Termostatos Detectores
Detectoresdeabsorbancia Detectoresdearreglosdediodos Detectoresdeinfrarrojo Detectoresdendicederefraccin Detectordedispersindeluz(ELSD) Detectoresdeespectrometrademasas

PROVEEDORES COMENTARIOS

Cromatografadefasereversa

BIBLIOGRAFA

INTRODUCCIN
Losavancesenelcampodelabiotecnologahanrequeridoelusodetcnicasmseficaces para la separacin y purificacin de biomolculas. La cromatografa de lquidos ha resultado ser una herramienta muy poderosa y eficiente para la separacin de mezclas complejas tanto de compuestos de bajo peso molecular como de protenas y cidos nucleicos. En los inicios de la cromatografa de lquidos se utilizaban columnas de vidrio con dimetrosde1a5cmylongitudesde50a500cm.Enestetipodecolumnasrealizsus trabajos el botnico ruso Mikhail Tswett. l emple esta tcnica para separar varios pigmentosvegetales,queaparecancomobandascoloreadasenlacolumna.Elrellenode las columnas consista en partculas de 150 a 200 micras de dimetro. Ms tarde se encontrquesepodaaumentarlaeficienciadisminuyendoeltamaodelaspartculasde losrellenos.Afinalesdelosaossesentaselogrdesarrollarlatecnologaadecuadapara producir y utilizar partculas del orden de las 3 a 10 micras. A esta nueva forma de cromatografaselellamcromatografadelquidosdealtaresolucin,HPLCporsussiglas eningls(HighPerformanceLiquidChromatography). ElsistemacromatogrficodefasereversafueintroducidoporHowardyMarlinen1950. Hasta ese momento,lacromatografa delquidos seutilizababsicamenteparaseparar compuestospolares,siendolafaseestacionariadeuncarcteraltamentepolarylafase mvilpocopolar.Estoscientficosrevirtieronlapolaridaddelasfasesconelobjetivode separarcidosgrasos.Asfuecomosurgilacromatografadefasereversa;aquellaenla que la fase estacionaria es no polar y la fase mvil es polar. Entonces, a la primera modalidaddecromatografaseleempezaconocercomocromatografadefasenormal. La tcnica de fase reversa, RPC (del ingles Reverse Phase Chromatography), se ha convertidoeneltipodecromatografamsampliamenteutilizadaenHPLCeincluyecerca delamitaddelosmtodosdecromatografadelquidosdescritosenlaliteratura.Esta tcnicaproporcionaretencinyselectividadptimascuandolasmuestrastienenuncarcter predominantementealifticooaromtico.

Cromatografadefasereversa

Enelpresentetrabajosepretendedarallectorunpanoramadelateorayaplicacionesdela cromatografaenfasereversa,ascomoalgunasconsideracionesimportantesduranteel desarrollodeestatcnicacromatogrfica.Ydadoquelacromatografadefasereversase aplicaenequiposdealtaresolucin(HPLC),tambinseincluyeunaseccinenlaquese describebrevementesufuncionamiento.

TEORADELACROMATOGRAFADEFASEREVERSA
Todaslasformasdecromatografadelquidossonprocesosdemigracindiferencial,donde loscomponentesdelamuestrasonselectivamenteretenidosporunafaseestacionariay eludos secuencialmente mediante el cambio de polaridad de la fase mvil. En la cromatografadefasereversa(RPC)seutilizaun empaque hidrofbico,usualmenteun grupofuncionaloctadecilouoctiloyunafasemvilpolar.

Lafaseestacionaria
Lafaseestacionariaparacromatografadefasereversaconsisteenunamatrizporosae insolublealaqueselehanunidoqumicamentecompuestoshidrofbicos.Lossoportes para casi todos los rellenos se preparan con slica rgida, formada por partculas mecnicamenteresistentes,porosasyuniformes,condimetrosde3,5o10micras. Lasuperficiedelaslicaestconstituidaporgrupossilanol(SiOH)qumicamentereactivos queabarcanunasuperficiecercanaalos8mol/m2.(Figura1)
Si Si Si Si OH O O

CH3 Si CH3 CH3 CH2 CH3 (CH2)17 CH3

Si

Si CH3

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Figura1.Grupossilanollibresygrupossilanolderivatizados.

Laslicapresentalasventajasderesistirlaaplicacindealtaspresionessincontraerse,yde noexpandirsealcontactoconlossolventes.Perotieneladesventajadeserqumicamente inestable;aunpHmenorde3losligandosunidosalaslicapuedenserremovidosyaun pHmayorde7.5,laslicasesolubiliza. Adiferenciadelaslica,lasmatricesdepoliestirenosonmuyestablesinclusoenpHsque vandesde1hasta12,locualpermitelavaryregenerarlacolumnaconhidrxidodesodio que es el agente ms efectivo para la remocin de protenas fuertemente unidas a la superficiedelafaseestacionaria.Adems,elpoliestirenotieneuncarcterhidrofbicoper se(Figura2)porloqueyanorequiereserderivatizado,evitndoseaselinconvenientede procesos ineficientes de unin de ligandos. Sin embargo, presenta la desventaja de expandirsealcontactoconlossolventesorgnicostpicamenteempleadosenRPC.
CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH

CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2 CH CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH

Figura2.Estructuraqumicadelasmatricesdepoliestireno.

Elacoplamientodelosligandosalaslicageneralmenteseefectausandoreactivosdetipo clorotrialquilsilanos.(Figura3)Enestareaccin,notodoslosgrupossilanolreaccionanya quelascadenasalquilogeneranunimpedimentoestricoqueprevieneladerivatizacin completadetodoslosgruposdisponibles.Elrecubrimientodelasuperficieporsililacinse 8

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limitaa4moles/m2.Losgrupossilanolresidualesimpartenunapolaridadindeseableala superficie,ysonresponsablesdelefectoderetencindemodomixto.Parareducireste efecto,losgrupossilanolresidualessehacenreaccionarconcompuestoscloroalquilsilanos mspequeoscomoelclorotrimetilyclorotrietilsilano.Aesteprocesoseleconocecomo endcappingobloqueo.

CH3 Si OH+Cl Si CH3 (CH2)17 CH3 SiO

CH3 Si CH3 (CH2)17 CH3+HCl

Figura3.Alquilacindegrupossilanol.

Porlogeneral,elgrupoalquilodelsiloxanoenestosrecubrimientosesunacadenaC8(n octilo)ounacadenaC18(noctadecilo).(Figura4)
CH3 O Si CH3 CH2 CH3

A)

CH3

B)

Si CH3

CH2 CH2

CH2 CH2

CH2 CH2

CH2 CH3

CH3

C)

Si CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH3 CH3

Figura4.Ejemplosdegrupossiloxanos.A)Grupoalquilode2carbonos B)Grupoalquilode8carbonosC)Grupoalquilode18carbonos.

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Puede considerarse que la RPC es un proceso de particin en donde los solutos estn distribuidosentreunafaseestacionarianopolaryunafasemvilpolar.Lossolutosno polarestiendenaadsorberseenlafaseestacionariaysemuevenatravsdelsistemams lentamentequelossolutospolares. Elmecanismoquesehapropuestoparaexplicarelmecanismoporelcualestassuperficies retienenalossolutoseselsiguiente.Cuandounsolutosedisuelveenagua,lasfuerzasde atraccinentrelasmolculasdeaguasedistorsionanoserompen.nicamentelossolutos altamentepolaresoinicospuedeninteraccionarconlaestructuradelagua.Lossolutosno polarescasinointeractanconestasestructurasycomoconsecuenciaabandonanlafase mvil para adsorberse al hidrocarburo de la fase estacionaria. La fuerza motriz de la retencinnoeslainteraccinfavorabledelsolutoconlafaseestacionaria,sinoelefectode repulsindeldisolventeporelsoluto.

Lafasemvil
Laretencinhidrofbicadelsolutoenlafaseestacionariapuededisminuirseaadiendoun disolventeorgnicoalafasemvilacuosa.Aldecrementarlapolaridaddelafasemvil,la distribucindelossolutossecambiahacialafasemvil. Lacantidaddemuestraqueseunealafaseestacionariadependedelaconcentracindel ligandoinmovilizado,delaspropiedadesqumicasyfsicasdelamolculaquevaaser adsorbidaydelapolaridaddelafasemvilyestacionaria.As,conformemenospolarsea lafasemvil,menorserlaadsorcindelamuestraalafaseestacionaria. Respectoa lascaractersticasqumicasdelligando,esdifcilpredecirqutipodecadena hidrocarbonadasermejorparadeterminadaaplicacin. Enprincipio,entremenospolarsealamolculaquesevaapurificar,serequerirunafase estacionariamshidrofbica.Sinembargo,silamuestraresultasermuyafnalamatriz,la elucinsedificultara.Asquedebehacerseunanlisiscuidadosodelamolculadeinters ydeterminarlanaturalezaqumicadeloscontaminantesasociados.

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Laporosidaddelaspartculasdelafaseestacionariatambinesunfactorimportanteque influyeenlacapacidaddeunin.Losporosgrandesfacilitanlainteraccindelsolutoconel ligando.Cuandoserequieraunacapacidaddeuninmxima,deberescogerseunamatriz que contenga poros suficientemente grandes, capaces de alojar todas las molculas de inters. Retencindemodomixto El modo mixto de retencin resulta de la interaccin de los grupos silanol cargados negativamente expuestos en la superficie de la matriz con los grupos cargados positivamente de las molculas de la muestra. Genera ensanchamiento de picos e incrementodelostiemposderetencin. Losgrupossilanolexpuestosenlasuperficiedelamatrizpuedenprovenirdeunend cappingineficienteodeldeteriorodelascolumnas.Lasuperficiedelamatrizseerosiona porelusodelacolumna,loqueresultaenlaexposicindelosgrupossilanol.Eluso prolongadodesolucionesacuosastambinpuedeacelerarelenvejecimientodelacolumna. El uso de fases mviles de bajo pH, suprime la ionizacin de los grupos silanol, sin embargo,nohayqueolvidarqueunpHmenorde3puedehidrolisarlosligandosdela matriz. Elmecanismodeseparacinencromatografadefasereversasebasaenladistribucindel solutoentrelafasemvilylaestacionaria.Laelucinoelarrastredelsolutomediantela fasemvil,seiniciaconuneluyentedeelevadapolaridadcomoeselcasodeunasolucin acuosa;aestafasemvilinicialseledenominafaseA.Hayquetomarencuentaquela polaridaddelafasemvilAdebesersuficientementebajacomoparadisolveralsolutode carcterhidrofbicoysuficientementealtacomoparapermitirqueelsolutoseunaala matrizhidrofbica. Para lograr la desorcin secuencial de los solutos unidos a la matriz, se disminuye la polaridaddelafasemvil.Estosehacemediantelaadicingradualdesolventesorgnicos alafasemvilAcomosonelmetanoloelacetonitrilo.Lafasemvilfinal,denominada faseB,eslaquepresentamenorpolaridadytieneelmayorpoderdeelucin.Lafuerzadel solventeestdefinidacuantitativamenteporelparmetro .(Tabla1)Generalmenteel pHdelafasemvilinicialyfinalpermanececonstante. Elacetonitriloyelmetanolsonlossolventesmscomunespuestoqueambostienenbaja viscosidad yno absorbenluz UV. El isopropanol es undisolvente conalto poder de

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elucin,sinembargo,noesdelosmsempleadosdebidoasuincrementadaviscosidadque resultaenbajatransferenciademasadelsolutoentrelasfasesyelevacindepresinanen bajosflujos. Paradescribircuantitativamentelapolaridaddelosdisolventes,Synderdesarrollelndice depolaridadP.(Tabla1)Enestaescala,losvaloresdepolaridadvarande10.2paraun compuestomuypolarcomoelaguahasta2paralosmuypocopolares.Cualquierndice depolaridadquesedeseeentreesoslmitessepuedeconseguirmezclandodosdisolventes adecuados.Deestemodo,lapolaridadPABdeunamezcladedisolventesAyBestdada por:

PAB=APA+BPB
Donde son las fracciones en volumen de cada solvente y P son los parmetros de polaridaddecadasolvente.

ndicede Disolvente UV nm Ciclohexano Dietilter Tetrahidrofurano Cloroformo Etanol Metanol Acetonitrilo Isopropanol Agua 200 215 212 245 210 205 190 205 190 refraccin
a25C

Viscosidad cP

ndicede polaridadP

Fuerza eluyente0

1.424 1.352 1.472 1.445 1.359 1.328 1.341 1.377 1.333

1.00 0.24 0.55 0.57 1.08 0.55 0.38 2.40 1.00

0.2 2.8 4.0 4.1 4.3 5.1 5.8 3.9 10.2

ND **0.43 *3.7 **0.26 ND *1 *3.1 *8.3 *Alta

Lafuerzadeleluyenteseestablecienbaseaunacolumna:*C18,**silica. ND=Nodeterminado Tabla1.ndicedepolaridaddeSnyder.

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Elucinporgradiente Las separaciones isocrticas usan la misma composicin de fase mvil a travs de la separacin. Las eluciones isocrticas se usan cuando la mezcla a separar no es muy compleja o cuando los componentes de la mezcla tienen tiempos de retencin muy diferentes. Peroparasepararmezclasdeprotenas,generalmenteserequieredeungradientedeelucin en el quelacomposicin de la fase mvil cambia atravs del anlisis comose indic anteriormente. Elgradientedeelucinserecomiendageneralmentepara: Muestrasquetengantiemposderetencinsemejantes. Muestrasdepesomolecularmayora1000. Muestrasdeorigenbiolgico. An cuandosepienseutilizarunaelucinisocrtica,esrecomendablehacerunprimer anlisisporgradienteparadeterminarelporcentajedelsolventemsadecuado. Encuantoalostiposdegradiente,loshaylineales,curvosyescalonadososegmentados. (Figura5)

Lineal
%B %B

Curvo

Segmentado
%B

Tiempo

Tiempo

Tiempo

Figura5.Formasdelosgradientesmscomunes

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Parmetroscromatogrficos
Elcomportamientoderetencindeuncompuestoreflejaladistribucindelsolutoentrela fasemvilylaestacionaria.Laconcentracinencadafaseestdadaporelcoeficiente termodinmicodereparticin.CuandoK=1,elsolutoseencuentraigualmentedistribuido entrelasdosfases. K =
CE CM

DondeCE yCM sonlasconcentracionesdesolutoenlafaseestacionariaylafasemvil respectivamente.

Factordecapacidad Laraznderepartoorazndecapacidad,k,relacionaelequilibriodedistribucindela muestradentrodelacolumna,esdecir,eslarelacindeltiempotranscurridoenlafase estacionariacontraeltiempotranscurridoenlafasemvil. Matemticamentesedefine comoelcocientedelosmolesdeunsolutoenlafaseestacionariaentrelosmolesenlafase mvil:

CE V E CM V M

k '=

Elfactordecapacidadpuedesercalculadoparacadapicousandolasiguienteecuacin:
k '= t R t 0 t0

DondetReseltiempoderetencindelamuestrayt0eseltiempoderetencindeunsoluto que no interacta con la fase estacionaria, tambin conocido como tiempo muerto. El

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tiempoderetencintranscurredesdelainyeccindelamuestrahastaqueelcompuesto alcanzaeldetector.Elprimercomponenteeludodeberteneruntiempoderetencindel dobledeltiempomuerto. Dichodeotramanera,laraznderepartoeseltiempoadicionalqueunsolutorequierepara eluir,encomparacinconunsolutonoretenido,paraelcualk=0.

Lafasemvilseleccionadadebedarvaloresdekqueestnenelrangode1a20.Valores mayores de k generan tiempos de retencin largos que resultan en tiempo analtico desperdiciado; y los valores menores que la unidad no proporcionan una resolucin adecuadaentrelossolutos. Lossolventesfuertesproveenpequeosvaloresde k,mientrasquelossolventesdbiles danvaloresdekmsaltos.Sehavistoqueporcada2unidadesdediferenciaenelvalorde polaridad de un mezcla de disolventes, el factor de capacidad k cambia un orden de magnitud aproximadamente, lo que significa que la retencin del compuesto en una columnaparticularpuedevariarsesimplementemediantelamodificacindelossolventes delafasemvil Eficiencia Una caracterstica importante de un sistema cromatogrfico es su eficiencia, expresada como una cantidad adimensional llamada nmero de platos tericos. Eltrmino plato tericoprovienedeunestudiotericoenelquesetrataunacolumnacomosiestuviera constituidadenumerosas,discretasycontiguascapasdenominadasplatostericos.Refleja elnmerodevecesqueelsolutosereparteentrelasdosfasesdurantesupasoatravsdela columna.Entremsgrandeseaelnmerodeplatostericosdeunacolumna,mayorsersu eficienciayportantosepodrlograrunamayorresolucin.

Laeficienciadeunacolumnapuededeterminarseapartirdeunpicodelcromatograma mediantelasiguienteecuacin:

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N =5. 54

tR W 1/2

DondetReseltiempoderetencindelpicoyW1/2esanchodelpicomedidoalamitaddela alturadelmismo.(Figura6)
tR Absorbancia

Altode pico

W1/2

Tiempo
Figura6.Determinacindelaeficienciadeunacolumnaenbaseaunpicodeuncromatograma.

Elnmerodeplatostericosalgunasvecesesreportadocomoplatospormetrodecolumna. Enestaexpresin,laalturaequivalenteaunplatotericoHestdadaporlaecuacin:
H= L N

DondeLeslongituddecolumnayNeselnmerodeplatostericos. La eficiencia depende principalmente de las propiedades fsicas de la matriz y de la columna.Laeficienciamejoramuchoaldisminuireldimetrodelacolumna,alaumentar sulongitudyalreducireltamaodepartculadelempaqueoalbajarlaviscosidaddel disolvente.

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Selectividad Laselectividadserefierealacapacidaddelmtodoparadistinguirlaspropiedadesdelos componentesanivelmolecularyquepermitediferenciarlos.Esimportantedeterminarlas caractersticasdelamolculaquenospermitirnsepararla,yaseapesomolecular,carcter cidobase,polaridad,tamao,actividadbioqumica,ptica,etc. La selectividad puede ser fsica o qumica, dependiendo de la naturaleza de las interacciones entreelgrupofuncional yelmediodeseparacin.Las interacciones que involucranfuerzasdedispersin,dipolosyfuerzasdehidrgenoseconsideranfsicas.Por otro lado, un equilibrio cidobase o la formacin de complejos se clasifican como selectividadesqumicas. LaselectividadfsicaeslaquepredominaenRPCporqueenestemtodoloscomponentes sonseparadosdeacuerdoasuspolaridades.EstosignificaquelaRPCpuedeusarsepara separargruposdecompuestosdeacuerdoasuestructuraqumica.Laspequeasdiferencias en las estructuras moleculares de dos compuestos resultan en grandes diferencias de adsorcinyporlotantopermitesuseparacinporRPC. Laselectividad() esequivalentealaretencinrelativadelospicosdelamuestrayest dadaporlasiguienteexpresin:
k '2 k '1 V2 V1

Donde V1 y V2 sonlosvolmenesderetencin, k1 y k2 sonlosfactoresdecapacidad paralospicos1y2respectivamente.

Resolucin Laresolucindeunacolumnaconstituyeunamedidacuantitativadesucapacidadpara separardossolutos. Losparmetrosquecontribuyenenlaresolucin(Rs)delospicossonlaselectividad(), laeficienciaonmerodeplatostericos(N)yelfactorderetencink.(Figura7y8)

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Cromatografadefasereversa

Estosparmetrosserelacionanenunaecuacindelasiguientemanera:

Rs=

1
4

k'

1k '

V2 V1

Rs =

V2 V 2 W 2 + W 1/ 2

W1

W2

Figura7.Determinacindelaresolucinenunpardepicosdeuncromatograma.

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A B A B B

95%A95%B Rs = 1

99%A99%B R = 1. 5 s

Figura8.Resolucindepicosendiferentescromatogramas.Enelsegundo cromatogramahaymayorresolucinporquelospicosestnmsseparadosunodeotro.

Paramejorarlaresolucindeunacolumnasepuedenvariarcadaunodelossiguientes parmetros: Factordecapacidad: eselelementomsmanipulabledebidoaquedependedela polaridaddelafasemvil.Paraunaresolucinptima, k debeestarenelintervalo entre2y5. Nmerodeplatostericos:losnmerosdeplatostericosseincrementanaumentando lalongituddelacolumna.Sinembargo,unaconsecuenciaadversaesunincrementodel tiemponecesarioparalaseparacin.La relacinentre N y Rs est definidapor el cuadradodeN.Porejemplo,unincrementoenelnmerodeplatostericosNde100a 625aumentarlaresolucinporunfactorde2.5ynoporunode6.25.Otraformade mejorar la resolucin consiste en reducir la altura de los platos lo cual puede conseguirsedisminuyendoeltamaodepartculadelrellenoobajandolaviscosidaddel disolvente. Selectividad:implicamodificarlascaractersticasqumicasdelrellenodelacolumna.

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Cromatografaporsupresininica
Lacromatografadeparesinicosocromatografaporsupresininica esuntipode cromatografadefasereversaqueseutilizaparalaseparacindeespeciesionizables.Se recomiendaelusodeestetipodecromatografaespecialmenteparamolculascargadasde granpesomolecularcomolasprotenasoloscidosnucleicos. Enestemododecromatografa,seaadealafasemviluncompuestoinicoqueaportaun contrainorgnicogrande;laconcentracindeestosagentesestenunrangode0.01%a 0.03%. Elmecanismoexactodelacromatografadeparesinicosnosehaestablecidoclaramente, sinembargo,existendosmodelosfundamentales. Elprimeropostulaquelamolculadelsolutoformaunparinicoconelcontrainenla fasemvilydeestamaneraaumentalahidrofobicidaddelamuestra.(Figura9)Elgrado enelquelamuestraionizadayelcontrainformanelcomplejodeparinico,ascomola fuerzadeunindelcomplejoconlafaseestacionaria,afectaaltiempoderetencindela muestra.Alaumentarlaconcentracindelcontrain,aumentalaretencinhastaunlmite quegeneralmenteestdadoporlasolubilidaddelcontrainenlafasemvil.

El otro mecanismo postula que el contrain se retiene en la fase estacionaria que es normalmente neutra y le proporciona una carga. Esta fase estacionaria cargada puede entoncesformarcomplejosconlosionesorgnicosdecargaopuesta.Esmuyprobableque elmecanismorealinvolucreaambospostulados. Luego,laelucindelosparesinicosseconsiguemedianteunafasemvilquecontenga metanoluotrodisolventeorgnicomiscibleenagua.

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+ + + +
Pp tid oscargad os p ositivam ente

+ +

+ +

Agentes su p resores d eiones cargad os negativamente

Oligonu cletid oscargad os negativam ente

Agentes su p resores d eiones cargad os p ositivam ente

Figura9.Supresindecargasdeprotenasydecidosnucleicos.

Elagentemsusadoparalasupresindecargasenprotenaseselcidotrifluoroacticoy paraloscidosnucleicoseslatrietilamina. El control del pH es el parmetro ms importante en este tipo de cromatografa. La retencinaumentaconformeelpHmaximizalaconcentracindelaformainicadelos solutos.UnpHbajoaseguraquelasbasesfuertesestnensuformainicaprotonadayque los cidos dbiles presentes estn en su forma no inica. La fase mvil es preparada generalmenteconcidotrifluoroactico(TFA)oelcidoortofosfricoquemantienenel pHcercanoa3. ElmayorbeneficiodelospHsbajosusadosenlacromatografadesupresininicaesla eliminacindelefectodemodomixtoquegeneraunincrementoeneltiempoderetencin yunensanchamientodepicos.Peroalmismotiempo,elmtododesupresininicaest limitado a un intervalo de pH de 3.0 a 7.5, debido a la inestabilidad de las fases estacionariasfueradeesteintervalodepH.

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Cromatografasecuencial
Enestetipodecromatografalascolumnasseacoplandemanerasecuencial,esdecir,se conectaunacolumnadespusdeotra.Deestamaneraloscompuestosaanalizarinteractan demaneraindependienteconcadasoporteylosmecanismosderetencinsondiferentesen cadacolumna. Laconsideracinmsimportanteeneldiseodeacoplamientodecolumnasinvolucrala compatibilidad de la fase mvil con cada columna. El eluyente debe facilitar la unin selectivadeloscompuestosdeintersenunaoambascolumnas. Lascolumnaspuedenacoplarsedemaneraqueloscontaminantesquedenretenidosenla primeraoenlasegundacolumna.Estamodalidadesempleadamsfrecuentementeparala purificacindeprotenas.Acontinuacinserevisanlostiposdeacoplamiento.

Arreglopositivonegativo En un acoplamiento de columnas positivonegativo, la protena de inters se une a la primeracolumnayloscontaminantesfluyensininteractuar.Enlasegundacolumnalos contaminantesquedanretenidos,perolaprotenadeintersno.Enlossiguientespasosse cambialapolaridaddelafasemvilgenerandolaelucindelaprotenadeunamanera concentrada. Generalmentelasprotenasestnpresentesenmuybajasconcentracionesenlasmuestras biolgicas,asquelaestrategiams eficientees utilizarunacolumnaqueretengaala protenaylaconcentre.

Arreglonegativopositivo Lacolumnainicialretienealoscontaminantes,mientrasquelasegundacolumnauneala protenadeinters.Enestearreglo,laprimeracolumna(llamadanegativaporqueno 22

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retienealaprotenaocomponentedeinters)generalmenteseremueve,luegoseprocedela elucin de la protena de la segunda columna (positiva) sin que los contaminantes interfieranpuestoquefueroneliminadosalretirarlaprimeracolumna. Unadelasdesventajasdeestearregloesquelaprimeracolumnadebeuniralamayorade loscompuestoscontaminantes.

Arreglonegativonegativo La protena de inters no tiene ningn tipo de interaccin con ninguna columna. La desventajadeestearregloesquelaprotenasevadiluyendoconformeatraviesaelsistema cromatogrfico.

Arreglopositivopositivo Eselarregloquegeneralamayorselectividadpueslaprotenaesretenidatantoen la primeracolumnacomoenlasegunda,asquedealgunamaneralaprotenasesometeados pasosdepurificacin.Laprotenaseunealacolumnainicialyloscontaminantespasande largo.Cuandolaprotenaeluyedelaprimeracolumnapasaalasegundadondeesretenida. Enestecasoserequieredeunsegundoprocesodeelucinparaliberaralaprotena.

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APLICACIONESDELACROMATOGRAFADEFASE REVERSA
Lacromatografadefasereversafuedesarrolladaen1950yfueideadaparalaseparacin depequeasmolculasorgnicas. Mstarde,conlaaparicindenuevossoportesparala faseestacionariaynuevosdetectores,seconvirtienunaherramientaindispensableparala separacindebiomolculascomoprotenas,pptidosyoligonucletidos.

Purificacindebiomolculas
Enlaactualidad,laRPCseusademanerageneralizadaparasepararlossiguientesgrupos debiomolculas: Protenasypptidosdeorigennatural Protenasypptidosrecombinantes Pptidosobtenidospordigestinenzimtica Pptidossintetizadosqumicamente Oligonucletidossintticos A continuacin se sealan algunas consideraciones generales para lograr estrategias de purificacincorrectas.

Purificacindeprotenasypptidosdeorigennatural La purificacin de pptidos y protenas a partir de sus fuentes naturales requiere de diferentestcnicascromatogrficasdebidoalacomplejidaddelamezclaoriginal.Parael ltimopasodepurificacinseusalaRPCylafiltracinporgeldealtorendimiento.Sin embargo,laRPCnoesunmtodo tanapropiadoparasepararpptidos yprotenas de fuentesbiolgicasdebidoalapresenciadelpidosyotrossolutosaltamentehidrofbicos queseunenfuertementealafaseestacionaria,dificultandosuseparacindelacolumna. Hay varios puntos a considerar cuando se utiliza la RPC para purificar molculas provenientesdemezclasbiolgicascomplejas.Enprimerlugar,siunaprotenaopptidose vaautilizarenestudiosfuncionales,debemosasegurarnosquelaactividadbiolgicase 24

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mantienedespusdecadapasodepurificacin.Estenoesunproblemacrticocuandose tratadepptidosoprotenaspequeas,perolasprotenasgrandestiendenadesnaturalizarse bajolascondicionesdelaRPC. Laeleccinadecuadadelmediodefasereversaylascondicionesdeelucin,incluyendoel tiempodeexposicinacondicionespotencialmentedesnaturalizantes,deberoptimizarsea findemantenerlaintegridadfuncionaldelamolcula.Adems,lapresenciadeproteasas enlasmuestraspuededificultarlapurificacindepolipptidos,porloqueesaconsejable trabajar conagilidaddurantelas primeras etapasdepurificacinafinde minimizar el tiempodecontactoentrelasproteasasylamuestra.Unamaneradeevitarladegradacinde protenasesadicionandoalasolucinamortiguadorainhibidoresespecficosdeproteasas. Otro problemacomn depurificacinapartirdemezclas naturales esel fenmeno de agregacin.Losagregadossolublescomodmerosotrmerospuedenserseparadosdelos monmerosporfiltracinengel.

Purificacindepptidosyprotenasrecombinantes Ladificultadparaaislarpptidosoprotenasdesusfuentesnaturales,sepuedesuperara travs de la produccin de stas con tcnicas recombinantes. Los polipptidos intracelularessonmsdifcilesdepurificar,yaqueesnecesariolisarlasclulasparasu obtencin. En cambio, las protenas o pptidos secretados al medio son relativamente fcilesdepurificaryengeneral,nosonsusceptiblesalasproteasasintracelulares. Lapurificacindepptidosrecombinantesdelmedioextracelularpuededificultarseporlos volmenes tangrandes que seobtienenporlo queserequieredeunpasoinicial para concentrar la muestra. Este inconveniente se puede resolver si se une al pptido una secuenciaterminalespecficacomoprotenaA,glutatintrasferasa,opoliaminocidos,lo que permitir una purificacin cromatogrfica por afinidad. Una vez concentrado y purificadoelpptidoser necesarioremoverelasa atravs demtodos enzimticos o qumicos.LapurificacindepptidosrecombinantespuedemonitorearsemedianteRPC, anlisis de amino cidos, mapeo de eptopes, bioensayos o electroforesis en gel de poliacrilamida.

Purificacindepptidosobtenidospordigestionesenzimticas

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Cromatografadefasereversa
La digestindeunaprotenaconproteasas,usualmentetripsina,generaunamezcla de pptidosquepuedenserseparadosporRPCparaobtenerunmapapeptdicodelaprotena. Incluso puede asignarse la posicin de los puentes de disulfuro al comparar los cromatogramasdeunadigestinendondelospuentesdedisulfuropermanezcanintactosy los cromatogramas de otra digestin en donde los puentes de disulfuro hayan sido reducidosconmercaptoetanol. Purificacindepptidossintticos En la actualidad, la sntesis qumica de pptidos menores de 20 amino cidos es un procedimiento de rutina en muchos laboratorios. Las cantidades sintetizadas van de miligramos hasta gramos. La generacin de pptidos sintticos genera contaminantes adyacentescomopptidostruncadosoconmodificacionesenlasecuenciadeaminocidos. Tambin se encuentran presentes pequeas molculas orgnicas como fenol y tioles, producidosalsepararelpptidosintticodelafaseestacionariaosoporte. Lospptidosconmenosde20aminocidos,engeneral,sepuedenobtenerconunalto gradodepureza usandosolamenteRPC.Parapurificarmicrogramosdemuestrapodra utilizarseunempaqueconpartculasde5 m,perosiserequierencantidadesmayores sernecesarioutilizarunamatrizde15a30m. Purificacindeoligonucletidossintetizadosqumicamente Lasntesisdefaseslidaautomatizadaesunprocedimientocomnmenteutilizadopara generaroligonucletidosde20a30paresdebasesdelargo. El carcter hidrofbico de las bases nitrogenadas disminuye en el orden adenina>timina>guanina>citosina.Entonces,losoligonucletidosricosenadeninatendern aeluirmslentoqueaquellosricosencitosina. Losprincipalescontaminantessonsecuenciastruncadasjuntoconpequeascantidadesde oligonucletidosquedifierenenlasecuencia.Laseparacinentrelassecuenciascompletas delasincompletassepuedesimplificarsilapurificacinsellevaacabousandogrupos protectores 5 tritilo que poseen tres anillos de benceno; de esta manera slo los oligonucletidoscompletostendrnlahidrofobicidadsuficienteparapermaneceranclados alafaseestacionaria.

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Cromatografadefasereversa

Purificacinagranescala
La purificacin a gran escala de pptidos y oligonucletidos sintticos o protenas recombinantesporcromatografadefasereversarequieredeunaaltaresolucinparala separacin de estos compuestos. En estos casos, la purificacin a escala analtica se optimizausandounamatrizdefasereversadepartculaspequeasyseescalautilizando unamatrizconunaselectividadsimilarperohechoconpartculasmsgrandes. Hayesencialmentetresetapasenlapurificacindeunabiomolculaapartirdeextractoso muestrasnaturales:lacaptura,purificacinintermediayelpulido. El propsito de la captura es aislar, concentrar y estabilizar la molcula blanco de la muestracrudaenformarpidayconunbuenporcentajederecuperacin.Lacapturanose esperaqueseaunpasoaltamenteresolutivo,peroesnecesariaparaaislarlamolculade inters de distintas sustancias contaminantes; es decir, es un proceso de separacin de grupo. Lafaseintermediadepurificacinseenfocaensepararalamolculablancodelamayora de las impurezas como protenas, pptidos, cidos nucleicos, endotoxinas y virus. La capacidad de resolver componentes similares es de suma importancia en esta etapa de purificacindadoqueloscontaminantespresentescompartencaractersticasfuncionalesy estructuralesconlamolculablanco. Elpulidoeselltimopasoparalaobtencindeunproductopuro,esteprocedimientose utiliza para remover el resto de los contaminantes e impurezas, de tal manera que el productofinalpuedaserobtenidopuroparasuposterioruso.Loscontaminantesenesta etapasonamenudomuysimilaresalamolculablanco.Losmscomunesincluyena variantesestructuralesyconformacionalesdelapropiamolcula.

Desalado
Ladesalacinesunprocedimientoderutinaenellaboratorioyconsisteenlaseparacinde contaminantesdebajopesomoleculardelasbiomolculasdemayorpesomolecular.Aeste procedimientoenocasionestambinseledenominacambiodebuffer.Lastcnicasno cromatogrficasparadesalarincluyenalaultrafiltracinyaladilisis.

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Cromatografadefasereversa
Las protenas, pptidos y cidos nucleicos pueden desalarse adecuadamente usando la cromatografadefasereversapuestoquelasmuestraspuedenrecuperarseyreconstituirse envolmenespequeosydeestamaneraevitarelfenmenodedilucinqueresultadela filtracinporgel. Una vez que se ha procesado toda la muestra, el soluto se eluye usando volmenes pequeosdefasemvildebajapolaridad,tpicamenteacetonitrilo.Sielsolventeutilizado es voltil, ste puede ser removido por evaporacin y la muestra residual podr ser resuspendidaenelvolumendeseadodeotrosolventeosolucin.

Anlisiscuantitativo
La cromatografa de fase reversa tambin puede proporcionar informacin cuantitativa acercadelasespeciesseparadas,locualledaunimpactodeaplicacinanmayoraesta tcnica. La cuantificacin en RPC se basa en la comparacin del rea del pico del compuestoproblemaconlasdeunoomsestndares. Losinstrumentoscromatogrficosestnequipadosconintegradoreselectrnicosdigitales, loscualespermitenunaprecisaestimacindelasreasdepico. Haycuatrotcnicasprincipalesparalacuantificacin:normalizacinderea,calibracin conestndarexterno,estndarinternoylaadicindeestndar.

Normalizacinderea Elreadelospicossereportacomounporcentajedereatotal.(Figura10)statcnicaes muy empleada para estimar las cantidades relativas de impurezas en una muestra; la desventajaesqueasumequetodosloscomponentestienenelmismonivelabsorcinala longituddeondaquesemonitorea.

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Cromatografadefasereversa

93%

2.8% 2.2% 0.8% 1.2%

Tiempo

Figura10.Ejemplodenormalizacinderea.

Calibracinconestndarexterno Implicaprepararsolucionesdelestndarconunaconcentracinconocida.Seinyectael mismovolumendecadasolucinyseconstruyeunacurvadecalibracinenfuncindela concentracinylasreasdepico.Laconcentracindelosestndaresdebeserparecidaala concentracinqueseesperaparalasmuestras.Lasmuestrasdeconcentracindesconocida sepreparan,inyectanyanalizandelamismamanera.Laconcentracindelasmuestrasse obtieneapartirdelacurvadecalibracin. A este mtodo se le llama estndar externo porque los estndares se analizan en cromatogramasseparadosdelasmuestras. Calibracinconestndarinterno Consisteenlaadicindeuncompuestodiferentealanalitoacadaunadelasolucionesque sevanaanalizar.Seanalizansolucionesdemuestradediferentesconcentracionesalasque sehaaadidolamismacantidaddeestndarinterno.

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Cromatografadefasereversa

Requerimientosparaunestndarinterno: Tenerbuenaresolucin(Rs>1.25) Factordecapacidadsimilaralcompuestoproblema Elcompuestoqueseutilicecomoestndarinternonodebeestarpresenteen la muestraoriginal Quetengaaltogradodepureza

Adicindeestndar Estemtodoseusaparaanlisisdetrazas.Diferentescantidadesdelanalitoquesedesea medirseadicionanalasolucinproblema,lacualcontieneunaconcentracindesconocida deanalito.Alacuantificacintotalselerestaelvalordelacantidadadicionada;deesta manerasepuedecalcularlaconcentracindesconocida.

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Cromatografadefasereversa

ALGUNOS ASPECTOS PARA EL DESARROLLO DE UN ANLISISDECROMATOGRAFADEFASEREVERSA

Enlasiguienteseccinsetratarnalgunasconsideracionesquehayquetomarencuentaen laaplicacindelacromatografadefasereversaparalaseparacindebiomolculascomo eslaseleccindecolumna,lafasemvil,lascondicionesdeelucin,preparacindelas muestras,manejodelascolumnas,ascomolaresolucindeproblemasmscomunes.

Naturalezaqumicadelafaseestacionaria
Paralaseparacindeprotenasgrandeshayunapreferenciaausarslicasconligandosn butiloynoctilosobrelosalquilosnoctadeciloyaquelasbiomolculasnosoncapacesde intercalarseenlascapasnalquilolargascomolohacenlasmolculaspequeas;adems, nosegeneraunaadsorcintanfuertedelasprotenasenlascadenasalquilopequeasypor consiguienteserequieremenorcantidaddesolventesorgnicosparalaelucin,locual disminuyeelriesgodedesnaturalizacindelaprotena.

Tamaoyformadepartcula
Laaccesibilidaddelamuestraalamatrizdependeengranmedidadeltamaodeporo.Los empaquescontamaosdeporomenoresde300armstrongsseusanparalaseparacinde pptidos y oligonucletidos. Generalmente se recomiendan tamaos de poro de 300 armstrongs o mayores para la separacin de protenas porque como se mencion anteriormente,losporosgrandesgeneranmejorresolucinparabiomolculasmslargas. Eltamaodelapartculatambindifiereentreunaseparacinanalticayunapreparativa. Lasseparacionesanalticassedesarrollanencolumnasconpartculasde3a5micras,las preparativas conpartculas de10a30micrasylas separaciones agranescalautilizan partculasde40a50micras.Elinconvenienteesqueamayortamaodepartcula,la columnasevuelvemsfrgilyportantosereducesutiempodevida.

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Cromatografadefasereversa
Respectoalaformadelaspartculas,lascolumnasconempaquedepartculasirregulares son menos caras que las partculas esfricas y son ms comnmente empleadas en aplicacionesdegranescala.

Tamaodelacolumna
Laresolucindebiomolculasdealtopesomolecularenlasseparacionesdefasereversa, es menos sensible al largo de la columna que la resolucin de molculas orgnicas pequeas,detalmaneraqueloscidosnucleicos,protenasypptidoslargospuedenser purificadoseficientementeencolumnascortas.Elincrementarellargodelascolumnasen generalnoincrementalaresolucinsignificativamenteyspodradaaralasprotenas porque la prdida deactividad biolgica es proporcional al tiempo deresidencia de la protenaenlacolumna. Porotraparte,lasseparacionesanalticasgeneralmenteusancolumnasde100a250mmde largo x 4 mm de dimetro; y las separaciones preparativas requieren columnas con dimetrosmsanchos,porejempo,de9mmaproximadamente.

VelocidaddeFlujo
Lavelocidaddeflujoesunfactorimportanteparalaresolucindemolculaspequeas,ya que la tendencia de las molculas a difundirse disminuye al incrementar el flujo, produciendopicosmsangostosyporlotanto,mejoralaresolucin.Lasprotenastienen menordifusibilidadquelasmolculaspequeas,porloqueseobtieneunabuenaeficiencia anconflujosbajos. Generalmente las separaciones en columnas de 100 a 250 mm de largo x 4.6 mm de dimetro se eluyen con un flujo de 1 ml/min y las separaciones preparativas que se desarrollanencolumnasde250mmx9.4mmdedimetroutilizanflujosde4ml/min. Las variaciones en la velocidad de flujo son especialmente significativas en las separacionesagranescala,peronoescrticaenlosexperimentosanalticos.

Temperatura
La temperatura puede afectar profundamente a la cromatografa de fase reversa, especialmente la utilizada para solutos de bajo peso molecular, pptidos pequeos y 32

Cromatografadefasereversa
oligonucletidos.Dadoqueeltransportedemasasensolucinentrelafasemvilylafase estacionariaesunprocesocontroladopordifusin,incrementarlatemperaturadisminuyela viscosidaddelsolventeyestogeneralmentefavorecelatransferenciademasasyporlo tanto, mejora la resolucin. En cambio, cuando las protenas se desnaturalizan por un incrementodelatemperatura, laestructuradestassedesdoblaytienemssitios de interaccinconlafaseestacionaria,porlotantoseincrementaeltiempoderetencin.

Solventes
Todoslossolventes,solucionesamortiguadoras,sales,ascomoelaguausadaparapreparar la fase mvil, deben serde altapureza qumica, libre de iones metlicos as como de partculassuspendidas. LapurezaqumicaesimportanteenRPCpreparativapuestoque cualquiercontaminanteenlafasemvilpuedeproducirpicosindeseables,ycontaminarla biomolculapurificada. Los solventes usados para preparar la fase mvil o la fase mvil ya preparada deben desgasificarseenunbaodeultrasonidopor10a15minutosparaprevenirlaformacinde gasqueafectaralaestabilidaddelacolumna.Tambinpuedendesgasificarseutilizando vacoyburbujeandohelio.

Desnaturalizacin Lasinteraccionesdelasprotenasconlossolventesorgnicos,engeneral,conduceacierta prdidadelaestructuraterciariaquepuedegenerarvariosestadosconformacionalesycada estado a su vez puede interactuar de manera diferente con la fase estacionaria. El desdoblamientopuedeexponerlosresiduoshidrofbicosdelaprotenaconelconsecuente incrementodelaretencin,loquepuedegenerarinsuficienterecuperacindelaprotena. Loscomplejosenzimticosyprotenasdecomponentesmltiplessonmslbilesaperder actividadquelospptidospequeos.Ahorabien,elprocesodedesnaturalizacinpresenta unacinticalentaypuedereducirseesteprocesodisminuyendoeltiempoquelaprotena permanece en la columna. En caso de que ocurriera cierta desnaturalizacin, la conformacinpodraregenerarsealreincorporarlaprotenaasuscondicionesnativas.En casodequeunaprotenaopptidofuerapurificadaconelfindedeterminarsuestructura primaria,ladesnaturalizacinnoseraunproblema.

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Cromatografadefasereversa
Gradientedeelucin Laretencindelasprotenasdisminuyeexponencialmentealadicionaralafasemvilun modificadororgnico.Estecomportamientodelasprotenasobligaalusodeelucionescon gradienteparalaseparacindemezclasproteicas. Cuandosepretendesepararporprimeravezloscomponentesdeunamezclacompleja,se usaungradientegruesoparaunaseparacininicial,queservirparaajustarlaformadel gradiente hasta llegar al punto ptimo. Esto usualmente implica la disminucin de la pendientedelgradienteenellugardondeeluyenloscomponentesdeseadosydelaumento delapendienteantesydespusdeesepunto. La eleccin de la pendiente del gradiente depender de que tan prximos eluyan los componentescontaminantesdelamolculablanco.Porlogeneral,cuandodisminuimosla pendiente del gradiente incrementamos la resolucin, pero tambin aumentamos los tiemposderetencin. LosgradientesenRPCsiempreprovienendeunacondicindealtapolaridad(fasemvilA altamenteacuosa)aunadebajapolaridad(fasemvilBconaltocontenidodesolvente orgnico). Los gradientes o pendientes de gradiente se reportan usualmente como el incrementoenelporcentajedelafasemvil Bporunidaddetiempo(%B/min) opor unidaddevolumen(%B/ml). Ungradientetpicovade0%Ba100%Ben10a30volmenesdecolumna.Conunflujo de1ml/minparaunacolumnade1ml,correspondeungradientede3a10%B/min.

Acondicionamientodecolumna
Elacondicionamientodecolumnadeberealizarsesiemprequeseuseunacolumnapor primeravez,despusdeunalmacenamientoprolongado,ycadavezquesedeseecambiarla fasemvilparaunanlisis. El acondicionamiento se lleva a cabo usando la misma fase mvil que la del anlisis cromatogrfico.Elprocedimientogeneralparaelacondicionamientodelascolumnasesel siguiente: 1. Lavar con 3 volmenes de columna de fase mvil B para eliminar posibles contaminantesdelanlisisanterior.

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Cromatografadefasereversa
2. Correr2a3volmenesdecolumnadeungradientelinealde100%faseBa100% faseA.Nodebecambiarsedemaneraabruptalafasemvilporqueexisteelriesgo dequelacolumnasedae. 3. EquilibrarconfaseAhastaquetodaslassealesdemonitoreoseanestables. Cadavezquesecambielafasemvil,esimportantecorrerunblancoparacorroborarla ausenciadeimpurezasyanalizarlaestabilidaddelsistema. DespusdehaberequilibradolacolumnaconlafasemvilA,elsegundopasoesaplicarla muestra a la columna. Enseguida se procede a eluir con la misma fase mvil A. La molculadeintersdeberunirsealamatrizylossolutosindeseadossernarrastradospor lafasemvil.

Preparacindelasmuestras
La muestra debe disolverse en la fase mvil que se emplear para hacer el anlisis cromatogrfico. Si la muestra no es completamente soluble en la fase mvil, puede adicionarsecidofrmico,acticooalgunasal;esteprocedimientomejoralasolubilidady noafectalaseparacin,siempreycuandoestosagentesseencuentrenenbajoporcentaje. Todaslasmuestrasdebencentrifugarsea10,000rpmpor10minutosantesdelainyeccin ofiltrarseatravsdeunamembranade0.22micrasparaeliminarpartculas. NoserecomiendaalmacenarlasfasesmvilesacuosasdepHneutropormsde3das porqueexisteelriesgodecrecimientomicrobianoyademslamuestrapodraoxidarse.

Limpiezadelacolumna
Serecomiendalimpiarlacolumnaperidicamente,especialmentecuandosedetecteuna elevacinenlapresinoprdidaderesolucin.Hayqueconsiderarquelaprdidade resolucindebidoalensanchamientodelospicospuededebersealapresenciadegrupos silanolenlasuperficiedelaslicaoinclusoaladisolucindelamatrizdebidoaluso frecuentedefasesmvilesconpHporarribade7. Unprocedimientocomndelimpiezaes:

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Cromatografadefasereversa
1. Lavar abajo flujocon varios volmenes de columna utilizando0.1 % deTFA (cidotrifluoroactico)enagua. 2. Correrungradiente,aproximadamente20a30volmenesdecolumna,desde0.1% deTFAenaguahasta0.1%deTFAenisopropanol.Elisopropanolesmuyusado paralalimpiezadecolumnasdebidoasualtopoderdeelucin. 3. Equilibrarcon100%deisopropanolconteniendo0.1%deTFAyluegollevarla columnanuevamenteaaguacon0.1%deTFAempleandoungradiente. 4. UtilizarungradienteparaintroducirlafasemvilA. 5. EquilibrarconvariosvolmenesdecolumnadefasemvilAantesdeiniciarel anlisis. Paracolumnasdepoliestireno,unprocedimientoefectivodelimpiezaesequilibrarcon variosvolmenesdecolumnaempleandohidrxidodesodio0.5M.Elhidrxidodesodio esunagentedelimpiezamuyefectivo.

Almacenamientodelacolumna
Lascolumnasdefasereversahechasabasedeslicanodebenalmacenarseensoluciones acuosasdebidoalainestabilidaddelaslicaencondicionesacuosas.Lascolumnasdeben almacenarseensolventesorgnicoscomometanollibredeTFA.

Resolucindeproblemas
Acontinuacinsepresentanalgunassolucionesparalosproblemasmscomunesdurante eldesarrollodeunanlisisporcromatografadefasereversa.

Sntoma

Causa

Solucin

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Cromatografadefasereversa
Elflujodelacolumna sehareducido. Presenciadematerial particuladoenlafasemvil. Precipitacindeprotenasenla columna. Filtrelasmuestrasylafase mvilantesdeusarlas. Reemplaceelfiltrodelafase mvil,laprecolumna,y/ola columna. Enamboscasoslimpiey regenerelacolumna. Revisequelabombaest funcionandoadecuadamente. Verifiquesilabombaoel sistemapresentanfugasosihay obstrucciones. Limpieyregenerelacolumna. Reemplaceelfiltrodelafase mvil,laprecolumna,y/ola columna. Cambieeladitivousadopara solubilizarlamuestra. Filtrelasmuestrasylafase mvilantesdeusarlas.

Nohayflujoporla columna.

Labombanofunciona.

Lapresinse incrementaduranteuna ovariascorridas.

Algunapieza,adaptadorotubo delsistemaestaobstrudo. Precipitacindelamuestraenla columna.

Sntoma
Lamuestranoeluyeen elgradienteusado.

Causa
LaconcentracindelsolventeB enelgradienteesmuybaja. Elpoderdeelucindelsolvente orgnicoesmuybajo.

Solucin
Incrementelaconcentracindel solvente. Sustituyalacolumnaporuna conligandosmenoshidrofbicos. Cambieelsolventeporotrode mayorespropiedadesdeelucin.

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Cromatografadefasereversa
Loscomponentesdela muestraeluyenenla fasedeequilibrio. Lamuestranoeslo suficientementehidrofbicapara adsorberseenlacolumna. Incrementelaconcentracindel agentesupresordeiones. Cambielacolumnaporunacon ligandosmshidrofbicos. Sustituyaelsolventeorgnico porotroconmenorespropiedades deelucin. Disminuyalaconcentracindel solvente.

Laresolucinesmenor aloesperado.

Laconcentracininicialde solventeesmuyalta. Lapendientedelgradientees muyalta. Bajaselectividad

Useungradientemsbajo. Adicioneoajustela concentracindelagentesupresor deiones. Cambielaceldadeflujo. Determinelosplatostericosde lacolumnaydesernecesario, cmbiela Limpieyregenerelacolumna. Incrementelaconcentracinde solventeenlafasemvilinicial. Limpieyregenerelacolumna. Disminuyaelvolumendecarga delamuestra.

Elvolumendelaceldade deteccinesmuygrande. Lacolumnaestamalempacada. Protenasolpidosprecipitados enlacolumna.

Laconcentracindelamuestra esdemasiadoalta.

Sntoma
Laresolucinesmenor aloesperado.

Causa
Haygrupossilanollibresenla superficiedelafaseestacionaria. Lavelocidaddelflujoesmuy alta.

Solucin
DisminuyaelpHparasuprimir laionizacindelosgrupossilanol ocambiedecolumna. Disminuyaelflujodeelucin.

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Cromatografadefasereversa
Ensanchamientode bandaoasimetra. Lacolumnaestmalempacada. Determinarelnmerodeplatos tericos.Desernecesario reemplacelacolumna. Limpieyregenerelacolumna. Disminuyaelvolumendecarga delamuestra.Nodebehaberms de1mgdemuestraporgramode faseestacionaria. Incrementelavelocidaddeflujo. Contineelacondicionamiento decolumnahastaquelalnea basalseaestable, aproximadamente5a10 volmenesdecolumna. Preparenuevamentelafase mvil. Preparenuevamentelamuestra. Disminuyaeltiempodecorrida afindelimitarlaexposicindela muestraalosreactivosdelafase mvil. Useunamatrizconligandos menoshidrofbicospara disminuirlaconcentracinde solventeBenlafasemvilo cambieelsolventedelafase mvil.

Lacolumnaestsobrecargada.

Nosepuedereproducir unperfildeelucin previo.

Haydifusindelamuestra. Lacolumnanoestequilibrada, faltaacondicionamiento.

Buenarecuperacinde lamuestraperopoca actividadbiolgica.

Lafasemvilnoseprepar correctamenteoelsolventese evapor. Alteracindelamuestradurante elalmacenaje. Loscomponentesdelamuestra estndesnaturalizadoso inactivadosenlafasemvil.

Sntoma

Causa

Solucin

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Cromatografadefasereversa
Lacantidaddemuestra enlasfracciones eludasesmucho menoraloesperado. Precipitacindelamuestra. Cambielacomposicindela fasemvilafindemantenerla estabilidad. DisminuyaelpHdelafase mviloadicioneunagente supresordeiones. Agregueinhibidoresde proteasasonucleasasominimice eltiempodeseparacin. Monitoreelamuestraadiferente longituddeonda.

Lamuestrasehaadsorbido fuertementealacolumnapor retencininica. Lamuestrasehadegradadopor proteasasonucleasas.

Picosmuypequeos

Lamuestraabsorbepocoaesa longituddeonda.

Picos extraos en el Impurezasenlafasemvil. Usereactivosdemejorcalidad. cromatograma. Lavelacolumna. Elucin incompleta de la corridaanterior. Ruidoenel Burbujasdeaireatrapadasenla Elimineelgasdelafasemvil. cromatograma columnaoenlaceldadel detector. Eltiempoderetencin paraunmismo componentedela muestraaumentaconel tiempo. Hayuncomportamientode modomixtodebidoagrupos silanolenlasuperficiedela slica. DisminuyaelpHparasuprimir laionizacindelosgrupos silanol.Obien,cambiela columna.

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Cromatografadefasereversa

EQUIPODEHPLC
LatcnicadefasereversaeseltipodecromatografamsampliamenteutilizadaenHPLC quesonlassiglasdelinglsHighPerformanceLiquidChromatography.Lacromatografa delquidosdealtaresolucinutilizapresioneselevadasparahacerpasarunflujodefase mvilatravsdeunacolumnaempacadaconpartculasmicromtricas.Sinlaaplicacinde presinseraprcticamenteimposiblequeeleluyentepasaraatravsdelacolumna. Dadaslascaractersticasdeunacolumnadecromatografadefasereversa,serequerirde unequipodeHPLCpararealizarlaseparacin.Asqueesrelevantecomentardeforma generalcmoestconformadoesteequipo. UnequipodeHPLCbsicamentedebecontarconunsistemadebombeoqueimpulseel flujodelafasemvilatravsdelacolumna,unacolumnaquesepareloscomponentesde lamuestra,undetectorquemidaalgunacaractersticadedichoscomponentesconformevan saliendodelacolumnayunprocesadorqueconviertalasealelectrnicadeldetectorenun cromatograma. Lafigura11muestraunesquemadeuncromatgrafodelquidosdealtaresolucintpico; enseguidaseexplicarbrevementecadaunodeloscomponentes.
Fuent e de helio regulada
Vlvulad e s alid a

A m o r t ig uad o r d e puls ac io ne s Vlvulad e d r e naj e

Bomba Vlvulad e e nt r ad a

Ent rada de j eringa para cebar

Al det ect or Co lum na

Filt r o Transduct or de presin Vlvulad e iny e c c i n Re g ulad o r d e c o nt r apr e s i n

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Cromatografadefasereversa

Figura11.Diagramaquemuestralaspartesmsimportantesqueintegranuncromatgrafodelquidosde altaresolucin.

Sistemasparaeltratamientodelosdisolventes
Los recipientes que contienen los solventes amenudo se equipan con un sistema para eliminarlosgasesdisueltos,comooxgenoynitrgeno,queinterfierenformandoburbujas enlossistemasdedeteccin. Undesgasificadorpuedeconsistirenunsistemadebombeoporvaco,dispositivospara calentaryagitarlosdisolventesosistemasdedifusinquepermitenarrastrarlosgases disueltosfueradelasolucinmediantefinasburbujasdeungasinertedebajasolubilidad. Para poderhacerelucionesporgradiente,losequiposdeHPLCmodernoscuentancon recipientes conectados a una mezcladora, lo que permite variar la relacin de los disolventesenformaprogramadaymodificarlosvaloresdemaneralinealoexponencial.

Sistemasdebombeo
LasbombasutilizadasenelHPLCsonmuypotentesyprecisas.Elflujodebeserlibrede pulsacionesyconuncaudalquepuedavariarentre0.1y10ml/min,lapresinpuedeser hasta de 6000psi (lbs/in2) y todos los componentes deben ser resistentes a la corrosin. Existentrestiposdebombas:bombasrecprocas,bombasdejeringaybombasdepresin constanteoneumtica. Labombasrecprocassonlasmsusadas,el90 % delosequiposdeHPLCmodernos cuentanconestesistemadebombeo.Eldisolventeesexpulsadodeunacmaraporel movimientodevaivndeunpistnaccionadoporunmotor.Lasbombasrecprocastienen ladesventajadequeproducenunflujoconpulsacionesquesemanifiestacomoruidoenla lneabasedelcromatograma.Entrelasventajasdeestasbombassepuedencitarsupequeo volumeninterno(35a400l),susaltaspresionesdesalida(porencimadelas10,000psi), su fcil adaptacin a la elucin con gradiente y sus caudales constantes que son prcticamente independientes dela contrapresindelacolumna yde laviscosidad del disolvente.Comounapartemsdelsistemadebombeoesta elrestrictor colocadoala

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Cromatografadefasereversa
salidadelabomba.Cualquierdiferenciaentrelasealyunvalorpreestablecido,seutiliza paraaumentarodisminuirlavelocidaddelmotordelabomba.

Sistemasdeinyeccindelamuestra
Amenudo,elfactorlimitanteenlaprecisindelasmedidasencromatografadelquidos porHPLC,eslareproducibilidadconquesepuedeintroducirlamuestraenlacolumna.El problemaseagravaporelensanchamientodebandaqueacompaaalasobrecargadelas columnas.Porello,losvolmenesqueseempleanhandesermuypequeos,de20 l hasta500l.Adems,sehadepoderintroducirlamuestrasindespresurizarelsistema. Elmtodomsampliamenteutilizadoparalaintroduccindelamuestrautilizadispositivos enformadebucle,quepuedenintroducirlamuestraapresionesdehasta7000psiconuna precisinaceptable.

Columnas
Comoseexplicenlaprimerapartedeestetrabajo,laseparacindeloscomponentesdela muestraseproduceenlacolumna. LamayoradelascolumnasparaHPLCseconstruyencontubosdeaceroinoxidablede dimetrointernouniforme.Estaclasedetubosmidenentre10y30cm.Eldimetrointerno delascolumnasesamenudode4a10mmylostamaosdelaspartculasdelosrellenos mscomunesson3,5y10m. Para aumentar la vida de la columna analtica se coloca delante una precolumna que eliminalamateriaensuspensinyloscontaminantesdelosdisolventes.Lacomposicin delrellenodelaprecolumnadebesersemejantealdelacolumnaanaltica;sinembargo, eltamaodelapartculaesporlocomnmayorparaminimizarlacadadepresin.

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Tiposderellenodelacolumna Elrellenopuedeserdedostiposdepartculasporosasopediculares.Elltimoconsisteen bolasdevidrioodepolmero,noporosasyesfricasconunosdimetroscaractersticosde 30a40 m.Enlasuperficiedeestasbolassedepositaunacapadelgadadeslice.El rellenopedicularseutilizaampliamenteenprecolumnasynoparacolumnasanalticas. LosrellenosdepartculasporosasparaHPLCestnformadospormicropartculasporosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible para un tamao determinado. La slice es el material ms comnmente empleado para este tipo de columnas,debidoaquesepuedenproducirpartculascondimetrosmuyuniformes.

Termostatos
Enmuchasaplicacionesnosenecesitauncontrolestrictodelatemperaturaylascolumnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, si se controla la temperatura de las columnasseobtienenmejorescromatogramas.Lamayoradelosaparatosllevahornosque controlan la temperatura en las columnas. Otra forma de controlar con precisin la temperaturaescolocandolascolumnasencamisasconaguaqueprovengadeunbaode temperaturaconstante.

Detectores
LosdetectoresencromatografadelquidoscomoHPLCsondedostiposbsicos.Los detectoresbasadosenunapropiedaddelafasemvilquerespondenacambiosenelndice derefraccin,laconstantedielctricaoladensidad,lascualessemodificanporlapresencia delosanalitos.Porcontraste,losdetectoresbasadosenunapropiedaddelsolutoresponden aalgunadelaspropiedadesdelamuestracomoeslaabsorcinenUV,fluorescencia, actividadptica,etc.Algunosdeestosdetectoressedescribenacontinuacin.

Detectoresdeabsorbancia

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Sonlosdetectoresmsempleadosyaquetantolasprotenascomoloscidosnucleicos absorbenluzdeestaregin.Laslongitudesdeondatpicamentemonitoreadasson: 210220 nm: corresponde a la absorcin de la unin peptdica. Se usa principalmenteparamonitorearpptidosquecarecendeaminocidosaromticos. 228nmparaHis 240nmparaCys 254nmparaPhe 250260nmparamediroligonucletidos 280nmparaTrpyTyr Losdetectoresdeabsorbanciaultravioletamssimplessonlosfotmetrosdefiltroscon unalmparademercuriocomofuente.Ladesventajaquepresentanestosaparatosesqueel efluentenosepuedemonitorearavariaslongitudesdeondaalmismotiempo. Afindereducirelensanchamientodebanda,elvolumendeunacubetadeflujo(enforma deZ)paramedirabsorbanciahadeserlomenorposible.Laslongitudesdelacubetavan de2a10mm(Figura12)demodoquelosvolmenesselimitanporlocomnde1a10 l.Ademslapresinnodebesermayordeunos600psi.puesexisteelriesgoderomperla cubetadeldetector.
De la columna

Vent anas de cuarzo

Fuent e UV

Det ect or

Al desecho

Figura12.Esquemadelacubetadeundetectordeabsorbancia.

Detectoresdearreglosdediodos

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Estetipodeinstrumentospermitenhacerbarridosadistintaslongitudesdeondadecada uno de los componentes separados. De esta manera, se generan una coleccin de cromatogramasadiferenteslongitudesdeondadecadapico. Mediantelosarreglosdediodossepuededeterminarlamejorlongituddeondaalaque debemonitorearseelcompuestodeinters.

Detectoresdefluorescencia LosdetectoresdefluorescenciaparaHPLCsonsemejantesendiseoalosfluormetrosy espectrofluormetros.Lafluorescenciasedetectapormediodeundetectorfotoelctrico colocadoperpendicularmenterespectoalhazdeexcitacin.Unaventajadelosdetectores deflorescenciaessualtasensibilidad,unastresrdenesdemagnitudmayoralaobtenida pormtodosdeabsorbancia. Detectoresdeinfrarrojo Una de las mayores limitaciones del uso de detectores de infrarrojo se debe a la interferenciageneradaporlosdisolventesqueseutilizan.Porejemplo,lasbandasanchasde absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prcticamente el uso de este detectorparamuchasaplicaciones. Detectoresdendicederefraccin Son considerados detectores universales,pues elndice de refraccines una propiedad fsicadetodosloscompuestos.Midenlasvariacionesenelndicederefraccindelafase mvilcuandohaydiferentessolutospresentes. Estosdetectorestienenladesventajadenosertansensiblescomolamayoradelosotros detectores, por ejemplo, son dos a tres veces menos sensible que un detector de absorbancia. Adems son muy inestables a los cambios de temperatura por lo que se requiereunestrictocontroldesta. Detectordedispersindeluz(ELSD) El efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una nube medianteunflujodenitrgenooaire.Lasgotitasviajanatravsdeuntubodeconduccin

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atemperaturacontroladadondetienelugarlaevaporacindelafasemvil,loqueorigina unasfinaspartculasdelcompuestoproblema.Lanubedepartculasdeanalitopasaatravs deunhazdelserymedianteunfotodiododesiliciosedetectalaradiacindispersada perpendicularmentealflujo. Unadelasmayoresventajasdeestetipodedetectoresquepuedeemplearsepara casi todoslossolutosnovoltilesyesmssensiblequeeldetectordendicederefraccin.

Detectoresdeespectrometrademasas Laespectrometrademasaseselmtododedeteccinmsrecienteycadavezsegeneraliza mssuuso. Lamuestraalsalirdelacolumnaesionizada.Luegolosionesseseparandeacuerdoasu relacincarga/masa.

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PROVEEDORES
Acontinuacinsepresentanlosnombresydireccioneselectrnicasdelosproveedoresms importantesdecolumnasyequiposcromatogrficos.

Compaa
ABI Alltech Beckman BioRad Merck J&WScientific J.T.Baker PerkinElmer VWR Waters Whatman

Pginadeinternet
http://www.appliedbiosystems.com/ http://www.alltechweb.com/ http://www.beckman.com/ http://www.biorad.com/ http://chrombook.merck.de/chrombook/index.jsp?j=1 http://www.chem.agilent.com/cag/cabu/jandw.htm http://www.jtbaker.com/chromatography/ http://las.perkinelmer.com/ http://www.chromatography.co.uk/products/Default.htm http://www.waters.com/ http://www.whatman.com/

Otraspginasdeinternetdeinters
http://www.rpi.edu/dept/chemeng/BiotechEnviron/IONEX/be_index.htm http://www.separationsnow.com/basehtml/SepH/1,1353,30000home00,00.html http://ntri.tamuk.edu/fplc/rev.html http://www.ionsource.com/tutorial/chromatography/rphplc.htm http://www.nestgrp.com/protocols/vydac/rpcbuffernote.shtml http://www.biocompare.com/jump/2105/ReversePhaseChromatography.html

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COMENTARIOS
Sin duda, la cromatografa de fase reversa se ha convertido en una herramienta indispensable en la investigacin biotecnolgica. Esta tcnica de separacin debe su crecimiento a su rapidez, simplicidad, relativo bajo costo y versatilidad. Justamente la adaptabilidad de la cromatografa de fase reversa permiti el surgimiento de la cromatografaporsupresininicaylasecuencialqueserevisaronenelpresentetrabajo. Tambinseprocurdarunavisindelasaplicacionesdelacromatografaenfasereversa enelreadelabiotecnologayalgunosaspectosaconsideraralmomentodedesarrollar unaseparacindefasereversa. Con seguridad se seguirn implementando modificaciones de la tcnica que permitan expandir an ms su uso. Ahora la tendencia es el empleo de columnas capilares que mejorenlaresolucindelosanlisisascomoelacoplamientoadetectoresmssensibles quegenerenmayorinformacindelcompuestoenestudiocomolosarreglosdediodosy losespectrmetrosdemasas.

BIBLIOGRAFA
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