Reaccin en cadena de la polimerasa

Gel de agarosa teido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad. La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

Fundamento e importancia
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. La reaccin en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California SA, en la dcada de 1980. Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de desnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer correccin de errores (Pfu, Vent). Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin (ver ms abajo). Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensacin sobre los tubos de

reaccin. Los termocicladores ms antiguos que carecan de este sistema, solucionaban el problema de la condensacin con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reaccin o con un poco de cera dentro de los tubos. Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico de enfermedades infecciosas.

Reactivos
Para realizar la tcnica se necesitan:2
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y y y y y

Los 4 desoxirribonuclesidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN. Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), oligonucletidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos, normalmente de 18 a 22, que permiten que la polimerasa inicie la reaccin. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucletidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar. Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin divalente. Tambin se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la sntesis de ADN. Actan como cofactores de la polimerasa. Iones monovalentes, como el potasio. Una solucin tampn (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70 C (la ms comn es la polimerasa Taq). ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar. Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Ciclo de amplificacin
Grado de amplificacin segn el nmero de ciclos empleados. A: gel de agarosa (1: ladder, 2: producto especfico, 3: producto inespecfico); B concentracin de ADN respecto del tiempo; C logaritmo de la concentracin de ADN respecto del tiempo.

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensin de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parmetros. stos incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y de los dNTP en la reaccin, y la temperatura de unin de los cebadores, as como la longitud del ADN que se desea amplificar.2

Inicio
Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C ( 98 C si se est usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor.

Desnaturalizacin
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (9495 C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la hebra, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin.

Alineamiento o unin del cebador

A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada.

Extensin o elongacin de la cadena

Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en direccin 3' 5', uniendo el grupo 5'fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende tanto de la ADN polimerasa usada

como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto.

Elongacin final
Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

Conservacin
Este paso se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo. La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.3 El/los tamaos de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

Optimizacin de la PCR
En la prctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:
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La PCR es una tcnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mnima cantidad de ADN para obtener un gran nmero de copias, as que puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificacin de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). La contaminacin con ADN extraos puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen espacialmente distintas etapas, y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realizacin de una PCR y la siguiente. Por ejemplo, en laboratorios de deteccin gentica, se suele hacer una divisin para la preparacin de la muestra por un lado (donde se cierran los tubos) y otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR. Disponen tambin de cabinas de seguridad biolgica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades, y la leja, las lmparas de UV y psoralenos son tambin muy recurridos para esta limpieza extensiva

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Las tcnicas de diseo de cebadores son importantes en la mejora de la obtencin de productos de PCR y en evitar la formacin de productos falsos. Algunas consideraciones al disear estos cebadores son: o Cada cebador debe integrar entre 18 y 24 bases. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy especfica, y los que se excedan en longitud harn que perdamos rendimiento en la reaccin. o La proporcin entre bases pricas y pirimidnicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 2 bases pricas. o Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre s, o se formarn dmeros entre ellos. Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que ms se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma ms eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Los componentes del tampn de reaccin debern ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas. El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecern termocicladores elaborados con materiales que hagan ms eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, adems de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicacin ser clave.

Tipos de PCR
PCR anidada
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy especfica.

PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad de amplificar especficamente una poblacin de secuencias de menor representacin.

PCR mltiplex
PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en un nico tubo con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una nica reaccin todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultneamente, junto con el resto de

los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la informacin de varios loci en una sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida construccin de base de datos.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera:
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1er paso: retrotranscripcin a partir del ARN. 2 paso: aplificacin a partir de la primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estndar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)

Artculo principal: PCR en tiempo real Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de su temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting temperature). Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en las tcnicas basadas en sondas especficas. En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la que usa sondas especficas. Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda est intacta, presenta una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen. La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la introduccin de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresin de la amplificacin en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulacin del ADN al final de un nmero predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificacin usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad

de ADN formada. El proceso se puede automatizar fcilmente usando un sistema que realice la amplificacin (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayora pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados.

Variaciones de la PCR bsica

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PCR especfica de alelo: esta tcnica de diagnstico o clonacin es usada para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs). PCR "assembly": consiste en la sntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para ello la PCR en un fondo de oligonucletidos largos con secuencias solapantes cortas. PCR asimtrica: es usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con respecto a la otra. PCR de colonia: mediante esta tcnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser rpidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN. Amplificacin dependiente de helicasa: esta tcnica es muy parecida a la PCR convencional, pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de desnaturalizacinextensin. PCR hot-start: esta tcnica reduce la amplificacin inespecfica durante las etapas iniciales de la PCR. PCR especfica de intersecuencia (ISSR): se trata de un mtodo de PCR para su uso en huella gentica, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella gentica nica de longitudes de fragmento amplificadas.

PCR inversa: es un mtodo usado para poder realizar la PCR cuando slo es conocida una secuencia interna. Muy til en la identificacin de secuencias que flanquean insertos genmicos. PCR mediada por ligacin: este mtodo usa pequeos linkers de ADN ligados al ADN de inters y mltiples cebadores hibridando estos linkers. PCR especfica de metilacin (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN genmico. Amplificacin Mltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con un nico par de cebadores, evitando as las limitaciones de resolucin de la PCR multiplex. PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR (preferentemente en tiempo real). PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimtrico es usada para aislar una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida. PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede existir alguna base desapareada en el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no especfico bajando gradualmente la temperatura de hibridacin a lo largo del progreso de la PCR. PAN-AC: este mtodo usa condiciones isotermas para la amplificacin, y puede ser usado en clulas vivas.

Aplicaciones
La tcnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia bsica, como herramienta de deteccin y/o generacin de acervos de fragmentos de ADN de inters; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en s mismo, por ejemplo en diagnstico clnico.