EVALUACIN DE FLUJO Y VARIABILIDAD GENTICA DE LA RANA RUB (Dendrobates bombetes) EN LAS RESERVAS DE YOTOCO (VALLE DEL CAUCA, COLOMBIA)

Y BREMEN (QUINDIO, COLOMBIA)

PROPONENTE: JUAN CAMILO MARTNEZ BARGUIL EST. INGENIERA QUMICA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

PARA: GRUPO DE APOYO FONDO NACIONAL AMBIENTAL FONAM GRUPO DE APOYO EL DEPARTAMENTO ADMINISTRATIVO DE CIENCIA TECNOLOGA E INNOVACIN COLCIENCIAS

JUNIO 2010

Tabla De Contenido
1. Planteamiento del problema 2. Justificacin 3. Objetivos 3.1. Objetivo general 3.2. Objetivos especficos 4. Marco terico 4.1 La familia Dendrobatidae 4.2 Dendrobates bombetes 4.2.1 Sinnimos 4.2.2 Descripcin 4.2.3 Clasificacin taxonmica 4.2.4 Distribucin geogrfica 4.2.5 Reproduccin 4.3 Marcadores moleculares y Microsatlites 4.4 Diversidad Genotpica 5. Metodologa 5.1 Marcadores moleculares 5.2 Localidad y rea de muestreo 5.3 Descripcin de muestreo 5.4 Anlisis Morfomtrico 5.4.1 datos morfomtricas 5.4.2 Anlisis de datos Morfomtrico 5.5 Estudio gentico 5.5.1 Anlisis de laboratorio 5.5.2 Extraccin de ADN 5.5.3 Anlisis de datos genticos 6. Cronograma de actividades 7. Presupuesto 7.1 Fuentes de financiacin 7.2 Valor total del proyecto 7.3 Rubros financiados 7.4 Detalles de rubros 7.4.1 Gastos de personal 7.4.2 Compra de equipos 7.4.3 Materiales y suministros 7.4.4 Salidas de campo 7.4.5 Uso de equipos y laboratorio 8. Bibliografa 9. Resultados Esperados

1. Planteamiento del problema

Los anfibios hacen parte de un eslabn fundamental en la cadena trfica puesto que estos se alimentan de un sin nmero de insectos y a su vez sirven de alimentos a muchos animales, pero en los ltimos aos se est presentando una reduccin o extincin de un sinnmero de especies lo cual es considerado una especie de bioindicador que busca alertar que algo no est bien (Fernndez 2007). Como es natural, el hombre hace caso omiso a estas advertencias por lo cual el problema ha seguido aumentando tanto que el ritmo de desaparicin de especies de anfibios es cada vez mayor. En la Lista Roja de Especies Amenazadas, editada por la Unin Internacional para la Conservacin de la Naturaleza (UICN), se seala que, de las 5.743 de especies conocidas, un tercio est en peligro de extincin. En los ltimos 25 aos, los cientficos creen que al menos 122 especies han desaparecido (UICN 2006, Fernndez 2007). Colombia es un pas rico en mucha diversidad y alberga una gran cantidad de especies de anfibios de las cuales muchos se encuentran en peligro y necesitan ser protegidas para su conservacin. La especie Dendrobates bombetes (conocida tambin como rana venenosa del Valle), vive en parches de bosque conservado, entre 1300 y 2000 m sobre el nivel del mar en la Cordillera Central (Reserva Natural de Bremen:) y Cordillera Occidental (Reserva Natural del Yotoco) de Colombia. Adems de esta distribucin de montaa, se informa que esta se ha encontrado tambin en el lado Pacfico de la Cordillera Occidental, en una zona muy rida conocida como Can del Dagua (Surez 2002). Esta llamativa y hermosa especie de rana endmica, est clasificada en estado vulnerable (VU) (Rueda 1998), aunque segn otra fuente ms actual esta en peligro (EN) (IUCN 2010), esto se debe posiblemente al aumento de la actividad agrcola y ganadera, adems del alto trafico de estas puesto que son muy apetecidas como mascotas. Para el caso de la reserva de Yotoc, la carretera de trfico pesado, probablemente est aislando poblaciones de D. bombetes Esta afectacin podra ocasionar que los individuos de estas poblaciones deban recurrir a la endogamia, lo cual a su vez puede disminuir la variabilidad gentica de la especie. Cabe resaltar que esta rana a diferencia de la mayora de los anfibios no se reproduce masivamente, puesto que solo pone un nico huevo en cada ciclo de apareamiento (Prez 2006) Esta informacin puede ser un punto clave a tener en cuenta al momento de realizar estudios que buscan la conservacin de especies amenazadas. En el presente proyecto, se quiere evaluar el grado de variabilidad gentica de las poblaciones de D. bombetes presentes en la reserva de Yotoc. Adems, debido a las afectaciones ambientales a que est sometida esta especie, se quiere determinar el nivel de estructuracin gentica de sus poblaciones. La informacin obtenida a partir de esta investigacin, podra servir como una estrategia de manejo para Dendrobates bombetes, y a su vez, como informacin de base para futuras investigaciones con esta y otras especies que hacen parte de la biodiversidad Colombiana.

2. Justificacin
El uso actual de la biodiversidad en Colombia es una actividad de la que se derivan beneficios alimentarios, econmicos, sociales y culturales principalmente en zonas rurales del pas. Es as como la lnea de Saberes Locales y Uso de la Biodiversidad del Instituto Humboldt, realiza sus investigaciones con miras a caracterizar el uso y manejo de los recursos de la biodiversidad, en diferentes regiones del pas. De este modo, se espera contribuir con la investigacin al diseo de estrategias de manejo que contribuyan a la promocin de sistemas de manejo sostenibles de la fauna, flora y otros recursos silvestres como mecanismos para mejorar la calidad de vida de las comunidades locales, incrementar el conocimiento asociado a los recursos y buscar nuevas oportunidades de manejo y conservacin de la biodiversidad. En este contexto, surge la necesidad de replantear los esquemas de conservacin de la biodiversidad partiendo de la base segn la cual las comunidades locales pueden y deben ser responsables del manejo de los recursos silvestres, de los cuales han dependido y han desarrollado tcnicas de uso y manejo que aun siendo tradicionales, deben ser valoradas, no solo con el fin de garantizar su propia subsistencia, sino como una estrategia de conservacin de la biodiversidad. Como se ha visto en los ltimos tiempos, un plan conservacionista en algunos casos, es menos efectivo en trminos de servicios a las comunidades locales, incluso cuando se trata de mantener especies objeto de uso. Para esto el Instituto Humboldt ha comenzado por hacer caracterizaciones de Uso de Biodiversidad con el fin de indagar acerca de intereses que tienen las comunidades en cuanto a la implantacin de alternativas productivas basadas en el uso sostenible de productos silvestres, enfocndose en usos, espacios de uso y usuarios.(Angel y Vieira 2004) Por otro lado Los venenos animales y vegetales son y seguirn siendo una fuente de sustancias de aplicacin teraputica en humanos; esto se observa en algunos miembros de la familia de anuros venenosos Dendrobatidae, los cuales secretan a travs de la piel alcaloides txicos. Dicha toxicidad particular ha permitido que estos componentes aislados en los extractos de piel, se destaquen en la actualidad como sustancias importantes para el tratamiento del dolor en enfermedades como el cncer, entre otras, y cuyo poder es comparable al de la morfina, con propiedades analgsicas mucho ms intensas y al parecer no adictivas (Celis 2005) Las ranas del genero Dendrobates entre las cuales est D. bombetes, son una fuente alternativa para mejorar la calidad de vida humana, adems de ser unas excelentes controladoras de plagas pues se alimentan de un sin nmero de insectos, por lo que vale la pena buscar la conservacin de las especies en peligro, claro est toda especie por intil que parezca desempea un papel importante en la naturaleza, por lo que merece ser protegida.

3. Objetivos

3.1 Objetivo General

Evaluar los niveles de estructuracin (flujo gentico) y Variabilidad gentica de la especie Dendrobates bombetes entre las Poblaciones establecidas en las reservas del Yotoc y la reserva del Bremen, adems de verificar estos mismos datos entre las subpoblaciones establecidas dentro de la reserva natural del Yotoc.

3.2 Objetivos especficos:

Determinar la variabilidad gentica de D. bombetes utilizando marcadores moleculares (microsatlites). Establecer los niveles de estructuracin existentes entre las distintas poblaciones estudiadas de D. bombetes. Evaluar la morfometra de los individuos colectados con respecto al tamao y los patrones de coloracin.

4. Marco terico

4.1

La familia Dendrobatidae

En Colombia existen cinco gneros de los nueve conocidos a nivel mundial para la familia Dendrobatidae, exclusiva de Sur y Centroamrica. Los dendrobtidos son ranas pequeas cuya longitud rostro-cloacal puede variar desde menos de un centmetro a cinco centmetros; adems, la mayora de las hembras son de mayor tamao que el macho, aspecto asociado con la reproduccin, pues muestran un amplexus o abrazo sexual, durante el cual el macho, sobre la zona dorsal de la hembra hace presin en la parte lateral del abdomen para llevar a cabo la fecundacin externa (Myers & Daly, 1983), de acuerdo con esto, muchos machos se relacionan con altos niveles de territorialidad e inversin de tiempo y energa durante el periodo reproductivo. Son ranas de hbitos diurnos, y se caracterizan por poseer dos escudos dermales en el extremo distal de los dedos y por el comportamiento de cargar renacuajos en la espalda como parte del cuidado parental. Muchas especies excretan por su piel venenos alcaloides que les sirven como defensa en contra de depredadores. Las especies ms txicas tambin se caracterizan por tener una coloracin vistosa (aposemtica) que sirve de advertencia a predadores. Al parecer, los alcaloides los obtienen de hormigas y otros insectos consumidos como parte de su dieta (Ron 2009). Se reconocen diferentes patrones de coloracin tanto intra como interespecficos, pues esta familia de hbitos diurnos, incluye tanto especies aposemticas aparentemente relacionadas con niveles de toxicidad (Dendrobates, Phyllobates y algunas Epipedobates) como crpticas (Colostethus) (Santos, et al 2003) Los gneros venenosos poseen sistemas muy eficientes para acumular selectivamente en la piel una variedad de alcaloides mediante la alimentacin, sin embargo, los individuos en condiciones de cautiverio pierden su toxicidad al igual que su progenie (Daly et al, 1997).

4.2 Dendrobates bombetes

4.2.1 Sinnimos: Dendrobates bombetes (Myer & Daly, 1980), Rana Rub (Perz 2006), Cauca poison Frog (Ramrez et al 2004), Minyobates bombetes (Myers, 1987), Ranitomeya bombetes (Grant et al 2006),
Minyobates bourdonnant (Ostrowski 2010)

4.2.2 Descripcin:
Son ranas muy pequeas, que por lo general alcanza entre los 16-20 mm de longitud. Carecen de histrioni cotoxinas. No poseen dientes ni membranas pediales interdigitales (Perz 2006). Cromticamente varan mucho, El color de fondo varia del negro al marron oscuro con dos franjas dorsolaterales de color rojo o anaranjado que comienzan por encima de la boca y que llegan a la mitad del cuerpo, a veces en toda la espalda. La parte superior de las extremidades delanteras son del mismo color que

las franjas, el resto y las extremidades traseras suelen ser marrn-rojizo o verdoso, la zona ventral es de color blanco-grisceo con un moteado negro, verde plido, azul plido (Schwarz et al 2009). Sus larvas tiene el disco oral indentado, con un espacio medial en el labio inferior y 2/3 hileras de dentculos queratinizados.(Perz 2006)

4.2.3 Clasificacin taxonmica:

Reino:Animalia >> Phylum: Chordata >> Clase: Amphibia >> Orden: Anura >> Familia: Dendrobatidae >> Gnero: Dendrobates >> Especie: Dendrobates bombetes (Prez 2006).

4.2.4 Distribucin geogrfica La especie Dendrobates bombetes vive en parches de bosque conservado, entre 1300 y 2000 m sobre el nivel del mar en la Cordillera Central (Reserva Natural de Bremen:) y Cordillera Occidental (Reserva Natural del Yotoco) de Colombia. Adems de esta distribucin de montaa, se informa que esta se ha encontrado tambin en el lado Pacfico de la Cordillera Occidental, en una zona muy rida conocida como Can del Dagua (Surez 2002). 4.2.5 Reproduccin La especie es capaz de reproducirse durante todo el ao. Tras un cortejo elaborado en el que el macho gua a la hembra al sitio de postura (siempre en sitios hmedos) se produce un apareamiento sin amplexo y la hembra deposita un nico huevo en ausencia de macho; el huevo no es custodiado permanentemente por sus padres. Los huevos eclosionan al cabo de 22 das y las larvas son recogidos por su padre para ser transportadas a los tanques de agua que se forman en las axilas de las hojas de las bromelias. La metamorfosis se completa al cabo de 140 das aproximadamente (Surez 2002).

4.3 Marcadores moleculares y Microsatlites

Los marcadores moleculares son secuencias polimrficas de protenas o de ADN que pueden ser utilizadas como indicadoras de la variacin gentica y nos pueden ayudar a responder preguntas en ecologa que son difciles de resolver de otra manera. Son fragmentos del genoma generalmente muy pequeos, que son tratados como loci, aunque no codifiquen para protenas. El nivel de polimorfismo puede variar entre cero y cientos de alelos en una especie. La gran ventaja que tienen es que la variacin en los marcadores puede ser cuantificada, lo que permite utilizar la estadstica para hacer comparaciones. Hay distintos tipos de marcadores, cada uno con ventajas e inconvenientes (alozimas, RFLP, RAPD, minisatlites, microsatlites), pero en los ltimos aos los microsatlites se han hecho muy populares para resolver muchos aspectos de la ecologa molecular (Gonzlez, 2003; Beebee & Rowe, 2004). Un buen marcador molecular debe reunir una serie de caractersticas para maximizar su utilidad: buena distribucin a lo largo del genoma, alto grado de polimorfismo, la tcnica para analizar el

marcador debe ser rpida y prctica, y debe poder repetirse con fiabilidad en otros laboratorios (Aranguren et al 2001). Los marcadores microsatlites o Secuencias Simples Repetidas (SSRs) son regiones del genoma en las que una secuencia corta, se repite un cierto nmero de veces. Cada locus microsatlite tiene alelos con distinto nmero de repeticiones, lo cual se evidencia en bandas de distinto tamao luego de su amplificacin por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Estos marcadores se heredan de manera codominante, permitiendo diferenciar bandas en individuos homocigotos y heterocigotos (Zhang, 2004). Los microsatlites presentan altas tasas de mutacin, lo que permite diferenciar individuos estrechamente emparentados (Zhang, 2004). Esta alta variabilidad gentica es muy til para describir la estructura y flujo gentico en poblaciones de insectos (Espinoza et al 2007). Los marcadores microsatlites son segmentos cortos de ADN de 1 a 6 pares de bases (pb), los cuales se repiten en tndem y de forma aleatoria en el genoma de los seres vivos (figura 1). Una de las ventajas de estos marcadores versus otros (minisatlites, RFLP, RAPD, etc.) radica en que estn considerados, por la mayora de autores como la ms poderosa herramienta para los estudios de gentica de poblaciones (Cheng y Crittenden,1994), ya que son muy polimrficos, presentan herencia mendeliana simple, son codominantes (pudindose diferenciar los individuos homocigotos de los heterocigotos), son fciles de medir y analizar, y son cien por cien fiables, repetitivos y automatizables (Aranguren et al 2001)

Desde el desarrollo de la PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa) por Mullis y col. (1986), que consiste en la amplificacin o reproduccin in vitro de grandes cantidades de una regin particular del ADN, a partir de una pequea cantidad original de ADN (molde) y con el uso de dos secuencias cortas e informativas de oligos, denominados primers que resultan ser especficos de la regin de inters y que garantizan que slo esa parte, y ninguna otra, va a amplificar, se han ido desarrollando una serie de tcnicas para realizar estudios de variabilidad gentica en las especies animales (Aranguren et al 2001). El mayor inconveniente de los microsatlites es que necesitan ser aislados de novo en cada especie, debido a que se encuentran habitualmente en regiones no codificantes del genoma donde la tasa de sustitucin de nucletidos es muy alta, por lo que no existen primers o cebadores universales como en el ADN mitocondrial, lo que supone un elevado esfuerzo. ltimamente, y cada vez con mayor frecuencia, se intenta la amplificacin cruzada con cebadores de una especie

en otra distinta, obtenindose en algunos casos resultados positivos (Schltterer et al., 1991; Gonzlez, 2003; Strecker, 2006). En el grupo de los anfibios la utilizacin de microsatlites es muy frecuente para realizar estudios poblacionales enfocados a la conservacin (Rowe et al., 2000; Beebee & Rowe, 2001; Vos et al., 2001; Gonzlez, 2003; Burns et al., 2004) y se han aislado en muchas especies (Brede et al., 2001; Wieczorek et al., 2002; Julian & King, 2003; Chan, 2007)

4.4 Diversidad Fenotpica

Uno de los atributos universales observados en las poblaciones naturales es la diversidad fenotpica respecto a gran parte de sus caracteres (Hartl & Clark, 1997). Estas diferencias en el fenotipo observadas en las distintas poblaciones son atribuibles a un proceso continuo de seleccin, en la cual diversos caracteres pueden ser, en su conjunto, adaptativos (Mayr, 1968). Pese a que las poblaciones naturales de casi todas las especies generalmente se presentan subdivididas, a escalas geogrficas ms amplias, estas pueden mostrar un mayor grado de diferenciacin gentica debido a factores asociados, principalmente la presencia de barreras geogrficas, disponibilidad de recursos y/o el aislamiento por distancia, entre otros.

5. Metodologa

5.1

Marcadores moleculares

Se seleccionaron marcadores (microsatlites) especficos (tabla 1) diseados por Martnez Barguil (2010) a partir de la secuencia EU342669 (Genbank) procedente de mitocondrias de dendrobates bombetes.

Tabla 1. Marcadores Moleculares (Martnez 2010) Marcador LEFT PRIMER RIGHT PRIMER Molecular DB1 DB2 DB3 DB4 CCTTAGAAGCCCACAAACGA GGCTCCTCTAGGGGGATATG AACATCGCCTCCTGCATAAC AGGTTTATCCCCGCTTCTTC

CCTTAGAAGCCCACAAACGA GCTCCTCTAGGGGGATATGG CAGCTTACCACGTGAGCGTA AGTGCCGGGTTAAAAAGGAC

5.2

Localidad y rea De muestreo

Para el muestreo fueron seleccionadas 2 reservas forestales protegidas en las cuales se encuentra la mayor parte de la distribucin de la especie estudiada, dichas reservas se muestran a continuacin: La Reserva Forestal Yotoc (0352N 7621O), est localizada en el municipio de Yotoc, departamento del Valle del Cauca. Tiene una extensin de 559 hectreas de bosques que se encuentran entre los 1.200 y 1.950 m de altitud, en la vertiente oriental de la cordillera Occidental. Este pequeo y aislado parche de bosque es uno de los ltimos remanentes de bosque subtropical hmedo del Valle del Cauca, con rboles que superan los 50 metros de altura. Gran parte de la extensin total de la Reserva est bien conservada, aunque est dividida por una carretera de trfico pesado que comunica Buga-LoboguerreroBuenaventura (en los kilmetros 17 y 18 de la ciudad de Buga) (Franco & Bravo 2005). La clasificacin holdridge para zonas de vida en esta reserva es Bh-PM (Jimnez et. al 2007) El bosque de Yotoc pertenece a la Universidad Nacional de Colombia y es manejado por la CVC. La Reserva se encuentra bien protegida y CVC recientemente compr terrenos adicionales para expandir sus lmites (FRANCO et. al 2005). La reserva de Bremen (0440'27''N 7537'56''O), est ubicado entre los 1.500 y 2.100 m de altitud sobre la vertiente occidental de la cordillera Central de los Andes en Colombia en

los municipios de Filandia y Circasia (Quindo) (BirdLife Internacional, 2009). Esta reserva adems se identifica con un clima fro y muy hmedo (F-MH), donde la temperatura oscila entre 12 y 18 C; y la precipitacin promedio anual es entre 2.000 y 4.000 mm (convenio instituto de investigaciones de recursos biolgicos Alexander Von Humboldt corporacin autnoma regional de Risaralda, CARDER 2007). La Reserva Forestal Bremen-La Popa (747 ha), propiedad de la Corporacin Autnoma Regional del Quindo desde el ao de 1970. Adicionalmente, los municipios de Filandia (Quindo) y Pereira (Risaralda) han establecido en sus planes de ordenamiento territorial esta rea como una Zona de Especial Significacin Ambiental, lo que la favorece y, de alguna manera, restringe su explotacin en el futuro (BirdLife Internacional, 2009). Por la condicin de proteccin a las que estn sometidas estas zonas se solicitan legalmente ante las autoridades ambientales los permisos para hacer el muestreo.

5.3
-

Descripcin De Muestreo

En La reserva De Bremen:

Se seleccionaran 80 individuos (D. Bombetes) adultos En la reserva forestal del Yotoc:

Se seleccionaran 80 individuos (D. Bombetes), teniendo en cuenta que se tomaran 40 a un lado de la carretera de trasporte pesado que atraviesa la reserva, los 40 faltantes sern recolectados del lado restante de dicha carretera. A cada ejemplar con ayuda de una esptula se le raspara cuidadosamente el paladar para obtener saliva y almacenarla adecuadamente para los anlisis posteriores.

5.4

Analisis morfomtrico

5.4.1 Medidas Morfometricas

A cada ejemplar (D. Bombetes) se le tomar la longitud rostro cloaca utilizando un vernier de 0.001 de precisin teniendo en cuenta de que una misma persona haga las mediciones para reducir errores por la percepcin. Los individuos se pesan utilizando una balanza analtica digital de marca OHAUS Pro AV624 de 0.01 g de precisin. Adems de esto se debe describir la coloracin presente en cada individuo. Esto con soporte fotogrfico. 5.4.2 Anlisis de datos Morfomtricos Se clasificaran los individuos de acuerdo a su coloracin, tamao sitio en el cual fueron encontrados y luego se verificara las variaciones entre estos, mediante un anlisis estadstico.

5.5

Estudio Gentico

5.5.1 Anlisis de laboratorio Las tcnicas moleculares y el anlisis de los datos se desarrollarn en el Banco de Tejidos/Laboratorio de Biologa Molecular, Instituto de Investigacin de Recursos Biolgicos Alexander von Humboldt , ubicado en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) en el municipio de Palmira, Valle del Cauca. 5.5.2 Extraccin de ADN El ADN se extraer utilizando el mtodo de fenol-cloroformo, o en su defecto mediante extraccin por el mtodo de salting-out (Sambrook et al., 1989). La cantidad y calidad del ADN extrado se evaluar en gel de agarosa al 0.8% teido con bromuro de etidio, y se cuantificar con transiluminador. 5.5.3 Amplificacin de loci microsatlites: Se realizar una PCR para los loci microsatlites hipervariables DB1, DB2, DB3, DB4, diseados para Dendrobates Bombetes por Juan Camilo Martinez Barguil (2010). Se amplificar 100 ng de ADN en un volumen final de 50l utilizando las condiciones siguientes (Gonzlez et. al 1995): dNTPs - - - - - - - - - - - - - - - 0,2mM MgCl2 - - - - - - - - - - - - - - - 1,5mM Buffer - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 X Taq Pol - - - - - - - - - - - - - 2,0-2,5U Primers - - - - - - - - - - - - - - -0,2M Luego se hace un pcr en tocuhdown, teneindo en cuenta la temperatura de aliniamiento de cada primer. Iniciar con un annealing 10C por encima de la temperatura de cada primer e ir disminuyendo 1C por un ciclo hasta llegar a la temperatur apropia del primer. Denaturar a 94C durante 1 minuto Denaturacin : 94C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 10 seg Alineamiento: 66C (1C/Ciclo) - - - - - - - - - - 1 min Extension: 72C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 min Hacer 10 ciclos Denaturar a 94C durante 1 minuto Denaturacin : 94C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 10 seg Alineamiento: 56C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 min Extension: 72C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 min Hacer 20 ciclos

Ahora un paso final de extensin de 72C Se procede con la adicin de 15 a 20l del producto en gel de poliacrilamida. Se corre esta mezcla en TBE 1X a 300 V por el tiempo requerido (Aproximadamente 2 horas) Como paso siguiente se tie con bromuro de etidio a una concentracin de 1 g/ml durante 3 minutos y para finalizar se realiza el fotografiado Para el gel de poliacrilamida se requiere (Gonzlez et. al 1995): Acrilamida/Bis-acrilamida(29:1) 30% - - - - - - - - - - 16.6 ml 10X TBE - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 5.0 ml Persulfato de amonio 10% (Recien Preparado) - - - 0.35 ml H2O - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 28.0 ml Desgasificar aplicando Vacio durante 10 min Temed - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.04 ml Verter el gel y dejar polimerizar durante una hora

5.5.4 Anlisis de datos genticos Para estimar el nivel de diversidad gentica se utilizar el programa POPGEN versin 1.31 (Yeh et al., 1999), para lo cual se construir una matriz con los genotipos de cada individuo evaluado. Se obtendrn medidas de diversidad gentica general como el nmero total de alelos, nmero efectivo de alelos (Kimura & Crow, 1964), frecuencias allicas, heterocigosidad observada (Ho), heterocigosidad esperada o ndice de diversidad gentica (He), y estructura gentica (GST) (Nei, 1973).

6. Cronograma de actividades

Meses ACTIVIDAD
Estandarizacin de tcnicas y solicitud de permisos ambientales Revisin de informacin sobre la zona de muestreo Desplazamiento al sitio de muestreo y toma de muestras. Desplazamiento al municipio de Palmira para llevar a cabo los anlisis de laboratorio Anlisis De Datos Entrega del informe final

1234567
X X X XXX XXXX X

7. Presupuesto.

7.1 Fuentes De Financiacin

Tipo de Fuente Externa Externa Interna

Fuente FONAM Colciencias Universidad Nacional De Colombia (contrapartida)

Valor Aportado ($) 37.000.000 40.000.000 35.000.000

7.2 Valor total del proyecto

Costos Totales ($)

112.000.000

7.3 Rubros Financiados

Tipo De Rubro Personal Equipos Materiales y Suministros Salidas de Campo Uso de Equipos y Laboratorios Total

Valores (% Total) 41,4 12,6 11 19.5 15.5 100%

7.4 Detalles de Rubros

7.4.1 Gastos de Personal

Descripcin Estudiante Maestra Estudiantes Pregrado Director de tesis (contrapartida UN) Asesor (Contrapartida Un) Auxiliares De Campo Total

Valor ($) 12.930.000 5.120.000 12.000.000 12.000.000 4.318.000 46.368.000

7.4.2 Compra de Equipos Descripcin Computador Equipo Fotogrfico Equipo De caza De Ranas Total Valor ($) 4.500.000 4.800.000 4.812.000 14.112.000

7.4.3 Materiales y suministros

Descripcin Plsticos y fungibles (frascos, jeringas, bolsas, nevera porttil, viales 0.2, 1.5 y 2.0 ml, puntas micropipeta, toallas de papel, guantes, cuchillas)

Valor ($)

200.000

Papelera, fotocopias, marcadores indelebles, libretas de campo Secuencias cebadoras (primers) para PCR Enzimas y reactivos para PCR Material para Extraccin de ADN Total

230.000 3.000.000 5.437.000 3.652.800 12.320.000

7.4.4 Salidas de Campo Lugar Viticos y transporte para tres personas durante12 das en los puntos de muestreo en cada salida Costo Unitario ($) Cantidad Valor ($)

10.920.000

21.840.000

7.4.5 Uso de equipos y laboratorio Item Valor ($)

Uso de los Laboratorios de Biologa molecular y Banco De Tejidos en las instalaciones del instituto de investigacin de recursos biolgicos Alexander Humboldt, as como los equipos necesarios para los procedimientos requeridos para el estudio 17.360.000 (Termocicladores, computadores, GPS, cmara fotogrfica, balanzas analticas, micropipeteadores, autoclave para esterilizacin, ultra purificador y destilador de agua, bao mara, microcentrfugas, fuentes de poder y congeladores, cmara de Extraccin, neveras)

8. Bibliogrfia

1. Acelas-Mantinilla, M. de J.; Rosales-Solano, H. F Universidad industrial de. Santander, Colombia; Toxinas y alcaloides de las ranas de la familia dendrobatidae. 2. Angel D. y Vieira M. I. 2004. Caracterizacin preliminar del uso de la biodiversidad en los hatos Guamito y Santa Trinidad, municipio Hato Corozal, Casanare. Informe presentado por la lnea de Uso de biodiversidad. Proyecto Orinoqua. Instituto de Investigacin de Recursos Biolgicos Alexander von Humboldt. Bogot, Colombia. 50 P. 3. Aranguren-Mndez, Jos A. y Jordana Jordi, Utilizacin de marcadores de ADN (microsatlites) en poblaciones de animales domsticos en peligro de extincin, 2001 4. Beebee, T.J.C. & Rowe, G. 2004. An introduction to molecular ecology. Oxford University Press. 346p 5. Beebee, T. J. C. & Rowe, G. 2001. Application of genetic bottleneck testing to the investigation of amphibian declines: a case study with Natterjack Toads. Conservation Biology, 15(1): 266-270.

6. BirdLife International (2009) Important Bird Area factsheet: Can del Ro Barbas y Bremen, Colombia. Downloaded from the Data Zone at http://www.birdlife.org on 28/5/2010 7. BirdLife International (2009) Important Bird Area factsheet: Reserva Forestal Yotoco, Colombia. Downloaded from the Data Zone at http://www.birdlife.org on 13/5/2010 8. Boletn Cientfico - Centro de Museos - Museo de Historia Natural Vol. 10, enero diciembre, 2005, pags. 117-148 9. Bravo Martnez, Karen Paola, Caracterizacin de la gametognesis en dendrobates truncatus (anura: dendrobatidae) presente en formaciones de bosque hmedo tropical (bh-t) en los cerros de corcovado (Ach: Bolvar), 2009, Universidad del Atlntico. 10. Brede, E. G., Rowe, G., Trojanowski, J. & Beebee, T. J. C. 2001. Polymerase chain reaction primers for microsatellite loci in the common toad Bufo bufo. Molecular Ecology Notes, 1: 308-310. 11. Burns, E. L., Eldridge, M. D. B. & Houlde, B. A. 2004. Microsatellite variation and population structure in a declining Australian hylid Litoria aurea. Molecular Ecology.

12. Celis Borrero, Catalina, Dendrobates truncatus (anura: dendrobatidae) sobre unin neuromuscular de mamfero, 2005.

13. Chan, L. M. 2007. Characterization of microsatellite markers for Couchs spadefoot toad (Scaphiopus couchii) and cross-amplification in other species of the family Scaphiopodidae. Molecular Ecology Notes, 7: 318-320. 14. Cheng H. H. and Crittenden, L.B. 1994. Microsatellite markers for genetic mapping in the chicken. Poultry Sci. 73:539-546

15. Daly, J.W., Garrafo & C.W. Myers. 1997. The origin of frog skin alkaloids: An enigma. Pharmaceutical News, 4 (4): 9-14.

16. Espinoza , Juan L ; Fuentes-Contreras, Eduardo ; Barros, Wilson ; Ramirez, Claudio; Utilization of microsatellites to determine genetic variability of the codling moth Cydia pomonella L. (Lepidoptera: Tortricidae) in Central Chile, 2007

17. Fernandz Muerza, Alex, Anfibios en peligro de extincin, Consumer Eroski 2007.

18. FRANCO, ANA M.; GUSTAVO BRAVO. 2005. reas importantes para la conservacin de las aves en Colombia. Pginas 117-281 en BirdLife Internacional y Conservation International, reas Importantes para la Conservacin de las Aves en los Andes Tropicales. BirdLife internacional, Quito, Ecuador. 19. Frost, Darrel R. 2010. Amphibian Species of the World: an Online Reference. Version 5.4 (8 April, 2010). Electronic Database accessible at http://research.amnh.org/vz/herpetology/amphibia/American Museum of Natural History, New York, USA.

20. Frost, D. R. (2004), Amphibian Species of the World, an online Reference, V. 3.0 (as of April 7 2006) 21. Gonzlez, E.G. (2003). Microsatlites: sus aplicaciones en la conservacin de la biodiversidad. Graellsia, 59 (2-3): 377-388.

22. Gonzalez D.O; Palacios, N y Tohme, J. (comps., eds.), Protocolos para Marcadores Moleculares; Unidad de investigacin en biotecnologa, centro internacional de agricultura tropical (CIAT), Cali-Colombia 78p. [Publicacin CIAT N 285] 23. Grant, Frost, Caldwell, Gagliardo, Haddad, Kok, Means, Noonan, Schargel, and Wheeler, 2006, Bull. Am. Mus. Nat. Hist., 299: 171. 24. Hart, D. L. & A.G. Clark. 1997. "Principles of Population Genetics". 3th edition.

Sinauer Associates, Inc. Publishers.

25. Jimnez E., Fernndez F., Arias T.M. y Lozano-Zambrano F. H. 2007. Sistemtica, biogeografa y conservacin de las hormigas cazadoras de Colombia. Instituto de Investigacin de Recursos Biolgicos Alexander von Humboldt. Bogot D. C., Colombia 622 p. http://www.humboldt.org.co/humboldt/mostrarpagina.php?codpage=20003111. 26. Julian, S. E. & King, T. L. 2003. Novel tetranucleotide microsatellite DNA markers for the wood frog, Rana sylvatica. Molecular Ecology Notes, 3: 256-258.

27. Kimura, M. & J. F. Crow. 1964. The number of alleles that can be maintained in a finite population. Genetics 49: 725-738. 28. Mayr, E. 1968. "Especies animales y evolucin". Ediciones de la Universidad de Chile y Ediciones Ariel.

29. Myers,C. W,. New generic names for some Neotropical poison frogs (Dendrobatidae). Pap. Avul. Zool. 36, 1987

30. Myers, C.W. &. Daly, J.W., Dart-Poison Frogs. Scientific, 1983 31. Myers, Charles W. and Daly, John W., taxonomy and ecology of dendrobates Bombetes, A new Andean poison frog with new skin Toxins, 1980

32. Nei, M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proc. Nat. Acad. Sci. 70(12): 3321-3323.

33. Ostrowski, T. & T. Mahn (2010): Artbeschreibung Ranitomeya bombetes. Dendrobase.de Eine Online-Datenbank der Familie Dendrobatidae (Anura). www.dendrobase.de/index.php?gattung=Ranitomeya&art=bombetes; Stand: Mai 2010.

34. Patio Juan Esteban, Acciones para la proteccin de la biodiversidad en Colombia,2008

35. Ron, S. R. 2001-2009. Anfibios de Parque Nacional Yasun, Amazona ecuatoriana. [en lnea]. Ver. 1.6 (2009). Museo de Zoologa, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador. Quito, Ecuador. http://tropicalfrogs.net/yasuni/ 36. Rowe, G., Beebee, T. J. C. & Burke, T. 2000. A microsatellite analysis of natterjack toad, Bufo calamita, metapopulations. Oikos, 88: 641-651.

37. RUEDA, Jos Vicente, 1998. Listas preliminares de anfibios colombianos con algn riesgo a Martha Patricia Ramrez Pinilla, Mariela Osorno-Muoz, Jose Vicente Rueda, Adolfo Amzquita, Mara Cristina Ardila-Robayo 2004. Ranitomeya bombetes. In: IUCN 2010.

IUCN Red List of Threatened Species. Version 2010.1. <www.iucnredlist.org>. Downloaded on 13 May 2010. 38. Sambroak, Fritoch, and Maniatis. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual. 3. Ed. Pag. E3, E4 y B12.

39. Santos, J.C., L. A. Coloma & D.C. Canatella. 2003. Multiple, recurring origins of aposematism and diet specialization in poison frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 40. Schltterer, C., Amos, B. & Tautz, D. 1991. Conservation of polymorphic simple sequences in cetacean species. Nature, 354: 63-65.

41. Schwarz, Benjamin; Ostrowski, Thomas; Olthof, Wouter; Gonella, Roberto; Martn, Roberto; Snchez, Albert; Durn, Pedro; Seoane, Rodrigo; La familia Dendrobatidae, gua visual de gneros y especies. (Parte II), Jungla Magazine, 2009 42. Strecker, U. 2006. Characterization and cross-species amplification of microsatellite loci in a Cyprinodon species flock. Molecular Ecology Notes, 6: 843-846. 43. Surez-Mayorga, Angela M., A review of the genus minyobates, 2002 44. The zoologist of the Nomenclature Committee, convention on international trade in endangered species of wild fauna and flora, amphibian reference update, 2006. 45. UNEP-WCMC. (2003). Checklist of herpetofauna listed in the CITES appendices and in EC Regulation 338/97. 9th edition. JNCC Report No. 340. 46. Vos, C. C., Antonisse-De Jong, A. G., Goedhart, P W. & Smulders M. J. M. 2001. Genetic similarity as a measure for connectivity between fragmented populations of the moor frog (Rana arvalis). Heredity, 86: 598-608. 47. Wieczorek, A. M.; Zamudio, R., King, T. L. & Gjetva, G. 2002. Isolation of microsatellite loci in spotted salamanders (Ambystoma maculatum). Molecular Ecology Notes, 2: 313-315. 48. Yeh, F.C., Rong-cai, Y., & Boyle, T. 1999. PopGene version 1.31. Microsoft Window-based freeware for population genetic analysis: quick user guide. University of Alberta/Center for International forestry research. Alberta, Canada. 49. Zhang, D-X. 2004. Lepidopteran microsatellite DNA: redundant but promising. Trends Ecol. Evol. 19:507-509.

9. Resultados esperados
Al momento de la finalizacin de este proyecto se tendr informacin considerable para la mejorar y estipular nuevas decisiones acerca de la conservacin de la especie Dendrobates bombetes pues conoceremos detalladamente si existe o no flujo gentico y variabilidad entre los parches ubicados en los andes. Adems de esto este trabajo puede ser motivo de nuevas investigaciones y fuente de informacin puesto que la existente acerca de esta hermosa y til rana es muy limitada.