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Introduzione Il fenomeno della interferenza virale fu descritto da lsaacs e Lindenmann nel 19 571.

Essi videro che una coltura tissutale o un animale da esperimento infettati con un virus divenivano in un tempo successivo resistenti ad una nuova infezion e provocata con lo stesso virus o con un virus differente. Alla sostanza artefic e di tale interferenza diedero il nome di INTERFERONE (IFN). Gli stessi lsaacs e Lindenmann riconobbero subito la potenzialit terapeutica di u na tale sostanza ma sono passati circa trenta anni sino al momento in cui tale p rospettiva si tramutata in realt. Perch mai? Il motivo principale che tali molecol e sono estremamente attive e pertanto esse vengono prodotte dall organismo in quan tit molto limitate. Soltanto le pi moderne tecnologie hanno consentito una loro id onea purificazione e una adeguata produzione mediante le metodiche di biologia m olecolare. Per di pi, esse sono una categoria di farmaci naturali completamente nuo va che, se un paragone pu essere fatto, trovano un corrispettivo nell attivit degli ormoni. Di conseguenza, gli sperimentatori hanno dovuto progressivamente imparar e a padroneggiare tali sostanze.

Gli interferoni Vengono chiamate interferoni quelle proteine solubili, appartenenti alla famigli a delle citochine, prodotte da quasi tutte le cellule dei vertebrati, che induco no una resistenza antivirale in molti stipiti cellulari in relazione ad un ampia v ariet di virus. Tale attivit nettamente differente per tempi e per modalit da quell a espletata dalle immunoglobuline. L interferone agisce idoneamente sulle cellule della stessa specie da cui esso sta to derivato (specie-specificit), ed necessario un metabolismo dell RNA integro affi nch l effetto antivirale possa compiersi. L attivit antivirale non esplica gli effetti positivi sulla cellula infettata che produce l interferone, che di regola muore a causa dell infezione, ma sulle altre contigue, mediante un attivit paracrina. Gli interferoni sono prodotti non solo in seguito ad infezione virale ma anche p er stimolo batterico o di prodotti batterici. Tant che si ritiene che essi possano avere un ruolo anche in quest ultimo tipo di infezione. Vi sono anche sostanze si ntetiche che possono indurre la produzione degli interferoni sia in vitro che in vivo. Sono sostanze a basso peso molecolare, quali il Tilorone e alcuni omopoli meri sintetici dell RNA (Poly 1-Poly C). Uno stimolo idoneo induce le cellule infettate a produrre contemporaneamente div ersi tipi di interferone. Questa pluralit molecolare e funzionale, ovviamente, ha complicato gli studi relativi al loro uso terapeutico. Esistendo quindi una variet di interferoni, s proceduto ad una loro classificazion e in: Interferoni di tipo I, cui appartengono l interteron-alfa, l interferon-beta, l i nterferon-tau e l interferon-omega, e Interferoni di tipo II, cui appartiene l interferon-gamma. I vari interferoni poi si suddividono in differenti proteine analoghe, di cui l in terferon-alfa ha il maggior numero di varianti, alcune glicosilate ed altre non glicosilate. Nell uomo, l lFN-? possiede una sola variante naturale, e cos pure l lFN-g . Gli interferoni di tipo I, interferone-alfa e interferone-beta, sono il prodotto

d una famiglia multigenica, posizionata sul braccio corto del cromosoma 9. Essi presentano sequenze di acidi nucleici codificanti e di amminoacidi strutturali o mologhi al 30-40%. Ma non solo i loro geni sono posizionati sullo stesso cromoso ma, in pi essi condividono anche uno stesso recettore cellulare. L interferon-gamma, interferone di tipo Il, posizionato sul braccio lungo del crom osoma 12, e le somiglianze in sequenze di acidi nucleici o di aminoacidi sono in significanti. Inoltre anche il recettore cellulare differente. Le funzioni degli interferoni di tipo I sono abbastanza simili, derivando da una differenziazione filogenetica relativamente recente. L interferon-gamma invece di fferente dagli altri, strutturalmente e funzionalmente, ma non in maniera sostan ziale, altrimenti non sarebbe pi un interferone.

Attivit degli interferoni Gli interferoni posseggono molteplici attivit: attivit antivirale, attivit antiprol iferativa e citomodificatrice, attivit immunomodulatrice. I meccanismi dell attivit antivirale degli interferoni non sono ancora stati chiari ti completamente. Infatti l interferone inibisce la replicazione di un cos gran num ero di virus, a loro volta cos differenti gli uni dagli altri, che si costretti a ipotizzare differenti meccanismi d azione. L attivit antivirale non ha per oggetto i virus ma le cellule, le quali vengono mod ificate in maniera tale che la replicazione virale non possa pi avere luogo. Ci av viene tramite 1. L inibizione della sintesi proteica necessaria alla replicazione virale. 2. La modificazione delle caratteristiche della membrana cellulare, che pertanto risulta meno aggredibile dal virus. L attivit inibente la replicazione virale in vitro differente da quella in vivo in quanto, in queste ultime condizioni, l influenza dell interferone sul sistema immuni tario contribuisce sostanzialmente all attivit antivirale complessiva. Il potere an tivirale degli IFN nei confronti dei vari ceppi virali molto variabile, e questo aspetto colpisce notevolente. I soggetti sani non presentano tracce significative di interferone a livello ema tico, in quanto gli interferoni sono prodotti in vivo soprattutto in occasione d i una infezione virale. In aggiunta all attivit antivirale gli interferoni posseggono anche: attivit antiproliferativa e citomodificatrice, il cui meccanismo non ancora del t utto definito, ma che diverso da quello dei farmaci citotostatici. Tali attivit s i esplicano soprattutto mediante la capacit interferonica di allungare il ciclo c ellulare, di indurre la differenziazione, di modificare le propriet della membran a, di aumentare i recettori e gli antigeni di membrana, di modificare il citosch eletro. Queste propriet vengono sfruttate nella terapia antitumorale e il potere antiprol iferativo dei vari IFN varia notevolmente in funzione della cellula tumorale con cui si ha a che fare. Posseggono, come si detto, anche attivit immunomodulatrice.

1. Incrementano l attivit macrofagica, e quindi la loro funzione di cellule pr esentanti l antigene. 2. Stimolano l attivit delle cellule NK (natural killer) e dei linfociti kille r. Queste cellule sono importanti quali responsabili della lisi cellulare, ad es empio per cellule infettate da virus o cellule tumorali. 3. Regolano l attivit dei linfociti B, in relazione alla dose di IFN e al temp o intercorso dal contatto con l antigene. 4. Aumentano la risposta in vitro dei linfociti T ai mitogeni ma deprimono le reazioni di ipersensibilit ritardata. 5. Ritardano il rigetto dei trapianti.

6. Aumentano l espressione degli antigeni di istocompatibilit: alfa e gamma-IF N quelli di classe I, e il gamma-IFN quelli di classe Il. Molto pi complesse sono le attivit che vengono espletate in presenza di altre cito chine. Da tutto ci deriva che le propriet degli interferoni hanno rilevanza nella patogen esi della sclerosi multipla (SM) e, potenzialmente. nel suo trattamento. Quando gli interferoni furono usati per le prime volte nel trattamento della scl erosi multipla, l obiettivo degli sperimentatori era quello di eradicare o tenere a bada una possibile infezione virale latente. Come noto, soprattutto i criteri epidemiologici sono favorevoli ad una tale ipotesi, indipendentemente dal fatto che i virus abbiano una funzione patogenetica diretta o mediata. Questo punto di vista rimane tuttora valido, anche se non ancora supportato da riscontri sperim entali decisivi. Successivamente per, si visto che anche le propriet immunomodulatrici degli interf eroni potevano influire positivamente sugli aspetti disimmunitari della malattia , e quindi sulla sua supposta patogenesi autoimmunitaria. Non si deve comunque dimenticare che molti dei dati di immunologia interferonica oggi disponibili sono stati ottenuti in vitro o sull animale da esperimento e non detto che tali dati abbiano valore anche nell uomo. Suddivideremo queste caratteristiche, per comodit, in propriet degli interferoni c he contribuiscono alla patogenesi della SM e propriet del beta-interferon che pos sono influenzare positivamente il decorso clinico. Per quel che riguarda il prim o gruppo: 1. Indagini immunoistochimiche hanno dimostrato che sia il gamma-interferon che il tumor necrosis factor-alfa sono rinvenibili peculiarmente a livello delle pla cche acute di demielinizzazione. 2. Entrambe queste citochine portano ad una maggiore espressione del comple sso maggiore di istocompatibilit di classe Il e ad un aumento della citotossicit d ei monociti e dei macrofagi. 3. Sia l interteron-gamma che il tumor necrosis factor-alfa sono aumentati nel liq uido cefalo-rachidiano durante le fasi attive della malattia. 4. I linfociti-T secernenti gamma-IFN sono aumentati nel liquor di pazienti con SM ed i loro monociti ematici sintetizzano pi gamma-IFN. 5. Il gamma-IFN induce l espressione degli antigeni del maggior complesso di istoc

ompatibilit di classe Il sugli astrociti, sull endotelio vascolare e sulla microgli a. 6. Il gamma-IFN induce l espressione della l-CAM-1 sull endotelio microvascolare, il che facilita la migrazione dei linfociti nelle sedi d infiammazione. 7. Il gamma-IFN insieme con l interleuchina-4 (IL-4) potenziano la proliferazione dei B-linfociti e la loro sintesi di lgG. 8. Per finire, si sa che il gamma-interferon ha provocato ricadute della malatti a e attivazioni del sistema immune nella sperimentazione terapeutica sull uomo2. Per quanto concerne il secondo gruppo di dati: 1. ll beta-lFN inibisce la sintesi del gmma-IFN da parte dei monociti del sangue periferico. 2. Inibisce l espressione dell antigene HLA-DR degli astrociti in coltura. 3. Riduce l espressione dell antigene HLA-DR sui monociti circolanti dei pazienti co n SM in fase acuta. 4. Migliora l attivit dei linfociti-T soppressori nei pazienti con SM progressiva. E preferibile prendere questi dati cos come essi sono, senza troppi commenti. Siam o, infatti, in un campo molto vasto, a cui di giorno in giorno giungono molti co ntributi, talora contraddittori. Ne consegue che i nostri punti di vista persona li di oggi potrebbero essere rovesciati in un qualsiasi momento successivo.

L interferone-beta Per quel che riguarda i tre tipi di beta interterone attualmente disponibili in commercio, l interferone-beta-1b, primo ad essere stato ufficialmente accreditato per l uso nella SM remittente-recidivante, prodotto da colture transfettate di Esc herichia coli, e proprio per questo motivo ha delle caratteristiche che lo rendo no differente dal beta-IFN naturale: il corredo genetico dell Escherichia coli non possiede i geni per la produzione della catena carboidratica, della quale la mo lecola quindi mancante. Inoltre non presente la metionina nella posizione 1della sequenza molecolare, e la cisteina in posizione 17 sostituita dalla serina. Tut to questo rende la sua struttura molecolare differente da quella del beta-IFN na turale e, verosimilmente, modifica pure alcune propriet antigeniche. Questo non i nficia le capacit antivirali, immunomodulatrici e antiproliferative della molecol a, ma esse sarebbero ridotte in potenza biologica di circa 10 volte. Questa perd ita di potenza biologica sarebbe collegata non direttamente alle variazioni negl i amminoacidi o all assenza della componente carboidratica, bens alla tendenza di q ueste molecole non glicosilate a formare aggregati molecolari, i quali sarebbero quindi biologicamente meno efficaci3. Questi dati necessitano comunque di confe rma da parte di altri laboratori. L interferone beta-1a il secondo interterone ad essere stato messo in commercio. E prodotto in colture di cellule di un mammifero, le cellule ovariche di criceto c inese, transfettate attraverso un plasmide con la componente cromosomica umana c odificante per il beta-IFN. Per tale motivo la sua molecola uguale alla molecola di beta-IFN prodotta dall uomo, sia per quanto concerne la presenza della compone nte glucidica, sia per il corretto posizionamento degli amminoacidi nella moleco la.

Anche il terzo interferone posto in commercio in Italia un interferone beta-1a, analogo al precedente. Come il precedente prodotto mediante colture di cellule o variche di criceto cinese transfettate, le quali, come gi si detto, provenendo da un mammifero, sono in grado di effettuare la glicosilazione. La molecola pertan to del tutto simile alla molecola umana, e le attivit biologiche di entrambi gli interferoni beta-1a sono simili a quelle della molecola naturale. Per quanto riguarda l uso clinico di questi interferoni parleranno ampiamente i pr ossimi oratori e pertanto mi limiter solo ad accennare ai metodi di somministrazi one. Di solito vengono utilizzati due metodi di somministrazione: quello intramuscola re e quello sottocutaneo. Gli altri due, quello endovena e quello intratecale, d i fatto non sono al momento utilizzati. In riferimento ai lavori fatti sul primo degli interferoni 1-a, sembrerebbe che vi sia una differenza di attivit interferonica nel siero del soggetto trattato a seconda che l iniezione venga fatta per via intramuscolare o sottocutanea, con una maggiore attivit per la prima delle due vie. Almeno questo risulta nello studio di John Alam e collaboratori4. Dallo studio di Munaf e collaboratori5, invece, non pare esservi questa differenz a, in quanto le concentrazioni ematiche non mostrano significativa variazione do po somministrazione intramuscolare o sottocutanea. Anche l attivit biologica valutata mediante lo studio della neopterina e della beta -2 microglobulina ematiche, paiono essere simili per le due vie di somministrazi one, che paiono quindi essere equivalenti. Ad ogni buon conto bene sapere che Schering-Farmades e Serono raccomandano la vi a sottocutanea per i loro rispettivi prodotti, mentre Biogen-DompBiotec raccomand ano la via intramuscolare.

L interferone-alfa Poche parole sull alfa interferone. E luogo comune dire che l alfa-interterone non ef ficace nella sclerosi multipla. La realt invece che l alfa-IFN non finora mai stato sottoposto ad uno studio cos esteso, cos preciso e ben congegnato, come accaduto invece per i beta-interferoni. Qui si accenna soltanto, molto in breve, ai lavor i di Massaro e collaboratori6,7 e di Durelli e collaboratori8. Il primo ha segna lato in uno studio aperto di fase 2, della durata di 4 anni, una influenza dell in terterone-alfa-2a ricombinate umano nel modificare positivamente il decorso dell a malattia nei soggetti con SM remittente-recidivante di et superiore ai 40 anni, mediante una posologia di 3 milioni di unit a d alterni per via intramuscolare. Durelli, in uno studio successivo8, ha egualmente mostrato l efficacia dell uso dell o stesso interferone per via intramuscolare nel modificare positivamente il deco rso della malattia, ma con dosaggio pi alto: 9 milioni di unit a d alterni, per sei mesi. Entrambi i gruppi hanno poi evidenziato che la sospensione del trattament o riporta il rischio di ricaduta alla situazione di partenza: il beneficio perta nto non si protrae nel tempo ma viene perso alla sospensione della cura.

L interferone-gamma

Non vi tempo sufficiente per parlare ampiamente del gammainterferone, si ricorda soltanto che l unica sperimentazione fatta con esso da Panitch e collaboratori2 fu sospesa anzitempo per evidente influenza negativa. Se per motivi commerciali e di opportunit etica questa decisione fu necessaria, resta comunque il dubbio di c osa sarebbe accaduto se la sperimentazione fosse stata ulteriormente protratta n el tempo. Se una persona ignara della causa della Iue in fase avanzata dovesse g iudicare l efficacia degli antibiotici in questa malattia sulla base dei risultati del periodo iniziale della cura, potrebbe dire che gli antibiotici sono controi ndicati nel suo trattamento noto infatti che nelle fasi avanzate della malattia l inizio della terapia pu portare ad un transitorio peggioramento -; un analogo dis corso potrebbe essere valido anche per quanto riguarda SM e gamma-IFN?

Gli anticorpi anti-interferone In questi ultimi tre anni si posto il problema degli anticorpi antiIFN, del loro significato e della loro rilevanza ai fini del successo terapeutico. Per primi i partecipanti alla sperimentazione americano-canadese sull interferonebeta-1b hanno segnalato la comparsa di anticorpi neutralizzanti soprattutto a pa rtire dall 8-24 mese di terapia, con una evidenza di una diminuzione di efficacia t erapeutica neI 35% dei pazienti trattati che avevano sviluppato anticorpi neutra lizzanti. Inoltre, il tasso di esacerbazione annuale nei pazienti trattati con 8 milioni di unit internazionali (MIU) a d alterni cominciava, sempre a partire dal secondo anno, ad essere significativamente pi alto nei soggetti che sviluppavano anticorpi. Tutto ci lasciava presagire una significativa rilevanza di questo fen omeno. Questi dati non sono stati del tutto confermati da uno studio italiano effettuat o presso l Universit La Sapienza di Roma. I gruppi dei professori Fieschi e Dianzani1 0, 11, che hanno studiato lo stesso fenomeno in pazienti trattati con interferon e beta-1a, pur avendo trovato un 16% di casi positivi dopo due anni di cura, non hanno confermato la dose-dipendenza del fenomeno, n una chiara relazione tra la presenza di anticorpi e una ridotta risposta terapeutica. Anche il gruppo americano che ha studiato l interferone beta-1a ha pubblicato i su oi dati sull argomento12, evidenziando che la comparsa degli anticorpi dopo 24 mes i di trattamento interessava circa il 5% dei pazienti, ma nei pazienti trattati con interferone beta-1b per uno stesso periodo l incidenza era 4-6 volte superiore , usando sempre lo stesso metodo d analisi. Questo dato, se confermato, suggerireb be un maggior potere immunogeno della molecola prodotta dall Escherichia coli. Interessante il contemporaneo dosaggio che essi hanno fatto della neopterina, ch e una indicatrice di attivit biologica dell interferone in vivo. Hanno trovato che tale molecola era significativamente diminuita nei sieri di pazienti positivi pe r anticorpi neutralizzanti. A questo punto sar bene spiegare cosa sono questi anticorpi neutralizzanti. Il dosaggio degli anticorpi anti-interterone viene eseguito mediante due tipi di metodiche nettamente differenti. I primi sono metodi biologici che consistono n el valutare la capacit di tali anticorpi nell inibire l attivit antivirale di un dato interferone su coltura cellulare. Sono questi gli anticorpi che vengono denomina ti neutralizzanti . Altri ancora valutano la proteina MxA, la cui sintesi intracellulare indotta dal legame del beta-IFN al suo recettore di membrana. La presenza di anticorpi neut

ralizzanti riduce quindi la sintesi di tale proteina ed segno di inefficacia del l interferone. Al secondo tipo di metodi appartengono i dosaggi immunologici, di solito un ELIS A (enzyme Iinked immunosorbent assay), che pongono in evidenza gli anticorpi cos detti leganti (binding), in quanto evidenziati in relazione al legame antigene-ant icorpo che alla base dei metodi anzidetti. Non vi di solito una relazione tra l un metodo e l altro, in quanto anticorpi legant i possono non possedere attivit neutralizzante, essendo il loro bersaglio antigen ico non rilevante ai fini dell attivit interteronica. Che i vari tipi di interferone somministrati in pazienti con SM portino in un mo mento o in un altro alla presenza di anticorpi antiIFN a livello ematico di alcun i di essi un fatto oramai assodato, il problema : quale rilevanza essi hanno dal punto di vista dell efficacia del trattamento; quali metodi di dosaggio sono event ualmente pi predittivi a questo scopo; quale significato ha la comparsa solo spor adica di titoli anticorpali significativi. Per rispondere a queste domande la prima cosa da conoscere quale il significato fisiologico o fisiopatologico della presenza di tali anticorpi anche in individu i non trattati, e, di conseguenza, se per caso tale presenza non abbia un ruolo perfettamente in ordine con la fisiologia. Ad esempio, potrebbero avere un ruolo finalizzato a mettere da parte un patrimonio di IFN di riserva da poter prontam ente utilizzare al momento opportuno; oppure, potrebbero possedere una funzione di modulazione della funzione interferonica; o di trasporto nei siti in cui esso pi necessario. Tutto questo oggi non noto. In secondo luogo, da vedere se la molecola interferonica, complessata col suo an ticorpo, perde realmente l attivit terapeutica che ci interessa, oppure la conserva , oppure ne possa acquisire di nuove, altrettanto interessanti. In caso di risposta sfavorevole, sarebbe poi da vedere quale tipo di provvedimen to sulla posologia, o quale trattamento accessorio, possono essere in grado di l imitare tale produzione di anticorpi. Certamente, in un futuro prossimo, avremo la risposta a queste domande. Per il momento ci limitiamo a valutare i fatti: Tra tutti i metodi analitici esposti precedentemente non esiste concordanza n s ulle tecniche, n su quali siano i valori da considerare alterati. Un consensus su questo argomento del tutto necessario e sicuramente si arriver a questo, in un f uturo non lontano. Nonostante vi sia un certo numero di pazienti positivi agli anticorpi anti-IFN che hanno un cattivo risultato clinico, vi sono pure quelli che continuano a ri spondere al trattamento nonostante titoli elevati. Inoltre vi sono pazienti che rispondono male al trattamento nonostante la non comparsa di anticorpi. Pertanto la eventuale sospensione della terapia interferonica dovrebbe essere valutata e decisa, almeno per ora, solo in relazione alla risposta clinica, con il possibi le supporto dell evidenza RMN. In altre patologie non-neurologiche la rilevanza tra presenza di anticorpi e r isposta terapeutica pi netta. Nei pazienti leucemici o con epatite-C trattati con alfa-interferone, ad esempio, vi una chiara relazione tra comparsa di titoli si gnificativi di anticorpi e la perdita di efficacia terapeutica. Questa relazione per diventa non pi evidente nei pazienti con tumori solidi trattati nella stessa maniera. La ovvia conclusione che, non esistendo regole fisse, per quel che rigu arda la SM queste regole le stiamo scoprendo ora, cammin facendo.