PREPARACIONES Y TINCIONES

PREPARACIONES
En fresco Temporales:
Fijas:
Gram, Ziehl Nielsen, Sheaffer y fulton, SEM, TEM, naranja de acridina.

Microcultivos de hongos, preparaciones de

tejidos

CONTRASTE DE FASES

PREPARACIONES TEMPORALES:

microcultivo de hongos

1.

Colocar en una caja de petri, un soporte para portaobjetos, un portaobjetos, 2 cubreobjetos y esterilizar a 121C por 15 min. Colocar sobre el portaobjetos un fragmento de agar papa dextrosa de 1cm2. Inocular con el asa micolgica cada lado del cuadrito de agar con el cultivo del hongo. Colocar encima un cubreobjetos. Colocar a un lado, una torunda de algodn impregnada de glicerol al 10%, estril; incubar a 28C durante 48 h.

2.

3.

4.

MICROCULTIVO

PREPARACIONES TEMPORALES:

microcultivo de hongos
5. Eliminar la torunda y agregar dos gotitas de formaldehdo g.r. Dejar reposar una hora. En un portaobjetos, colocar una gotita de azul de algodn y colocar el cubreobjetos superior del microcultivo, sellar con esmalte de uas transparente. Eliminar el agar y colocar otra gotita de azul de algodn, sellar con esmalte.

6.

7.

Observar a 10X y 40 X. Realizar respetando los aumentos y colorearlos.

dibujos

MICROCULTIVO

Penicillium sp.

Acremonium sp.

Preparaciones Fijas
Agentes fijadores Agentes fsicos .- calor, resinas Agentes qumicos: Etanol al 100% Paraformaldehdo Gliceraldehdo tetrxido de osmio

Preparaciones Fijas:
Transferir una pequea porcin de la colonia a un portaobjetos limpio y desengrasado, homogeneizar con una gotita de agua. Dejar secar al aire y fijar con calor suave.

TINCIONES
TINCIONES SIMPLES TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES ESPECFICAS

Tincin de Gram
Colocar una gotita de cristal violeta sobre el frotis, dejar interactuar 1 min. Enjuagar con agua Colocar una gotita de lugol durante 1 min., enjuagar con agua Colocar dos gotitas de etanol-acetona y enjuagar con agua Colocar una gotita de safranina, 30 seg., y enjuagar con agua dejar secar y observar a 10X, 40X y 100X a inmersin. Dibujar y colorear.

Cepas aisladas de gasoductos

(Tincin de Gram)

TINCIN CON NARANJA DE ACRIDINA

Transferir una gota del cultivo a un portaobjetos limpio y desengrasado, dejar secar al aire. Fijar con etanol al 100%, cubriendo el frotis durante 5 min. Eliminar el etanol y colocar 100 L de naranja de acridina durante 3 min.

TINCIN CON NARANJA DE ACRIDINA

Eliminar el exceso del colorante con etanol al 70%. Observar en un microscopio de epifluorescencia con un filtro azul, emisin a 490 nm.

MICROSCOPIA DE EPIFLUORESCENCIA

PREPARACIN FIJA: SEM

Fijar una porcin del cultivo con glutaraldehdo al 2%, g.m. por 8 h. Eliminar el glutaraldehdo lavando 3-4 veces con amortiguador de fosfatos Agregar 2 gotas de tetrxido de osmio y fijar durante 3 h. Lavar con amortiguador de fosfatos Deshidratar con etanol en concentraciones crecientes (40, 50, 60, 70 , 90 y 100%) Secar al punto crtico durante 1h Cubrir con carbono y oro en polvo Observar en el microscopio electrnico.

Microscopa Electrnica De Barrido (SEM)

biopelcula de 10 m de grosor D. alaskensis

TINCIN DIFERENCIAL TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN (AAR)

Se utiliza para diferenciar las bacterias denominadas cido alcohol resistentes de las No cido alcohol resistentes Algunas bacterias poseen, en su pared celular, ciertos cidos grasos de cadena larga que les confiere la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol cido, tras haber sido teidas con colorantes bsicos. Esta tincin requiere un calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene la capa cerosa formada por cido miclico

TINCIN DIFERENCIAL TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN (AAR)

Frotis bacteriano Cubrir el frotis con Fucsina fenicada y calentar hasta emisin de vapores durante 5 minutos. Lavar con agua de la llave Decolorar con alcohol cido 1 minuto (asegurndose de que no se desprende mas color rojo). Lavar con agua de la llave para eliminar el exceso Agregar azul de metileno al 1% como colorante de contraste

Mycobacterium sp. 1000 X

Nocardia asteroides, 1000 X

Los bacilos cido alcohol resistentes aparecen coloreados en rojo sobre el fondo azul de la preparacin. Este tipo de tincin se utiliza para observar los gneros Mycobacterium y Nocardia Las bacterias No cido alcohol resistentes se tien con el colorante de contraste (azul)

Tinciones Estructurales
Estructura
Flagelos

Tincin
Mtodo de Fontana-Tribondeau Mtodo de Leifson

Esporas
Cpsula Corpsculos Grnulos Metacromticos

Mtodo de Moeller Mtodo de Wirtz-Conklin

Mtodo de Hiss Mtodo de la Tinta china Mtodo de Albert Mtodo de Loeffler

TINCIN DE SCHAEFFER-FULTON
Las esporas son formas de resistencia bacteriana. Tienen forma esfrica u oval. Al microscopio las esporas sin teir se observan como grnulos brillantes. Segn su localizacin se distinguen tres tipos de esporas: Centrales, Subterminales, Terminales
Realizar el frotis Cubrir el frotis con verde de malaquita Calentar 5 minutos a emisin de vapores Enjuagar con agua de la llave Cubrir con la Safranina dejar actuar 1 minuto lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.

Endosporas:
Tcnica Schaeffer y Fulton

Bacillus sp.

2000 X

1250X

TINCIN DE NEGATIVA DE CAPSULA

La cpsula es una capa mucosa, ms o menos gruesa, que envuelve la pared celular de algunas bacterias. Esta compuesta de polisacaridos, mucopolisacaridos o polipptidos Por su alto contenido de agua se tien dbilmente por los colorantes Prepara un frotis a partir de una suspensin densa de bacterias en solucin salina al 0.85% Agregar una gotita de cristal violeta o de tinta china. Dejar secar al aire y observar