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Un batteriofago o fago un virus che parassita un determinato batterio, di cui pu provocare la distruzione per lisi.

I batteriofagi pi complessi, come quelli della serie T, hanno una forma a spillo. La testa contiene l'acido nucleico, sotto a questa si trova un collare, seguito da una coda che si sfrangia all'estremit libera in 5 o 6 fibre. Il batteriofago attacca il batterio fissando le fibre su un punto preciso della superficie del batterio. Con un meccanismo di contrazione inietta il suo acido nucleico, mentre l'involucro proteico rimane all'esterno. Una volta iniettato, il genoma fagico pu seguire due vie. Nel ciclo litico (tipico dei batteriofagi T), utilizzer l'apparato di replicazione dell'ospite per produrre nuove

particelle fagiche, fino al raggiungimento del volume di scoppio, momento in cui la cellula si disgregher per lisi. Nel ciclo lisogenico invece, il genoma fagico (solitamente quello di ) si integrer in un punto specifico del

cromosoma batterico, att. In questo stato integrato, il fago viene chiamato profago, e ogni qual volta il cromosoma batterico si replica, il genoma di integrato replica anch'esso. Un batterio che contiene un profago detto "lisogeno". Lo stato di profago mantenuto da una specifica proteina prodotta dal fago stesso. L'allontanamento di questo repressore induce il ciclo litico.

I ceppi EHEC sono in grado di promuovere un'istopatologia A/E (vedi EPEC) e di secernere la tossina Stx1(indentica alla tossina di Shigella) insieme alla tossina Stx-2 (60% di analogia alla tossina di Shigella). Entrambe le tossine sono codificate da fagi lisogeni e hanno una subunit A e cinque subunit B, in grado di legarsi al globotriaosilceramide o Gb3.

Streptococcus pyogenes Scarlattina una complicazione della faringite. I ceppi responsabili sono prodottore della tossina eritrolitica, codificata da un fago lisogeno.

TOSSINE ADP RIBOSILANTI: Le tossine che agiscono alterando il contenuto intra-cellulare di AMP-c agiscono con due fondamentali meccanismi. Un primo gruppo di tossine agisce alterando la funzionalit delle proteine G, famiglia di proteine coinvolte nelle cascate dei cosiddetti "secondi messaggeri" che utilizzano lo scambio di guanosina difosfato come interruttore molecolare per avviare o interrompere alcune reazioni biochimiche all'interno della cellula, alcune delle quali controllano la regolazione dell'attivit dell'adenilato-ciclasi. Producono enzimi ADP-ribosilanti che agiscono staccando la nicotinammide del NAD e trasferendo la rimanente porzione su una proteina bersaglio. Nella cellula eucariotica la ADP-ribosilazione rappresenta il meccanismo fisiologico di modificazione post-traduttiva di alcune proteine ed operata da enzimi che provocano una poli-ADP-ribosilazione per l'addizione di una catena, spesso ramificata, caratterizzata da numerose molecole di ADP-ribosio. Le tossine batteriche che agiscono con questo meccanismo sono, invece, enzimi mono-ADP-ribosilanti. Esempi sono costituiti dalla tossina colerica, dalla tossina termolabile di Escherichia coli e dalla tossina pertossica. La tossina colerica e la tossina termolabile di Escherichia colienterotossigeni sono prodotte da batteri che si localizzano nell'intestino tenue. Il secondo gruppo di tossine caratterizzato da una attivit adenilato-ciclasica intrinseca e sono quindi in grado di sintetizzare autonomamente AMP-c una volta pervenute all'interno della cellula bersaglio. Esempi sono rappresentati dalla adenilatociclasi/emolisina prodotta da Bordetella pertussis e dal cosiddetto edema factor della tossina carbonchiosa.

Induzione: sintesi di enzimi in risposta alla comparsa di un substrato specifico La capacit di agire da induttore altamente specifica. Molecole strutturalmente affini al lattosio possono agire da induttori della b-galattosidasi ma non vengono metabolizzate: una molecola con questa caratteristica chiamata induttore gratuito (IPTG)

ARCHEI --- Thomas Cavalier-Smith propose (tra il 2002 e il 2004) una classificazione alternativa[1] in base alla quale tutti i batteri discendono da organismi gram-negativi, dotati di una doppia parete cellulare. Da questi sarebbero derivati innanzitutto i batteri gram-positivi, dotati di una singola parete cellulare, e solo da questi gli archei e gli eucarioti. In base a questa classificazione, tuttora controversa, Archaea e Bacteriaverrebbero riuniti di nuovo in un unico dominio, quello dei Prokaryota.

Pur mantenendo le caratteristiche dei procarioti (assenza di un nucleo distinto e di organuli citoplasmatici rivestiti da membrane, presenza di un unico filamento di DNA, strutture di rivestimento pi complesse rispetto alla cellula eucariote), date le condizioni estreme in cui possono svilupparsi, gli archei presentano una composizione biochimica unica delle loro strutture di rivestimento, che conferisce loro una notevole impermeabilit e che li differenzia sia dai batteri che dagli eucarioti. La parete cellulare degli archei composta da proteine, polisaccaridi o molecole di pseudopeptidoglicano, che al posto dell'acido muramicocontengono acido talosaminuronico, mentre mancano i D-aminoacidi caratteristici dei batteri.

ESPERIMENTI
Il test di fluttuazione rappresenta forse il contributo pi importante della coppia Luria Delbrck, e forn la prima risposta al problema, molto sentito all'epoca, dell'acquisizione della resistenza ai virus da parte dei batteri. Fu Salvatore Luria, nel 1943, a ideare l'esperimento, ispirandosi (secondo il racconto che ne fece) alle slot machines. Questi meccanismi hanno un comportamento antistatistico, cio non distribuiscono equamente i premi tra i giocatori: pochi vincitori conquistano grandi somme. Luria applic lo stesso ragionamento a venti colture indipendenti di batteri, contenenti un numero simile di individui. Se la resistenza al virus fosse stato un fenomeno indotto dalla stessa infezione, le colonie avrebbero dovuto presentare un numero di batteri resistenti pressoch uguale. Se invece il virus selezionava batteri gi resistenti, la distribuzione degli individui sopravvissuti all'infezione sarebbe dovuto risultare diseguale, con valori "fluttuanti" da una coltura all'altra. I risultati confermarono la seconda ipotesi, mostrando anche come la resistenza fosse trasmessa ereditariamente. Luria comunic i risultati a Delbrck, che formul una trattazione matematica per calcolare il tasso di mutazione dei batteri. I risultati di questo esperimento furono pubblicati sulla rivista Genetics nel 1943.

L'esperimento di Frederick Griffith del 1928 fu uno dei primi esperimenti a suggerire che i batteri sono in grado trasferire informazioni genetiche attraverso un processo noto come trasformazione.[1][2] In tal modo, esso apr la strada alla determinazione di quale fosse la natura del materiale genetico.

Che esistesse una qualche sostanza in grado di trasmettere l'informazione genetica (il materiale genetico, appunto) era noto da tempo. Tra la fine del 1800 e i primi anni del 1900 venne proposto e dimostrato che il materiale genetico fosse racchiuso nei nuclei delle cellule (August Weismann) e in particolare

nei cromosomi (teoria cromosomica dell'ereditariet di Sutton, Boveri del 1902 dimostrata solo pi tardi dagli esperimenti su Drosophila melanogaster di Thomas H. Morgan e dei suoi allievi). Rimaneva per aperta la questione intorno alla materia costitutiva del materiale genetico. L'ufficiale medico inglese F. Griffith in quegli anni studiava un batterio in grado di causare la polmonite: lo pneumococco (Streptococcus pneumoniae). Nei suoi esperimenti fece uso di due ceppi batterici: Il ceppo S, detto anche liscio dal momento che produce colonie lisce e lucenti (grazie alla presenza di

una capsula batterica polisaccaridicache avvolgeva ogni cellula). Questo ceppo in grado di provocare la polmonite. Il ceppo R, detto anche rugoso dal momento che produce colonie dall'aspetto "rugoso" (a causa dell'assenza della capsula batterica). Questo ceppo non in grado di provocare polmonite. Di fatto ora sappiamo che il ceppo R deriva da una mutazione di un ceppo S. Per quanto riguarda il ceppo S, ne esistono diverse varianti suddivise in base alla composizione chimica della capsula. Griffith, in particolare, studi le varianti note come IIS e IIIS. In seguito a mutazioni di batteri IIS si potevano sviluppare batteri R (privi di capsula). I batteri R (detti IIR dal momento che derivano da batteri IIS) possono retromutare (cio riacquisire, in modo naturale, la capacit di produrre la capsula batterica) e formare pneumococchi di ceppo S: ma solo IIS. Lo stesso discorso vale per i batteri IIIS. In definitiva IIR non potr mai retromutare in IIIS e IIIR non potr mai retromutare in IIS. Quando Griffith iniett batteri IIR in un topo, verific che la cavia non si ammalava e non era possibile

isolare questi batteri dai tessutidell'animale.

Quando il medico iniett batteri IIIS in topo, verific che l'animale si ammalava, moriva ed era possibile

isolare questi batteri dai tessuti dello stesso.

Successivamente prese alcuni batteri IIIS e li uccise in seguito a shock termico. Iniett poi questi

batteri morti in un topo e come c'era d'aspettarsi il topo non si ammal e non fu possibile isolare IIIS dai tessuti dell'animale.

Da ci si deduce che, per provocare la malattia, necessaria la presenza della capsula e i batteri capsulati

devono essere ovviamente vivi.


A questo punto Griffith prepar una miscela in cui erano presenti batteri vivi IIR e batteri morti IIIS

(uccisi da trattamento termico). Iniett questa miscela in un topo: quello che ci si aspettava era la NON comparsa di malattia nell'animale (dal momento che non sarebbero dovute sussistere le condizioni appena citate). In realt il topo si ammal e mor; nei suoi tessuti si riscontrarono batteri IIIS.

Per spiegare a prima vista questo strano risultato si potrebbe forse pensare che alcuni batteri IIR iniettati siano retromutati in IIS (causando la polmonite), ma questo da escludere dal momento che nei tessuti dell'animale erano stati isolati batteri IIIS e non IIS. Conclusioni [modifica] Griffith propose l'unica spiegazione plausibile: alcuni batteri IIR, in seguito all'interazione con batteri morti IIIS si erano trasformati in IIIS. Evidentemente all'interno dei IIIS morti doveva essere presente una qualche sostanza in grado di conferire ai batteri IIR che l'acquisivano la capacit di sintetizzare la capsula polisaccaridica. Questa sostanza il materiale genetico. Griffith chiam il materiale genetico principio trasformante. Erroneamente, come per la stragrande maggioranza degli scienziati suoi contemporanei, riteneva che questa sostanza dovesse essere di natura proteica. A partire da questo importantissimo esperimento, Avery, MacLeod e McCarty nel 1943 dimostrarono che il materiale genetico in questione era ilDNA (anche se la prova definitiva arriv solo dagli esperimenti di Hershey

e Chase del 1953).

Schema dell'esperimento di Avery

Avery si procur una coltura di pneumococchi di tipo S. A questo punto lis le cellule (cio ne ruppe la parete e la membrana cellulare) in modo da ottenere una soluzione nella quale era disciolto il materiale contenuto nei batteri, il cosiddetto estratto cellulare o lisato cellulare.

Il materiale genetico doveva presumibilmente essere uno dei diversi tipi di macromolecole biologiche presenti nei batteri: (proteine, polisaccaridi,acidi nucleici ovvero DNA e RNA e lipidi). Avery e colleghi riuscirono a separare l'estratto cellulare nelle varie componenti macromolecolari appena citate. Successivamente cercarono di capire quali di queste sostanze erano effettivamente in grado di trasformare batteri R avirulenti in batteri S virulenti. Le cavie sopravvivevano quando trattate con tutte le biomolecole tranne gli acidi nucleici: il materiale genetico doveva essere quindi DNA e/o RNA.

Per capire quale delle due sostanze fosse, divisero l'estratto contenente l'acido nucleico in due aliquote: una venne trattata con l'enzimaribonucleasi (RNasi) che degrada selettivamente l'RNA e non il DNA, l'altra venne invece trattata con deossiribonucleasi (DNasi) che degrada selettivamente il DNA e non l'RNA. Ci che si osserv era la trasformazione dei batteri R in batteri S solo in seguito all'aggiunta dell'aliquota trattata con RNasi. Il materiale genetico doveva allora essere necessariamente il DNA.

Hershey e Chase svolgevano studi su un fago, ovvero un virus in grado di infettare i batteri, nel loro caso il batterio Escherichia coli (E. coli); in particolare il fago di loro interesse era noto come "T2".

All'epoca era noto che T2 era formato esclusivamente da DNA protetto da un involucro proteico. I due scienziati prepararono in parallelo due colture di E. coli: Nel terreno di coltura della prima introdussero fosforo marcato radioattivamente (l'isotopo 32P). Nel terreno di coltura della seconda introdussero zolfo marcato radioattivamente (l'isotopo 35S).

I batteri delle due colture metabolizzarono da una parte il fosforo marcato e dall'altra lo zolfo marcato introducendo questi atomi radioattivi nelle biomolecole presenti all'interno delle cellule. In particolare: Il fosforo marcato si trover in gran parte nei nucleotidi e di conseguenza anche negli acidi nucleici; non sar

presente invece in quantit significative nelle proteine. Lo zolfo marcato si trover nelle proteine (in particolare nell'amminoacido cisteina) e non si trover nei

nucleotidi. A questo punto i ricercatori infettarono parallelamente le due colture batteriche con il fago T2. Questo virus utilizza l'apparato biosintetico delle cellule di E. coli per replicare il proprio DNA e per sintetizzare le proteine del rivestimento (cfr. Ciclo litico di un virus). Dal momento che i nucleotidi e gli amminoacidi utilizzati nella sintesi del DNA e delle proteine virali sono quelli presenti all'interno della cellula infettata, ne risulta che i fagi sviluppati dall'infezione nella prima coltura avranno un DNA marcato radioattivamente, mentre quelli sviluppati dall'infezione della seconda coltura avranno il rivestimento proteico esterno marcato radioattivamente.

Hershey e Chase separarono i fagi neoformati (quelli marcati) dai due terreni di coltura e, separatamente, li utilizzarono per infettare altre due colture di E. coli, in questo caso cresciute su terreni "standard" privi di isotopi radioattivi. Nel caso in cui i fagi infettanti avessero il DNA marcato, in seguito all'infezione gran parte della radioattivit

veniva misurata all'interno delle cellula batteriche colpite (e nel DNA di una parte dei nuovi fagi sviluppatisi in seguito a questa infezione). Nel caso in cui i fagi infettanti avessero il rivestimento proteico marcato la radioattivit veniva misurata

solamente all'esterno delle cellule batteriche colpite (e non era presente sul rivestimento proteico dei nuovi fagi sviluppatisi in seguito a questa infezione).

Il processo utilizzato per determinare se la radioattivit provenisse dall'interno o dall'esterno delle cellule fu il seguente: dopo un certo tempo dall'inizio dell'infezione, il terreno di coltura veniva posto in un omogenizzatore. La conseguente agitazione provocava il distacco del rivestimento proteico dei virus dalla membrana cellulare (in questo caso si parla di "ombre fagiche" poich questi rivestimenti proteici non contengono il DNA che gi stato iniettato nella cellula). Il tutto veniva poi centrifugato: la parte cellulare (contenente eventualmente il DNA marcato) rimaneva sul fondo della provetta, mentre i rivestimenti proteici distaccati dalle membrane cellulari rimanevano in sospensione. A seconda di dove si misurava la maggiore radioattivit era possibile dedurre se la molecola marcata si trovasse o meno all'interno della cellula. Nel caso del DNA marcato la radioattivit si misur sul fondo della provetta:

Nel caso delle proteine marcate la radioattivit si misur sul sopranatante:

Conclusione [modifica]
Dal momento che il fago per replicarsi ha bisogno di introdurre all'interno della cellula ospite il suo materiale genetico per poter sfruttare l'apparato batterico di replicazione / trascrizione / traduzione, appare evidente che questo materiale genetico deve essere per forza il DNA poich, come dimostrato, le proteine non entrano nella cellula colpita mentre il DNA s.

A questo punto rimaneva aperta un'ultima questione: "Di cosa fatto il materiale genetico degli "organismi" che non contengono DNA (i virus a RNA)?". La risposta a questa domanda non tard ad arrivare in seguito a studi condotti sul virus del mosaico del tabacco (TMV) da Gierer e Schramm (1956) e da Fraenkel-Conrat e Singer (1957).

L'esperimento di Lederberg e Tatum


La conoscenza dei processi qui descritti stata conseguita attraverso innumerevoli osservazioni ed esperimenti condotti in laboratori molto attrezzati. Tra questi merita di essere esposto quello eseguito da Lederberg & Tatum nel 1946 col quale stato provato in modo inconfutabile che questi microscopici organismi possono scambiare materiale ereditario. Tuttavia prima di procedere nell'esposizione occorre fornire alcune notizie propedeutiche sul lavoro del microbiologo. I batteri possono essere coltivati entro scatole o tubi su terreno sterile, cio privo di altri organismi che con la loro crescita e competizione possono turbare lo svolgersi della ricerca. Il terreno (= pabulum) pi semplice, o minimo, sul quale si allevano molte specie eterotrofe consta di una soluzione dei composti inorganici necessari alla crescita delle cellule, pi una sostanza organica che fornisca l'energia necessaria. Se per si ha a che fare con ceppi i quali, a seguito di una mutazione hanno perso la capacit di sintesi di un qualche composto, allora al terreno minimo occorre aggiungere quel composto bell'e pronto, altrimenti quel ceppo non si svilupper. Va anche premesso che per convenzione universale tra i genetisti un ceppo geneticamente incapace di sintesi di un composto deve essere indicato con la sigla (in corsivo) di quel composto seguito dal segno - ; se ad esempio il ceppo non sintetizza la leucina, esso verr designato come Leu- ; in caso contrario verr designato come Leu + L'esperimento fu cos organizzato: vennero coltivati nel medesimo recipiente, con terreno integrato da tutte le sostanze necessarie, due ceppi del comune colibacillo Escherichia coli. Uno di essi era capace di sintetizzare tutte le micromolecole organiche occorrenti ma non la biotina e la metionina (quindi H- e Met - ); l'altro invece era capace di sintetizzare tutte le micromolecole comprese la biotina e la metionina (quindi H eMet ) ma incapaci di sintesi di leucina, treonina e vitamina B1 (quindi Leu -, Thr e- e B1 -). Dopo qualche tempo di convivenza, dalla discendenza di questi due ceppi vennero recuperate cellule capaci di vivere su terreno minimo e quindi capaci di fabbricarsi tutte e cinque le sostanze menzionate (quindi H+, Met+, Leu+, Thr+, B1+ ) (fig.). Il risultato indicava chiaramente che il riassortimento dei patrimoni genetici - e quindi la sessualit - aveva permesso la comparsa di individui geneticamente dotati in modo da poter vivere senza difficolt in un ambiente precluso a tutte le cellule preesistenti.