Elabor acin del Jerez

Geraldine Tibasosa Rodrguez gtibasosa@javeriana.edu.co Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiologa, Laboratorio de Microbiologa Industrial, Bogot D.C., 18 de Noviembre de 2011 RESUMEN

Se elaboro un jerez a pequea escala durante tres meses, evaluando y observando los cambios ocurridos y los factores importantes durante la elaboracin de este producto. Materiales y mtodos como materia prima se utilizaron uvas pasas previamente selladas, se estrujaron y se dio inicio a la fermentacin en un recipiente previamente inoculado con Saccharomuyces cerevisiae. Se observo la morfologa de los microorganismos presentes a travs del tiempo mediante coloracin de Gram, se realizo el recuento en cmara de Neubawer para ver la concentracin celular inicial de levaduras. Para la identificacin bioqumica de Saccharomyces spp. se tomaron muestras del vino y se evalu la capacidad de asimilacin y fermentacin de diversos azcares por parte de la levadura, su capacidad de tolerancia al etanol y su reaccin frente a la urea, la muestra se sembr en medios de cultivo OGY y rosa de bengala para la observacin macroscpica y microscpica. Tambin se realizo la identificacin de microorganismos contaminantes del jerez en medios Zygosaccharomyces, Tenner-Vetsch modificado, carbonato clcico-etanol WL adicionado de actidiona. Finalmente se realiz un anlisis fisicoqumico del jerez con la intencin de observar los slidos en suspensin, la acidez, alcoholes, compuestos nitrogenados, entre otros. Adems se realizaron trasiegos, filtraciones y centrifugaciones para eliminar la mayor cantidad de slidos en suspensin y obtener un jerez clarificado y de mejor calidad. Resultados. Se obtuvo un jerez con 1 de alcohol, sin contaminantes y sin enfermedad alguna, mostro el brillo caracterstico de un vino, los recuentos y observaciones de los microorganismos involucrados detectaron presencia de Levaduras salvajes en un comienzo y luego la accin de Saccharomyces cerevisiae Conclusiones Se demostr que la tcnica de vinificacin es una buena prctica para la obtencin de un buen jerez, ya que se evaluaron todos los pasos adecuados contando con la utilizacin de levaduras para la fermentacin, el comportamiento de la levadura mostro una leve accin a travs del tiempo ya que era catalogada como una levadura de alta produccin de etanol. Palabras Clave: Jerez, vinificacin, Saccharomyces cerevisiae, fermentacin, levaduras salvajes. Introduccin Aunque el vino lleve ya varios siglos integrando una cultura, algunas costumbres y tradiciones de la civilizacin occidental, sus orgenes entroncan casi con los del propio ser humano. Siempre ha habido constancia de las ms variadas formas de bebidas alcohlicas, obtenidas de la fermentacin de un amplio abanico de productos de la tierra, dependiendo en

cada lugar de las particularidades productivas y meteorolgicas. La bebida espirituosa conocida como jerez es un tipo de vino espaol, originario de la provincia de Cdiz, este es un producto fermentado elaborado a base de uvas, podemos tambin decir que las primeras noticias del vino de Jerez nos las proporciona en el siglo I a.C el gegrafo griego Estrabn, que atribuye a los fenicios el haber trado las vides a esta regin, all por el ao 1100 A.C. (1) El carcter nico del vino de Jerez se debe a diversos factores, entre los que destacan el singular clima, suelo, variedades utilizadas, as como el exclusivo proceso de produccin , en primer lugar se realiza la vendimia o recoleccin de las uvas, esta puede ser manual o mecnica y se realiza entre los meses de Febrero y Abril para la latitud sur, o entre Julio y Octubre si la vid est sembrada en latitud norte, posteriormente se transporta a las uvas o materia prima a la planta donde pasa por un proceso de despalillado donde se le retiran todos los raspones propios de la planta, acto seguido las uvas pasan a ser estrujadas y es as como se obtiene el mosto, este es llevado a un proceso de fermentacin, seguido de tcnicas de filtrado en donde se retira la biomasa que realizo el proceso de fermentacin, posteriormente el liquido obtenido se envejece y se envasa (2). Uno de los pasos claves y principales en la elaboracin de este producto alcohlico es la fermentacin ya que este es el proceso en el cual la glucosa ser fermentada produciendo etanol y CO como productos primarios, por accin de levaduras salvajes o levaduras comerciales cuidadosamente

caracterizadas, las uvas fermentan cuando la piel de los granos se rompe: los azucares contenidos en el interior de los frutos maduros entran entonces en contacto con las levaduras presentes en el hollejo que recubre cada grano y comienza la fermentacin, la inoculacin de dicha levadura depende del criterio del productor y de las caractersticas organolpticas que desee dar a su vino. Como bien deca el etanol y el CO son los productos primarios de la fermentacin por lo tanto no son los nicos productos resultantes de la fermentacin, durante este proceso tambin se generan compuestos como el glicerol, acetaldehdo, cido actico, cido succnico, cido lctico, la acetona, el diacetilo y el 2-3 butanodiol, que tambin son producidos por microorganismos y que pueden tanto darle caractersticas deseables al vino como generar sustancias desagradables, y en algunos casos enfermedades (2). De ah que la practica desarrollada en el laboratorio a lo largo del semestre no solo buscara la produccin de un vino a parte de uvas pasas, sino tambin el determinar sus condiciones microbiolgicas. 1. Materiales y mtodos. 1.1. Materia Prima Se utilizaron 1000 gramos de uvas pasas empacadas y selladas al vacio, uvas verdes deshidratadas. 1.2 Estrujado e inicio de la fermentacin Las uvas se estrujaron con las manos y se colocaron en un recipiente de vidrio transparente en una proporcin de 3/4 partes, se adiciono agua hasta aproximadamente parte, y se realizo

una coloracin de Gram de los microorganismos presentes en la muestra, se obtuvo un inoculo de Saccharomyces cerevisiae al cual se le hizo un recuento y una coloracin y se adiciono al mosto, de manera que por cada mL de jerez hubiera una concentracin de 10 8 clulas (2%). Se adiciono 5 mL de meta bisulfito de sodio al 10% para evitar la contaminacin, se mezclo e incubo durante 4 das. Sin cerrar hermticamente el recipiente. 1.3 Primer Trasiego A los quince das de llevado a cabo el proceso, se filtro a travs de gasa y se volvi a dejar en proceso fermentativo. Se realizo un segundo recuento en cmara de Neubawer con el fin de estimar la poblacin de levaduras presentes. Se adiciono 10 mL de agaragar.

caractersticas microscpicas.

macroscpicas

1.6 Evaluacin de contaminantes Se realizaron controles de calidad e identificacin y determinacin de la cepa de Saccharomyces cerevisiae para el control de calidad se determino si el jerez tenia microorganismos considerados como contaminantes o como causantes de enfermedades en el vino por esto se planteo verificar si haba la existencia de levaduras salvajes Botrytis, Bacterias acticas, Bacterias cido lcticas, para esto se utilizaron los medios Zygosaccharomyces , TennerVetsch modificado , carbonato clcicoetanol y WL adicionado de actidiona. Los cuales fueron sembrados por la tcnica de aislamiento por agotamiento y se envi a incubar. 1.7 Determinacin fsico-quimica Para la determinacin fsico-qumica de jerez se hicieron las siguientes pruebas -Polisacridos/pectinas: Se tomo 1 ml del vino y se aadi 2 ml de etanol al 1%, se dejo en reposo durante 15 minutos. -Azcares reductores: estimacin visual rpida. Esta prueba fue til al finalizar la fermentacin: Se Tomo 2 ml del vino filtrado y coloco en un tubo posteriormente se adiciono una pastilla de Clinitest, se comparo por color con una escala. Prueba del alcoholmetro: Se Introdujo el alcoholmetro limpio y seco, dentro del jerez para efectuar la lectura. Luego se hizo la correccin de temperatura correspondiente para dar un dato veraz

1.4 Evaluacin del crecimiento de la levadura Pasados estos das, se realizo una coloracin de Gram, con el fin de determinar la presencia de la levadura, la cual estaba en gemacin, se cierra muy bien el recipiente y se almacena en un lugar seco. 1.5 Identificacin bioqumica de S. cerevisiae Se monto una batera de nueve bioqumicas con el fin de determinar las
caractersticas de asimilacin y fermentacin de: Lactosa, Fructosa,

Arabinosa, Xilosa, Manitol, Arbutina, Sacarosa, Glucosa, Maltosa, Tolerancia al Etanol al 1% en caldo nutritivo, se siembra en medios de cultivo OGY y rosa de bengala y se observan

1.8 Filtracin y Clarificacin Se realizo una coloracin de Gram para verificar si la levadura haba finalizado el proceso de fermentacin. Luego de 30 das se filtro a travs de gasa y papel filtro, con el fin de purificar y darle el brillo caracterstico al vino. En varios tubos falcn de 50ml, se centrifug la muestra a 7000 RPM por 5 minutos con el fin de retirar slidos suspendidos, clulas muertas y 2. Resultados:

partculas. Una vez terminada esta clarificacin se envaso el producto en una botella oscura. 1.9 Determinacin caractersticas organolpticas Luego de obtener un jerez previamente envasado se degusto y se tomaron en cuenta las diferentes opiniones de los catadores.

A continuacin se muestra detalladamente los resultados de los recuentos, las coloraciones, las identificaciones, viabilidad, y porcentaje de viabilidad llevadas a cabo durante todo el proceso de vinificacin: 2.1 Recuentos y Coloraciones
Prueba Inculo Levaduras Salvajes Da 4 Levaduras Salvajes Y S. cerevisiae Da 15 Da 30 Da 45 Da 60

Coloracin de Gram

Levaduras Levaduras Salvajes Salvajes Y S. cerevisiae Y S. cerevisiae

S. S. cerevisiae cerevisiae

Recuento en cmara de Newbauer

8,5*10E7

3,9*10E7

5*10E7

Tabla 1: Evaluacin en tiempo de levaduras, Coloracin de Gram y Recuento en cmara de Neubawer. 2.2 Identificacin Bioqumica de Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Glucosa Galactosa Ribosa Arabinosa Sacarosa Maltosa Celobiosa Trehalosa

+ + + + +

Lactosa Xilosa Rafinosa + Ramnosa + Tabla 2: Tomada del manual de laboratorio, pruebas bioqumicas reportadas para una cepa de Saccharomyces cerevisiae. Prueba Arabinosa Fructosa Glucosa Lactosa Maltosa Manitol Sacarosa Xilosa Etanol Agar OGY Agar Rosa de Bengala Lectura Negativo Fermentacin positiva Fermentacin positiva Negativo Fermentacin positiva Negativo Fermentacin positiva Asimilacin positiva Positivo Crecimiento de colonias blancas de tamao mediano, superficie lisa brillante. Crecimiento de colonias blancas de tamao mediano, superficie lisa brillante.

Tabla 3: Resultados obtenidos una cepa de Saccharomyces cerevisiae. 2.3 Observacin Microscpica: 2.4 Recuento de viabilidad Fecha Clulas viables Clulas muertas % de viabilidad 31 de Agosto de 2011 394 38 91,2 7 de Septiembre de 44 13 77,2 2011 Tabla 4: Viabilidad de levaduras presentes en el Jerez 2.5 Pruebas fsico-qumicas del Jerez Prueba Pectinas Almidones Azucares reductores Porcentaje de alcohol Lectura Negativo Negativo 250 mg/dl 1%

PRUEBAS DE AISLAMIENTO

RESULTADOS

Aislamiento de Zygosaccharomyces : Agar zigosa Aislamiento de levaduras salvajes: Medio WL

No hubo crecimiento Levaduras cremosas y redondas

Aislamiento de bacterias acido lctico: Tenner-V No hubo crecimiento de bacterias cido lcticas Aislamiento de bacterias acido-acticas: CaCO3 No hubo crecimiento de bacterias acido acticas.

Tabla 5: Resultados de asilamientos para contaminantes 2.6 Contaminantes del jerez 3. DISCUSIN La elaboracin del jerez es uno de los procesos ms llamativos e interesantes para aprender sobre la accin que realizan las levaduras frente a las uvas y transforman este sustrato en un vino exquisito, para esto es necesario llevar a cabo el proceso de fermentacin alcohlica, en donde se transforman los azcares de la uva en etanol, CO2 y otros compuestos qumicos (1). Durante el proceso de elaboracin del jerez, se llev a cabo el estrujado de las uvas con el fin de exponer los azcares presentes en estas y dejarlos disponibles para las levaduras que llevaran a cabo el proceso de fermentacin. Cave aclarar que las uvas pasas estaban con los hollejos y por ello puede contener desde el inicio de la prctica microorganismos, como levaduras salvajes, la presencia de estas puede producir alteraciones al vino (enfermedades del vino). Una diferencia importante entre estos dos tipos de levaduras es su tolerancia al alcohol. La mayora de las levaduras salvajes pueden tolerar un 4% de alcohol y durante el proceso de fabricacin se alcanza esta concentracin, la fermentacin se detiene. En cambio las levaduras de cultivo pueden tolerar un 14% antes de que su crecimiento se detenga completamente. (romano, 2003)(6). Adicionalmente las levaduras salvajes no producen algunos de los compuestos aromticos deseables para el producto final. Por lo tanto para evitar la presencia de este tipo de levaduras durante el proceso, se debi adicionar al mosto metabisulfito de sodio al 10% ya que reaccionan de forma sensible ante la presencia de este. No obstante las uvas con las que se prepar el mosto podran haber contenido tambin, desde el momento de la vendimia, bacterias que pudiesen ocasionarle enfermedades al vino e incluso ocratoxinas, unas toxinas micoticas que son perjudiciales para la salud y seran nocivas para quien pudiese consumir el vino(2).

Inicialmente se determin la presencia de levaduras salvajes, su identificacin se realiz mediante tincin de Gram y se observaron al microscopio levaduras alargadas, posterior a la inoculacin y conforme pasaban los das de la fermentacin, se observ la presencia continua de levaduras salvajes en una proporcin casi igual a Saccharomyces cerevisiae, y luego se presencio ms Saccharomyces cerevisiae y menos levaduras salvajes. Como se observa en los resultados de la Tabla 1 y la imagen 1, las coloraciones de Gram se realizaron durante todo el proceso fermentativo y en todas se observaron caractersticas macroscpicas tpicas de Saccharomyces cerevisiae. Durante la evaluacin del crecimiento de la levadura, las coloraciones de Gram mostraron a S. cerevisiae en su fase reproductiva (asexual) observandose levaduras gemando, indicando su crecimiento exponencial. Los

recuentos en cmara de Newbauer, permitieron estimar la poblacin de levaduras durante el proceso. As se determin con el primer recuento que la concentracin inicial de levaduras se encontraba en concentracin de10e8 cel/ ml de jerez siendo el adecuado para llevar a cabo un proceso fermentativo. A los 15 das la poblacin aument, lo que indica que S. cerevisiae tuvo una fase exponencial buena, pues aument la poblacin a 8,1*10e9 cel/ml, que era lo que se buscaba, producir la suficiente biomasa que fermente los azcares de las uvas. dado esto fueron inoculadas levaduras del tipo S. cerevisiae en el mosto (5% del volumen final en 250ml de caldo saboureaud), ya que pese a que llevan a cabo el proceso de fermentacin, no hacan parte de la flora inicial que se encuentra presente en las uvas (Fleer; 2003).(3)En el ltimo recuento (12 de Octubre-11), a los sesenta das aproximadamente, se estimo una baja concentracin de levaduras por ml de jerez, es decir que la viabilidad a este punto es casi nula, lo que indica que los nutrientes se han comenzado a agotar y la levadura entr en un periodo estacionario donde no hay incremento en el nmero de clulas sino que al contrario empiezan a morir. En cuanto a la identificacin bioqumica de acuerdo con los resultados y comparndolos con literatura, se puede confirmar que el microorganismo inoculado al jerez es Saccharomyces cerevisiae. El proceso de fermentacin se llev a cabo por accin de estas levaduras. Posteriormente, se realiz un aislamiento en agar OGY y Rosa de Bengala, en donde se evidenci crecimiento de colonias blancas de tamao mediano, superficie lisa brillante, caractersticas de una levadura. Las pruebas confirman que la cepa industrial inoculada era correspondiente a S. cerevisiae. Posteriormente al realizar la prctica de contaminantes del jerez se observ que no hubo crecimiento en el medio carbonato de calcio para bacterias cido-acticas, por lo tanto se pudieron descartar enfermedades producidas por estas bacterias, tales como el picado actico que se caracteriza por la produccin de cido actico, acetaldehdo y acetato de etilo lo que aumenta la acidez voltil. Adicionalmente se pudo afirmar que no habra transformacin de glucosa a cido glucnico, ya que estas bacteria no estaban presentes en el vino (4). Por otro lado al ver que tampoco hubo crecimiento de bacterias acido lcticas en el medio Tenner Vetsch modificado, se pudo afirmar que no ocurrira una fermentacin malolctica posterior a la fermentacin alcohlica por lo tanto el vino no sera muy suave, por el contrario conservara el sabor astringente que provee al vino el cido mlico, del mismo modo la acidez total del vino se mantendra igual. No obstante la ausencia de bacterias acido lcticas no es del todo negativa puesto que al no estar presentes se evitara la formacin de aminas biogenas por descarboxilacin de aminocidos. Observando los resultados en el agar WL, se determin la presencia de levaduras
salvajes, debido a que el medio present un cambio de color de azul a verde por la presencia el indicador de pH (verde de bromocresol), lo que indica que la levadura lleva a cabo un proceso de fermentacin y no otro microorganismo. (4)Por otro lado no se evidenci la presencia de Zygosaccharomyces, levaduras salvajes, puesto que en el medio no se observ ningn crecimiento de levaduras salvajes, esto se debe seguramente a que muy seguramente no sean Zygosaccharomyces, sino otro gnero de levaduras salvajes.

A pesar de que el jerez, es apto para el consumo, la presencia de levaduras salvajes como lo indica la tabla 3, demostr que dicha poblacin se mantuvo a lo largo del proceso de elaboracin de este, tal vez por malos procesos de filtracin. Dichas levaduras aparecen al inicio del proceso, ya que vienen en las uvas y pueden ayudar al proceso fermentativo en un comienzo, aunque posteriormente deberan ser desplazados por las levaduras industriales (S.cereviseae)(2). Al no ocurrir dicho proceso, se llev a cabo una repoblacin por dichos microorganismos, tomando los residuos existentes de la transformacin del azcar en alcohol, aunque no se generaron malos olores, ni caractersticas indeseables en el jerez (Mesa y Alegre; 1999).(5) Durante el proceso de elaboracin del jerez, se realizaron dos trasiegos con el fin de separar los slidos precipitados en el fondo del recipiente de vidrio. El primero con un colador, y el segundo con toallitas absorbentes, que por el tamao de sus poros resulta ms eficaz para filtrar slidos mas pequeos, esos detallados trasiegos se realizaron para evitar que se forme una gran capa de slidos en la parte superior e impedir el paso de molculas de oxgeno, pues estos residuos y las uvas al hidratarse flotan creando una capa que cubre la superficie del mosto. Finalizando los trasiegos, se llev a cabo la etapa de clarificacin, para que el jerez adquiera caractersticas fsicas propias como el brillo y el color, esto se logr inicialmente dejandolo quieto durante un tiempo, para obtener una sedimentacin de todos los slidos residuales durante 4 semanas. El proceso de filtracin se realiz para separar sedimentos en los cuales podra presenciarse S.cereviseae tras la clarificacin, para preparar el jerez a la posterior centrifugacin que elimina totalmente la presencia de levaduras presentes, quedando listo este para el consumo y Con el fin de conocer la madurez, reduccin del avinagramiento y mejora del proceso, se realizaron los anlisis fisico-quimicos al jerez, los cuales son de suma de importancia puesto que tambin pueden afectar el rendimiento y las funciones vitales de S. cerevisiae, as como su respiracin, fermentacin y reproduccin. (5) En la prueba realizada para determinar la presencia de pectina en el vino, result negativa, lo cual se evidenci al no observarse alguna formacin de gel despus de algunos minutos del contacto de la pectina con la muestra de jerez. La pectina, un polisacrido compuesto de una cadena lineal de molculas de acido D-galacturnico, las cuales unidas constituyen el cido poligalacturonico (7). La pectina siendo un agente importante en la gelificacin en medio cido y en presencia de azcares, es utilizado con el fin de dar consistenia a los diferente alimentos, sin embargo en la industria vincola no es tan favorable el uso de este componente, pues en ningn caso se desea un vino con agentes gelificantes que le otorguen consistencia, ausencia de pectina en el jerez en importante, puesto que en el caso de que estuviera presente podra generar alcoholes no deseables en el jerez. As mismo la prueba de almidn presento un resultado negativo lo cual significa que el jerez no tena slidos en suspensin. La acidez total esta constituida por todos los cidos valorables de un vino, las cuales se miden en gramos de cido tartrico por litro. Un vino de mesa no debe tener una acidez total inferior a 3,5 g de cido tartrico / litro. (2). Esto significa que el resultado obtenido demuestra una acidez bastante alta, generando probablemente la inhibicin de varios microorganismos pero a su vez evitando la formacin de un sabor inspido y estabilidad mnima.(7)

Para la determinacin de azcares reductores, se adicion una pastilla de clinitest en donde el sulfato de cobre de la pastilla reacciona con los azucares reductores contenidos en el jerez, reduciendo el sulfato cprico a oxido cuproso.(6) El color resultante vara de acuerdo a los azucares reductores presentes, el hidrxido de sodio alcaliniza el medio favoreciendo la reaccin. Durante la reaccin del jerez con la pastilla se produjo color, el cual es proporcionado por la reaccin entre el hidrxido de sodio, el agua y el cido ctrico. El color obtenido tras esta reaccin fue verde oscuro, esto indica que tras el proceso fermentativo que llevo a cabo la levadura en el jerez, existe la presencia de glucosa en una concentracin de 250 mg/dl, la cual no fue transformada a etanol posiblemente por ausencia de S.cereviseae.(7) Finalmente se determin el porcentaje de alcohol del jerez elaborado, midiendo con el alcoholmetro, el porcentaje obtenido fue de 1%, lo que indica que despus del proceso de fermentacin que llevo a cabo S.cerevisiae a partir de los azcares presentes en la uva, la levadura no transform estos azcares a etanol y si lo hizo es probable que haya sido en muy poca concentracin y se haya evaporado.

CONCLUSIONES Despus de todo este proceso de vinificacin se concluye que es un buen proceso para la obtencin de vinos, pero se necesita tomar mas precauciones con cada uno de los pasos para que no se altere ninguna reaccin y conlleve como en este caso a un muy bajo grado de alcohol, tambin se evidencio que la accin de la cepa de Saccharomyces inoculada no fue tan eficiente como se esperaba, ya que se catalogaba como una cepa industrial de alta produccin de etanol.

BIBLIOGRAFA (1) Charles W. Bamforth, Alimentos, fermentacin y microorganismos, Editorial University of California Davis, ACRIBIA S.A, Zaragoza Espaa, 2007 (2) Alfonso V. Carrascosa, Rosario Muoz, Ramn Gonzlez, microbiologa del Vino, AMV Ediciones, Madrid Espaa, 1 edicin 2005. (3) Fleet, G; (2003); Yeast interactions and wine flavor; Journal of food microbiology; pp 86:11-22. (4) Blouini J. Peynaud;E;(2004). Enologa prctica; conocimiento y evaluacin del vino; cuarta edicin; editorial Mundi-Prensa libros; Madrid, Espaa, Pag 23- 25, 37, 50-55. (5) Mesa,J; Alegre, M ; (1999);El papel de los microorganismos en la elaboracin del vino; ciencia y tecnologa de alimentos; vol 2 No 4; pp 174-178. (6) Romano, P; Fiore, C; Paraggio; Caruso, M; Capece, A; (2003). Function of yeast species and straings in wine falvor; international journal of food microbiology; pp 168-180.

(7) Pelamoe,D; Malliard, C, Maisondieo, D, (2003); El vino del analisis a la elaboracin; editorial Acribia, Pag 11-15