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La cromatografia liquida ad alta prestazione (in inglese High Performance Liquid Chromatography) o cromatografia liquida ad alta pressione (High

Pressure Liquid Chromatography), pi semplicemente nota con l'acronimo inglese HPLC un tipo di cromatografia liquida.Si tratta di una tecnica cromatografica che permette di separare due o pi composti presenti in un solvente sfruttando l'equilibrio di affinit tra una "fase stazionaria" posta all'interno della colonna cromatografica e una "fase mobile" che fluisce attraverso essa. Una sostanza pi affine alla fase stazionaria rispetto alla fase mobile impiega un tempo maggiore a percorrere la colonna cromatografica (tempo di ritenzione), rispetto ad una sostanza con bassa affinit per la fase stazionaria ed alta per la fase mobile.Il campione da analizzare iniettato all'inizio della colonna cromatografica dove "spinto" attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile applicando pressioni dell'ordine delle centinaia di atmosfere. Per ottenere un'elevata efficienza nella separazione necessario che le dimensioni delle particelle del riempimento siano molto ridotte (di solito hanno diametri compresi da 3 a 10 m), per questo motivo indispensabile applicare un'elevata pressione se si vuole mantenere una ragionevole velocit di flusso dell'eluente e quindi un tempo di analisi adeguato.Alla fine della colonna applicato un rilevatore (IR, UV-VIS, spettrofluorimetrico, spettrometro di massa) e un calcolatore che permettono una analisi in continuo dell'uscita della colonna e quindi di poter quantificare e/o identificare le sostanze iniettate.I vantaggi principali di questa tecnica sono: la dimensione ridotta della colonna che evita problemi di deviazioni longitudinali (movimenti della fase mobile longitudinali) e di percorsi alternativi; velocit di eluizione (passaggio della fase mobile attraverso la colonna) costante e regolabile; velocit di esecuzione ridotta; piccole quantit di composto necessaria all'analisi (nell'ordine dei 5-10 microgrammi di campione solubilizzato in apposito solvente) tutto a favore di una maggiore accuratezza e precisione.Lo svantaggio principale degli apparecchi per HPLC il costo molto pi elevato rispetto ad una cromatografia su colonna tradizionale (circa 20-30 000 euro per uno strumento completo dalle medie prestazioni), anche se non possibile paragonare le due metodiche poich presentano campi di applicazione diversi.

La cromatografia liquido-solido o di adsorbimento o a fase normale (acronimo: NP-HPLC) basata sull'interazione tra i siti attivi dell'adsorbente solido (generalmente silice) con i gruppi funzionalipresenti nelle molecole del soluto da separare. I soluti si legano in maniera reversibile alla fase stazionaria mediante interazioni dipolo-dipolo o interazioni dipolo-dipolo indotto. Questo tipo di interazioni il risultato di un complesso fenomeno competitivo tra le molecole della fase mobile e del soluto per i siti attivi della fase stazionaria.La fase stazionaria generalmente composta da microparticelle di gel di silice di forma irregolare o tendenzialmente sferica delle dimensioni di 3-10 m, i cui centri attivi sono rappresentati dai gruppi silanolici (-OH). Oltre al gel di silice si possono utilizzare come fase stazionaria l'allumina, la poliammide, o l'acetato di cellulosa. Le fasi mobili generalmente impiegate sono miscele di pentano, esanocloruro di metilene, ed etere etilico.

La cromatografia a scambio ionico, o semplicemente cromatografia ionica (IC), il tipo di cromatografia che si basa sul principio di attrazione tra gli ioni di carica opposta. Molti composti organici, come ad esempio gli amminoacidi, possono avere parti della molecola polarifavorendo quindi la loro separazione tramite questo metodo. La carica netta che questi composti presentano dipende dal loro pKa e dal pH dellasoluzione. Molto importante anche il ruolo della determinazione della concentrazione dei cationi e anioni nell'ambito dell'analisi delle acque.La cromatografia a scambio ionico permette di separare molto semplicemente gli ioni. molto utile per la purificazione di campioni analitici poich, ad esempio, si potrebbe aver bisogno di analizzare un anione in una matrice di cationi. Come le altre metodiche cromatografiche poi inoltre in grado di
[1] effettuare determinazioni quali-quantitative. Nella cromatografia a scambio ionico la fase stazionaria costituita da mac romolecole contenenti dei siti attivi ionizzati, in cui i controioni possono essere scambiati con altri

aventi carica uguale, eluiti con la fase mobile. Si instaura cos una sorta di competizione fra i controioni della fase stazionaria e quelli della miscela in fase di separazione, nei confronti dei siti attivi ionizzati della fase stazionaria. Durante la separazione gli ioni presenti nella fase mobile vengono separati gli uni dagli altri in base alla diversa affinit per ciascuno dei siti ionizzati della fase stazionaria.

Come nella normale cromatografia, si ha una colonna c romatografica impaccata con uno speciale tipo di resina, in grado di scambiare ioni. Esistono due tipi di resine: scambiatrici anioniche e scambiatrici cationiche. Queste ultime possiedono gruppi carichi negativamente e attraggono, quindi, molecole cariche positivamente, viceversa la prima. Esempio classico di gruppo in grado di scambiare cationi -SO3- , mentre un tipico gruppo che scambia anioni il gruppo -NH4 . Molto importante, ai fini di determinare l'intensit dell'interazione fase fissa-analita, il rapporto carica/massa: utilizzando infatti il modello elettrostatico possibile spiegare i diversi tempi di ritenzione, essendo le specie ioniche aventi maggior rapporto carica/massa quelle a essere maggiormente trattenute (ad esempio Na+ esce prima rispetto a Fe 3+ e lo stesso Fe3+ segue Fe2+).Molti scambiatori ionici sono costituiti da polimeri di stirene e di divinilbenzene (polistirene). Il polistirene essendo un polimero lineare solubile in numerosi solventi. Condensando invece stirene con divinilbenzene si ottengono polimeri con legami crociati e quindi insolubili: pi alto il numero di legami crociati maggiore sar la capacit di trattenere composti ad alto peso molecolare. Alla lunga queste colonne devono essere rigenerate e di solito si usano sali in grado di creare composti pi stabili con gli ioni in colonna, in modo da rigenerare la resina (di solito si usa cloruro di sodio concentrato). Altre colonne, meno pregiate, utilizzano invece la silice opportunamente modificata chimicamente.
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Si parla di cromatografia di ripartizione, quando la fase stazionaria un liquido che impregna un solido granulare inerte, in cui le sostanze da separare si solubilizzano. Durante l'eluizione le molecole delle sostanze si dispongono (ripartiscono) dinamicamente tra le due fasi a seconda della loro affinit in esse. Scontato ma importante, le fasi (stazionaria e mobile) devono essere immiscibili fra loro.Le due tecniche che ad oggi sfruttano il principio della ripartizione sono la gascromatografia e la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC).Il fenomeno della ripartizione viene sfruttato per la separazione in colonna degli analiti, che a seconda delle caratteristiche chimico fisiche si legheranno pi o meno stabilmente alla fase stazionaria e quindi avranno diverso tempo di ritenzione. modifica

Gli analiti che attraversano la colonna, trasportati dal gas o dal solvente devono essere "catturati" dal materiale di riempimento che costituisce la fase stazionaria. Un tempo le fasi stazionarie erano costituite da materiali organici specifici. Al giorno d'oggi le fasi stazionarie sono costituite da un solido inerte al quale viene fissato stabilmente un liquido organico specifico, che costituisce la "vera" fase nella quale avviene la ripartizione degli analiti. Questa tecnica si dimostrata negli anni molto efficace, s ia per la possibilit di preparare fasi stazionarie molto specifiche sia per la semplice rigenerazione delle colonne.

Il gas o il solvente che trasporta l'eluito passa nella colonna (che nel caso del gascromatografia pu raggiungere lunghezze di 60 m, essendo opportunamente avvolta a spirale) mette in contatto gli analiti con la fase stazionaria, nella quale a seconda delle caratteristiche chimico fisiche (affinit, polarit, peso molecolare) si scioglier pi o meno bene.

La concentrazione di una sostanza ripartita tra due diverse fasi liquide obbedisce alla legge di Nernst, che stabilisce che il rapporto tra le concentrazioni del soluto nelle due fasi a contatto fra loro una costante a temperatura costante per un dato soluto:

Gli analiti che hanno peggiore affinit saranno i primi ad abbandonare la colonna e quindi raggiungere il rivelatore. Man mano che procede l'analisi si pu intervenire sulle condizioni per modificare la ripartizione.

La cromatografia di esclusione molecolare un processo di analisi che si utilizza per separare sostanze organiche aventi elevati pesi molecolari, soprattutto proteine e macromolecole.

Il concetto che sta alla base di questa separazione molto semplice: la "fase fissa" un supporto inerte costruito appositamente con pori di dimensioni controllate. La "fase mobile" un solvente organico o acquoso ed eluisce i soluti attraverso la colonna cromatografica.I soluti con un volume maggiore dei pori della fase fissa (ovvero con un peso molecolare molto elevato) usciranno dalla colonna con il fronte del solvente, i soluti che invece hanno dimensioni minori rispetto al diametro e alla superficie dei pori saranno trattenuti dalla colonna per un tempo proporzionale al peso molecolare del soluto stesso.