Prctica 3

TCNICAS DE TINCIN DIFERENCIAL COLORACIN DE GRAM

Fundamentacin: La tincin de Gram es la ms empleada en bacteriologa, es una tincin diferencial. Por este mtodo se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram positivos (+) y Gram negativos (-), en funcin de su reaccin frente a la coloracin. Las Gram negativas se tien de color azul violeta y las Gram negativas de un color rosa. Objetivo: Distinguir las caractersticas morfolgicas macroscpicas y microscpicas para la identificacin de microorganismos a travs de la tincin de Gram. Materiales: *Soporte de tincin. (2 varillas de vidrio) *4 goteros o pipetas. *5 frotis. *Vaso de precipitado. *Microscopio 140x y 100x. Preparacin de reactivos: Cristal Violeta Solucin A: Cristal violeta ----------- 2g. Etanol --------------------- 20 ml. Solucin B: Oxalato de amonio -------------------- .8g. H2O destilada ---------------------------- 80 ml. Reactivos: *Cristal violeta. *Yodo lugol. *Safranina. *Alcohol Cetona.

Preparar las soluciones por separado y despus mezclar. Safranina Safranina (polvo) ---------- 1g. Glicerina ---------------------- 30 ml. H2O destilada --------------- 100 ml. Alcohol Cetona Alcohol etlico -------------- 70 ml. Cetona ----------------------- 30 ml. Yodo lugol Yodo -------------------------- 1g. Yoduro de potasio ------- 2g. H2O destilada -------------- 100 ml. Disolver el yodo y el yoduro de potasio en H2O destilada, calentar suavemente si es necesario.

Desarrollo: 1. Se toma una gota de agua y se agrega al frotis. 2. Se abre el agar con sangre, este debe estar cerca del mechero para que las bacterias no se propaguen. 3. Se toma una porcin del cultivo de bacterias y se pone en el portaobjetos sobre la gota de agua y se mezcla. 4. Se flamea el frotis para que la muestra quede fijada, se etiqueta. 5. Se repite el procedimiento con cada uno de los medios de cultivo. 6. Ya que estn fijados los frotis, stos se colocan sobre el soporte para tinciones. 7. Se cubre toda la superficie del frotis con cristal violeta por 1 min. 8. Lavar suavemente con agua de la llave. 9. Cubrir con yodo lugol todo el frotis, se deja actuar por 1 min. Lavar de la misma manera. 10. Cubrir con alcohol cetona (50% - 50%) y dejar 30 seg. moviendo suavemente la laminilla, hasta que no se arrastre ms colorante. 11. Lavar con agua. 12. Se cubre completamente el frotis con safranina por 1 min. Lavar y secar. 13. Observar por inmersin. Las bacterias Gram + se vern de color azul violeta y las Gram rosadas. 14. Repetir este procedimiento con cada uno de los frotis ya fijados. Observaciones: Agar tubo inclinado: se observaron bacilos Gram negativos, estos tenan un color rojo. Agar sangre: en este se pudieron observar estreptococos gran negativos de un color rosado casi rojo. Agar verde brillante: se pudo observar que eran cocos Gram positivos, estos se tieron de un color azul violeta.

Se le agrega una gota de agua al frotis

Se le agrega la colonia y se frota

Se flamea el frotis para su fijacin

5 frotis ya fijados listos para su tincin

Alcohol cetona

Cristal violeta

Soporte de tincin

Se colocan los frotis sobre el soporte de tincin

Se le agrega cristal violeta hasta cubrir por completo el frotis

Se lava con agua de la llave

Se le agrega yodo lugol

Se lava con agua de la llave

Se le cubre con alcohol cetona y se mueve suavemente por 30 seg.

Se lava con agua

Se le cubri el frotis completamente con safranina

Se lava con agua

Agar tubo inclinado bacilos Gram color rojo

Agar verde brillante cocos Gram + color azul violeta

Agar sangre cocos Gram color rosado casi rojo

Conclusiones: Con esta prctica podemos concluir que los Gram negativos efectivamente se tien de color rosado casi rojo y los Gram positivos color azul violeta. Aprendimos la tcnica para fijar un frotis y la manera de usar la tcnica de Gram de manera efectiva.

Cuestionario 1. Describa algunas de las caractersticas morfolgicas coloniales de bacteria en medio slido. Los organismos individuales presentan alguna de las tres formas generales siguientes: Cocos (elipsoidales o esfricos): se pueden presentar en pares (diplococos), en cadenas (estreptococos), en racimos (estafilococos), de cuatro (ttradas) y con formas geomtricas (sarcinas). Bacilos o bastones (cilndrica o en forma de bastn): se presentan de dos (diplobacilos), en cadenas (estreptobacilos) y empalizados (empalizado). Espirilos (espiral o helicoidal): se presentan en general como clulas individuales, independientes; pero las clulas de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, nmero y amplitud de las espiras y rigidez de la pared. Varias espiras (espiroquetas), dos espiras (comas o vibrios). 2. Indique tipos de colonias obtenidas. Se obtuvieron colonias de cocos Gram y Gram + y de bacilos Gram -. 3. Piensas que obtuviste un solo tipo bacteriano? No Por qu? Porque los medios de cultivo usados fueron diferentes y adems al no haber esterilizado los materiales pudieron haberse contaminado los cultivos con otras bacterias. 4. Por qu es necesario efectuar coloraciones para observar bacterias? Para poder observar y clasificar las bacterias de acuerdo a su coloracin. 5. Cmo clasificaras la coloracin de Gram? Como la ms importantes y usadas de todas las coloraciones diferenciales que existen. 6. Cul es la etapa crucial de esta coloracin? Cuando no se tien bien las bacterias, o cuando la muestra no se ha fijado bien y la muestra se cae al momento de lavar. 7. Cul es la coloracin de las bacterias Gram positivas? Las bacterias se vern de un color azul violeta. 8. Por qu se fija con calor el frotis? La fijacin tiene por objetivo matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la clula y adherir la preparacin al portaobjeto. Las clulas se lavan si no estn fijadas, durante el proceso de tincin.