ESCOLA SENAI HORCIO AUGUSTO DA SILVEIRA

TCNICO DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
Prof. rica Helena dos Santos

CRESCIMENTO E CULTIVO MICROBIANO

Crescimento microbiano
Crescimento microbiano usualmente caracterizado pelo tempo requerido para duplicar massa celular ou nmero de clulas. Crescimento de Bactrias por diviso simples :

Crescimento de Levedura normalmente por brotamento:

Crescimento de mofos:

Os mofos caracteristicamente crescem por alongar e/ou ramificar, formando um miclio.

No laboratrio de anlise:

O microbilogo utiliza tcnicas especficas para estudar os microrganismos.

Isolamento e Cultivo de Culturas Puras

Uma populao microbiana, sob condies naturais, contm muitas espcies diferentes.
Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os microrganismos em uma amostra, para ento classific-los e caracteriz-los.

Isolamento e Cultivo de Culturas Puras

Os microrganismos na natureza normalmente existem em cultura mistas, com muitas espcies diferentes ocupando o mesmo ambiente.
Ao determinar as caractersticas de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura, ou seja, em que todas as clulas na populao so idnticas no sentido de que elas se originaram de uma mesma clula parental.

Meios de cultura

Em laboratrio, os microrganismos so cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura.

O tipo de meio utilizado depende de vrios fatores: consideraes sobre a origem do material a ser analisado;
a espcie que se imagina estar presente nesta amostra; as necessidades nutricionais dos organismos.

Meios de cultura

Devemos sempre considerar:

1. 2. 3.

Estado fsico dos meios de cultura Lquido Slido Semi-slido

Meios de cultura
Devemos sempre considerar: Composio qumica dos meios de cultura Meios sintticos Meios complexos

1. 2.

Meios de cultura
Devemos sempre considerar: Classificao funcional dos meios de cultura Meio seletivo Meio diferencial Meio de enriquecimento

1. 2.

3.

Meios de cultura

Tcnicas de isolamento de microrganismos

Tcnica 1: Meio lquido

Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. Mergulhe a ala carregada de bactrias no tubo com o meio de cultivo e agite a ala (fig.3)

Figura 3: Semeadura em meio lquido

Tcnicas de isolamento de microrganismos

Tcnica 2: Meio semi-slido

Mergulhe a Agulha de nquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe fornecida. Faa uma injeo com a agulha carregada com bactrias no meio de cultivo semi-slido (fig. 4).

Figura 4: Semeadura em meio semi-slido

Tcnicas de isolamento de microrganismos

Tcnica 3: Meio slido (gar inclinado)

Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. Encoste levemente a ala na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfcie do agar (fig. 5)

Figura 5: Semeadura em meio slido

Tcnicas de isolamento de microrganismos

Tcnica 4: Esgotamento por meio de estrias superficiais

A amostra semeada na superfcie do meio solidificado com uma ala de semeadura para esgotar a populao, assim em algumas regies do meio, clulas individuais estaro presentes (fig. 6).

Figura 6: Esgotamento com estrias feitas com ala

Tcnicas de isolamento de microrganismos

Tcnica 5: Semeadura em superfcie

Uma gota da amostra diluda colocada na superfcie do gar e com o auxlio de uma ala de semeadura de vidro (ala de Drigalsky) esta gota espalhada sobre o meio (fig. 7).

Figura 7: Semeadura em superfcie

Tcnicas de isolamento de microrganismos

Tcnica 6: Mtodo de pour-plate

A amostra diluda em tubos contendo meios liquefeitos (45o C). Aps homogeneizao so distribudos em placas de Petri; e aps a solidificao dos meios as placas so incubadas. As colnias se desenvolvero tanto acima quanto abaixo da superfcie (internas), (fig. 8).

Tcnicas de isolamento de microrganismos

Tcnica 6: Mtodo de pour-plate

Figura 8: Diluio seriada e plaqueamento

Conservao de culturas puras

Para armazenar por um perodo curto, as culturas podem ser mantidas temperatura de refrigerao (4 a 10 oC). Para armazenar por um perodo longo, as culturas so mantidas em nitrognio lquido (196 oC) ou em freezers (-70 a -120 oC), ou ainda congeladas, e ento desidratadas e fechadas vcuo em um processo denominado liofilizao.

Conservao de culturas puras

Alguns dos mais usados mtodos de conservao: transferncia peridica para meios novos; sob camada de leo mineral; liofilizao; congelamento.

Preparo dos microrganismos para a microscopia luminosa

Tcnica entre lmina e lamnula e gota pendente
Tcnicas de Colorao

Tcnica entre lmina e lamnula e gota pendente utiliza uma suspenso de microrganismos vivos em uma gota ou uma camada lquida.

Figura 9: tcnicas de esfregao

possvel ainda a realizao de contagem de clulas com preparaes a fresco utilizando-se uma placa especial com estrias

Figura 10: Contagem de clulas em hemacitmetro

Tcnicas de Colorao a camada fina do espcime seca e corada, assim os microrganismos ficam fixados superfcie e apresentam-se corados para facilitar a visualizao.

As principais etapas do preparo de um espcime microbiano corado para exame microscpico so: 1. Confeccionar um esfregao, ou uma camada fina do espcime sobre uma lmina de vidro; 2. Fixar o esfregao seco lmina, usualmente com o calor, para fazer aderir o microrganismo lmina; 3. Colorao com um ou mais corantes .

Tcnicas de colorao

Colorao Simples - a colorao de microrganismo

com uma nica soluo de corante; ex: azul de metileno para leveduras, ou bolores.

Colorao diferencial - envolve mais de uma soluo

de corante; ex: colorao de lcool-cido para bactria causadora da tuberculose; distingue esta bactria patognicica, por meio da cor (vermelho, pelo corante principal), de outras bactrias (azul, pelo corante do fundo) encontradas em amostras como saliva e escarro.

Tcnicas de colorao

Colorao de Gram - neste processo, o esfregao

bacteriano tratado com os reagentes na seguinte ordem:

1. o corante prpura cristal violeta,

2. a soluo de iodo (substncia que fixa o corante no interior da clula),

3. o lcool (remove o corante de certas bactrias) e 4. o corante vermelho safranina (fig. 11).

Tcnicas de colorao

Colorao de Gram Bactrias Gram-positivas, retm o corante cristal violeta e aparecem coradas em violeta-escuro. Bactrias Gram-negativas, perdem o cristal violeta quando tratadas com lcool, so ento coradas com o corante safranina e aparecem coradas em vermelho.

Tcnicas de colorao

Colorao de Gram

Informaes utilizadas para Caracterizar os Microrganismos Caractersticas Morfolgicas - tamanho, forma e arranjo das clulas; Caractersticas Metablicas - maneira pela qual o microrganismo desenvolve os processos vitais; Caractersticas Antignicas - os anticorpos produzidos em animais de laboratrios podem ser usados para detectar a presena de antgenos nicos em culturas bacterianas e so usados para caracterizar os microrganismos;

Caractersticas Patognicas - importante determinar se o microrganismo causa doena (patognico) ou no causa doena (no-patognico);

Informaes utilizadas para Caracterizar os Microrganismos Caractersticas Genticas - a maioria dos microbiologistas conta atualmente com tcnicas que permitem realizar anlises genticas para classificar ou identificar os microrganismos ou compreender a sua atividade.

A sonda de DNA um exemplo de procedimento gentico rpido e amplamente utilizado - uma fita de DNA de uma espcie conhecida misturada com uma fita de uma espcie desconhecida.
Se os microrganismos so da mesma espcie, as duas fitas se combinaro, ou se ligaro. Esta combinao aparece como uma fita dupla de DNA com um marcador ligado.

Questes 1. Qual a curva caracterstica do crescimento de bactrias num sistema descontnuo? 2. O que so meios de cultura? 3. Como podem ser classificados os meios de cultura? 4. Em qual situao o meio de cultura complexo deve ser utilizado? 5. Como possvel verificar o crescimento de uma bactria produtora de cido num cultivo microbiano? 6. Quando necessrio a realizao da diluio seriada? Explique como realizada.