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DETERMINAO COLORIMTRICA DE GLUTATIONA E DISSULFETO DE GLUTATIONA EM MICROPLACAS

(MTODO DA RECICLAGEM COM GSSG REDUTASE)
Baseado em Anderson ME Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples. Methods Enzymol 1985; 113: 548-555.

PRINCPIO:
2 GSH + DTNB GSSG + 2 TNB GSSG + H+ + NADPH 2 GSH + NADP+
GSSG redutase

A formao do TNB (cido tionitrobenzico) pode ser monitorada espectrofotometricamente a 412 nm (ou 415 nm, dependendo do equipamento). Na presena da redutase e de NADPH, o GSSG resultante da primeira reao (ou aquele que j estava presente na amostra) reconvertido em GSH que re-oxidado a GSSG formando mais TNB. Como a quantidade de GSSG redutase constante e os demais substratos (como NADPH e DTNB) so adicionados em quantidade saturantes, a velocidade de formao de TNB proporcional quantidade inicial de GSH (e de GSSG) nas amostras. Conforme a reao prossegue, o DNTB (e o NADPH que tambm poderia ser monitorado) vai sendo consumido enquanto que a GSH (e/ou o GSSG) reciclada, ou seja, volta para a primeira reao conforme indicado no esquema acima.

faixa linear
Embora se possa monitorar o NADPH no espectrofotmetro (ou leitora de ELISA) a 340 nm, o coeficiente de absoro deste ( 340nm = 6,22 mM-1.cm-1) no permite uma sensibilidade to boa quanto a conseguida com a monitorao do TNB ( 412nm = 13,6 mM-1.cm-1 e 415nm = 7,351 mM-1.cm-1), no apenas pelo fato de os coeficientes de absoro do TNB a 412 e 415 nm serem maiores mas tambm porque boa parte da intensidade luminosa a 340 nm fica retida no poliestireno das microplacas (o que reduz a sensibilidade do sinal). Caso se deseje monitorar o consumo de NADPH (que tambm diretamente proporcional concentrao inicial de GSH), pode-se utilizar um espectrofluormetro para cubetas (4 faces polidas) ou leitoras de microplacas dotadas de sistema fluorimtrico (e equipadas com placas de cristal de quartzo) utilizando-se 366 nm para excitao e emisso de 400 a 3000 nm com filtros apropriados.

abs

2 As curvas so lineares at 8 nmols de GSH (ou GSSG) por ponto nas condies especificadas. Aps as corridas, os melhores intervalos de tempo iniciais devem ser escolhidos (dentro da faixa de linearidade mostrada na figura acima) para que os softwares calculem as velocidades mximas. Durante as corridas, cada well deve ser monitorado individualmente para que se tenha certeza de que artefatos como sujeiras e precipitados das amostras no venham a provocar alteraes de absorbncia fictcias devidas ao espalhamento de luz. Sujeiras costumam proporcionar rpidos picos de absorbncia que caem fortemente quando a partcula sai da linha do caminho ptico. Normalmente, estas alteraes de absorbncia possuem derivadas extremamente elevadas, incompatveis, portanto, com as inclinaes observadas para outras amostras. O uso de duplicatas ou triplicatas durante as corridas permite que se avalie esse efeito facilmente. Depois das corridas e do exame inicial dos resultados (descrito acima), plotam-se as vrias concentraes de GSH (ou GSSG) contra as velocidades mximas (iniciais) que podem ser dadas em unidades de variao de absorbncia por minuto ( UA/min), miliunidades de absorbncia por minuto ( mUA/min) ou, ainda, podem ser calculadas em termos de nmols de TNB (ou NADPH) respectivamente formados (ou consumidos) por minuto (nmol/min), conforme o grfico abaixo.

Como se trata de uma medida cintica, isto , a concentrao de GSH inicial das amostras est sendo determinada em funo da velocidade da reao de reciclagem de GSH (ou GSSG) com o DTNB, qualquer fator que influencie ou altere a velocidade da reao interferir no resultado da anlise. Por exemplo, alteraes interensaio de temperatura, diferenas na concentrao de GSSG redutase entre uma amostra e outra (devem-se usar os mesmos reagentes para todas as amostras!) e, especialmente, variaes de tempo entre as pipetagens durante e entre ensaios so fatores crticos que comprometem a reprodutibilidade dos resultados. Por isso, tomamos muito cuidado em definir como as amostras so pipetadas, razo pela qual os ensaios esto divididos em duas partes, conforme a maneira de se pipetar a redutase (que o ponto temporal crtico). Aps os ensaios, utilizar para os clculos a expresso abaixo, tendo em vista que, na determinao da GSHTOTAL, o GSSG medido duas vezes (uma, pelo que h de GSSG nas amostras e outra pela converso do GSH presente em GSSG):

[GSH] = GSH Total 2 [GSSG]

PREPARAO DAS AMOSTRAS:

Soluo de homogeneizao: cido meta-fosfrico (MPA) a 5% (m/v) = 5 g de MPA em 100 mL de gua. Quando abrir o frasco de MPA (slido) pela primeira vez, preparar todo o contedo de uma s vez e guardar a soluo pronta em geladeira. Para facilitar a manipulao, podem ser preparadas solues de MPA 10X mais concentradas, isto , MPA a 50% (50 g/100 mL) que deve ser conservada em geladeira e diluda 1:10 com gua no da utilizao. Preparao de clulas isoladas: lavar as clulas (aderidas ou em suspenso) com PBS gelado pelo menos duas vezes. Depois de secas, romper as clulas diretamente em MPA 5% = cerca de 150-200 L de MPA para 107108 clulas; de 50-100 L de MPA para populaes de 106107 clulas. Se for encontrada dificuldade para a lise celular, possvel utilizar-se volumes equivalentes de HCl diludo (10 mM) para romper as clulas e, em seguida, adicionar-se o MPA para uma concentrao final de 5%. Apesar de o MPA ser o cido de escolha para a maioria dos ensaios de GSH (lembrar que GSH sofre auto-oxidao para GSSG em pH acima de 6,0!), pode-se utilizar tambm o cido sulfosaliclico a 10% (m/v). A homogeneizao feita com a prpria ponteira das micropipetas (aspirando e devolvendo as clulas para os tubos at formar-se um homogenato leitoso). A seguir, centrifugar as amostras em microcentrfuga (de preferncia a 4C) por 5 min na velocidade mxima (cerca de 15.000 x g) e utilizar os sobrenadantes. Preparao de tecidos: extrair e congelar imediatamente os tecidos com auxlio de freeze-clamp (em nitrognio lquido ou gelo seco). Depois de pesados, homogeneizar os tecidos diretamente em MPA 5% razo de 5-10 mL/g de tecido. Pequenas quantidades de tecidos podem ser homogeneizadas base de 1 mL/100 mg. Os pesos devem ser anotados (exatamente), enquanto que os volumes podem ser aproximados (desde que sejam exatamente conhecidos). Por exemplo, para um tecido de 1,23 g, o correto seria utilizar-se 6,15 mL de MPA, para trabalharmos na faixa de 5 partes de MPA para 1 de tecido. Entretanto, 6,15 mL difcil de ser medido e, se voc tentar, vai incorrer em erro desnecessrio. Ento, pese os 1,23 g de tecido e ANOTE. Depois, mea 5 mL com uma pipeta de vidro e homogeneize (se houver uma pipeta de 5 mL expandida ou pipetas de 10 mL disponveis, voc poder usar 6 mL). Depois da homogeneizao, centrifugue as amostras por 5 min a 4C em microcentrfuga (15.000 x g) e colete o sobrenadante para as determinaes. Papas de hemcias: quando estiver trabalhando com papas de hemcias (o que resta do sangue depois que voc centrifuga e retira o plasma ou o soro), talvez seja necessrio utilizar uma quantidade maior de MPA porque os eritrcitos apresentam altas concentraes de GSH. Para tanto, colete um volume conhecido de sangue (por exemplo, 1 mL) e separe o plasma heparinizado (ou soro). Misture a papa de hemcias obtida (cerca de 0,5 mL no caso) com 5 volumes de MPA (2,5 mL). Depois, faa uma diluio em srie se for necessrio. Embora haja variao conforme os protocolos experimentais utilizados, na maioria dos casos diluir 1:8 diretamente com MPA funciona bem. Isto , para cada 0,5 mL de papa de hemcias, adicione 4 mL de MPA e homogeneize. Centrifugue as amostras por 5 min a 4C em microcentrfuga (15.000 x g) e colete o sobrenadante para as determinaes. Plasma: embora as concentraes de GSH plasmticas sejam relativamente baixas (cerca de 25 vezes menos que no fgado, ou 3 vezes menos que no bao), possvel determinar-se as quantidades de GSH e GSSG em amostras plasmticas homogeneizando-se o plasma diretamente em MPA razo de 1-5 mL MPA por mL de plasma. Depois, centrifugue as amostras por 5 min a 4C em microcentrfuga (15.000 x g) e colete o sobrenadante para as determinaes.

Preparao das amostras para GSSG

(Akerboom & Sies, 1981) Como o ensaio por reciclagem de GSH transforma GSH em GSSG (pela ao do DTNB), todo o GSSG das amostras reciclado a GSH no segundo passo (via GSSG redutase, na presena de NADPH). Ento, para a determinao das quantidades iniciais de GSSG nas amostras, torna-se necessrio eliminar toda a GSH das mesmas sem, no entanto, oxid-las a GSSG (o que daria um falso resultado a maior). Para tanto, as amostras so tratadas com N-etilmaleimida (NEM) que se conjuga com GSH sem oxid-la. O problema que a reao de conjugao s ocorre em pH 6,0. Contudo, a GSH facilmente oxidada nestes valores de pH (por essa razo, inclusive, as amostras so extradas em meio cido, MPA 5%). Ento, alm do NEM, prepara-se uma soluo fortemente tamponante em pH 6,0 (Pipes) contendo o agente neutralizador (KOH). Note-se que a ordem em que as amostras so misturadas com os reagentes faz toda a diferena nos resultados: primeiro adiciona-se o NEM s amostras contendo GSH+GSSG contidas em tubos Eppendorf de 1,5 mL. Em seguida, inclinam-se, cuidadosamente, os tubos Eppendorf (um a um) at um ngulo de aproximadamente 45. Desta forma, as amostras estaro no fundo do tubo enquanto que uma gota de Pipes/KOH adicionada na parte central da

4 parede do tubo. Fecha-se o Eppendorf e agitam-se as amostras imediatamente num duplo-passo em que, ao mesmo tempo em que se fecham os tubos, levam-se os mesmos para serem agitados em vrtex j ligado. A rapidez fundamental porque, se houver alcalinizao de um pequeno microambiente em torno da gota de Pipes/KOH (que uma mistura muito alcalina), haver transformao de GSH em GSSG. Na seqncia, o excesso de NEM deve ser extrado com solvente orgnico (acetato de etila) para evitar que reaja com as novas molculas de GSH que so formadas durante o ensaio de reciclagem com a GSSG redutase. Finalmente, o excesso de solvente (que inibe o ensaio da redutase) deve ser removido por secagem em corrente de nitrognio ou SpeedVac (concentrador centrfugo). A auto-oxidao deve ser monitorada medindo-se a quantidade de GSSG formada quando se adicionam quantidades conhecidas de GSH a amostras (ou padres) de GSSG em experimentos prvios de padronizao. Cada experimentador deve preparar seus experimentos de padronizao pois a velocidade com que se neutralizam as amostras para o processamento do GSSG varia muito de uma pessoa para outra. Reagentes e materiais: NEM (MW 125,1) 0,2 M = 740,6 mg/30 mL etanol absoluto guardar em geladeira Pipes (MW 302.4) 0,3 M = 9,07 g/100 mL de KOH 2,0 M KOH (FW 56.11) 2,0 M = 11,22 g/100 mL de gua Misturar o Pipes na soluo 2 M de KOH para obter-se o Pipes/KOH. Acetato de etila Nitrognio gasoso ou concentrador centrfugo Procedimento: 150 100 50 10 L amostra + L amostra + L amostra + L amostra + 50 35 17 3,4 L NEM + L NEM + L NEM + L NEM + 30 20 10 2 L Pipes/KOH L Pipes/KOH L pipes/KOH L Pipes/KOH ou ou ou

- Depois de tudo misturado, as amostras devem ser extradas 3X com volumes de 500 L (cada) de acetato de etila. - Secar o excesso de acetato de etila em SpeedVac por cerca de 5 min. conveniente secar-se tudo e rediluir com o mesmo volume inicial de amostra de GSSG (10, 50, 100 ou 150 L) utilizando-se MPA a 5%. - As amostras esto prontas para a determinao de GSSG e podem ser congeladas at o uso.

1. Ensaio para repetidor 10 L - Determinao a 415 nm

REAGENTES: Tampo fosfato de sdio 143 mM pH 7,5: Preparar individualmente - Na2HPO4 anidro (FW 142) = 2,031 g/100 mL de gua ou Na2HPO4.7H2O (FW 268,1) = 3,834 g /100 mL e - NaH2PO4 anidro (FW 120) = 1,716 g/100 mL de gua ou NaH2PO4.1 H2O(FW 137,99) = 1,973 g/100 mL Depois, misturar as duas solues 143 mM at pH = 7,5

5 Tampo de Ensaio (TE) = EDTA 6,3mM em Tampo fosfato de Sdio 143 mM

- Depois de acertar o pH do Tampo Fosfato, adicionar 234,6mg de EDTA (sal dissdico, FW 372,24) para cada 100 mL de Tampo Fosfato pH 7,5. DTNB concentrao final em cubetas de 1cm seria 1,6 mM x 1,4 (100 L/70 L) x 3,3 (1cm/ 0,3 cm leitora) x 1,85 (razo 412nm/415nm ) = 1.6mM x 8,8 vezes = 14.1mM sendo que a concentrao final no ensaio ser 9,87mM. Portanto, preparar (MW 396.4) = 5,59 mg por mL de TE. NADPH (MW 833.4) final 0,17 mM como vamos usar: 10 L/100 L finais preparar 1,7 mM = 1,42 mg/ml NaHCO3 0,5% NaHCO3 0,5% = 5 mg NaHCO3/1 mL H2O GSSG redutase = final 0,5U* (a 25C)/mL pipetada com repetidor de 10 L Como vamos diluir 10 L/100 L finais (1:10) = preparar suspenso a 5 U/mL Utilizando Enzima Sigma G4751 = 3571 U/mL diluir 1:714 = 2 L/1,43 mL finais com TE. Utilizando Enzima Calbiochem 1320 U/mL (a 37C) = 317.7 U/mL (a 25C) diluir 1:63 = 10 L/630 L finais com TE. * O padro para as unidades sempre a 25C para efeito de clculos mesmo que voc tenha aferido a atividade do lote de redutase a 37C, como manda a definio atual.

CURVAS (s para 415 nm repetidor de 10 L): GSH 1mg/mL em MPA 5% = 3,254 mM diluir 1: 4 com MPA = 813,5 M GSSH 1mg/mL em MPA 5% = 1,632 mM diluir 1: 2 com MPA = 816,0 M Efetuar diluies em srie com MPA a 5% Diluio 75 L + 25 MPA 0 3/4 1:1 1/2 1:1 1/4 1/8 1:1 1:1 1/16 ZERO = MPA 5% GSH = nmol/mL) 813.5 610.1 406.8 203.4 101.7 50.8 (0) ( M nmols em 10 L GSSG ( M = nmol/mL) nmols em 10 L 8.14 6.10 4.07 2.03 1.02 0.51 (0) 816.0 612.0 408.0 204.0 102.0 51.0 (0) 8.16 6.12 4.08 2.04 1.02 0.51 (0)

ENSAIO
(Referncia = Blank = TE)
- 10 L amostra em MPA 5% (em gelo) - 70 L DTNB (banho-maria 37C) - agitar - 10 L NADPH (temperatura ambiente) - agitar - monitorar a 415 nm a 37C at estabilizar a leitura - START com 10 L de GSSG redutase - agitar e ler por cerca de 4 minutos

6 - volume final = volume adicionado a B (blanks) = 100 L ou - 10 L amostra em MPA 5% (em gelo) - 75 L DTNB (temperatura ambiente ou banho-maria 37C) - agitar - 10 L NADPH (temperatura ambiente) - agitar - monitorar a 415 nm a 37C at estabilizar a leitura - START com 10 L de GSSG redutase - agitar e ler por cerca de 4 minutos - volume final = volume adicionado a B (blanks) = 105 L Com a incubadora ligada (a 37C), correr as amostras e as curvas simultaneamente com o seguinte programa: 415nm total # 1 leitura 13 s - 5s mix # 30 leituras 10 s - sem agitao entre cada leitura No final, plotar: nmols de GSH (ou GSSG) contra miliunidades de Abs/min (ou nmols/min)

Clculos:
Fornecendo os valores das concentraes da curva ao software, os valores de abs/min ou mUA/min sero convertidos automaticamente para M ou para nmols em 10 L, dependendo de como voc deu a entrada de dados. Se a sua amostra for de plasma, sangue, papa de hemcias ou outros fluidos, conveniente entrar com os dados da curva em M; assim, no final s multiplicar pelas diluies (ou deixar que o software multiplique pela diluio das amostras) e o resultado est pronto direto. Para papa de hemcias, expresse os resultados em termos do volume original de sangue de onde partiu a papa homogeneizada. Se a sua amostra proveniente de material slido, como pellet de clulas ou tecidos (homogenatos de msculos etc.), melhor voc entrar com os dados da curva em nmols por 10 L. Ao final, os resultados sero dados pelo software em termos de nmols por 10 L. Como sua amostra inicial no era uma soluo, mas sim um material slido, faa a seguinte operao: converta os nmols por 10 L ensaiados para nmols por mL de homogenato (multiplicando por 100). Depois, multiplique pela diluio efetuada nas amostras para o ensaio (se no houve diluio, use o fator = 1; observe que o software tem entrada para esta informao, ou seja, se quiser, voc pode receber os resultados calculados j com a diluio descontada; caso contrrio, faa voc mesmo a multiplicao do resultado em nmols/mL x diluio da amostra). Aps a compensao das diluies e conhecendo-se os valores em nmols/mL, multiplique este resultado pelo volume de MPA utilizado na homogeneizao para obter a massa de GSHTOTAL ou GSSG nas amostras e, por fim, divida esse resultado pelo nmero de clulas, pelos miligramas de protena, pelos gramas ou miligramas de tecido de partida (a massa de material que foi homogeneizada com o volume correspondente de MPA). Assim, o resultado fica: nmols de GSHTOTAL (ou GSSG) = (nmols/10 L) x 100 x diluio x volume de MPA/massa de amostra Observe que tecidos moles e clulas apresentam uma grande quantidade de gua (cerca de 70-80%). Portanto, um resultado mais correto sempre obtido quando se leva em considerao esse fato. Para compensar a quantidade de gua contida nas amostras, voc precisa saber primeiro a proporo exata. Depois, no lugar de volume de MPA, voc vai colocar volume de MPA+ (P x massa de material de partida), onde P = porcentagem de gua. Por exemplo, se voc pesou 1 g de bao e homogeneizou o mesmo em 5 mL de MPA, na verdade, voc homogeneizou 1 g de peso fresco de bao em 5 mL + cerca de 0,80 x 1 g 5 mL + 0,8 mL = 5,8 mL de fluido que diluiu a sua amostra de GSH ou GSSG. Veja que 0,8 mL em 5,0 mL representam 16% de erro. Entretanto, essa informao deve ser usada com cuidado sempre que houver situaes que alterem a quantidade de gua nos tecidos (edema ps-estresse, inflamao etc.). Por isso, bastante aceitvel utilizar-se, como uma boa aproximao, apenas a massa do tecido (ou quantidade de clulas ou miligrama de protena) e o volume utilizado em sua homogeneizao.

7 No se esquea tambm de que, para saber as concentraes de GSH reais nas amostras, necessrio efetuar a operao: [GSH] = GSHTOTAL 2 [GSSG]. Veja que GSHTOTAL no a concentrao de nenhuma entidade biolgica. Trata-se de um valor fictcio obtido experimentalmente em termos de equivalentes de glutationa .

2. Para pipeta multicanal 25 L - Determinao a 412 ou 415 nm

REAGENTES: Tampo fosfato de sdio 143 mM pH 7,5: Preparar individualmente - Na2HPO4 (FW 142) = 2,031 g/100 mL de gua ou Na2HPO4.7H2O (FW 268,1) = 3,834 g /100 mL e - NaH2PO4 (FW 120) = 1,716 g/100 mL de gua ou NaH2PO4.1 H2O(FW 137,99) = 1,973 g/100 mL Depois, misturar as duas solues 143 mM at pH = 7,5 Tampo de Ensaio (TE) = EDTA 6,3mM em Tampo fosfato de Sdio 143 mM - Depois de acertar o pH do Tampo Fosfato, adicionar 234,6mg de EDTA (sal dissdico, FW 372,24) para cada 100 mL de Tampo Fosfato pH 7,5. DTNB (FW = 396.4) a concentrao final em cubetas de 1cm seria: 1,6 mM x 2,2 (=110 L/50 L de volume final/volume inicial) x 3,3 (=1cm/0,3 cm leitora) x 1,85 (razo 412 nm/ 415 nm = 13,43 x) = 21,49mM Portanto, para leituras a 415 = usar DTNB 21,5 mM 8.52 mg/mL TE conc. final no well = 9.77mM a 412 = usar DTNB 11,6 mM 4.60 mg/mL TE conc. final no well = 5.28mM -NADPH (MW 833.4) concentrao final no well = 0,17 mM. Como vamos usar 25 L/110 L finais (o NADPH ser diludo 1:4,4), devemos preparar uma soluo 4,4 x mais concentrada (= 0.748 mM) = 1,25 mg NADPH em 2 mL de NaHCO3 0,5% (5 mg de NaHCO3 por mL em gua). GSSG redutase = 0,5 U*/mL final. Como vamos utilizar 25 L/110 L ( = 1:4,4 x), devemos preparar uma suspenso a 2,20 U/mL (pipetada com pipeta multicanal de 25 L)

Utilizando Enzima Sigma G4751 = 3571 U/mL diluir 1:1600 = 2 L/3,2mL finais com TE. Utilizando Enzima Calbiochem 1320 U/mL (a 37C) = 317.7 U/mL (a 25C) diluir 1:150 = 4 L/600 L finais com TE. * O padro para as unidades sempre a 25C para efeito de clculos mesmo que voc tenha aferido a atividade do lote de redutase a 37C, como manda a definio atual. CURVAS (s para 412/415 nm pipeta multicanal de 25 L): GSH 1mg/ml MPA 5% = 3,25mM diluir 1:8 com MPA = 406,8 M GSSG 1mg/ml MPA 5% = 1,632mM diluir 1:4 com MPA = 408,03 M Efetuar diluies em srie com MPA a 5%:

Diluio 75 L + 25 MPA 0 3/4 1:1 1/2 1:1 1/4 1/8 1:1 1:1 1/16 ZERO = MPA 5%

GSH = nmol/mL) 406,8 305,1 203,4 101,7 50,85 25,43 (0)

( M nmols em 25 LGSSG ( M = nmol/mL) nmols 25 L 10,17 408,03 7,63 306,0 5,09 204,0 2,54 102,0 1,27 51,0 0,64 25,5 (0) (0)

em 10,2 7,65 5,1 2,55 1,28 0,64 (0)

Obs.: Ateno com esta curva pois, dependendo da rapidez com que a reao for executada, os pontos de diluio 0 e podem cair numa faixa no linear. Caso isso acontea, despreze os pontos ou proceda mais rapidamente com o ensaio (se possvel). Note que esta curva diferente da utilizada na medida a 415 nm com repetidor de 10 L.

ENSAIO
(Referncia = Blank = TE)
- 10 L amostra em MPA 5% (em gelo) - 50 L DTNB banho-maria 37C - agitar - 25 L NADPH temperatura ambiente - agitar - monitorar a 412 (ou 415) nm a 37C at estabilizar a leitura - START com 25 L de GSSG redutase - agitar e ler por cerca de 4 minutos - volume final = volume adicionado a B (blanks) = 110 L Com a incubadora ligada (a 37C), correr as amostras e as curvas simultaneamente com o seguinte programa: 412 nm (ou 415 nm) total # 1 leitura 13 s - 5s mix # 30 leituras 10 s - sem agitao entre cada leitura No final, plotar: nmols de GSH (ou GSSG) contra miliunidades de Abs/min (ou nmols/min)

Clculos:
Fornecendo os valores das concentraes da curva ao software, os valores de abs/min ou mUA/min sero convertidos automaticamente para M ou para nmols em 10 L, dependendo de como voc deu a entrada de dados. Se a sua amostra for de plasma, sangue, papa de hemcias ou outros fluidos, conveniente entrar com os dados da curva em M; assim, no final s multiplicar pelas diluies (ou deixar que o software multiplique pela diluio das amostras) e o resultado est pronto direto. Para papa de hemcias, expresse os resultados em termos do volume original de sangue de onde partiu a papa homogeneizada. Se a sua amostra proveniente de material slido, como pellet de clulas ou tecidos (homogenatos de msculos etc.), melhor voc entrar com os dados da curva em nmols por 10 L. Ao final, os resultados sero dados pelo software em termos de nmols por 10 L. Como sua amostra inicial no era uma soluo, mas sim um material slido, faa a seguinte operao: converta os nmols por 10 L ensaiados para nmols por mL de homogenato (multiplicando por 100). Depois, multiplique pela diluio efetuada nas amostras para o ensaio (se no houve diluio, use o fator = 1; observe que o software tem entrada para esta informao, ou seja, se quiser, voc pode receber os resultados calculados j com a diluio descontada; caso contrrio, faa voc mesmo a multiplicao do resultado em nmols/mL x diluio da amostra). Aps a compensao das diluies e conhecendo-se os valores em nmols/mL, multiplique este resultado pelo volume de MPA utilizado na homogeneizao para obter a massa de GSHTOTAL ou GSSG nas amostras e, por fim,

9 divida esse resultado pelo nmero de clulas, pelos miligramas de protena, pelos gramas ou miligramas de tecido de partida (a massa de material que foi homogeneizada com o volume correspondente de MPA). Assim, o resultado fica: nmols de GSHTOTAL (ou GSSG) = (nmols/10 L) x 100 x diluio x volume de MPA/massa de amostra Observe que tecidos moles e clulas apresentam uma grande quantidade de gua (cerca de 70-80%). Portanto, um resultado mais correto sempre obtido quando se leva em considerao esse fato. Para compensar a quantidade de gua contida nas amostras, voc precisa saber primeiro a proporo exata. Depois, no lugar de volume de MPA, voc vai colocar volume de MPA+ (P x massa de material de partida), onde P = porcentagem de gua. Por exemplo, se voc pesou 1 g de bao e homogeneizou o mesmo em 5 mL de MPA, na verdade, voc homogeneizou 1 g de peso fresco de bao em 5 mL + cerca de 0,80 x 1 g 5 mL + 0,8 mL = 5,8 mL de fluido que diluiu a sua amostra de GSH ou GSSG. Veja que 0,8 mL em 5,0 mL representam 16% de erro. Entretanto, essa informao deve ser usada com cuidado sempre que houver situaes que alterem a quantidade de gua nos tecidos (edema ps-estresse, inflamao etc.). Por isso, bastante aceitvel utilizar-se, como uma boa aproximao, apenas a massa do tecido (ou quantidade de clulas ou miligrama de protena) e o volume utilizado em sua homogeneizao. No se esquea tambm de que, para saber as concentraes de GSH reais nas amostras, necessrio efetuar a operao: [GSH] = GSHTOTAL 2 [GSSG]. Veja que GSHTOTAL no a concentrao de nenhuma entidade biolgica. Trata-se de um valor fictcio obtido experimentalmente em termos de equivalentes de glutationa .

OBSERVAES IMPORTANTES
Correr sempre curvas em paralelo com as amostras! No convm trabalhar com as microplacas totalmente preenchidas se no houver sistema robotizado de pipetagem automtica da placa toda. Se as pipetagens forem manuais (mesmo usando repetidores e pipetas multicanais) o tempo entre a pipetagem das curvas e da ltima amostra pode ser to grande que as reaes iniciais podem j se encontrar em plat quando as microplacas forem levadas leitora de ELISA.

Texto a ser usado na seo de Materiais e Mtodos dos manuscritos

MEASUREMENT OF GSH, GSH DISULFIDE (GSSG), AND ACTIVITIES OF KEY-ENZYMES OF GSH METABOLISM. Mesenteric lymph node lymphocytes and TW256 cells (107 cells for both cell types) were prepared and assayed for GSH and GSSG contents as well as for the measurement of the activities of total GSH S-transferases (GST, EC 2.5.1.18) and -glutamylcysteine synthetase ( -GCS, EC 6.3.2.2) as described in Kolberg et al. (2005). For GSH and GSSG measurements, cells were rinsed twice with PBS and disrupted in 200 l of 5% (w/v) metaphosphoric acid (MPA) on ice. After centrifugation (16,000 x g, 2 min at room temperature), cell lysates were spectrophotometrically (415 nm) assayed on a microplate reader (Bio-Rad temperature-controlled Benchmark reader) by modification of the 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) [DTNB, Sigma]/GSSG reductase (Sigma) recycling method1, using the N-ethylmaleimide (NEM, Fluka) conjugating technique for GSSG sample preparation2. Samples (10 l), for both GSH and GSSG determinations, were assayed in 105- l final volume in 96-well polystyrene plates (Corning) at 37C in the presence of 10 mM DTNB, 0.17 mM -NADPH (Sigma, dissolved in 0.5% (w/v) NaHCO3 as a stabilizing agent) and 0.5 U/ml GSSG reductase (EC 1.6.4.2, Sigma). The activity of the key-enzymes of GSH metabolism, GST and -GCS, were also spectrophotometrically assessed (in 96-well microplates) in the 16000 x g (30 min, 4C)-supernatant fraction of cells extracts (from approx 107 cells) obtained after cell sonication 1 ml of specific extraction buffers as described, respectively, in ref. 3 and 4. Protein concentration was determined by the Bradfords method5 using fraction V bovine serum albumin (Sigma) as standard. Referncias originais:

10 1. Anderson ME Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples. Methods Enzymol 1985; 113: 548-555. 2. Akerboom TPM, Sies H. Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples. Methods Enzymol 1981; 77: 373-382. 3. Mannervik B, Gluthenberg C. Glutathione transferase. Methods Enzymol 1981; 77: 231-235. 4. Seelig JF, Meister A. Glutathione biosynthesis; gamma-glutamylcysteine synthetase from rat kidney. Methods Enzymol 1985; 113: 379-390. 5. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72: 248-254. Por favor, ao publicar o trabalho, cite a seguinte referncia: Angela Kolberg, Tatiana Gomes Rosa, Minia Tase Puhl, Gustavo Scola, Daiane da Rocha Janner, Alexandre Maslinkiewicz, Denise Jacques Lagranha, Thiago Gomes Heck, Rui Curi, and Paulo Ivo Homem de Bittencourt Jr. (2005) Low expression of MRP1/GS-X pump ATPase in lymphocytes of Walker 256 tumour-bearing rats is associated with cyclopentenone prostaglandin accumulation and cancer immunodeficiency. Cell Biochemistry and Function (no prelo).

VALORES DE REFERNCIA
(Akerboom & Sies, 1981)

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