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ENZIMI

CATALISI ENZIMATICA. Meccanismo d’azione degli enzimi; Energia dl attivazione; Componenti strutturali e funzionali; Nomenclatura e classificazione; Specificità dl substrato ed azione; Modello Lock and Key; Coenzimi principali; Principio di additività dell’energia libera in reazioni accoppiate.

ενζυµ ον (“nel lievito”): un po’ di storia

Nell’antichità, denominati fermenti

Diastasi del malto idrolizza l’amido più velocemente dell’acido solforico

1835: Prima teoria della catalisi chimica (Berzelius)

1860: Fermentazione causata da sostanze termolabili (Pasteur)

1877: Primo uso del termine “enzima”

1897: Estrazione dal lievito degli enzimi della fermentazione alcolica,

dimostrazione che può avvenire in assenza di cellule integre (Buchner) 1913: Equazione di Michaelis-Menten, primo modello matematico del

funzionamento degli enzimi 1926: Cristallizzazione di ureasi (Sumner)

1930: Cristallizzazione di pepsina, tripsina e chimotripsina: tutti gli

enzimi sono proteine (Northrop) 1965: Teoria dell’allosterismo (Jacob, Monod, Changeaux)

1992: L’attività degli enzimi può essere regolata con modificazioni

covalenti (Fischer, Krebs) 1997: Anche RNA può agire come catalizzatore: non tutti gli enzimi sono

proteine 2004: Ruolo dell’ubiquitina nella distruzione degli enzimi (Ciechanover, Hershko, Rose)

Alcune caratteristiche della materia vivente

Composta da molecole non viventi, vale più della somma delle

sue parti (1+1=3) Si presenta con poche differenze in specie diverse

Ogni componente con funzione specifica e insostituibile, più

funzioni per ciascun componente Trasforma l’energia derivata dall’ambiente costruendo strutture

ordinate e complesse da materiale disordinato e semplice Abilità di autoriprodursi in modo preciso utilizzando le

informazioni contenute nel proprio interno Capacità evolutiva, irritabilità ed adattamento all’ambiente

Resa ottimale:

Svolge solo le reazioni necessarie minimizzando la produzione di prodotti di scarto Impedisce reazioni indesiderate prevenendo il dispendio energetico Porta a termine le reazioni in tempi brevi E’ indipendente dalle condizioni ambientali (temperatura, pressione) Può riutilizzare la stessa “macchina” per molte volte

Energia di attivazione

Y si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a X

Conversione X Y termodinamicamente favorevole

Ma la reazione non può avvenire se X non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione

non può avvenire se X non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione
Distribuzione delle molecole a vari livelli di energia Energia di attivazione Molecole con energia maggiore
Distribuzione delle molecole a vari livelli di energia
Energia di attivazione
Molecole con energia
maggiore dell’energia di
attivazione
Energia
Aumento di temperatura
Presenza di un catalizzatore
Numero di molecole
Energia Energia di attivazione Energia di attivazione Energia di senza attivazione catalizzatore A con
Energia
Energia di attivazione
Energia di
attivazione
Energia di
senza
attivazione
catalizzatore
A
con
catalizzatore
Stato
iniziale
Energia liberata
Riduzione dell’energia di
attivazione del substrato
mediante:
dalla reazione
P

Combinazione transitoria col substrato Stabilizzazione dello stato di transizione Inserimento di numerosi stati di transizione con livello energetico inferiore

Stato finale

Un enzima immaginario: la metallasi

•   •   •   Un enzima immaginario: la metallasi La barretta deve essere piegata

La barretta deve essere piegata prima di essere rotta (stato di transizione) Enzima con alta affinità per il substrato:

stabilizza il substrato Enzima con alta affinità per lo stato di transizione:

stabilizza lo stato di transizione e accelera la reaziuione

Enzimi: catalizzatori biologici

Non modificano l’equilibrio della reazione, ma solo la velocità con la quale l’equilibrio viene raggiunto Non vengono modificati nella reazione, e al termine della reazione sono subito disponibili per catalizzare una nuova reazione

modificati nella reazione, e al termine della reazione sono subito disponibili per catalizzare una nuova reazione
modificati nella reazione, e al termine della reazione sono subito disponibili per catalizzare una nuova reazione

H 2 O 2 e catalasi

2 H 2 O 2 ⇐⇒ 2 H 2 O + O 2 Catalizzata da catalasi Reazione spostata a destra (K eq alta) ma molto lenta (k velocità bassa)

Struttura generale degli enzimi DNA RNA ribosomi Zimogeno Substrato Prodotto (precursore) Sito attivo Apoenzima
Struttura generale degli enzimi
DNA
RNA
ribosomi
Zimogeno
Substrato
Prodotto
(precursore)
Sito attivo
Apoenzima
Ubiquitina
ENZIMA
Lisosomi
ATTIVO
degradazione
Parte non-proteica
ione metallico o
coenzima
Sito allosterico
Effettore
allosterico

Nomenclatura degli enzimi

Denominazione classica costituita da 3 parti:

Nome del substrato Nome del coenzima Nome della reazione catalizzata + “asi”

Esempio: Lattico-NAD-deidrogenasi

catalizzata + “asi” Esempio: Lattico-NAD-deidrogenasi International Enzyme Commission, fondata nel 1956 da Prof.

International Enzyme Commission, fondata nel 1956 da Prof. M. Florkin:

77 membri, presidente attuale Angelo Azzi Classificazione degli enzimi secondo il sistema delle classi EC Esempi:

Creatin kinasi: EC 2.7.3.2, adenosintrifosfato : creatin N-fosfo trasferasi Lattato deidrogenasi: EC 1.1.1.27, lattato : NAD+ ossidoreduttasi

Ha funzionato bene fino agli anni ‘90 (circa 3200 enzimi)

Progetto genoma umano (HUGO):

Esistono circa 20,000 geni, in buona parte enzimi

Classificazione internazionale degli enzimi

1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione

1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore 1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore 1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore 1.4 agisce sul gruppo CH-NH 2 del donatore 1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore 1.6 agisce su NADH 2 o NADPH 2 1.7 agisce su altri composti azotati 1.8 agisce su gruppi solforati 1.9 agisce sui gruppi eme

Classificazione internazionale degli enzimi

1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra

2.1 gruppi ad una unità di carbonio 2.2 gruppi chetonici o aldeidici 2.3 gruppi acilici 2.4 gruppi glicosidici 2.5 gruppi alchilici 2.6 gruppi azotati 2.7 gruppi fosforici 2.8 gruppi contenenti zolfo

Classificazione internazionale degli enzimi

1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi

3.1 legami esterei 3.2 legami glicosidici 3.3 altri legami 3.4 legami peptidici 3.5 legami C-N non peptidici 3.6 legami anidridici 3.7 legami C-C

Classificazione internazionale degli enzimi

1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami

4.1 legami C = C 4.2 legami C = O 4.3 legami C = N 4.4 legami C = S

Classificazione internazionale degli enzimi

1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero

5.1 racemasi 5.2 cis-trans isomerasi

Classificazione internazionale degli enzimi

1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione

2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola

ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi

4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami

5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo

isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di

ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi

6.1 legami C-O 6.2 legami C-S 6.3 legami C-N 6.4 legami C-C

Classificazione internazionale degli enzimi

1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi

Modello Lock and Key: l’enzima si combina chimicamente col substrato • Emil Fisher 1894 –

Modello Lock and Key: l’enzima si combina chimicamente col substrato

Emil Fisher 1894

Si formano legami “esatti” fra

Il sito attivo è costituito dal

“negativo” del substrato

enzima e substrato

Riconoscimento anche

Esempio: glicerol kinasi (lega

tridimensionale

solo il glicerolo in forma alfa) Può distinguere stereoisomeri D- e L- degli aminoacidi

Spiega la specificità, ma NON spiega la stabilizzazione dello stato intermedio

ma NON spiega la stabilizzazione dello stato intermedio Un modello più sofisticato: induced fit + substrate
ma NON spiega la stabilizzazione dello stato intermedio Un modello più sofisticato: induced fit + substrate

Un modello più sofisticato:

induced fit + substrate strain

Daniel Koshland 1958 (University of California Berkeley) Sito di legame non completamente pre-formato L’interazione fra substrato e enzima induce un cambiamento conformazionale nell’enzima che prelude ad un legame più stabile col substrato (induced fit) Il substrato è forzato verso la formazione dei prodotti (substrate strain)

col substrato ( induced fit ) •   Il substrato è forzato verso la formazione dei

Il legame enzima-substrato avviene tramite l’interazione delle cariche del substrato con alcuni aminoacidi del sito attivo

Esempio: proteasi a serina Alterazioni della struttura primaria di un enzima possono mutarne l’attività causando malattie genetiche

possono mutarne l’attività causando malattie genetiche Il legame enzima-substrato induce un cambiamento

Il legame enzima-substrato induce un cambiamento conformazionale nell’enzima

Esempio: esochinasi senza e con glucosio

Il legame enzima-substrato induce un cambiamento conformazionale nell’enzima Esempio: esochinasi senza e con glucosio 11

Il cambiamento conformazionale forza il substrato ad assumere una nuova struttura o conformazione

Esempio: lisozima, che idrolizza i polisaccaridi

Esempio: lisozima, che idrolizza i polisaccaridi Dalla sequenza degli aminoacidi alla struttura delle

Dalla sequenza degli aminoacidi alla struttura delle proteine

sequenza degli aminoacidi alla struttura delle proteine •   Struttura primaria (sequenza degli aminoacidi) –

Struttura primaria (sequenza degli aminoacidi)

Sempre lineare

Struttura secondaria (conformazione della catena)

α-elica o β-a pieghe

Struttura terziaria (tridimensionalità della catena)

Relazioni locali o remote dei gruppi R Proteine globulari o fibrose

Struttura quaternaria (interazioni fra più catene)

Struttura primaria e mutazioni genetiche

Tutte le funzioni delle proteine necessitano del riconoscimento fra zone o

Enzima-substrato, molecole di adesione-membrane, anticorpo-antigene…

domini della proteina con altre molecole o parti di molecola:

Il dominio preposto al riconoscimento e la molecola da riconoscere

Se ne deriva uno stato patologico, quella mutazione interessa il dominio di

devono essere complementari in termini di struttura e di carica Il riconoscimento dipende dalla distribuzione dei gruppi R e dalla

sequenza degli aminoacidi Una mutazione della struttura primaria può impedire o rendere difficile

il riconoscimento, causando disfunzioni più o meno gravi

riconoscimento Se la mutazione è silente (non genera malattie o disfunzioni), è possibile che l'aminoacido mutato non sia nel dominio di riconoscimento

Spesso è sufficiente la mutazione di un solo aminoacido

Tutte le malattie causate da tali mutazioni sono genetiche

Tutte le malattie genetiche originano una mutazione della struttura primaria delle proteine

Di tutte le reazioni possibili per un substrato, l’enzima ne favorisce una sola

Gli enzimi forzano le vie metaboliche attraverso reazioni selezionate (ad es:

A > B > H > K > N > T > Z) favorendo il flusso unidirezionale di materiale

(ad es : A > B > H > K > N > T > Z)
(ad es : A > B > H > K > N > T > Z)

Piccole molecole organiche, spesso derivate da vitamine Si legano all’enzima

Spesso fungono da “secondo substrato”

Determinano la specificità della reazione catalizzata

Coenzimi

la specificità della reazione catalizzata Coenzimi Adenosin trifosfato (ATP) •   Coenzima delle chinasi,

Adenosin trifosfato (ATP)

Coenzima delle chinasi, trasferisce un gruppo Pi al substrato Esempio: Glucosio + ATP Glucosio-6-fosfato + ADP In molte chinasi, il substrato vero è Mg-ATP

  Esempio: Glucosio + ATP ⇒ Glucosio-6-fosfato + ADP •   In molte chinasi, il substrato

Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD + )

Coenzima di deidrogenasi Derivato da niacina Trasferisce un protone da/a substrati:

lattato + NAD + ⇐⇒ piruvato + NADH +

H +

Esiste una forma fosforilata NADP +

NADH + H + •   Esiste una forma fosforilata NADP + Flavina adenina dinucleotide (FAD)

Flavina adenina dinucleotide (FAD)

Coenzima di deidrogenasi

Derivato da riboflavina (vit.

B 6 )

Trasferisce due protoni da/a

substrati

Succinato + FAD ⇐⇒ Fumarato + FADH 2

(vit. B 6 ) •   Trasferisce due protoni da/a substrati –   Succinato + FAD

Trasportatore e attivatore di gruppi acilici (acidi grassi) e di acetato

Coenzima A

di gruppi acilici (acidi grassi) e di acetato Coenzima A Metalli di transizione (Fe, Zn, Cu,

Metalli di transizione (Fe, Zn, Cu, Mn…)

Cofattori più che coenzimi Presenti in 2/3 degli enzimi Agiscono come stabilizzatori della proteina e come donatori/accettori di elettroni (acidi di Lewis), per esempio i citocromi

CINETICHE CHIMICHE E ENZIMATICHE

Ordine di reazione; Ipotesi per l’azione degli enzimi; Equazione di Michaelis-Menten; Velocità massima e KM; Trasformazione di Lineweaver-Burk; Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche.

Cinetiche chimiche (A P)

Trasformazione di Lineweaver-Burk; Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche. Cinetiche chimiche (A ⇒ P) 17
Effetto della concentrazione di A (A ⇒ P) A4 > A3 > A2 > A1
Effetto della concentrazione di A (A ⇒ P)
A4 > A3 > A2 > A1
[prodotto]
Velocità iniziale
A4
A3
A2
A1
Tempo
A1
A2 A3
A4
[A]
Velocità iniziale Cinetica enzimatica Cinetica chimica
Velocità iniziale
Cinetica enzimatica
Cinetica chimica

Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche

[A]

Ipotesi per l’azione degli enzimi [S] >> [E] E + S ⇐⇒ ES ⇒ EP

Ipotesi per l’azione degli enzimi [S] >> [E]

E + S ⇐⇒ ES EP E + P

L’enzima si lega col substrato per formare ES: reazione reversibile Il complesso ES subisce il cambiamento conformazionale che induce la formazione di P (reazione relativamente lenta) L’enzima rilascia P e torna nello stato iniziale La velocità globale è regolata da [ES]

Ordine di reazione

Primo ordine

Secondo ordine

Pseudo primo ordine

A P v=k[A] 1 , n=1

A + B P v=k[A] 1 [B] 1 , n=2

A + B P v=k[A] 1 [B] 1 , n=2 ma se [B]»[A], v=k[A] 1 , n=1

Ordine zero

v=k, n=0 v dipende dalla concentrazione del catalizzatore

v 0 Se [S] è molto alto, v 0 non cambia all’aumentare di [S] V
v 0
Se [S] è molto alto, v 0 non cambia
all’aumentare di [S]
V max
Ordine 0
Ordine misto
1° ordine

Interazione enzima-substrato

Se [S] è alto, v 0 è controllata da [E]

Se [S] è intermedio, v 0 è controllata sia da [S], sia da [E]

Se [S] è basso, v 0 è controllata da [S]

[substrato]

Se [S] è basso, v 0 è controllata da [S] [substrato] Commission on Enzyme Nomenclature of

Commission on Enzyme Nomenclature of the International Union of Biochemistry

Attività enzimatica: moli di substrato convertito per unità di tempo in condizioni standard di temperatura, pH e forza ionica:

1 katal = 1 mol/s 1 IU = 1 micromole/min

Attività specifica: attività enzimatica per mg di proteina (moli/tempo/mg proteina)

Espressione di purezza

Costante catalitica o numero di turnover: attività enzimatica per mole di enzima (moli/tempo/mole enzima)

Equazione di Michaelis-Menten (1913)

v 0 = V max [S ] K M + [S ]

v 0 = V m a x ⋅ [ S ] K M + [ S
v 0 = V m a x ⋅ [ S ] K M + [ S

Leonor Michaelis & Maud Menten

Leonor Michaelis (Berlin, January 16, 1875 – New York, October 8, 1949). Maud Leonora Menten (Ontario, March 20, 1879 – July 26, 1960), among the first women in Canada to earn a medical doctorate. At that time women were not allowed to do research in Canada, therefore she decided to do research in other countries such as the United States and Germany. Accomplished musician and painter.

Assunzioni di Michaelis-Menten

• • 1 solo substrato Fattore limitante:

E + S ⇐⇒ ES E + P

formazione di ES Tutto E ES

Non esiste E libero E saturo di S

ES stazionario

formazione di ES Tutto E ⇒ ES –   Non esiste E libero –   E

Ipotesi v 0 =V max /2

K M = [S] quando v 0 =V max /2 E’ una concentrazione (dimensioni moli/litro) E’ indipendente da [E]

v 0 = V max [ S] K M + [ S ]

v 0 = V m a x ⋅ [ S ] K M + [ S

V max

= V m a x ⋅ [ S ] K M + [ S ] V

V max [ S ]

=

] K M + [ S ] V max V m a x ⋅ [ S

2 K M + [ S]

1 =

max V m a x ⋅ [ S ] = 2 K M + [ S

[ S]

m a x ⋅ [ S ] = 2 K M + [ S ] 1

2 K M + [ S ]

K M + [ S ] = 2 [ S]

K M = [ S]

Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche v 0 V max V max /2 K [S] M
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
v 0
V max
V max /2
K
[S]
M
Trasformazione di Lineweaver-Burk v 0 = V max ⋅ [S ] K M + [S
Trasformazione di Lineweaver-Burk
v 0 = V max ⋅ [S ]
K M + [S ]
1
= K M + [ S ]
v
V max ⋅ [ S ]
0
1
[ S ]
K M
v
=
⋅ [ S ] +
V max ⋅ [ S ]
0
V max
1
1
Y
= K M ⋅
v
[ S ] + 1
V
0
V max
max
X
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche 1 1 = K M ⋅ v [S] + 1
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
1
1
= K M ⋅
v
[S] + 1
V
0
V max
max
1/v 0
1/V max
-1/K M
1/[S]
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche Grafico di Lineweaver-Burk 1/V 0 V 0 V max V
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
Grafico di Lineweaver-Burk
1/V 0
V 0
V max
V max /2
1/V max
K M
[S] -1/K M
1/[S]

Esochinasi (HK) e glucochinasi (GK) Glucosio + ATP Glucosio-6-fosfato + ADP

[ glucosio ] in sangue: 5 mM [ glucosio ] intracellulare: 0.2-2 mM Muscolo: HK

Inibita da Glucosio-6-fosfato Utilizzo di glucosio indipendente da [ glucosio ] in sangue

Epatociti: GK

Non inibita da Glucosio-6-fosfato Trasformazione di glucosio in glicogeno dipendente da [ glucosio ] in sangue

Pancreas: GK

Non inibita da Glucosio-6-fosfato Sensore di [ glucosio ] in sangue per la produzione di insulina

  Non inibita da Glucosio-6-fosfato –   Sensore di [ glucosio ] in sangue per la

[alcool] in sangue, g/l

Mµ[aldeide],

Metabolismo dell’alcool

Alcool deidrogenasi

Aldeide deidrogenasi

CH 3 -CH 2 OH &&&&&→ CH 3 -CHO &&&&&→ CH 3 -COO

Etanolo

Acetaldeide

Acetato

•   K M di alcool deidrogenasi per etanolo: 1 mM (46 mg/l) –  
K M di alcool deidrogenasi per etanolo: 1 mM (46 mg/l)
Enzima saturo dopo pochi drinks (anche uno)
Metabolizzazione segue una cinetica di ordine zero
Velocità: 10 g/h
Diminuzione del tasso nel sangue: 0.15 g/l
Indipendente dal tasso iniziale
3 varianti con poche differenze in termini di K M e V max
•  
K M di aldeide deidrogenasi per acetaldeide: 0.01 mM
Livello di acetaldeide 1/1000 di quello di etanolo
In presenza di isoforma con K M =1 mM, accumulo di acetaldeide
“Oriental flush”
con K M =1 mM, accumulo di acetaldeide “Oriental flush” 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0 1 2 3 4
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Tempo, ore dopo 0.6 g/kg

60 50 40 30 20 KM=1 mM KM=0.01 mM 10 0 0 1 2 3
60
50
40
30
20
KM=1 mM
KM=0.01 mM
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Tempo, ore dopo 0.6 g/kg

REGOLAZIONE DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA

Necessità fisiologica; Catene enzìmatiche; Controllo del livello di enzima; Ubiquitina; Fattori fisici e chimici di modulazione dell’attività; Inibizione competitiva e non competitiva; Compartimentalizzazione intracellulare; Modificazioni allosteriche e covalenti; Allosterismo e cooperatività; Cinetica degli enzimi allosterici e cooperativi.

Il buon funzionamento della cellula richiede che le varie attività enzimatiche siano regolate

In condizioni di stato stazionario, i processi cellulari non funzionano mai al massimo delle loro capacità, ma possono anche venire completamente disattivati:

Non produrre prodotti inutili Economizzare energia Aumentare rapidamente l’attività se necessario

Reversibilità delle reazioni enzimatiche •   •   •   L’enzima favorisce il raggiungimento
Reversibilità delle reazioni enzimatiche
L’enzima favorisce il raggiungimento dell’equilibrio, quindi in teoria
potrebbe catalizzare anche la reazione inversa
A ⇐⇒ B
Ma, se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione
diventa praticamente irreversibile
A → B → C
Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene
enzimatiche)
•  
A → B → C → D → E
Anche se le singole reazioni enzimatiche sono reversibili, in pratica il
flusso è unidirezionale perché il prodotto di una reazione funge da
substrato per la reazione successiva
Spesso il prodotto terminale di una sequenza di reazioni (E) inibisce il
deflusso della stessa catena a livello della prima reazione A → B
L’accumulo di E “chiude il rubinetto”
La mancanza di E “riapre il rubinetto”
A → B → C → D → E

Caratteristiche generali delle reazioni regolatorie

ΔG<<0 (maggior efficacia) Precoci nella catena enzimatica Inibizione o regolazione da parte del prodotto finale Gli enzimi coinvolti sono spesso multimerici

Capacità catalitica = (concentrazione di enzima) x (efficienza catalitica)

Controllo della concentrazione di enzima (regolazione lenta)

Regola generale: Tutte le strutture cellulari ed extracellulari (ad eccezione dell’eritrocita umano) sono sottoposte a ricambio ed equilibrio dinamico Quindi, ad ogni istante, il livello di un enzima dipende da:

Velocità di sintesi della proteina Velocità di trasformazione da zimogeno in enzima attivo Velocità di degradazione

Velocità di sintesi

Può aumentare in seguito all’accumulo intracellulare del substrato (es: operon del lattosio) Può aumentare in presenza di induttori gratuiti senza relazione col substrato Può essere repressa dai prodotti terminali della catena enzimatica (es: alcuni aminoacidi (His, Leu), effetto glucosio in E.coli)

Trasformazione da zimogeno (pro-enzima) in enzima attivo

Leu), effetto glucosio in E.coli) Trasformazione da zimogeno (pro-enzima) in enzima attivo proinsulina → insulina 28

proinsulina insulina

Leu), effetto glucosio in E.coli) Trasformazione da zimogeno (pro-enzima) in enzima attivo proinsulina → insulina 28

Chimotripsinogeno chimotripsina

Chimotripsinogeno → chimotripsina Attivazione degli zimogeni pancreatici mediante taglio proteolitico 29

Attivazione degli zimogeni pancreatici mediante taglio proteolitico

Chimotripsinogeno → chimotripsina Attivazione degli zimogeni pancreatici mediante taglio proteolitico 29
Velocità di degradazione Dipende da: • Lisosomi, pinocitosi, endocitosi • Ormoni (insulina, glucagone,

Velocità di degradazione

Dipende da:

Lisosomi, pinocitosi, endocitosi

Ormoni (insulina, glucagone, glucocorticoidi…)

Ubiquitina (The kiss of death), Nobel Prize 2004

Aaron Ciechanover, Avram Hershko e Irwin Rose, Medical Sciences, Technion in Haifa and UC Irvine College of Medicine in California) Proteina altamente conservata (76 aa) e ubiquitaria Attivata da ATP

Gli altri enzimi proteolitici non dipendono da ATP

Si lega covalentemente alla proteina-bersaglio (Lys) Il complesso proteina-ubiquitina marcato per la distruzione

Il complesso proteina-ubiquitina marcato per la distruzione Funzioni biologiche della proteolisi ubiquitina- dipendente
Il complesso proteina-ubiquitina marcato per la distruzione Funzioni biologiche della proteolisi ubiquitina- dipendente
Il complesso proteina-ubiquitina marcato per la distruzione Funzioni biologiche della proteolisi ubiquitina- dipendente

Funzioni biologiche della proteolisi ubiquitina- dipendente

Regolazione del ciclo cellulare

Essenziale per uscire dalla fase mitotica e separare i cromosomi durante mitosi e meiosi Malfunzionamenti causano formazione di cellule con numero anomalo di cromosomi (Down e tumori solidi)

Riparazione del DNA, cancro e apoptosi

Essenziale per mantenere il livello di p53 (il “guardiano del genoma”)

Risposte immunologiche e infiammatorie

Regolazione di NF-kB (fattori di trascrizione) per attivare l’espressione genica Generazione di peptidi MHC (difesa contro le infezioni virali)

Fibrosi cistica

Coinvolta nella mutazione di CFTR (transmembrane conductance regulator)

Compartimentalizzazione

Si può ottenere un forte aumento di concentrazione di molecole compartimentalizzandole in una zona delimitata da una membrana Esempio: GLUcose Transporter (GLUT)

–   GLUT1, costitutivo –   GLUT4, inducibile da insulina
–   GLUT1, costitutivo
–   GLUT4, inducibile da insulina

Modulazione dell’attività dell’enzima (regolazione veloce)

pH Temperatura Inibizione reversibile ed irreversibile:

Competitiva Non-competitiva Uncompetitiva

Modificazioni allosteriche Modificazioni covalenti

pH, temperatura e attività enzimatica •   Ogni enzima ha il suo pH ottimale Il
pH, temperatura e attività enzimatica
Ogni enzima ha il suo pH ottimale
Il pH ottimale può non corrispondere
col pH in cui si trova l’enzima
•  
•  
Per ogni enzima, esiste una temperatura
ottimale
La temperatura ottimale può non
corrispondere con la temperatura in cui
si trova l’enzima (37°C)
Aumento dovuto alla
temperatura
(1.7-2.5 ogni 10°C)
Diminuzione dovuta
alla denaturazione
della proteina
Risultato
Velocità

0

10

20

30

40

50

Temperatura

Inibizione competitiva e non-competitiva

40 50 Temperatura Inibizione competitiva e non-competitiva Competitiva: Substrato e inibitore si legano al sito attivo

Competitiva:

Substrato e inibitore si legano al sito attivo dell’enzima Il complesso enzima+substrato è inattivo

Non-competitiva:

Quando l’enzima lega l’inibitore, l’enzima cambia la conformazione e diventa inattivo

Inibizione competitiva •   I simile a S, compete con S per il sito attivo
Inibizione competitiva
•   I simile a S, compete con S per il sito attivo di E
•   Inibizione reversibile all’aumentare di [S]
•   V max non cambia, K M aumenta
1/v 0
v 0
↑ inibitore
V max
→ inibitore
V max /2
1/V max
1/[S]
→ K M
[S] → 1/K M

Esempi di inibizione enzimatica competitiva

CH 3 OH Metanolo

CH 3 -CH 2 OH Etanolo

→ K M [S] → 1/K M Esempi di inibizione enzimatica competitiva CH 3 OH Metanolo
→ K M [S] → 1/K M Esempi di inibizione enzimatica competitiva CH 3 OH Metanolo

Esempi di inibizione enzimatica competitiva

Metotrexato o antifolato, antileucemico che rallenta la biosintesi di purine e pirimidine

che rallenta la biosintesi di purine e pirimidine Esempi di inibizione enzimatica competitiva Fluorouracile,

Esempi di inibizione enzimatica competitiva

Fluorouracile, analogo della mercaptopurina

di purine e pirimidine Esempi di inibizione enzimatica competitiva Fluorouracile, analogo della mercaptopurina 34

Esempi di inibizione enzimatica competitiva

Substrati suicidi o antimetaboliti, prevengono la reazione col substrato e/o disattivano l’enzima Penicillina inibisce transpeptidasi che stabilizza le membrane batteriche

transpeptidasi che stabilizza le membrane batteriche Inibizione non competitiva •   I reagisce su un sito
Inibizione non competitiva •   I reagisce su un sito diverso dal sito attivo •
Inibizione non competitiva
•   I reagisce su un sito diverso dal sito attivo
•   Tende a disattivare E
•   Inibizione non reversibile all’aumentare di [S]
•   K M non cambia, V max diminuisce
v
1/v 0
0
↓ inibitore
↑ inibitore
↓ V max
↑ 1/V max
↓ V max /2
1/[S]
[S] 1/K M
K M

Esempi di inibizione non-competitiva

Degradazione proteica (temperatura, estremi di pH) Molti veleni e composti mercuriali (reagiscono con -SH dei residui di Cys) Cianuro, reagisce con gli ioni metallici degli enzimi della catena respiratoria Diisopropil fluorofosfato (Sarin), gas nervino, inibisce gli enzimi contenenti Ser (acetilcolinesterasi)

nervino, inibisce gli enzimi contenenti Ser (acetilcolinesterasi) Inibizione uncompetitiva I si lega al complesso ES 36
nervino, inibisce gli enzimi contenenti Ser (acetilcolinesterasi) Inibizione uncompetitiva I si lega al complesso ES 36

Inibizione uncompetitiva

I si lega al complesso ES

nervino, inibisce gli enzimi contenenti Ser (acetilcolinesterasi) Inibizione uncompetitiva I si lega al complesso ES 36
Inibizione uncompetitiva •   L’inibitore reagisce con il complesso ES •   Cambiamenti simultanei di
Inibizione uncompetitiva
•   L’inibitore reagisce con il complesso ES
•   Cambiamenti simultanei di K M e V max
V
1/V 0
0
+ inibitore
V
max
+ inibitore
1/V max
1/[S]
K
[S]
1/K M
M
V max + inibitore 1/V max 1/[S] K [S] 1/K M M Modificazioni covalenti degli enzimi
V max + inibitore 1/V max 1/[S] K [S] 1/K M M Modificazioni covalenti degli enzimi

Modificazioni covalenti degli enzimi

La fosforilazione AUMENTA l’attività di alcuni enzimi

Glicogeno fosforilasi, citrato liasi, fosforilasi

b chinasi, HMG-CoA reduttasi chinasi e altri

La fosforilazione DIMINUISCE l’attività di altri enzimi

Acetil-CoA carbossilasi, glicogeno sintasi, piruvato deidrogenasi, HMG-CoA reduttasi

e altri

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1992

Edmond H. Fischer and Edwin G. Krebs, Professors Emeritus, University of Washington, Seattle, USA … for their discoveries concerning reversible protein phosphorylation as a biological regulatory mechanism

cAMP

cAMP Ormone cAMP come secondo messaggero Proteina G Recettore Adenilato ciclasi ATP cAMP R R R
Ormone cAMP come secondo messaggero Proteina G Recettore Adenilato ciclasi ATP cAMP R R R
Ormone
cAMP come secondo messaggero
Proteina
G
Recettore
Adenilato
ciclasi
ATP
cAMP
R
R
R
C
R
C
Protein chinasi A
inattiva
C
C

Protein chinasi A attiva

Allosterismo allo = l’altro

Attività enzimatica sotto il controllo di un modulatore Classe K o V: altera K M o V max Inibitore o stimolatore Interazione eterotropica: il modulatore è diverso dal substrato Interazione omotropica: il modulatore funge anche da substrato

omotropica: il modulatore funge anche da substrato Jacques Monod Nobel Prize 1965 Quando due leganti si

Jacques Monod Nobel Prize 1965

Quando due leganti si legano alla stessa proteina, possono influenzare l’uno il legame dell’altro

•   Esochinasi (HK) Glucosio + ATP ⇐⇒ glucosio-6-fosfato + ADP •   Quando HK
•   Esochinasi (HK)
Glucosio + ATP ⇐⇒ glucosio-6-fosfato + ADP
•   Quando HK lega glucosio, l’affinità per ATP
aumenta
•   Quando HK lega ATP, l’affinità per glucosio
aumenta

Allosterismo

Effetto reciproco di due leganti quando i siti di legame sono separati Se i due leganti si legano alla STESSA conformazione di un enzima, ne risulta un’interazione POSITIVA Se i due leganti si legano a conformazioni DIVERSE , ne risulta un’interazione NEGATIVA

A A A S S
A
A
A
S
S

Modello di enzima allosterico multimerico

A provoca un cambiamento conformazionale che facilita il legame con S Il cambiamento conformazionale è trasmesso alla subunità adiacente Allosterismo e cooperatività:

Allosterismo: cambiamenti conformazionali di una subunità in risposta ad un effettore allosterico Cooperatività: cambiamenti conformazionali di una subunità in risposta al cambiamento conformazionale della subunità adiacente Conformazione privilegiata nell’evoluzione naturale: il destino di una molecola è associato alla presenza/assenza di un’altra

Cinetiche degli enzimi allosterici e cooperativi •   Sigmoide, non iperbolico •   NON-Michaelis-Menten •
Cinetiche degli enzimi allosterici e cooperativi
•   Sigmoide, non iperbolico
•   NON-Michaelis-Menten
•   Sempre più efficaci all’aumentare del numero di subunità
v 0
4 subunità
1 subunità
2 subunità
[S]