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Nas indstrias qumicas, farmacuticas, alimentcias, refinarias, petroqumicas, laboratrios de anlises clnicas, ambiental e forense entre outras, frequentemente necessrio separar, isolar, purificar, identificar e quantificar os componentes de misturas muitas vezes bastante complexas.
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Cromatografia
Poder de resoluo
Simplicidade da tcnica
COLUNA CROMATOGRFICA
FLUXO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
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COLUNA CROMATOGRFICA
FLUXO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
SINAL
TEMPO
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COLUNA CROMATOGRFICA
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DETECTOR
CROMATOGRAMA
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COLUNA CROMATOGRFICA
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CROMATOGRAMA
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COLUNA CROMATOGRFICA
FLUXO
DETECTOR
CROMATOGRAMA
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CROMATOGRAFIA
TCNICA
PLANAR
EM COLUNA
FASE MVEL
LQUIDO
GS
FLUIDO SUPERCRTICO
LQUIDO
FASE ESTACIONRIA
LQUIDO SLIDO FASE LIGADA LQUIDO SLIDO FASE LIGADA SLIDO FASE LIGADA LQUIDO SLIDO FASE LIGADA
HPLC
Requisitos da amostra
Amostra solvel na fase mvel Lquidos e slidos Inicos ou covalentes Baixo e alto peso molecular Em geral mais lentas que CG
Tipo de Amostra
BOMBA
AQUISIO DE DADOS
O cromatgrafo a lquido constitudo dos seguintes componentes: 1. 2. 3. 4. 5. Reservatrio e sistema de bombeamento da fase mvel Sistema de introduo de amostra Sistema analtico: coluna cromatogrfica e termostato Sistema de deteco (um ou mais detectores) Sistema de registro e tratamento de dados.
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tampa de teflon
A escolha do filtro funo da natureza da fase mvel. Usualmente utiliza-se membranas de nylon (0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5 m)
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CONSIDERAO IMPORTANTE 2: A fase mvel deve ser degaseificada para evitar a formao de bolhas no processo de separao o que pode interferir no desempenho da anlise. As tcnicas de degaseificao so: Ultrasom Refluxo com resistncia de aquecimento Vcuo (trompa dgua) Purga com Hlio Uso de membrana semipermevel e vcuo online.
CONSIDERAES IMPORTANTES
Vazo constante essencial para qualquer separao por HPLC. Alta presso necessria para impulsionar o solvente atravs da coluna cromatogrfica vencendo a enorme resistncia imposta pela fase estacionria. Normalmente se utiliza bombas recprocas com um ou preferencialmente dois pistes o que minimiza pulsao. Preferencialmente devem operar com programao de vazo e deve ser possvel a interrupo do processo em presses fora dos limites mximos e mnimos pr-estabelecidos. importante introduzir fatores de correo de compressibilidade para a fase mvel utilizada ainda que os lquidos tenham baixa compressibilidade. Caso contrrio, a vazo real pode diferir da selecionada.
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BOMBEAMENTO POR GRADIENTE Alguma anlises necessitam alterao da composio da fase mvel, sem alterao da vazo total, com a finalidade de diminuir tempo de anlise e/ou melhorar a separao dos componentes da amostra.
O bombeamento por gradiente pode ocorrer baixa presso ou a alta presso. No caso de baixa presso utiliza-se uma nica bomba e a seleo do solvente a ser utilizado d-se atravs de vlvula de multiplas vias controladas pelo software do sistema. J no caso do bombeamento de alta presso, cada solvente tem uma bomba especfica. A figura abaixo ilustra o equipamento necessrio para o a anlise por gradiente a baixa e alta presso.
A figura abaixo ilustra dois cromatogramas obtidos por anlises isocrtica e por gradiente. ISOCRTICA GRADIENTE
A amostra introduzida na vlvula com auxlio de uma microseringa com agulha sem ponta e a injeo efetuada pela rotao da vlvula da posio de carga para a posio de injeo.
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O detector um dispositivo conectado na sada da coluna que percebe a presena de componentes e emite um sinal eltrico a ser registrado na forma de um pico cuja rea proporcional a quantidade do componente analisado. Um detector ideal deve possuir as seguintes caractersticas: Alta Sensibilidade Estabilidade Mudanas de temperatura e vazo de fase mvel no devem alterar o sinal Reprodutibilidade Resposta Linear A resposta do detector deve variar linearmente com a concentrao do analito numa de concentrao Resposta rpida aos analitos No contribuir para o alargamento do pico O volume da cela do detector deve ser o menor possvel para evitar a perda de eficincia Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a sensibilidade. Confiabilidade Facilidade de manuseio No destrutivo Condio necessria para cromatografia preparativa Seletividade Habilidade relativa de um detector medir um composto e no outro. Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
extensa faixa
do sistema.
TIPOS DE DETECTORES
Os principais detectores utilizados em HPLC so: ndice de refrao Espectrofotometira UV-Visvel Fluorescncia Eletroqumico Espectrometria de massa LC/MS
ESPECTROFOTMETRO UV-Visvel (UV-VIS) TIPOS DE DETECTORES UV-VIS: Espectrofotomtricos O comprimento de onda varivel entre 190nm e 800nm selecionado atravs do monocromador (UV = lmpada de deutrio e VIS = lmpada de tungstnio). Possui maior aplicao pois permite selecionar o comprimento de onda mais adequado para os componentes a serem analisados. Maior sensibilidade: escolha do comprimento de onda de maior absorbncia. Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de interesse absorve e outros no. Permite a utilizao de anlise por gradiente: escolha do comprimento de onda onde os constituintes da fase mvel no apresentam variao de absorbncia. Permite obter o espectro de absorbncia de cada componente separado interrompendo o fluxo da fase mvel e assim selecionar o melhor comprimento de onda.
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Como mostra o esquema do detector, o comprimento de onda selecionado atravs do monocromador do feixe de luz emitido pela lmpada de deutrio ou tungstnio e incide na cela por onde passam os componentes da amostra que absorve parte da luz dependendo de sua absortividade molar e concentrao. A quantidade de luz no absorvida detectada pela fotomultiplicadora.
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ndice de Refrao Mudana do IR da fase mvel Universal Micrograma 103 104 3-15 Alta
Espectrofotometria UVVIS Absorbncia de luz UVVIS Seletivo Nanograma 104 105 1-20 Baixa Compostos que absorvem na regio UVVIS
Fluorescncia Excitao com luz produz emisso fluorescente Seletivo < picograma 103 105 8-25 Baixa Compostos ou derivados que fluorescem
Eletroqumico Oxidao ou reduo em um potencial fixo Seletivo Fentograma 105 5-10 Mdia Espcies que oxidam ou reduzem
Princpio de operao Tipo Quantidade mnima detectvel Faixa de linearidade Volume da cela (microlitro) Sensibilidade a temperatura Aplicaes
Geral
Charged Aerosol
UV
Refractive Index
Atualmente utilizam-se softwares que permitem: Processar os dados de cromatograma Armazenar e registrar Controlar a composio da fase mvel (isocrtica e por gradiente), vazo da bomba, amostrador automtico, temperatura da coluna Realizar clculos para System Suitability Test (SST)
Em funo da fase estacionria utilizada tem-se os seguintes mecanismos de separao: Adsoro Partio Troca inica Excluso Bioafinidade
Kads =
FM
FE
PARTIO A fase estacionria um lquido depositado ou quimicamente ligado a um suporte slido. As molculas dos componentes a serem separados se distribuem entre a fase estacionria ligada e a fase mvel lquida de acordo com sua afinidade relativa:
Kpart =
PARTIO
FM
FE
A FM carrega as molculas nela dissolvidas. Para reestabelecer o equilbrio, molculas na FE passam para a FM e so arrastadas. Tem-se um equilbrio dinmico em cada segmento da coluna. Como a FM est em contnuo movimento, esta acaba retirando todas as molculas da coluna.
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TROCA INICA
A fase estacionria uma resina catinica ou aninica. O esquema abaixo ilustra o processo:
+ + + -
A separao efetuada de acordo com o tamanho das molculas. A fase estacionria tem poros de tamanho controlado Molculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros e apresentam um maior tempo de reteno Molculas grandes movem-se rapidamente atravs da coluna pois no entram nos poros A tcnica utilizada na anlise de compostos de alta massa molecular O mecanismo da excluso forma a base da cromatografia gel (permeao de gel e filtrao de gel) utilizada na determinao de distribuio de peso molecular de polmeros e protenas
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Nessa tcnica somente componentes que possuem bioafinidade com a fase estacionria so retidos.
Uma srie de parmetros cromatogrficos so importantes para serem utilizados na identificao dos compostos separados, avaliar o desempenho cromatogrfico e auxiliar na otimizao do processo de separao.
Na anlise cromatogrfica, mantido constantes a vazo da fase mvel e a temperatura da coluna, o tempo de reteno constante.
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A partir da figura acima, definimos os seguintes parmetros cromatogrficos de acordo com as equaes abaixo:
Parmetro Cromatogrfico Definio
k =
tr / to tr2 / tr1
= 16 ( tr / Wb )2
Outra medida da eficincia da coluna dada pela altura do prato, H (altura equivalente a um prato terico. onde L = comprimento da coluna L H= N = nmero de pratos N
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A introduo da amostra na coluna leva menos de 1 segundo. Como o equilbrio entre FE e FM muito rpido, a largura dos picos tambm deveria ser aproximadamente 1 segundo. Entretanto, isso no ocorre devido a processos de transporte de massa que altera a velocidade das molculas de um mesmo composto dentro da coluna. Estatisticamente algumas molculas viajam mais rapidamente e outras mais lentamente que a mdia das molculas, atingindo o detector em tempos diferentes. Consequentemente, o pico registrado alargado. Alm dos processos de transporte de massa, causas externas coluna, tambm contribuem para o alargamento dos picos. Quanto maior o valor de N maior a eficincia da coluna. A altura equivalente a um prato terico outra maneira de considerar a eficincia da coluna. Quanto menor H, maior a eficincia da coluna. H o resultado da somatria das contribuies de cada um dos processos de alargamento intra-coluna(Hi) e extra-coluna(He).
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5 3 Vazo
As FE so constitudas de material slido, granulado, finamente dividido e densamente empacotado dentro de um tubo feito de material inerte, normalmente ao. O material slido pode estar revestido ou ligado quimicamente a um lquido.
Colunas de permeao de gel fabricadas com sais de clcio ou chumbo de resinas sulfnicas com dimetro de poro controlado, so usadas nas anlises de dextrana, oligossacardeos e acares.
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
Grupos silanis so responsveis por retenes no especficas que provocam alargamento dos picos.
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As slicas usuais s podem ser utilizadas na faixa de pH 2 8, pois os grupos TMS sofrem hidrolise a pH menor que 2 e a slica se dissolve em fase mvel contendo gua em pH maior que 8. Muitos desses problemas: cauda nos picos de analitos bsicos, limitao de pH, baixo tempo de vida da coluna, tem sido resolvidos ou minimizados atravs de desenvolvimentos mais recentes, tais como: slica de alta pureza, partculas hibridas, slica tipo C(slica hidreto) e novas quimicas ligantes.
ENDCAPPING
FASES ESTACIONRIAS
fase reversa.
OCTADECIL
OCTIL
FENIL
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
C8 C8 C8 C8
Si- O - Si O O
CH2CH2CH2CH2-
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
Si- O - Si O O
Si- O - Si -
Si- O - Si -
Si- O - Si -
FASE MVEL
ESCOLHA DO SOLVENTE EM HPLC O sucesso da separao cromatogrfica s possvel se for aplicada uma FM correta a uma FE conveniente. A escolha da composio da FM leva em conta vrios fatores, tais como:
Propriedades fsico-qumicas que afetam a solubilidade, partio e adsoro e, portanto, a separao Propriedades fsicas que afetam a possibilidade de deteco dos componentes Propriedades fsicas que dificultam o manuseio das bombas, detectores ecoluna Propriedades que afetam a segurana (toxidez e inflamabilidade) Custo
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FASE MVEL
SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS Os seguintes parmetros devem ser considerados para uma escolha adequada da FM: Viscosidade Compressibilidade Presso de vapor Toxidez ndice de Refrao Corte de UV (cut off) espectro de absoro UV-VIS Miscibilidade de solventes e outras caractersticas importantes Fora dos Solventes
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gua, metanol, hidrocarbonetos e outros compostos com viscosidade menor que 1cP so timos solventes no parmetro viscosidade. A viscosidade influncia na eficincia pois afeta o coeficiente de difuso acarretando em perda de nmero de pratos tericos da coluna. A viscosidade de misturas de solventes no varia linearmente com a composio.
UV cut off 200 200 263 245 235 215 215 330 260 215 190 210 205 -
IR 20C 1.3750 1.3910 1.4595 1.4460 1.4240 1.4070 1.3530 1.3590 1.3720 1.4220 1.3440 1.3770 1.3290 1.3328
FASE MVEL
RELAO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM
Ao variar a polaridade da fase mvel, varia o fator capacidade(k=tr/to) e consequentemente a seletividade na separao. Variao de tr e resoluo com a composio do solvente em anlise de metil, etil, propil e butil parabenos. coluna ODS (10cm x 0.6 cm), UV 254nm, 40C, gua/metanol
FASE MVEL
Utilizar Fase Normal Adicione pequenas quantidades de modificadores orgnicos fortes Ajuste pH para os compostos parcialmente inicos; fora inica Ajuste Temperatura Altere o modificador
fator reteno : k = tR / tM fator separao: = k2 / k1 = tR2 / tR1
Glicina
OClMERC
Isoindol
OCl-
OPA / MERC
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Picos com cauda em fase reversa continua sendo um problema em cromatografia. Particularmente na separao de compostos bsicos e portanto um problema constante na anlise de produtos farmacuticos. Picos com cauda causam inmeros problemas, incluindo baixa resoluo, sensibilidade reduzida , preciso e quantificao inadequada. A figura 1 ilustra como a resoluo e sensibilidade da amostra afetada por picos com cauda. A figura 2 ilustra como a exatido e preciso de uma anlise pode sofrer devido a inabilidade dos sistemas de dados identificar exatamente onde uma cauda do pico inicia e termina.
DISSOLVA A AMOSTRA NA FASE MVEL OU REDUZA A FORA DO SOLVENTE REDUZA A MASSA DE AMOSTRA INJETADA TABELA 2 INDICA A QUANTIDADE RECOMENDADA DE AMOSTRA A SER INJETADA PARA DIFERENTES COLUNAS. REDUZA O pH da FASE MVEL PARA <3 AUMENTE A FORA INICA DA FASE MVEL, 25mM A 50mM RECOMENDADO ADICIONE UMA AMINA COMPETITIVA NA FASE MVEL 10mM DE TEA SUFICIENTE. SELECIONE FASE ESTACIONRIA COM MENOR ATIVIDADE DE SILANOL.- FIG.6 AUMENTE A CONC. DE SAL NA FASE MVEL. 25mM A 50mM E USUALMENTE SUFICIENTE. REDUZA O pH da FASE MVEL PARA <3. ADICIONE UM CIDO ORGNICO COMPETITIVO. 1% DE ACIDO ACTICO OU 0.1% DE TFA USUALMENTE SUFICIENTE. SUBSTITUA A COLUNA. TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS RARAMENTE VALE A PENA.
VAZIOS NA COLUNA
Problemas com a forma do pico de compostos bsicos so normalmente comuns. Mas h vrios passos simples que podem melhorar significativamente a forma do pico de bases: 1- Selecione uma coluna base-slica desativada. 2- Usar fase mvel com baixo ph. 3 Aumento da concentrao de sais na fase mvel. 4 Selecione uma coluna heavily endcapped. 5 Adicione uma base competitiva.
Alguns fabricantes resolveram o problema usando silanos polares com fase ligada ou usando endcapping hidrofilico. Ambos tem o mesmo efeito de manter a fase alquilica(C18 ou C8) extendida, mesmo MBOS quando se usa fase mvel 100% aquosa. Colunas: AquaSep, HydroBond AQ, HydroBond PS, ProntoSIl AQ, Zorbax SB AQ
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A anlise qualitativa em HPLC tem por objetivo a identificao dos analitos de interesse. Existem dois casos a serem considerados para anlise qualitativa com HPLC: Anlise Qualitativa em Controle de qualidade
MTODOS POR NORMALIZAO Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna e so detectveis Existem dois procedimentos: Normalizao de rea (% em rea) Normalizao utilizando-se a rea corrigida
%i
Ai x100 Ai
Ai = rea do composto i Ai = somatria das reas de todos componentes Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional a sua concentrao e que mesma concentrao de diferentes compostos resulte em reas iguais (o que dificilmente ocorre).
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Ai = rea do composto i Fi = fator de resposta do componente i AiFi = somatria das reas de todos componentes multiplicadas pelos respectivos fatores de resposta necessrio conhecer todos os componentes da amostra para determinao dos fatores de resposta de cada componente
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Ai
Ci
Nesta tcnica, se o volume injetado no for exatamente o mesmo ou se houver alterao de algum parmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo, variao da intensidade de luz do UV-VIS ou alterao na FM, as reas dos picos podero ser maiores ou menores daquelas obtidas na calibrao e consequentemente os resultados sero incorretos.
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1. Determina-se a curva de calibrao de cada componente atravs da anlise de misturas padres contendo o padro interno. Nessa curva de calibrao utiliza-se a relao entre rea do componente i e rea do padro interno em funo das relaes de suas concentraes. 2. Posteriormente, injeta-se a amostra contendo padro interno (preferencialmente na mesma concentrao utilizada na calibrao) e obtem-se a concentrao do analito atravs da curva de calibrao. Se o volume de amostra injetado for diferente do utilizado na calibrao, ou se algum parmetro analtico for alterado resultando em reas diferentes daquelas esperadas nas condies de calibrao, a relao de rea entre analito e padro interno no ser afetada.
Ai / Api
Ci / Cpi
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