Revista Brasileira de Cincia Avcola Rev. Bras. Cienc. Avic. vol.3 no.2 Campinas May/Aug. 2001 http://dx.doi.org/10.

1590/S1516-635X2001000200001

Influenza Aviria: Uma Reviso dos ltimos Dez Anos Avian Influenza: A Review of the Last Ten Years

RESUMO A influenza aviria doena extica no Brasil. O sistema de vigilncia implementado pelo Programa Nacional de Sanidade Avcola (PNSA) mantm monitorao permanente das aves das principais espcies domsticas, tanto do material gentico importado para a indstria avcola, por exemplo, da espcie das galinhas (Gallus gallus formadomestica), perus (Meleagris gallopavo formadomestica), codornas (Coturnix coturnix japonica), patos (Anas), primrios (elite), bisavs e avs para postura ou corte, como aves de espcies de explorao mais recente, exticas, por exemplo avestruzes (Struthio camelus) ou nativas, por exemplo emas (Rhea americana). Os plantis de reprodutores em produo so tambm acompanhados por amostragens peridicas, conforme previsto no PNSA, alm da monitorao das respostas aos programas de vacinao, por exemplo, contra bronquite infecciosa e doena infecciosa bursal. O PNSA estabelece as normas de atuao para o controle e erradicao da doena de Newcastle (ND) e Influenza Aviria (AI) (Projeto de Vigilncia, 2001), a saber: I - Notificao de focos da doena (e confirmao laboratorial no LARA-Campinas); II - Assistncia a focos; III - Medidas de desinfeco; IV - Sacrifcio sanitrio; V - Vazio sanitrio; VI - Vacinao dos plantis ou esquemas emergenciais; VII - Controle e fiscalizao dos animais susceptveis; VIII - Outras medidas sanitrias; A vigilncia e ateno ao foco exige o diagnstico laboratorial e diferencial de AI e ND, que segue as normas do PNSA, conforme o sumrio abaixo: 1- Interdio e coleta de materiais para exame laboratorial oficial; 2- Registro das aves: espcie(s), categoria(s), nmero(s), manuteno de aves; utenslios e produtos no local; proibio de trnsito de e para a(s) propriedade(s) em um raio de 10 km; controle de todos os animais e materiais possveis fontes de propagao; desinfeco de vias de entradas e sadas (s) propriedade(s); inqurito epidemiolgico. 3- Confirmao laboratorial: isolamento de agente letal hemaglutinante em ovos embrionados de galinhas SPF, no inibido (inibio da hemaglutinao) ou no neutralizado (soroneutralizao) por soro especfico para o vrus da doena de Newcastle; caracterizao do agente como vrus da influenza aviria (AIV) por deteco de antgenos da nucleoprotena e/ou matriciais de AIV e de seu subtipo por ensaios especficos para a caracterizao da hemaglutinina e neuraminidase (imunodifuso, imunoenzimticos ou moleculares). 4- Abate e destruio imediata (cremao) de todas as aves, resduos, carnes e ovos da(s) propriedade(s) atingida(s) e vizinhas (raio de 3 km); limpeza e desinfeco das instalaes; vazio sanitrio (mnimo 21 dias); 5- Permitir o transporte para o abate ou incubao dentro da zona de vigilncia (raio de 10 km). 6- Proibir feiras, exposies, mercados na zona de vigilncia (10 km).

INTRODUO
A influenza aviria (AI) inclui amplitude de sndromes que se manifestam desde infeco subclnica, doena suave respiratria das vias superiores ou doena fatal generalizada em aves domsticas. Inmeros diferentes isolados do vrus da influenza aviria (AIV) circulam entre diversas espcies animais ao redor do mundo. Embora AIV possa infectar enorme diversidade de espcies das classes de aves e mamferos, so tidas como reservatrios naturais as aves aquticas, aves habitantes das praias e gaivotas, sendo consideradas aberrantes as infeces em galinhas, perus, sunos, eqinos e humanos (Suarez, 2000). O alto nvel de recombinao gentica, observado especialmente entre integrantes dos AIV do tipo A, conseqncia do genoma segmentado, que permite permutaes de genes, em contraste com integrantes de Paramyxoviridae, por exemplo o vrus da doena de Newcastle, que no apresentam recombinao detectvel por apresentar genoma no segmentado (Kingsbury, 1990.) A baixa incidncia dos AIV nos perodos migratrios subtropicais das aves aquticas (Murphy & Webster, 1996) pode explicar a baixa ou rara ocorrncia no Brasil. As conceituaes e procedimentos do Programa Nacional de Sanidade Avcola (PNSA) descrevem a AI como doena causada por Orthomyxoviridae Influenza A, com patogenicidade intravenosa em aves de 6 semanas de idade maior que 1,2, ou infeces com AIV dos subtipos H5 ou H7 ou AIV cujas seqncias do stio de clivagem da hemaglutinina contm mltiplos aminocidos bsicos, de acordo com o manual da O.I.E. ((Projeto de Vigilncia, 2001). Influenza como zoonose

A influenza em humanos parece ocorrer desde os primrdios da humanidade, segundo a literatura antiga, que data, por exemplo 2000 a.C., com o registro de doena respiratria aguda com durao de poucos dias ou semanas (Toniolo Neto, 2001). A evoluo de variantes de AIV capazes de apresentar carter zoontico constante e tem sido demonstrada experimentalmente. As etiologias pelo menos das ltimas duas pandemias (1918-1919 e 1968) foram caracterizadas como estirpes hbridas que continham genoma recombinante de AIV de aves e humanos. A ameaa de pandemia por AIV em humanos preocupao permanente dos agentes de sade pblica, uma vez que h evidncias dos vrus H5N1 e H9N2 terem sido transmitidos de aves para humanos nos mercados de aves de Hong Kong (Horimoto & Kawaoka, 2001). Alguns subtipos de AIV tm importncia direta em sade humana. O AIV H5N1, que ocasionou o bito de 6 pessoas em Hong Kong em 1997, foi transmitido diretamente de galinhas para humanos. A adaptao a novo hospedeiro significa principalmente alterao rpida das glicoprotenas da superfcie, especialmente da hemaglutinina (HA), embora o H5N1 tenha apresentado mudanas de aminocidos em outras protenas e no em HA, indicando que sua HA est altamente adaptada s aves, no necessitando mudar e que os outros genes podem advir de outras origens por recombinao gentica, inclusive com seqncias internas de consenso previamente encontradas em humanos, a exemplo de H5N1. As seqncias de aminocidos de origem humana obtidas por recombinao podem ter importncia como determinantes do aspecto zoontico (Zhou et al., 1999b). A recombinao gentica entre influenza de aves, sunos e humanos foi demonstrada, aps episdios de doena respiratria em plantis de sunos na Carolina do Norte (NC), Texas (TX), Minnesota (MN) e Iowa (IO) em 1998. O isolado da NC resultou de recombinao entre H3N2 de humanos com o clssico H1N1 de sunos e os demais de H3N2 humano, H1N1 clssico suno e genes de vrus de aves (AIV). A hemaglutinina dos quatro isolados obtidos derivou-se de H3N2 humano em circulao em 1995 (Zhou et al., 1999a).

Uma estirpe de AIV classificada como A/Hong Kong/156/97 (H5N1) de alta patogenicidade foi descrita em episdio fatal de influenza em criana com faringite, tosse seca e febre, estirpe que apresentava mltiplos aminocidos bsicos no stio de clivagem da HA, carter associado alta patogenicidade para galinhas, nas quais resultou na mortalidade de 15/16 aves inoculadas. Em mais 12 casos humanos com estirpes de AIV semelhantes essas foram isoladas, 3 obtidas de casos fatais (Subbarao et al., 1997). Na China, o surgimento de AIV H1N1 em sunos alertou para o papel da espcie como intermediria de todos os oito genes de origem primariamente aviria, funcionando ainda como fonte de genes para a recombinao gentica de subtipos de AIV. Os sunos podem assim representar uma importante espcie na transmisso para humanos na China. (Guan et al., 1996.). Novas estirpes de influenza vrus esto constantemente emergindo na populao humana. Trs pandemias em humanos (1918-19 H1N1 - Espanhola, 1957 H2N2 Asitica e 1968 H3N2 Hong Kong) esto descritas na literatura, nas quais os subtipos cruzaram as barreiras de espcie hospedeira. Da mesma forma, o surto em Hong Kong em 1997 com H5N1 indica para o risco futuro de pandemia, contra a qual no haveria tempo suficiente para estabelecimento de proteo vacinal s populaes humanas. Estirpes de AIV em perodos interpandmicos podem apresentar variao antignica leve (antigenic drift) e podem evoluir para variao antignica forte (antigenic shift) e originar surto de doena. A vigilncia epidemiolgica base para a determinao de atualizaes vacinais e os agentes antivirais anti-neuraminidase devem ser considerados como adjuvantes para vacinas (De Jong et al., 2000). A alta homologia entre os genes internos dos isolados H6N1 indica que esses subtipos so capazes de intercambiar seus genes e so, portanto, fonte potencial de isolados patognicos para humanos, sendo sugerida a vigilncia epidemiolgica para aves aquticas e domsticas, sunos e humanos (Hoffmann et al., 2000). As seqncias dos genes de 18 estirpes de AIV de humanos, que resultaram em bito de seis pacientes, no surto de Hong Kong, em 1997,

evidenciaram que as estirpes desse surto derivaram de influenza vrus de aves e no de humanos (Subbarao & Shaw, 2000). Um estudo dos fatores de risco para AIV em 15 pacientes humanos hospitalizados, relacionado ao isolado H5N1 (Hong Kong), foi conduzido aps a morte de uma criana em Hong Kong, em 1997. Fatores como idade, sexo e vizinhana foram considerados. A exposio s galinhas vivas do mercado de aves de Hong Kong foi considerada significativa, enquanto o consumo ou preparao de produtos, bem como a exposio a humanos com doena respiratria, inclusive influenza, no foi associada doena (Mounts et al., 1999). Impacto econmico O impacto econmico nas espcies domsticas destinadas produo enorme em muitos pases, sem contar o envolvimento das espcies de vida selvagem e preservao, valor individual de estimao e ainda os investimentos em sade humana. Surtos de AI causados pela amostra de baixa patogenicidade H7N2 em poedeiras, frangas em recria (Gallus gallus formadomestica) e perus (Meleagris gallopavo formadomestica), na Pennsylvania (EUA), durante 1997 e 1998, foram analisados economicamente (depopulao e lucros cessantes) e extrapolados para a populao avcola total deste estado, indicando um custo total de US$ 3,5 milhes (Davison et al., 1999). Os episdios em Minnesota nos EUA, entre 1979 e 1981, foram monitorados economicamente e indicaram despesas anuais em torno de 1 milho de dlares (Poss et al., 1982), relacionadas com perdas de produtividade em ganho de peso e produo de ovos. Os custos relacionados s indenizaes, diagnstico, suporte tcnico e comando ttico (Pennsylvania - sacrifcio de mais de 11,2 milhes de aves mais de 7,2 milhes de poedeiras e 3,6 milhes de frangos de corte em 278 propriedades) no programa de erradicao da AI, estabelecido a partir de novembro de 1983 na Pennsylvania e Virginia, foram US $ 30.140.574,00 e 2.328.317, respectivamente (Avian Influenza Task Force, 1984), incluindo isolamento de vrus de aves de vida livre da regio de quarentena (patos pretoAnas anas e Mallard-Anas platyrhynchos, gansos canadenses-Branta canadensis, faises de pescoo

anelado-Phasianus, gaivota de bico anelado-Larus) e sorologia (inibio da hemaglutinao e inibio da neuraminidase) em aves e mamferos (patos-Anas e gansos domsticos-Branta e selvagens, gaivotas marinhas-Larus, corvos-Corvus, estorninhos-Sturnus, pssaros pretos de asa vermelha-Agelaius phoeniceus, pardais-Passer, pombos-Columba, faises-Phasianus, camundongos-Mus e ratos-Rattus) (Avian Influenza Task Force, 1984.), totalizando ao final US $ 60 milhes ao governo e 15 milhes aos proprietrios, que poderiam chegar a US $ 1,5 bilhes aos avicultores e 5 bilhes aos consumidores, caso no houvesse a deciso de erradicao. Os consumidores dispenderam mais de US $ 300 milhes em custos aumentados dos produtos (Lasley, 1987). Os efeitos negativos dos surtos de AIV de alta patogenicidade (HPAIV) na provncia de Guangdong (China) foram sentidos nos mercados de produtos e aves, repercutindo nos estabelecimentos rurais. Um sistema de informao entre instituies de pesquisa, ensino e indstria de processamento com o manejo animal e mercado foi recomendado para minimizar os prejuzos (Wei-Hua, 1998).

ETIOLOGIA
A influenza aviria causada por vrus da famlia Orthomyxoviridae. As propriedades fsicas, qumicas e biolgicas dos vrus da influenza aviria (AIV) sero descritas a seguir. Os vrions dos AIV so aproximadamente esfricos de at 200nm de dimetro ou pleomrficos, quando observados os replicados pelos hospedeiros naturais. Estirpes propagadas em ovos tm morfologia mais regular (circular) e em mdia entre 80 e 120nm de dimetro. O envelope contm projees rgidas (spikes) de hemaglutinina e neuraminidase, que formam um halo caracterstico ao redor das partculas em colorao negativa e observadas por microscopia eletrnica (Fig. 1 e 2; Copyright Linda M Stannard, 1995 e Fig. 3 e 4, ISTO 1561/01/09/1999). O genoma viral composto de oito segmentos de RNA de fita simples. A estrutura de RNA-protena (nucleoprotena NP) do cerne no comumente observvel, apenas poucas partculas

ntegras evidenciam o contedo helicoidal interno. Entretanto, partculas rompidas liberam o contedo de NP, que longa e apresenta um aspecto de zper ou espinha de peixe (estrutura helicoidal). Maiores detalhes da estrutura, composio e biologia dos influenza vrus em geral so encontrados nos captulos Orthomyxoviruses (Murphy & Webster, 1996) e Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication (Lamb & Krug, 1996)

Dados da estrutura e composio dos AIV podem ser conferidos na Tabela 1. O cerne dos AIV contm o material gentico formado por RNA dividido em 8 segmentos de fita simples enrolados em si prprios e revestidos por unidades da protena do capsdeo, a nucleoprotena (NP), formando uma hlice. A NP,

embora exera o revestimento do RNA, permite espao entre essas unidades estruturais e o RNA, com exposio das ligaes fosfo-diester do RNA, rapidamente acessveis digesto por ribonucleases (Kingsbury, 1990.). Dez genes esto localizados nos 8 segmentos do RNA. As protenas estruturais compreendem, de acordo com os genes codificadores, como produto do gene 4, a hemaglutinina (HA) e do gene 6 a neuraminidase (NA). Ambas so glicoprotenas que formam as grandes projees superficiais do envelope. O gene 7 codifica a glicoprotena da membrana (M1) ou matriz, a protena menor da membrana (M2) e o polipeptdeo M3, todos estes 3 componentes inseridos na dupla camada lipdica do envelope. O gene 5 codifica a nucleoprotena (NP), as unidades que revestem o RNA, formando o nucleocapsdeo. As 3 enzimas polimerases virais, PA codificada pelo gene 3, PB1 codificada pelo gene 2 e PB2 codificada pelo gene 1 esto todas localizadas na extremidade de cada unidade do nucleocapsdeo. O gene 8 codifica as protenas no estruturais NS1 e NS2, de funo desconhecida. A HA responsvel pela adsoro ao receptor celular. Este receptor composto de glicoprotena silica, contendo o cido N-acetil neuramnico terminal (COOH-C= O-CH2-CH-OH-CH-NH-C= O-CH3-CH-OHCH-OH-CH2-OH), protena que necessita maturao ps traduo para poder intermediar a fuso com a membrana da clula sendo infectada (Kingsbury, 1990.). A HA reconhece receptores com cadeias de acares da srie lacto-sialil tipos I e II (cido silico) nas clulas, determinando a amplitude de hospedeiros (Suzuki, 2000). O stio de conexo da HA ao receptor celular forma uma cavidade em cada uma das trs subunidades do trmero de HA, cujos resduos de aminocidos tirosina 98, triptofnio 153, histidina 183, c. glutmico 190 e leucina 194, inacessveis aos anticorpos, so muito conservados entre os subtipos (Lamb & Krug, 1996). A HA confere tambm capacidade de aglutinao ao muco do sistema respiratrio. Classificao A classificao dos integrantes da famlia Orthomyxoviridae muito precisa. O nome do vrus

compe-se de informaes separadas por barras verticais, que incluem o tipo (A, B ou C)/ espcie animal/ localizao geogrfica/ nmero de referncia do laboratrio/ ano de isolamento/ subtipo de HA/ subtipo de NA. Entretanto, as informaes sobre virulncia no esto includas na nomenclatura. Geral A famlia Orthomyxoviridae contm trs tipos antignicos ou gneros A, B e C de vrus influenza, distingveis pela composio da unidade estrutural protica do nucleocapsdeo (NP) e da protena no glicosilada do envelope (M1). Desses, B e C so principalmente patgenos humanos e A so isolados de muitas espcies animais, incluindo humanos. As glicoprotenas da superfcie das estirpes integrantes do tipo A apresentam muito maior variabilidade antignica se comparadas quelas de integrantes de B e C. Os tipos A e B apresentam maior semelhana morfolgica entre si e so diferentes de representantes do tipo C, que contm as glicoprotenas do envelope dispostas em disposio hexagonal (Kingsbury, 1990.). Todos os AIV de aves so integrantes do tipo A e so divididos em subtipos pela anlise da hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) (Easterday et al., 1997). Atualmente, 15 HA e 9 NA antigenicamente distintas so conhecidas. Subtipos de influenza A avirios As hemaglutininas H1 a H15 e neuraminidases N1 a N9 so reconhecidas (Easterday et al., 1997). Quaisquer combinaes entre HA e NA so possveis na natureza. Alguns exemplos de estirpes de aves classificadas incluem: H5N2 (Pennsylvania e Virginia, EUA, Nov 1983-Jan 1984 alta patogenicidade; H5N1 (Hong Kong, China, A/Environment/Hong Kong/437/99, 1997 alta patogenicidade); H5N1 (Inglaterra, A/turkey/England/91 alta patogenicidade); H7N2 (Pennsylvania, EUA, Jan 1997 Mar 1998 mdia patogenicidade); H8N4 (Wisconsin, EUA, 1968, A/turkey/Wisconsin/1/68 mdia patogenicidade); H5N3 (Hokkaido, Japo A/duck/Hokkaido/4/96 no patognico). A doena causada por AIV nas espcies de aves pode variar grandemente com a estirpe de vrus e a

espcie hospedeira. A infeco produzida pela maioria das estirpes subclnica, embora algumas resultem em doena que envolve o sistema nervoso central com mortalidade alta em uma semana de curso clnico. Essas estirpes esto classificadas principalmente nos subtipos de hemaglutinina H5 e H7, como por exemplo A/fowlplaguevirus/dutch/27 (H7N7-galinha) e A/Tern/SouthAfrica/1/61 (H5N3Chlidonias). Em perus, as infeces resultam em problemas muito importantes (de H1 a H15), pois uma espcie em que as infeces respiratrias crnicas causam srios problemas econmicos. As infeces em perus parecem estar associadas periodicamente pela transmisso de aves migratrias. Doena por AIV ocorre com menos freqncia em Gallus gallus formadomestica (galinha industrial), especialmente pelas caractersticas de manejo, que aplica noes de biossegurana, com afastamento de aves domsticas e selvagens, especialmente Anatidae. Entretanto, episdios importantes em galinhas esto relacionados na literatura. Um exemplo H5N2 na Pennsylvania, Estados Unidos, em 1983, que tornou-se virulento e custou US$ 60 milhes para a erradicao. A infeco em patos (Anatidae), geralmente subclnica, inclui a replicao pulmonar e intestinal. Os AIV mais importantes que ocorrem em humanos (H1N1, H2N2 e H3N2) ocorrem tambm em patos, nos quais produzem infeco respiratria superior e no intestinal (Murphy & Webster, 1996). Os subtipos H5 e H7 comumente esto associados a estirpes de alta patogenicidade para certas aves selvagens e domsticas. A HA dessas estirpes clivada (haste da HA2-glicoprotena da fuso) e infecta diretamente os cultivos em monocamada, no requerendo tratamento enzimtico com proteases exgenas (tripsinas). Essas estirpes contm mltiplos aminocidos bsicos na regio carboxi-terminal de HA1, o que possivelmente est relacionado ao reconhecimento pelas proteases endgenas celulares, permitindo clivagem imediata ps-traduo e infecciosidade in vitro e in vivo, com carter transmissvel (Tabela 2). O seqenciamento dos oito segmentos do genoma de uma estirpe do subtipo H5N1 de humanos, considerado como original de aves e comparado com uma estirpe de galinhas de

alta patogenicidade (H5N1, A/Environment/Hong Kong/437/99 - Hong Kong, China, 1997), revelou 99% de identidade das seqncias, mas ambos no foram relacionados a nenhuma informao gentica de influenza acessvel no GenBank, com quatro clusters relacionados com isolados da Eursia. A anlise filogentica da HA revelou mltiplos aminocidos bsicos no stio de clivagem da HA (Tabela 2), fentipo presente em isolados de alta patogenicidade para galinhas (Suarez et al., 1998). A heterogeneidade no gene da hemaglutinina e a emergncia de fentipo de alta virulncia entre estirpes do subgrupo H5N2 foram descritas no Mxico. Estirpes obtidas no surto de AIV no Mxico Central foram comparadas no gene codificador e stios de clivagem da HA, estudo que demonstrou que nenhuma das 18 estirpes apresentou seqncias de aminocidos previstas (predicted) idnticas em HA1, com mudanas no restritas a uma regio. Duas linhagens filogenticas foram estabelecidas com variaes de 10,5% para a seqncia de aminocidos e 6,2% para os nucleotdeos. As estirpes patognicas (HPAIV) que causaram alta mortalidade em galinhas apresentaram a substituio do cido glutmico por lisina na posio 324 da HA e insero de arginina e lisina nas posies 325 e 326, sendo que essa insero pareceu ser uma duplicao da seqncia AAAGAA da posio 965-970 dos nucleotdeos de HA1, possivelmente duplicada pela polimerase (Garcia et al., 1996). Estrutura e Composio Qumica Os vrions completos dos integrantes de Orthomyxoviridae so compostos de 0,8 a 1% de RNA, 70% de protena, 20% de lipdio e 5 a 8% de carboidratos. O envelope derivado da membrana plasmtica da clula hospedeira replicadora. Partculas virais replicadas em hospedeiros naturais humanos ou animais so pleomrficas (morfologia heterognea), principalmente arredondadas, de at 200nm de dimetro, mas incluindo tambm formas longas em basto, enquanto que partculas propagadas em ovos ou cultivos de clulas tm morfologia mais regular (80-120nm). O carter para maior uniformidade morfolgica determinado geneticamente e associado principalmente ao gene de M1 e menos associado aos genes das principais

projees superficiais hemaglutinina e neuraminidase (Lamb & Krug, 1996; Murphy & Webster, 1996). Os vrions de todas as estirpes de AIV no so morfologicamente distingveis de outros vrus influenza dos tipos A e B. As projees do envelope conferem aspecto caracterstico aos vrions dos tipos A e B e distingveis de C (neste dispostas em arranjo hexagonal) (Kingsbury, 1990.) A hemaglutinina (HA), juntamente com a neuraminidase (NA), determina o impressionante aspecto do envelope viral (Figura 1, 2, 3 e 4), caracterizado por aproximadamente 500 projees radiais de HA que se projetam para fora. A proporo HA:NA de 4 a 5 HA para cada NA. A HA codificada pelo segmento 4 do RNA genmico, sendo sintetizada no retculo endoplasmtico rugoso (RER) como um polipeptdeo nico HAo (peso molecular 76.000). O segmento 4 do RNA constitui-se de 1742 a 1778 nucleotdeos e codifica um polipeptdeo de 562 a 566 resduos de aminocidos, sendo a cadeia HA1 de 319 a 326 e HA2 de 221 a 222 resduos de aminocidos. Um peptdeo de sinalizao direciona a cadeia nascente para a membrana do RER, onde clivada por peptidase de sinal que a transforma em protena prottipo tipo 1 HA, integrante da membrana viral (Figura 6). A clivagem pode resultar em perda de um a seis resduos. A HA ps-maturada pela adio de sete cadeias de oligossacardeos, adicionados cadeia principal e trs resduos de palmitato adicionados por ligao tio-ter aos trs carbonos terminais das cisteinas proximais. A anexao de cinco cadeias de carboidratos na estrutura lateral da HA1 e uma na cadeia lateral de HA2 resulta aparentemente na conformao tridimensional adequada da HA. Apenas uma cadeia de acar anexada regio globular de HA1, para estabilizao das associaes dos oligmeros entre as unidades globulares do topo da estrutura. A estrutura ancorada no envelope viral um trmero homogneo de monmeros no ligados covalentemente entre si. A clivagem da HA em duas cadeias ligadas por pontes dissulfdricas, HA1 (~47.000) e HA2 (~29.000), depende da estirpe viral, tipo de clula hospedeira e condies de replicao, necessria para a infecciosidade, determinante da patogenicidade e disseminao da infeco. A HA estende-se por 135

para fora do envelope. Trs molculas de HA2 formam um trmero espiralizado que est ancorado e se projeta do envelope (76 ), na extremidade distal do qual conecta-se a HA1, a subunidade globular mais externa. Uma regio hidrofbica de HA2, que embebida na haste da HA e torna-se exposta em pH cido, forma o peptdeo da fuso (Lamb & Krug, 1996; Wiley & Skehel, 1990). A homologia dos aminocidos da HA entre duas estirpes uma do grupo A e outra do grupo B foi de 24% em HA1 e 39% em HA2, sugerindo relacionamento evolutivo entre os grupos A e B do vrus influenza (Lamb & Krug, 1996).

As trs principais funes ou propriedades da HA so: 1. Ligar-se ao receptor contendo cido silico na superfcie da clula hospedeira, proporcionando a adsoro da partcula viral clula; 2. Responsvel pela penetrao do vrus atravs da membrana citoplasmtica, intermediando a fuso do envelope da partcula endocitada com a membrana endosomal, resultando na liberao dos nucleocapsdeos no citoplasma; 3. o principal antgeno do vrus contra o qual o hospedeiro desenvolve anticorpos neutralizantes e pandemias de influenza esto associadas a mudanas em sua estrutura antignica.

Todos os tipos de hemaglutininas (H1 a H15) reconhecem cadeias de acares da srie sialillactose tipo I e II (cido silico alfa 2-3 (6)Gal beta 1-3 (4) GlcNAc beta 1-) em glicoprotenas e glicolipdeos nas clulas alvo como molculas receptoras. Diferentes cidos silicos nas membranas das clulas resultam em diferentes permissividades replicao de AIV. As estirpes de aves e eqinos ligam preferencialmente ao receptor 2-3Gal (SA23Gal) do cido silico terminal, enquanto as estirpes humanas ligam-se ao receptor SA2-6Gal. A distribuio do cido silico nas membranas celulares das espcies animais influencia o espectro de hospedeiros. As traquias de suinos tm ambos receptores para vrus de aves (SA2-3Gal) e de humanos (SA2-6Gal). HA que reconhecem Neu5Gc23Gal, abundantes nas clulas epiteliais da traquia de eqinos, so capazes de infectar eqinos, enquanto um AIV com HA que reconhece Neu5Ac2-6Gal mas no Neu5Ac2-3Gal incapaz de infectar eqinos. AIV que reconhece Neu5Ac2-3Gal replicado nos intestinos de patos, principalmente nas clulas epiteliais das criptas. Os sunos podem representar, por essa permissividade, hospedeiros para a recombinao de estirpes de aves e humanos (Suzuki, 2000). Uma estirpe humana de AIV do subtipo H3, apesar de origem aviria, no replicada no intestino de patos, para a qual o reconhecimento do glicoconjugado que possui cido Ngliconeuramnico ligado galactose por ligao 2,3 relacionado com a habilidade de replicao no epitlio do colon de patos e o reconhecimento de NeuGcalfa2,3-Gal determina o enterotropismo (Suzuki et al., 2000). Determinantes antignicos comuns podem ser encontrados nas HA de diferentes subtipos. Um estudo com anticorpos monoclonais detectou duas regies conservadas conformacionais na haste da HA, uma em HA1 e outra em HA2, dos subtipos H1, H2, H5 e H6 (Smirnov et al., 1999). Cinco stios antignicos (A, B, C, D e E) esto localizados na regio globular mais externa (HA1) de cada monmero (Figura 5). O stio de ligao ao receptor celular (cido silico) corresponde localizao B e forma uma bolsa em cada subunidade de HA1. As bolsas so inacessveis aos anticorpos e os

aminocidos (tirosina 98, triptofnio 153, histidina 183, cido glutmico 190 e leucina 194) componentes so muito conservados entre as estirpes. As especificidades entre os stios de ligao e os receptores celulares diferem de acordo com os hospedeiros. Por exemplo, humanos, aves e cavalos podem apresentar restries s infeces interespecficas (Lamb & Krug, 1996). Glicoprotena da fuso: Ativao por da HA e relao com patogenicidade As estratgias para a fuso das duplas camadas lipdicas do envelope viral e clula hospedeira incluem: 1. A mudana conformacional da HA deve ocorrer no momento e local certo para evitar que o peptdeo de fuso da HA produza autoaglutinao dos monmeros; 2. O peptdeo de fuso pode intercalar dentro das duas camadas lipdicas; 3. Vrios trmeros de HA devem adsorver para assegurar a formao do poro de fuso competente; 4. A HA requer o stio trans-membrana para a completa fuso. HA de engenharia gentica ancora s membranas, com ncora de fosfatidilinositol glicosil, e promove fuso apenas parcial (hemifuso); Uma regio hidrofbica de HA2 torna-se exposta em pH cido e forma a glicoprotena da fuso. As mudanas conformacionais na HA em pH baixo resultam na exposio de alguns stios e no seqestramento de outros. Por exemplo, os stios de clivagem por tripsina do peptdeo da fuso exposto tornam-se sensveis digesto pela termolisina e a ponte dissulfdrica nica que liga HA1 e HA2 torna-se exposta. Apesar das modificaes, a molcula mantm a estrutura trimrica e os stios de combinao com o receptor mantm os resduos de ligao ao cido silico. As pontes dissulfdricas entre as subunidades HA1 e HA2 protegem a cabea globular da HA de mudana conformacional em pH cido, que impediria a associao ao receptor celular (Lamb & Krug, 1996).

A clivagem da molcula HA em HA1 e HA2 um prrequisito para a mudana conformacional, que ocorre em pH cido e, portanto, uma condio para infecciosidade (Figura 6). As HA que possuem resduo nico do aminocido bsico arginina no peptdeo de conexo entre HA1 e HA2 no so clivadas in vitro, ou seja, no so clivadas por maturao no complexo de Golgi, mas podem ser clivadas pela adio de tripsina exgena (Klenk et al., 1975), enquanto HA com mltiplos resduos de aminocidos bsicos no mesmo peptdeo de conexo so clivadas pela furina, uma protease residente na rede trans-Golgi (Tabela 2). A existncia de motivos reconhecidos e clivados pela furina tem sido relacionada virulncia, aspecto especialmente caracterizado para os influenza de aves (Klenk et al., 1994). A patogenicidade dos AIV est relacionada ativao dos novos vrions pela furina. O stio de clivagem est localizado em seqncia de mltiplos aminocidos bsicos e a clivabilidade mxima foi observada com pelo menos 5 resduos bsicos no stio que contenha carboidratos associados. A substituio da arginina carboxiterminal por lisina em HA1 inibe a clivagem (Walker & Kawaoka, 1993). As proteases de diversas clulas em cultivo in vitro foram comparadas com a furina purificada, confirmando o papel da furina como ativadora da HA para fuso (Walker et al., 1994). Alm da ativao da HA pela furina (endoprotease relacionada a subtilisina; do complexo trans-Golgi) h outras enzimas descritas com papel maturador da HA. A protease PC6, tambm relacionada a subtilisina e muito disseminada, pode tambm ativar AIV virulentos in vitro, indicando que outras enzimas de clivagem da HA podem estar presentes nos animais (Horimoto et al., 1994). Neuraminidase A neuraminidase (NA) uma das glicoprotenas do envelope que qualifica, juntamente com a HA, o subtipo das estirpes dos vrus influenza. A estrutura fsica da NA de uma haste com uma poro globular (cabea) na extremidade, tomando a forma de um cogumelo. A NA um tetrmero homogneo de peso molecular aproximado de 220.000 (protena integrante da membrana da classe II) e pode ser removida do envelope viral com protease, condio

em que aglutinam formando rosetas entre a haste e a cabea. A NA removida enzimaticamente do vrion retm a atividade enzimtica e as propriedades antignicas. um tetrmero em forma de cubo, cada monmero composto de 6 folhas antiparalelas de 4 fitas cada (Bossart-Whitaker et al., 1993). A NA produto do gene 6 do RNA e, para o subtipo A/PR/8/34, por exemplo, o segmento 6 do RNA tem 1413 nucleotdeos e codifica um polipeptdeo de 453 aminocidos. A atividade biolgica da NA est envolvida com a catlise de remoo dos acares de cido silico da HA. A NA (acetil neuramil hidrolase) est, tambm como a HA, sujeita variao antignica e atua na hidrlise da ligao -cetosdica entre o cido silico terminal e uma D-galactose ou D-galactosamina adjacente. Anticorpos especficos contra a NA no so neutralizantes, embora reduzam o tamanho das placas de efeito citoptico (Lamb & Krug, 1996). A atividade enzimtica da NA sobre os stios de cido silico dos receptores celulares mediada por dois stios na superfcie superior (distal) e outro na superfcie inferior (proximal) da cabea globular. Na extremidade globular, 11 stios conservados apresentam ligao ao cido silico. Embora as atividades biolgicas e enzimticas estejam confinadas cabea, mesmo quando removida do vrion, o papel da NA no ciclo biolgico de influenza vrus est ainda obscuro. A remoo do cido silico da HA, NA e superfcie celular permite o transporte do vrus pela camada de mucina, o que permite ao vrus encontrar o seu receptor na membrana celular das clulas da mucosa. Algumas NA (N1 e N9) tm atividade hemaglutinante alm de enzimtica, um receptor que no se conhece o papel (Lamb & Krug, 1996). Todos os subtipos de NA de origem aviria exibem atividade de hemadsoro, embora a ausncia dessa no impea a replicao desses em hospedeiros avirios (patos de Pequim) (Kobasa et al., 1997). Conforme descrito para os subtipos N1 e N9, a regio hidrofbica da NA (resduos 7 a 35 Nterminais) na base da haste tem o papel de direcionar a molcula para a membrana do RER e sua ancoragem estvel no envelope e, tem sua seqncia embebida na membrana citoplasmtica (cauda transmembrana) e conservada (N-Met-Asn-Pro-Asn-Gli-

Lis). A haste tem grandes variaes em seqncia e nmero de aminocidos (62 a 82), enquanto a cabea pode apresentar homologia entre 42 e 57% entre subtipos de influenza A, com os resduos de cistena conservados e conformao tridimensional semelhante. O stio de combinao com o substrato forma uma grande bolsa em cada um dos quatro monmeros, cada um com a configurao de hlice de avio determinada por seis dobras de quatro fitas proticas cada. Mutaes dos resduos conservados da regio podem resultar em perda da atividade enzimtica. H cinco stios potenciais para incorporao de carboidratos por ligaes nitrogenadas (Lamb & Krug, 1996; Bossart-Whitaker et al., 1993). Mutao antignica em HA e NA: Drift e shift antignico A mutao antignica dos AIV est caracterizada por alteraes leves ou sutis (drift) ou grandes alteraes (shift) na seqncia de aminocidos da HA e NA. A acumulao de mutaes de ponto na HA ou NA resulta em alteraes detectveis como antigenic drift (mudana leve), cuja taxa de acumulao varia com a taxa evolutiva dos AIV, sendo menor entre os AIV que os demais influenza A vrus. As taxas de mutao mais altas so encontradas entre os influenza A humanos, enquanto influenza A de eqinos e sunos so intermedirios. Substituies de aminocidos no foram detectadas em um perodo de 50 anos entre alguns AIV. Os AIV representam, assim, influenza vrus conservados antigenicamente, com acumulaes de mutaes ao acaso, indicando a no participao da seleo imune nas mudanas antignicas leves, em contraste com o que ocorre em humanos. Antigenic drift foi detectado em influenza vrus de eqnos e sunos, mas os resultados podem confundir comparaes com diferentes linhagens filogenticas (Murphy & Webster, 1996). Os caminhos da evoluo de estirpes de H1N1 humanos entre 1997 e 1986 foram determinados pelo mapeamento de oligonucleotdeos e estudos de seqenciamento, que evidenciaram que os influenza A podem evoluir por dois ou mais caminhos evolutivos simultaneamente nos casos estudados, confirmando a mutao mdia de 4 a 6 oligonucleotdeos por ano (Cox et al., 1989). As mutaes que resultam em

mudanas na especificidade do stio da HA de ligao ao receptor celular ocorrem logo aps a transmisso de AIV de aves para sunos ou humanos, sendo altamente associadas capacidade do novo vrus em desencadear epidemias. Os vrus de aves e focas ligaram-se de forma fraca ao polmero sinttico sialilglicopolmero (6'SLN-PAA), uma indicao de pouca afinidade ao receptor celular, enquanto as primeiras estirpes humanas e de sunos detectadas ps-transmisso ligaram-se ao 6'SLN-PAA com grande afinidade (Matrosovich et al., 2000). Nucleoproteina A nucleoprotena (NP) o principal componente estrutural em contato direto com o RNA (Figura 5), revestindo e dando forma estrutura da ribonucleoproteina (RNP). As diferenas na composio antignica da NP permitem a classificao em influenza vrus tipos A, B e C. Todos os AIV esto classificados no tipo A. O segmento 5 de 1565 nucleotdeos do RNA codifica a sntese de um polipeptdeo de 498 aminocidos rico em resduos de arginina. Embora reaja com o fosfato (cido) do RNA, nenhuma seqncia bsica foi reconhecida para a interao, o que sugere mltiplos stios de interao RNA-NP. As NP recm-sintetizadas no citoplasma so transportadas ao ncleo por informaes dos resduos de aminocidos 327 a 345. O RNA do vrion (fita negativa) e o molde (fita positiva) mantm associaes com a NP, enquanto os RNAm no (Lamb & Krug, 1996). A fosforilao da NP ocorre, mas no est claro o seu papel ou funo. Uma proporo das NP recm- sintetizadas fosforilada imediatamente aps a traduo, estando a fosfolizao associada migrao ao ncleo e a quinase envolvida na fosforilao parece ser influenciada pela temperatura de incubao (in vitro) das clulas infectadas (Almond & Felsenreich, 1982). Protenas da Membrana M1 e M2 A protena matriz do envelope viral M1 (Figura 5) o mais abundante polipeptdeo da partcula de AIV, com 3.000 unidades por vrion, localiza-se na face interna da dupla camada lipdica e representa um antgeno tipo ou gnero-especfico (influenza vrus A, B ou C) altamente conservado dentro de cada tipo.

Ao revestir a face interna do envelope, confere a esse rigidez e interage com as caudas citoplasmticas de HA, NA, M2 do envelope e no cerne com a RNP, todas essas interaes, entretanto, sem confirmao experimental. Ao interagir com a RNP, M1 inibe a transcrio e direcionamento ao ncleo celular, enquanto aps sua sntese enviada ao ncleo para permitir a sada da RNP do ncleo (Lamb & Krug, 1996). A M1 contm um motivo (motif) de zinco que promove interao protena-protena (Elster et al., 1994). Purificaes da RNP contm M1, demonstrvel com anticorpos monoclonais anti-M1. A interao entre M1 e a protena no estrutural NS2 foi demonstrada em vrions purificados (Yasuda et al., 1993.). Ambas protenas M1 e M2 so produto da traduo do segmento 7 do RNA, que contm 1027 nucleotdeos os quais codificam para M1 um polipeptdeo de 252 aminocidos (PM 27.801) e, para M2, 97 aminocidos (PM 11.010) (Lamb & Krug, 1996). A protena M2 (Figura 7) est presente em pequeno nmero no vrion (20 a 60 unidades), embora seja muito expressada na membrana plasmtica da clula infectada. Localiza-se atravessando a dupla camada lipdica, formando o canal inico do vrion. (Lamb & Krug, 1996). A protena M2 um tetrmero homogneo que consiste de um par de dmeros ou tetrmeros ligados por pontes dissulfdricas. Um anticorpo monoclonal (14C2) anti-M2 restringe o tamanho das placas de efeito citoptico por interferir nas interaes entre M1 e M2 durante montagem e brotamento. A partir dos estudos do efeito de amantidina, utilizada na profilaxia e tratamento de infeces por influenza A, props-se a funo da protena M2 como canal inico que permite ons Na+ e principalmente H+ entrarem no vrion durante a desnudao e modulao do pH de compartimentos intracelulares, uma vez que est expressa de forma abundante na membrana celular.

Produto do gene PB2 Um AIV recombinante com o gene PB2 derivado do AIV A/Mallard/NY/78 e os demais derivados do influenza humano A/Los Angeles/2/87 apresenta expresso do fentipo de restrio na amplitude hospedeira, que resulta em eficiente replicao em tecidos de aves, mas incapacidade para produzir placas em monocamadas de clulas de mamferos (MDCK), fentipo que est associado capacidade de replicao no trato respiratrio de humanos e esquilos. Entretanto, a substituio de apenas um aminocido na posio 627 do produto do gene PB2 (de Glu para Lis) resulta em restaurao da infecciosidade aos hospedeiros mamferos (Subbarao et al., 1993). A protena um tetrmero homogneo, em que cada cadeia tem 97 aminocidos, com 24 resduos expostos para fora da clula, 19 resduos na regio trans-membrana (poro propriamente dito) e 54 resduos como caudas intracitoplasmticas. A funo do canal ativada por pH baixo e bloqueada por amantadina, uma droga antiviral. A atividade do canal inico essencial para o desnudamento dos influenza vrus nos compartimentos endossomais da clula infectada (Lamb et al., 1985 apud Lamb & Krug, 1996). Replicao

Ilustraes sobre a replicao podem ser observadas nas figuras 8 a e b.

Adsoro, Fuso e Desnudamento

A adsoro, fuso e desnudamento podem ser observadas na Figura 8. Os vrions dos influenza vrus tm afinidade qumica e colam aos receptores celulares que contm cido silico, atividade mediada no vrion pela extremidade mais externa da HA. O stio de combinao entre a HA e o receptor celular uma estrutura tridimensional em forma de bolsa, com diferenas de especificidade varivel com a seqncia de aminocidos do segmento protico, cuja interao com o cido silico mediada pela galactose a2,6 em humanos ou 2,3 em aves (Lamb & Krug, 1996). As glicoprotenas e glicolipdios dos receptores celulares reconhecidos pela HA de todos os subtipos de AIV contm cadeias de acares (cido silico- 23(6)Gal 1-3 Glc NAc 1-) (Suzuki, 2000). Embora a interao qumica seja fraca e de baixa avidez individualmente, uma alta avidez total obtida por mltiplas interaes de baixa afinidade (Lamb & Krug, 1996). A endocitose mediada pelo receptor a denominao atual para penetrao na clula por englobamento (viropexis). A alta capacidade de internalizao mediada por vesculas recobertas por clatrina, a principal protena das vesculas recobertas e mediadora de endocitose, associadas membrana celular. A endocitose envolve receptores de manose, os quais so considerados os principais receptores de endocitose para os influenza vrus, para a internalizao em macrfagos de camundongos (Reading et al., 2000). Uma invaginao forma-se em stios tipo bolsa, recobertos pela clatrina na membrana. Aps a internalizao, o revestimento de catrina removido e a vescula funde com endossomos que formam a srie de organelas celulares de pH cido crescente, cujo ambiente gerado por H+-ATPases, promove o desnudamento das partculas virais. Compostos que alcalinizam o pH dos endossomos (cloreto de amnia; cloroquina) impedem o desnudamento viral dos influenza vrus e outros vrus que utilizam a rota de endocitose, embora no tenham atividade antiviral. O papel da protena M2 como canal inico essencial para o desnudamento dos influenza vrus. A droga amantadina tem atividade antiviral nesse processo inicial da infeco, impedindo a liberao da ribonucleoprotena RNP presa protena M1 e caudas citoplasmticas da HA, a RNP no assim transportada ao ncleo e bloqueia-se a replicao

viral. O pH baixo do endossomo ativa o canal inico de M2 e o fluxo de ons para o interior do vrion rompe as interaes protena-protena entre RNP e M1. O pH neutro da membrana celular permite, ao contrrio, a associao RNP-M1 e montagem do vrion na sada da clula. O canal inico mediado pela protena M2 permite o pH cido correto no interior da partcula viral para permitir a fuso do envelope do vrion com a membrana da clula (Murphy & Webster, 1996; Lamb & Krug, 1996). Transcrio e Replicao do RNA A introduo do RNA no ncleo celular d-se atravs dos poros da membrana nuclear ainda como complexo RNP. O RNA (13.588 nucleotdeos para a estirpe A/PR/8/34) liberado para o ncleo celular composto de 8 segmentos lineares e de fita simples e contm 10 genes. Cada segmento contm uma seqncia conservada de 12 ou 13 nucleotdeos nas extremidades 3' e 5', respectivamente. O RNA viral (RNAv) transcrito em RNA mensageiro (RNAm) por estimulao pelo dinucleotdeo ApG, que complementar extremidade 3' de cada segmento de RNAv (3'-UpCpG-..........5') e incorporado ao novo RNA transcrito na extremidade 5'. A iniciao da sntese do RNAm ocorre por fragmentos 5' capeados derivados de recm-formadas transcries de RNA polimerase II da clula. A cpia efetuada at que resduos de uridina so encontrados, 15-20 bases antes da extremidade 5' do RNAv, quando se encerra a transcrio e adicionada a terminao poli-A (poliadenilada) ao RNAm. A replicao do RNAv ocorre primeiramente com a sntese dos RNA moldes (cpias de tamanho total do RNAv) e cpia desse molde para RNAv. Para ocorrer a replicao, so necessrias cpias de extenso completa do RNAv. Os RNA transcritos ou moldes so copiados sem iniciadores e no so terminados em poli-A durante a sntese do RNAm. A replicao ou cpias a partir desse molde, sem iniciadores, d origem a RNAv, que contm terminaes 5' trifosforiladas. Os trs tipos de RNA que existem durante a replicao (RNAv, RNAmolde e RNAm) so todos sintetizados no ncleo da clula. O processamento celular do RNAm viral utiliza os mesmos mecanismos dos precursores celulares, permitindo a metilao do RNAm em resduos de adenosina e dois segmentos de RNAm

atuarem como precursores, que so processados resultando em fragmentos de RNAm menores. Iniciadores da clula, fragmentos de RNA derivados de transcries de RNA polimerase II especificamente capeadas iniciam a sntese de RNAm no ncleo. Esse mecanismo exige o suprimento continuado de RNA polimerase II celular plenamente funcional e justifica a inibio da sntese de RNAm por actinomicina D e -amantadina. A transcrio do RNAm comandada pelo penltimo resduo de citosina do RNAv e alongada at atingir os 5 a 7 resduos de uridina 1522 nucleotdeos do final 5' do RNAv, quando a cauda poli-A adicionada extremidade 3' do RNAm. Wsta cauda relacionada com a "ala-de-panela" que determinaria o encerramento da transcrio. Esse encerramento tambm poderia ser causado pela prpria RNA polimerase atuando como barreira fsica (Lamb & Krug, 1996). Replicases (complexo enzimtico) podem ser catalizadoras diferentes das transcriptases, envolvidas nas cpias de RNAv e sntese dos moldes. As transcriptases estariam envolvidas na sntese de RNAm. Papel da Protena No Estrutural NS1 A NS1 est envolvida na regulao da exportao de RNAm (viral) clivado do ncleo (e RNAm celulares), inibindo essa exportao e tambm a clivagem do pre-RNAm. Traduo Durante a infeco pelos influenza vrus ocorre uma dramtica mudana de sntese protica, de protenas celulares para protenas virais, comandada por processos nucleares e citoplasmticos. Embora haja no ncleo a degradao das transcries de RNAm celular, esse mecanismo no explica suficientemente a interrupo da traduo de RNAm celular, pois h muitos RNAm celulares funcionais no citoplasma. A interrupo da traduo dos RNAm celulares ocorre em 3 horas aps a infeco de diversos tipos celulares. No ocorre por degradao ou modificao do RNAm celular, mas se deve interrupo da iniciao e alongamento das tradues. A iniciao da traduo seletiva e privilegia RNAm viral por serem muito eficientes os iniciadores desses (Lamb & Krug, 1996).

Brotamento Observaes de clulas infectadas ao microscpio eletrnico permitem a visualizao dos influenza vrus na membrana plasmtica, as quais evidenciam protenas estruturais presentes na membrana celular, independentemente de outros componentes estruturais, estrutura hbrida de membrana celular e protena viral precursora do envelope viral e relacionada ao brotamento dos novos vrions para fora da clula. As protenas da clula hospedeira no so includas na estrutura do envelope viral e, a exemplo de algumas protenas virais no transportadas para a membrana, parecem ser excludas ou seletivamente impedidas (por exemplo, a protena viral M2 est expressa na membrana celular em concentrao 4 vezes menor que a HA). As associaes proticas envolvidas no brotamento viral (Figura 8) incluem contatos entre M1, ligada dupla camada lipdica e a nucleoprotena (NP). atraente a noo de que as caudas citoplasmticas das HA teriam o papel de permitir essas interaes entre o envelope viral e seus componentes internos, embora tenha sido demonstrado que vrions sem as caudas citoplasmticas executam brotamento normal. Os stios citoplasmticos da HA (caudas citoplasmticas), pelo menos em parte, pareceram necessrios para o processo de seleo das protenas a serem montadas no vrion (Naim & Roth, 1993). A liberao dos vrions aps o envelopamento pelas associaes de NP-M1 parece necessitar da ao da neuraminidase (NA), uma vez que vrions com NA defectiva formam agregados e se reduz a liberao (e ttulo) desses em cultura (Lamb & Krug, 1996). Classificao de Isolados Os lquidos alantides (LA) de ovos SPF inoculados com material suspeito via cavidade alantidea aos 10-11 dias de embriognese so testados para atividade hemaglutinante (HA) frente a hemcias de galinhas SPF. LA reagentes para HA devem ser titulados (microteste em diluio dupla seriada), padronizados para 4 e 8 unidades hemaglutinantes e avaliados em provas de inibio da hemaglutinao (HI) com soro monovalente contra o vrus da doena de Newcastle (NDV). LA com HA no neutralizada no HI para NDV deve ser testado para a presena de

antgenos da nucleoprotena (NP) ou protena da matriz do tipo A, para confirmao de AIV. Os testes mais comuns para identificao da NP ou protena da matriz de AIV so imunodifuso dupla ou teste de hemlise simples radial em gel, na qual reagem o AIV sendo identificado e um soro monoespecfico contra AIV. ELISA foram desenvolvidos empregando anticorpo monoclonal especfico para a NP ou protena da matriz e representam ensaios rpidos, sensveis e especficos (Walls et al., 1986.). A subtipificao da HA e NA a seguir obtida em testes com um painel de 15 soros contra as 15 HA e 9 NA diferentes, no podendo haver reao cruzada entre elas, sendo fundamental a identificao prvia do AIV pela deteco de NP ou protena da matriz, por haver possibilidade de reao negativa por surgimento de nova HA. Testes de inibio da neuraminidase, especialmente os microtestes, detectam subtipos de NA, com soros especficos contra cada uma das nove neuraminidases (Easterday et al., 1997). Aves domsticas comercializadas nos mercados de aves vivas em Hong Kong foram monitoradas desde 1997, aps o surto de HPAIV H5N1 em humanos, sendo que foram detectados gansos sorologicamente reagentes ao AIV H5N1 em 1999 e os vrus isolados, denominados coletivamente A/Environment/Hong Kong/437/99, por swabbing das gaiolas. A/Env/HK/437/99 foram caracterizados como uma mistura de quatro isolados, muito relacionados aos isolados A/Goose/Guangdong/1/96 (Cauthern et al., 2000). As seqncias de estirpes de AIV do surto de Hong Kong em 1997 foram examinadas evidenciando que derivaram de influenza vrus de aves e no de humanos (Subbarao & Shaw, 2000). Estudos filogenticos de isolados de AIV contendo H7, obtidos de aves dos mercados de aves vivas do nordeste dos EUA indicaram para mltiplas recombinaes de genes, em que o gene da HA pareceu ter sido o nico gene novo introduzido (Suarez et al., 1999.). As hemaglutininas de isolados de oito surtos de AIV H5N2 de alta patogenicidade no norte da Itlia foram estudadas, sendo os isolados considerados semelhantes ao A/HK/156/97 (H5N1 de Hong Kong 1997), agrupando filogeneticamente com esse, mas distingveis deste. A HA de uma amostra no patognica H5N9 isolada durante o perodo dos

surtos foi considerada semelhante amostra altamente patognica A/turkey/England/91 (H5N1) (Donatelli et al., 2001).

EPIDEMIOLOGIA
Ocorrncia Somente o tipo A de AIV causa infeco natural em aves, embora todos os 15 subtipos de HA e nove de NA tenham sido isolados de aves, nas quais dois grupos distintos podem ser divididos, considerando a virulncia. Os isolados muito virulentos causam a influenza de alta patogenicidade (HPAIV), com mortalidade que atinge 100% das aves. Os HPAIV apresentam geralmente HA dos subtipos H5 e H7, embora nem todos isolados desses subtipos sejam de alta patogenicidade. Todos os outros subtipos so menos patognicos para aves, resultando em doena respiratria leve, embora possa ser agravada por infeces concomitantes, imunodepresso e/ou condies de ambincia desfavorveis s aves. Surtos primrios de HPAIV tm sido descritos desde 1959, cinco em perus e 12 em galinhas. Subtipos causadores de HPAIV so raramente isolados de aves silvestres. Por exemplo, HPAIV representam 15% dos isolados de patos e gansos e 2% de outras espcies. Em silvestres, entretanto, mais comum o isolamento de amostras de baixa virulncia para aves domsticas. O contato das aves domsticas com aves silvestres determinante para a ocorrncia de surtos nas primeiras. O papel da transmisso mecnica tambm importante, principalmente por trabalhadores e tcnicos ao transferir fezes infectadas para lotes susceptveis (Alexander, 2000). As informaes sanitrias do Office International des Epizooties (http://www.oie.int/esp/info/hebdo/EIS_01.HTM) registram os focos de influenza aviria por HPAIV em janeiro e fevereiro de 2000 na Itlia, em galinhas, perus, codornas e galinhas da Angola e vrias outras espcies nas regies de Fruili, Venezia, Giulia, Lombardia, Sicilia, Trento, Veneto e Piemonte, com maior nmero de focos na provncia de Brescia (65 em janeiro e 33 em fevereiro) e Mantova (28 em

janeiro e 3 em fevereiro) na regio da Lombardia, Verona (65 em janeiro e 21 em fevereiro) e Vicenza (19 em janeiro e 1 em fevereiro) em Veneto, envolvendo um total de 5.932.622 aves em janeiro e 1.777.777 em fevereiro. Na Itlia, HPAIV parecem ser enzoticos desde o sculo 19 e relatos de isolamentos de AIV de baixa patogenicidade de vrios subtipos tm sido publicados (Franciosi et al., 1981; Petek, 1982; Papparella et al., 1994; 1995), isolados de aves domsticas, especialemente perus e aves aquticas selvagens (Capua & Marangon, 2000). De acordo com o relatrio da O.I.E. de 1997 (O.I.E. Bulletin, 1997), formas de alta patogenicidade de AIV ocorreram em Hong Kong (um em abril e dois em maio), na Itlia (3 surtos em novembro e 4 em dezembro) e Austrlia (um surto). AIV foram isolados da gua (onde podem ser preservados durante o congelamento de inverno, aguardando o retorno das aves) e de fezes da margem de lagos que abrigam comunidades de patos selvagens migratrios no Canad. O estudo canadense concluiu que 20% dos patos selvagens jovens esto infectados com muitos subtipos (enzoticos) quando se agrupam para a migrao, embora no apresentando sinais clnicos. Os patos podem excretar AIV por 30 dias, mas infeco persistente no foi demonstrada. A contnua circulao dos AIV nas populaes de aves aquticas migratrias ocorre, entretanto em baixa incidncia nos perodos migratrios subtropicais (Murphy & Webster, 1996), possivelmente explicando a baixa ou no ocorrncia no Brasil. A baixa virulncia dos AIV em patos garante a preservao do vrus na natureza, por adaptao da infeco durante muitos sculos, perpetuando os AIV nesses reservatrios naturais, dos quais disseminam-se mutantes e/ou recombinantes capazes de infectar as diversas espcies animais, incluindo focas, baleias, sunos, cavalos e aves domsticas, especialmente perus (Murphy & Webster, 1996), alm de humanos (Figura 9).

A hiptese atual considera as aves aquticas, especialmente da ordem Anseriformes, incluindo patos, marrecos e gansos como reservatrios principais de influenza A na natureza. Dessas espcies haveria a transmisso para todas as demais espcies de aves, por exemplo aquticas da ordem das procelrias (Procellariidae, Puffinus sp.; Diomedeidae; Hydrobatidae; Pelecanoididae) e gaivotas (Laridae, Larus sp.), passeriformes e mamferos. A transmisso de AIV foi demonstrada entre sunos e humanos (linhas slidas). H inmeras evidncias da transmisso entre patos e outras espcies com base nas informaes de anlises filogenticas do gene da nucleoprotena de grande nmero de estirpes de influenza vrus dos cinco diferentes grupos de hospedeiros. O intercmbio de AIV entre sunos e humanos tem sido demonstrado (seta em negrito). Alta homologia entre os genes internos foi detectada nos isolados H9N1, H6N1 e H5N1 indicando que esses subtipos so capazes de fazer intercmbio de genes e, portanto, figurar como fonte potencial de isolados patognicos para humanos, sendo necessria a vigilncia epidemiolgica para esses em aves aquticas e domsticas, sunos e humanos (Hoffmann et al., 2000). As etiologias das pandemias humanas de 1957 e 1968 foram caracterizadas como estirpes hbridas que continham genoma recombinante de AIV de aves e humanos (Horimoto & Kawaoka, 2001). O pool

gentico de AIV em aves aquticas migratrias e de praia sugere que uma transmisso de baixo nvel ocorre entre essas aves por todo o ano, caracterizando dois grupos reservatrios com interseco geogrfica em todo o globo. Todos os subtipos de HA e NA ocorrem nessas aves. Embora tenham sido detectadas evidentes tendncias dos isolados serem geograficamente restritos e hospedeiros especficos, caracterizados pela protena NP, por exemplo de eqinos, sunos, gaivotas e outras espcies de aves e isolados de humanos, outros genes apresentam extensiva tendncia recombinao gentica. Todas as linhagens de AIV de mamferos foram originadas do pool gentico das aves (possvel inclusive para influenza B). As anlises dos segmentos do RNA que codificam as protenas das espculas (HA, NA e M2) e protenas internas (RNA transcriptases A, B1 e B2; NP, M e S) de uma grande variedade de hospedeiros e de regies geogrficas distintas permitiram essas concluses. O compartilhamento gentico de AIV entre essas espcies ocasiona surtos e pandemia, indicando a possibilidade de sunos servir como hospedeiros intermedirios para intercmbio gentico entre AIV de aves reservatrio e humanos (Webster et al., 1992). O ltimo surto de AIV de alta patogenicidade (HPAIV) em galinhas nos Estados Unidos foi causado por representantes do subtipo H5N2 na Pennsylvania e New Jersey, em 1983-1984, que foi controlado pelo esforo federal de erradicao (Avian Influenza Task Force, 1984.). Entretanto, vrios AIV H5N2 foram isolados entre 1986 e 1989 em aves de mercados de aves vivas nos Estados Unidos. Para avaliar as relaes epidemiolgicas entre as estirpes, as seqncias dos genes que codificam a subunidade HA1 da HA e do gene que codifica a protena no estrutural (NS) foram determinadas para 11 estirpes e comparadas com as seqncias de estirpes conhecidas. As estirpes de 1986-1989 foram todas relacionadas s estirpes de 1983-1984 da Pennsylvania, pela seqncia de bases e de aminocidos de ambos os genes e protenas, provando que a linhagem Pennsylvania/83 (Penn/83) no foi completamente erradicada. Outra informao interessante sobre a linhagem Penn/83 que ela

apresentou substituies de aminocidos exclusivas, no detectadas em outras linhagens de AIV, indicando que Penn/83 pode estar circulando de forma inaparente nas aves antes dos surtos clnicos, representando outro exemplo de manuteno e evoluo de longo termo de AIV (Suarez & Senne, 2000). Oito surtos de influenza aviria subtipo H5N2 de alta patogenicidade, com ndices de patogenicidade de 2,98 a 3,00, caracterizados por inoculao intravenosa em galinhas de 6 semanas de idade, foram diagnosticados nas regies de Veneto e FruiliVenezia Giulia, no nordeste da Itlia, entre outubro de 1997 e janeiro de 1998. Em todos os surtos, os riscos caracterizados incluram movimentao de aves, criaes de mltiplas espcies e contato com aves aquticas migratrias. As medidas de controle previstas pela Comunidade Europia, na lei 92/40/EEC, foram aplicadas e impediram a disseminao para a avicultura industrial (Capua et al., 1999). Surtos de AIV foram diagnosticados em galinhas poedeiras, frangos e reprodutoras da regio metropolitana de Islamabad, Murree e Abbatt Abad (Paquisto), entre 1994 e 1995, resultando em mortalidade de mais de 85% das aves. Vrus hemaglutinante de eritrcitos (galinha, ovelha, coelho, cobaio, bovino, papagaio, pombo, codorna e pardal) foi isolado em embries SPF, ocasionando a morte embrionria 36 horas p.i., no sendo inibido por anticorpos contra o vrus da doena de Newcastle ou bronquite infecciosa. A estirpe foi caracterizada como integrante do subtipo H7 de AIV (Muhammad et al., 1997). Um surto de doena caracterizada por queda sbita na produo de ovos, de 70% para 5%, edema das faces, fraqueza e morte de 2 a 3% ao dia, ocorrido em 1998, tambm no Paquisto, foi descrito em reprodutores de diferentes idades, principalmente em lotes de 45 semanas, do qual se isolou A/chicken/Pakistan/3/99 (H9N2) (Naeem et al., 1999). Em humanos, h evidncias sorolgicas que houve pandemias em 1889-1890 causadas por vrus semelhante ao subtipo "asitico" (H2N2), em 1900 (H3N8), 1918 (H1N1 - Espanhola), 1957 (H2N2

Asitica), 1968 (H3N2 Hong Kong), 1977 (H1N1 Russa). A pandemia de 1918 matou entre 20-40 milhes de pessoas e mudou o curso da histria, por debilitao do exrcito alemo. A mortalidade por influenza entre as tropas dos EUA atingiu 80% do efetivo na 1 Guerra Mundial (Murphy & Webster, 1996). Crianas humanas so a principal fonte de transmisso de vrus influenza A na comunidade, visto que as escolas e salas de aulas fornecem as condies de proximidade e aglomerao que favorecem a disseminao, especialmente por aerossol. Os influenza A resistem nos aerossis por um inverno inteiro no ambiente de baixa umidade dentro de casa nos climas temperados (dezembrojaneiro a abril-maio nos EUA), contribuindo para a ocorrncia estacional de influenza no inverno. A deteco de mutantes de hemaglutinina ao final da primavera tem sido considerada indicao de risco de surto para o prximo inverno (Moriuchi et al., 1991 citados por Murphy & Webster, 1996). Em humanos, embora a morbidade mais alta esteja em pessoas com 20 anos ou menos, a taxa de mortalidade mais alta ocorre entre pessoas com 65 anos ou mais. A mortalidade mdia de humanos por influenza em adultos de 65 anos de idade ou mais velhos a cada ano de 1:2200. A pandemia de 1918 ocasionou alta mortalidade em jovens adultos e naqueles acima de 65 anos, caracterstica que no se repetiu em pandemias subseqntes. Nos anos de epidemia de 1957 e 1958, 70.000 pessoas morreram e 1 em cada 300 adultos com 65 anos de idade ou mais morreu. Embora a mortalidade humana seja mais alta no primeiro ano de surto com novo subtipo, a mortalidade acumulada nos anos seguintes interpandemia significativamente mais alta que a do primeiro ano (Murphy & Webster, 1996). Nenhum ttulo de anticorpos circulantes especficos contra AIV foi detectado em 100 pombos (Columba livia) urbanos da cidade de Santiago do Chile avaliados durante 12 meses (maro 1996-maro 1997). Ttulos muito baixos (1 a 3 log2) para PMV-1 (doena de Newcastle) e nenhum ttulo para PMV-7 foram detectados (Toro et al., 1999). Na China, vinte espcies (no citadas) de aves raras em 4 fazendas foram avaliadas sorologicamente para diversos agentes de doena para as aves industriais.

Anticorpos para Mycoplasma gallisepticum (Mg), Salmonella pullorum (SP), clamidiose aviria (CA), doena de Newcastle (ND), laringotraqueite infecciosa (LI), doena de Marek (DM), bronquite infecciosa (BI), sndrome da queda da postura (EDS), bouba aviria (FP), leucose aviria, artrite viral e clera aviria foram detectados em 13 espcies, com Mg ocorrendo como o mais alto ndice (25%), seguido de SP (21.5%), CA (16.67%) e ND (15.31%). Anticorpos para doena infecciosa bursal (Gumboro), coriza infecciosa, adenovrus avirios do grupo I e influenza aviria no foram encontrados e testes intradrmicos de tuberculina foram negativos (Zhang et al., 1996). Outro estudo foi desenvolvido em outras 13 granjas de aves industriais e um de aves exticas, nas quais todas as aves industriais foram negativas para AIV, e 39/50 das amostras de soros das aves exticas foram positivas para AIV pelo teste de AGP. As aves exticas tinham histrico de doena clinicamente semelhante clera aviria, no resolvida com vacinao contra a clera aviria e doena de Newcastle ou soroterapia contra a doena infecciosa bursal. A doena causou a mortalidade de 10.000 faises e o controle de novos episdios foi obtido com a destruio dos faises sobreviventes e de outras espcies de aves, alm da aplicao de limpeza e desinfeco rigorosas (Zhu et al., 1996). Um estudo epidemiolgico desenvolvido na Itlia investigou a presena de AIV em faises criados para esporte em fazendas de caa. As amostras de swab cloacal de 200 indivduos no resultaram em isolamento de agente hemaglutinante (Piccirillo et al., 1999). Outro estudo italiano caracterizou estirpes de alta patogenicidade de AIV (HPAIV) do subtipo H5N2 isolados da avicultura do norte da Itlia. As estirpes italianas, embora distingveis de A/Hong Kong/156/97 (H5N1), foram consideradas antigenicamente semelhantes. A anlise filogentica da HA das estirpes italianas agrupou essas com as estirpes de Hong Kong, embora as anlises de HA, NS e NP das estirpes de H5N1 em circulao em Hong Kong e H5 italianas indicarem origens de ancestrais diversos. Na Itlia, nenhuma evidncia de transmisso de aves para humanos foi detectada para H5N2 (Donatelli et al., 2001), em contraste com as estirpes H5N1 de Hong Kong. Entretanto, estudos

anteriores de composio e seqenciamento da HA de A/duck/Ukraine/1/63 (H7) indicaram que as HA1 e HA2 dessa estirpe esto intimamente relacionadas com o subtipo H3 de Hong Kong (Ward et al., 1981). Influenza aviria no Brasil H ainda pouqussimos estudos na literatura cientfica nacional e internacional sobre a ocorrncia de AIV nas aves selvagens e ornamentais da fauna brasileira. Os trabalhos descrevem avaliaes de fauna local, com amostragem de algumas espcies. Um estudo da fauna de aves do Rio de Janeiro descreveu a ocorrncia e caracterizou estirpes de AIV natural em espcies ornamentais nesse estado (Couceiro et al., 1982). Um estudo sorolgico em espcies de aves silvestres foi desenvolvido no Estado de So Paulo por Anraku et al. (1971), estudando anticorpos por gel precipitao. Em avaliaes sorolgicas de plantis industriais conduzidas em Minas Gerais, em frangos de corte (Resende et al., 1990), no foram detectados anticorpos para AIV. Aps os surtos de 1983-1984 nos EUA, os pesquisadores investigaram anticorpos para AIV H5N2 em frangos de corte, com vistas a determinar o status sanitrio especfico desses. Para os ensaios laboratoriais, foi utilizada a gel precipitao em gar, no sendo detectadas quaisquer reaes especficas para AIV. Soros de 2000 frangos, entre 49 e 60 dias de idade, de 175 lotes em 96 granjas comerciais das regies do Alto So Francisco e Metalrgica de Minas Gerais, colhidos entre 1985 e 1986, foram avaliados. Os resultados indicaram que as estratgias de biossegurana implementadas pelo Ministrio da Agricultura, proibindo a importao de aves e ovos frteis dos EUA no perodo crtico, foram eficientes. Atualmente, o Ministrio da Agricultura mantm monitorao permanente das aves importadas nas portas de entrada do pas. O Projeto de Vigilncia Ativa (Projeto de Vigilncia, 2001) do PNSA, coordenado pelo Ministrio da Agricultura, em colaborao com instituies pblicas (universidades, Secretarias da Agricultura, institutos de pesquisa etc) e privadas (indstria, laboratrios de produo de vacinas e diagnstico etc) prev tambm a

amostragem para a avaliao permanente dos plantis comerciais nacionais, que inclui a simultnea avaliao para vrus, assim como anticorpos, para a doena de Newcastle e influenza aviria. Em humanos, a ocorrncia de influenza tem sido regularmente acompanhada. Um estudo de 12 meses aps a implementao do programa de vacinao voluntria indicou que a vacinao no foi suficiente para a reduo dos episdios clnicos e faltas ao trabalho em relao aos indivduos no vacinados (Ramadan et al., 2001). Estudos sobre a ocorrncia de esquizofrenia em humanos adultos no Brasil e sua relao com a estao de chuvas indicaram a infecco por influenza vrus durante a gestao como base para esta relao (Messias et al., 2001). Em outro estudo, soros de humanos foram avaliados em Belm do Par para anticorpos contra influenza A e B, nos anos de 1992 e 1993, por inibio da hemaglutinao para anticorpos contra A/Taiwan/1/86 (H1N1), A/Beijing/353/89 (H3N2) e B/Yamagata/16/88. Anticorpos para ambas estirpes de influenza A foram detectados em 84% (H3N2) e 56% (H1N1) dos soros e nveis mais baixos para o tipo B. Um aumento na incidncia de ttulos para H3N2 e tipo B foi detectado em 1993. (Santos et al., 1997). Anticorpos para H3N2 A/Hong Kong/1/68 e A/Bangkok/1/79 e A/Brazil/11/78 (H1N1) foram tambm investigados em nativos americanos da tribo Kren-Akorore (Parque Indgena do Xingu), tribo contactada pela primeira vez apenas em 1973, para os quais nenhum ttulo de anticorpos foi detectado, indicando a ausncia de transmisso por contato prvio e o isolamento dessa populao (Nascimento et al., 1985). Evoluo dos AIV Os estudos da ecologia dos influenza vrus tm confirmado a hiptese que as estirpes de mamferos evoluem de estirpes de aves. Cinco linhagens filogenticas foram estabelecidas com base nos estudos da NP: uma eqina antiga (no detectada h 15 anos), uma linhagem eqina recente, uma linhagem de gaivotas, uma de sunos e outra de humanos formam os ramos principais de evoluo. Os grupos de sunos e humanos so relacionados, ambos possivelmente originrios de influenza A

avirio (AIV) comum. Linhagens separadas de AIV, baseadas em estudos da NP e outros genes, foram determinadas para estirpes das Amricas e Europa/Asia (Webster et al., 1992), distino que estaria associada migrao de aves aquticas, principalmente no sentido norte-sul (latitude) nesses continentes, e no leste-oeste (longitude). Aves que migram no sentido da longitude teriam importante papel na continuidade da evoluo de influenza. Os modelos atuais de evoluo para os vrus influenza A so baseados em estudos de estirpes humanas, nas quais a taxa de evoluo muito alta em HA, em contraste com as protenas internas (RNA transcriptases A, B1 e B2; NP, M1 e NS). As velocidades de evoluo de M1 e M2 tm ndices diferentes e esto adequadas ao critrio protena externa e protena interna, a M2 localizada externamente com taxa muito mais alta que M1 interna e uma grande proporo das mutaes no gene de M2 no so silenciosas, enquanto que as mudanas em M1 no afetaram a codificao em um perodo de 55 anos (Ito et al., 1991). Em contraste aos influenza A de humanos, os AIV de aves aquticas tm ndices de evoluo baixos, com indicaes de que no h evoluo lquida nos ltimos 60 anos. As mudanas de nucleotdeos nos AIV so silenciosas e no representam trocas de aminocidos, significando que os AIV das aves aquticas funcionam como reservatrio natural de genes sem ou com poucas mudanas (Murphy & Webster, 1996), entre eles os vrus que forneceram os segmentos genticos envolvidos nas pandemias de 1918 (gripe Espanhola), 1957 e 1968 (sia). A evoluo molecular dos influenza A nas populaes de aves e humanas apresenta diferentes padres. Em aves co-circulam um grande nmero de segmentos genmicos de hemaglutininas diferentes. A modificao simultnea da HA e NA foi sugerida como necessria para a adaptao de influenza A de aves aquticas selvagens para galinhas domsticas, embora a modificao da HA para Sia2-3Gal parea no restringir a transmisso inicial de aves para humanos. Os AIV H5N1 de aves apresentam deleo de 19 aminocidos na haste da NA e um carboidrato na cabea globular da HA. A deleo reduz a liberao do AIV das clulas e a presena do carboidrato reduz a afinidade viral para os receptores

celulares. A NA encurtada e HA adicionalmente glicosilada so caractersticas dos subtipos H5 e H7 de galinhas (Matrosovich et al, 1999). A taxa de evoluo dos AIV nas espcies hospedeiras naturais (aves aquticas, aves de praia e gaivotas) considerada baixa, enquanto que em mamferos alta. Outras espcies como galinhas, perus, sunos, eqinos e humanos so consideradas como hospedeiros aberrantes. A distino entre espcies hospedeiras normais e aberrantes importante, pois permite a verificao de taxas de mutao diferenciadas nesses dois grupos. A presso seletiva para adaptao nas espcies aberrantes, por exemplo espcies da classe dos mamferos, determina alta mutabilidade de AIV presentes nesses. As seqncias de nucleotdeos dos genes precursores da hemaglutinina (HA) e componentes no estruturais (NS) foram comparadas entre seqncias de consenso e seqncias genticas de AIV de surtos em galinhas e perus, indicando que as taxas de evoluo foram semelhantes quelas de mamferos, evidenciando a adaptao de AIV nessas espcies de aves (Suarez, 2000). Informaes genticas entre AIV de humanos, sunos e aves foram demonstradas na HA do subtipo H1, aps a deteco de semelhanas empregando anticorpos monoclonais contra A/duck/Alberta/35/76 (Austin & Webster, 1986). Analisando a evoluo molecular dos vrus influenza, Marakova et al. (1998) produziram um dendograma com dois grupos distintos, no primeiro com relao linear entre o ano do isolamento e a distncia evolucionria, incluindo os vrus humanos, mas no linear no segundo grupo, composto predominantemente por AIV (de aves), concluindo que a recombinao gentica no atuou de forma considervel neste processo, os subtipos modernos de HA possivelmente formados antes da introduo de AIV na espcie humana. As relaes filogenticas entre amostras de AIV do subtipo H5 isoladas na Amrica do Norte foram avaliadas por anlise dos genes da HA e NS, indicando a manuteno de mltiplas divises e sublinhagens em aves aquticas migratrias, sendo que, das quatro seqncias de HA1 conhecidas, trs esto presentes em aves aquticas migratrias. A anlise filogentica do gene

NS em populaes de patos evidenciou a existncia de sublinhagens mltiplas e re-arranjo deste gene em dois alelos. Das sublinhagens, as mais instveis geneticamente foram aquelas isoladas dos surtos recentes no Mxico central (Garcia et al., 1997), presentes em plantis de galinhas durante 16 meses. As seqncias de aminocidos deduzidas de HA na regio associada com a adsoro ao receptor celular revelaram que isolados de aves aquticas, galinhas vivas de mercado popular e perus no possuam glicosilao no aminocido 236, embora essa ocorra em isolados de galinhas industriais (Garcia et al., 1997). O papel dos sunos como fonte de vrus para humanos e aves e vice-versa (Figura 9) tem sido relatado. O isolamento de AIV do subgrupo H4N6 de sunos com pneumonia de uma fazenda comercial, descrito no Canad, permitiu a demonstrao da infeco natural inter-espcie de aves para sunos. A anlise filogentica dos 8 segmentos do RNA demonstrou ser essa estirpe representante da linhagem norte americana de AIV (Karasin et al., 2000). Um isolado de AIV H1N1 em sunos foi descrito como capaz de cruzar a barreira especfica entre aves e sunos, indicando evoluo e mutao independentes do isolado aps a transmisso para sunos (Stech et al., 1999). Os genes da hemaglutinina de quatro isolados de AIV de sunos da Carolina do Norte, Texas, Minnesota e Iowa foram todos derivados do isolado humano H3N2 que circulou em 1995 (Zhou et al., 1999). A seqncia de nucleotdeos do gene da HA1 da estirpe A/turkey/Germany/2482/90, isolada de aves mantidas em fazenda de sunos, foi comparada com o gene da HA1 de estirpes isoladas dos surtos recentes de influenza em aves e sunos. As seqncias do gene da HA de uma estirpe H1 de perus proporcionaram evidncias adicionais de transmisso originria de sunos (Wood et al., 1997). A coinfeco de sunos com influenza vrus suno e avirio defectivo gerou recombinantes que apresentavam HA de origem aviria e que puderam ser replicados em sunos. Essas evidncias indicam que infeces mltiplas de influenza vrus contribuem para a gerao de variantes por recombinao (Kida et al., 1994). De fato, recombinaes genticas mltiplas

foram demonstradas entre AIV e influenza humanos em co-infeces em sunos, gerando novo gentipo de H1N2, a partir de co-infeco de H1N1 tipo humano e H3N2 tipo suno seguido de infeco por H1N1 tipo avirio (Brown et al., 1998). Os seqenciamentos parciais dos genes codificadores da neuraminidade e de componentes estruturais internos de AIV foram obtidos de um isolado 268/96 de um humano (mulher) com conjuntivite, apresentando homologia de 98,2% estirpe AIV H7N7 de perus isolada na Irlanda do Norte, em 1995. O relato descreve e caracteriza pela primeira vez a infeco de humanos por AIV diretamente de aves (Banks et al., 1998).

TRANSMISSO
A transmisso de AIV da ave infectada para a ave susceptvel ocorre principalmente a partir de secrees respiratrias e digestrias, direta ou indiretamente, essa ltima especialmente por equipamentos contaminados com fezes (insetos, veculos de transporte, bebedouros, gua, comedouros, rao, gaiolas, pessoal por roupas, calados e botas etc). As aves de vida livre podem transmitir diretamente a infeco ao inadvertidamente compartilharem o ambiente de criao. Quatro categorias de fontes de transmisso para a avicultura industrial foram hierarquizadas (Alexander, 1982), em ordem de importncia, sendo: a 1 outras espcies de aves domsticas (por exemplo, patos para galinhas), a 2 aves de companhia exticas (no ainda descrito na literatura apesar do potencial terico), a 3 aves selvagens (fonte comum de transmisso para a avicultura industrial, por exemplo a partir de aves aquticas migratrias) e a 4 outras espcies animais (por exemplo, de sunos para perus). A transmisso de AIV H2 da Eursia para aves de praia da Amrica do Norte foi determinada. A HA da linhagem Eursica foi detectada em isolados americanos que, considerando a importncia da pandemia de 1957 pelo subtipo H2, refora a

necessidade de vigilncia epidemiolgica continuada (Marakova et al., 1999). A importncia da via fecal-oral de transmisso de aves migratrias para outras espcies foi demonstrada em estudo em que isolados de AIV, assim como do vrus da doena de Newcastle, foram obtidos de patos migratrios abatidos em Mississipi (EUA), sendo a neuraminidase (NA) de um AIV no reconhecida por nenhum dos soros de referncia, embora relacionada com a NA de A/duck/GDR/72 (patos - Alemanha), A/turkey/Ontario/7732/66 (perus - Canada), A/duck/Ukraine/1/60 (patos Ucrnia) e A/turkey/Wisconsin/68 (perus EUA). Um dos isolados A/duck/Memphis/546/74 produziu conjuntivite e descarga ocular em 1/5 dos patos inoculados experimentalmente e eliminao nas fezes por 10 dias (Webster et al., 1976). Aves aquticas, consideradas reservatrios de AIV e vrus da doena de Newcastle (NDV), tm sido amostradas para virologia. Aves aquticas selvagens de 14 espcies da frica do Sul (262 aves) que habitavam as proximidades de criatrio intensivo de avestruzes (Struthio camelus), onde ocorreram casos de influenza, foram avaliadas, sendo que oito continham a estirpe H10N9. Todas as estirpes foram apatognicas para galinhas com ndice de patogenicidade intravenoso 0,00 (Pfitzer et al., 2000). A circulao continuada de vrus de alta virulncia entre aves domsticas e humanos foi detectada em Hong Kong, relacionada com os isolados H5N1 de 1997 (A/HK/156//97), compartilhando H5 com idnticos stios de clivagem, indicando que pelo menos um dos genes das estirpes H5N1 de Hong Kong de 1997 continua a circular pela China continental (Cauthen et al., 2000). Entretanto, a transmisso de AIV de galinhas para uma criana parece ter ocorrido em um episdio sem o papel de espcie intermediria (por exemplo, sunos) como "recipiente de mistura" para recombinao (Claas et al., 1998). Ao contrrio, em estudos para a caracterizao de isolados de H5N2 da avicultura italiana, no foram encontradas evidncias de transmisso de ave para humanos (Donatelli et al., 2001).

A transmisso inter-espcies de AIV, tendo em vista os surtos de H5N1 em Hong Kong, foi abortada parcialmente, impedindo pandemia. A estratgia foi de erradicao por sacrifcio de aves nos mercados de aves vivas e outras aves na regio dos surtos, e chamou a ateno para aves como fonte de vrus para humanos (Shordridge et al., 2000). Portadores e Reservatrios Naturais A co-infeco de AIV de diferentes subgrupos em espcies de aves considerada importante estratgia de gerao de diversidade entre os gentipos de AIV. Surtos em perus tm sido descritos nos EUA, nos estados produtores de perus, mantidos em rotas de migrao de aves aquticas migratrias, especialmente da ordem Anseriformes. Os perus tm sido desafiados nas estaes de migrao por estirpes patognicas (Alexander, 2000). O papel dos patos na introduo de AIV com hemaglutinina (HA) H3 para sunos no sul da China foi considerado no surgimento da estirpe A/Hong Kong/68 (H3N2), em que a HA entre vrus isolado de pato domstico apresentou semelhana de 98,7 e 99,5%, respectivamente, para HA de suno e pato selvagem (Yasuda et al., 1991). A transmisso de HPAIV AIV (H7) de propriedades vizinhas com galinhas e patos para uma granja de matrizes de frangos de corte de 24 semanas de idade foi registrada na Austrlia. Aves acometidas no surto apresentaram edema subcutneo, congesto da cabea e palidez do msculo do peito. AIV foi detectado nas aves industriais em impresses pancreticas coradas por imunofluorescncia e as aves das propriedades vizinhas apresentaram ttulos de anticorpos para H7 (Selleck et al., 1997). Embora algumas espcies exticas possam representar risco de transmisso de doenas para a avicultura industrial, uma estirpe de AIV H10N7 isolada de emu (Dromaius novaehollandiae) que apresentava sinais clnicos respiratrios e conjuntivite, foi caracterizada como no patognica para galinhas (Woolcock et al., 2000).

Diferenas de adaptao de diferentes AIV para diferentes espcies de aves foi descrita. Sharp et al. (1997) propem que os subtipos de AIV so diferentemente adaptados aos hospedeiros, nos quais a infeco natural no ocorre ao acaso. Os subtipos de AIV mais raros s aves poderiam ser adaptados por co-infeco com AIV mais comuns. De acordo com esses autores, os subgrupos de AIV predominantes nas espcies so relativamente espcie-especficos, enquanto os AIV de outros subgrupos presentes em eventos de co-infeco no o so (Sharp et al., 1997). Soros de falces das pradarias (Falco mexicanus) foram negativos para anticorpos contra AIV, assim como negativos para o vrus da doena de Newcastle (Morishita et al., 1998). Aves aquticas selvagens foram consideradas reservatrios de AIV e vrus da doena de Newcastle (NDV). Amostras para virologia de 14 espcies aquticas selvagens da frica do Sul, que habitavam as proximidades de criatrio intensivo de avestruzes (Struthio camelus) onde ocorreram casos de influenza, foram examinadas para AIV. Das 262 aves avaliadas, oito amostras continham a estirpe H10N9 e todas as estirpes foram apatognicas para galinhas (ndice de patogenicidade intravenoso 0,00). Em contraste, os soros de 33 aves continham anticorpos contra AIV H10 e apenas uma ave com anticorpos para H6, esse ltimo sendo isolado de avestruzes durante um surto de influenza na rea. As aves aquticas foram tambm avaliadas para o NDV, no sendo nenhuma estirpe isolada, embora anticorpos tenham sido detectados em 34 de 46 soros examinados (Pfitzer et al., 2000).

PERODO DE INCUBAO
O perodo de incubao de AIV para o aparecimento dos sinais clnicos em aves varivel com a espcie de ave, estirpe de vrus, dose de desafio e via de aplicao ou exposio, variando entre poucas horas e 3 dias (Easterday et al., 1997).

SINAIS CLNICOS

A infeco por AIV em aves resulta em quadro clnico muito varivel, dependendo da espcie, idade e sexo da ave, estirpe e dose de vrus e infeces oportunistas ou concomitantes. Os sinais clnicos so conseqncias de alteraes geralmente dos sistemas respiratrio, digestrio, nervoso e reprodutivo, com decrscimo do consumo de alimento e produtividade (ganho de peso e produo de ovos), emagrecimento, quadro respiratrio de leve a grave, com lacrimejamento, edema da face e cabea, cianose, alteraes nervosas e diarria (Easterday & Hinshaw, 1991; Easterday et al., 1997). A doena pode ser superaguda e resultar em mortes fulminantes sem quadro clnico prvio. As diferenas de susceptibilidade entre as espcies de aves ocasionam ampla variao nas conseqncias clnicas da infeco, em que uma estirpe patognica para uma espcie e no para outra. Os perus parecem ser muito sensveis a estirpes que ocorrem de forma assintomtica em patos (Murphy, 1987).

LESES
A caracterizao da patogenicidade dos AIV foi por algum tempo relacionada com a presena de HA do subtipo H7 e no permitia a elucidao dos episdios de doena em que estirpes no virulentas do mesmo subtipo eram isoladas de aves normais. A terminologia de peste aviria (fowl plague), associada a H7, foi sendo abandonada e em substituio adotaram-se critrios de classificao dos AIV de alta virulncia (HPAIV), conforme as seguintes recomendaes: 1 - Qualquer vrus de influenza letal a 6, 7 ou 8 de 8 galinhas com 4-6 semanas de idade em um perodo 10 dias, inoculadas via intravenosa com 0,2 ml de lquido alantide a 1:10 sem bactrias; 2 - Qualquer vrus da influenza dos subtipos H5 e H7 que no atinja o critrio acima, mas apresente seqncia de aminocidos no stio de clivagem da HA compatvel com as estirpes de alta virulncia (mltiplos aminocidos bsicos);

3 - Qualquer vrus da influenza no integrante dos subtipos H5 e H7, que cause a morte de 1 a 5 das galinhas de 4 a 6 semanas de idade via intravenosa (item 1), em 10 dias e seja replicado em monocamadas celulares na ausncia de tripsina (Proceedings, 1994). As leses resultantes de infeco por AIV (Easterday et al., 1997; Easterday & Hinshaw, 1991) so amplamente variveis, dependendo da estirpe de AIV, quanto patogenicidade, espcie de ave, dose de infeco, status imune do hospedeiro e infeco(es) concomitante(s). Em infeces por HPAIV, a morte pode ocorrer antes que leses proeminentes sejam observveis. Em termos gerais nenhuma leso considerada caracterstica de influenza. As leses do sistema respiratrio, por exemplo, nos seios paranasais (secreo fibrinosa, mucopurulenta ou catarral), traquia (edema e secreo de intensidade varivel na mucosa), sacos areos espessados e com exsudato seroso, fibrinoso ou fibrinopurulento. Peritonite por ovo ectpico e por contigidade dos sacos areos pode ser observada. Poedeiras podem tambm sofrer salpingite com acumulao de exsudatos no oviduto. Enterite hemorrgica, fibrinosa (graves) ou catarral (leve) pode ser observada e mais comum em perus (intestino delgado e cecos). Estirpes de subtipos de AIV que causam doena sistmica apresentam HA clivada (ativao que permite a penetrao na clula) por todas as proteases presentes em quaisquer clulas do hospedeiro sensvel, enquanto AIV no patognicos ou de baixa patogenicidade tm clivagem, e ativao da HA, somente nos intestinos das aves. Os mamferos podem ativar a HA com enzimas principalmente do sistema respiratrio, onde causam maior patogenia, embora as complicaes sistmicas possam envolver produtos de outros genes, como NA (Zambon, 1999). A presena de mltiplos aminocidos bsicos no stio de clivagem da HA (Tabela 2) considerada fentipo caracterstico de estirpes de alta patogenicidade para galinhas (Suarez et al., 1998).

Uma estipe de AIV A/mandarin duck/Singapore/805/F-72/7/93 (H10) de alta patogenicidade (HPAIV) para galinhas e isolado de patos, embora de subtipo no comumente associado s estirpes de HPAIV (H5 e H7), no apresentou seqncia de mltiplos aminocidos bsicos no stio de clivagem da HA e no foi replicado no encfalo de galinhas inoculadas via intravenosa. Os autores concluram que a patogenicidade estaria associada replicao renal (Wood et al., 1996). As estirpes de HPAIV esto relacionadas na lista A de doenas do Office International des Epizooties (OIE), so altamente contagiosas e produzem doena em mltiplos sistemas das aves, levando alta mortalidade algumas estirpes integrantes dos subtipos H5 e H7. A maior parte dos AIV isolados so, entretanto, de baixa patogenicidade e resultam em infeco subclnica ou respiratria e/ou reprodutiva em grande variedade de espcies de aves domsticas e selvagens e no constam da lista da OIE. Desde 1955, 18 surtos foram documentados de HPAIV. No so consideradas as aves aquticas selvagens como reservatrio de HPAIV, embora sejam portadoras de AIV de baixa patogenicidade, que periodicamente cruzam as barreiras especficas de hospedeiros, ocasionando doena leve em aves domsticas. AIV suaves podem evoluir para HPAIV por mutaes ou recombinao da HA. As estirpes de HPAIV de surtos em aves domsticas so comumente isoladas de aves selvagens durante o surto. Mtodos de controle que contam com a ocorrncia de infeco baixa nos plantis no so, por isto, aceitveis por gerao de oportunidade de mutao e recombinao (Swayne & Suarez, 2000). AIV de baixa patogenicidade A/emu/TX/39924/93 (H5N2) isolado de ratitas foi submetido a cultivos que selecionaram mutante de HPAIV. O mutante apresentou alteraes na HA com a adio de 6 nucleotdeos na posio 970-975 codificadora da HA1, resultando na insero de arginina e lisina prxima do stio de clivagem (glicoprotena da fuso). O restante da seqncia da HA diferiu apenas em 7 aminocidos e o stio de clivagem foi imediatamente clivado durante a replicao. A estirpe causou leses compatveis com estirpes de HPAIV em galinhas. Uma PCR dirigida para a deteco do stio de mutao (6

nucleotdeos) detectou apenas a estirpe mutante e no a original, podendo significar que a mutao foi rpida ou no detectada no vrus precursor (Perdue et al., 1996). A virulncia dos AIV foi associada duplicao da seqncia de clivagem da HA. Estirpes de AIV de alta patogenicidade (HPAIV) isoladas dos surtos de 1994-1995 no Mxico tinham a insero de dois aminocidos bsicos (arginina e lisina) no stio de clivagem da H. Uma das estirpes (A/Ck/Queretaro/7653-20/95) tinha informao gentica adicional para quatro aminocidos (arg-lysarg-lys) no mesmo stio e a anlise da seqncia do gene de HA sugere que ela derivou de estirpe no patognica isolada um ms antes. A insero dos quatro aminocidos produto da duplicao direta de parte da regio rica em purina que precede o cdon da arginina no gene do stio de clivagem (Perdue et al., 1997). Uma estirpe de H5N2 altamente disseminada no Mxico e associada apenas a quadros clnicos e leses leves foi associada evoluo de estirpe de HPAIV para a avicultura industrial dos Estados Unidos. O seqenciamento do segmento do gene codificador da regio de clivagem da HA das estirpes detectou apenas seqncias caractersticas de estirpes no patognicas na estirpe original e seqncias de estirpes de alta virulncia na estirpe variante, a estirpe HPAIV com clivabilidade em cultivos de fibroblastos sem tripsina (Horimoto et al., 1995). Os linfcitos foram caracterizados como a principal clula alvo em perus para uma estirpe de HPAIV. Grandes diferenas na capacidade de infectar a traquia de perus foram observadas, entretanto, entre duas estirpes de AIV virulenta e no virulenta, aps a exposio intratraqueal de doses pequenas de AIV. A estirpe no patognica turkey/Wisconsin/68 exigiu doses muito mais altas de desafio e provocou infeco do epitlio traqueal, espalhando para a serosa peritoneal, enquanto a estirpe patognica turkey/Ontario/7732/66 apresentou intenso pantropismo, atingindo primeiramente clulas mononucleares (macrfagos e linfcitos), excretada em 24 horas pela traquia e em 32 horas pela cloaca, presente em 24 horas nos stios linforeticulares do timo, bao e tonsilas cecais e replicao secundria detectada no bao, timo, tonsilas cecais, bolsa

cloacal, glndula de Harder, reas linforeticulares dos intestinos, medula ssea e no pncreas. Nos intestinos, no houve deteco de infeco epitelial por turkey/Ontario/7732/66, nos quais foram observados pontos brancos de necrose atravs da serosa. Os picos de replicao de turkey/Ontario/7732/66 na bolsa cloacal e glndula de Harder ocorreram mais tardiamente. Infeco tardia (aps 104 horas de infeco) por turkey/Ontario/7732/66 foi detectada no crebro, com leses em pequenos focos de encefalomalcia, e corao, com pericrdio descorado, atrofia da gordura cardaca e mltiplos focos de necrose do miocrdio (Resende, 1980). A patobiologia de A/chicken/Hong Kong/220/97 (H5N1) para 7 espcies de aves galinceas, incluindo galinhas, perus, codornas de penacho branco e japonesa, galinha da Angola, faises e perdiz foi estudada, nas quais resultou em mortalidade entre 75 e 100% em 10 dias. Clinicamente, as aves apresentaram depresso, diarria mucide e disfuno neurolgica. As leses mais proeminentes foram esplenomegalia, edema e congesto pulmonar, hemorragias em regies linfides do intestino, nas superfcies serosas e musculatura esqueltica. A mortalidade precoce em 24 horas aps a inoculao foi relacionada ao edema e congesto pulmonar e localizao do vrus no endotlio vascular, enquanto a mortalidade aps 48 horas foi relacionada ao desequilbrio bioqumico sistmico, falha mltipla de rgos ou combinao de ambas (Perkins & Swayne, 2001). Uma patologia semelhante sndrome do nanismo infeccioso (m absoro) foi descrita em pintinhos de 32 dias inoculados via saco areo (108,1 DIE50/ml) com A/whistling swan/Shimane/499/83 (H5N3), cujos sinais clnicos iniciaram dia 3 p.i., caracterizados por diarria de suave a severa e espirros. Diferenas significativas foram detectadas entre os pesos corporais dos sobreviventes e controles, com leses no pncreas, timo e bolsa cloacal. Antgenos do vrus foram detectados no pncreas, fgado, rins, pulmes, sacos areos e mucosa do cecum. Os autores sugeriram a possibilidade do AIV atuar como agente de nanismo infeccioso em pintinhos (Silvano et al., 1997).

A susceptibilidade dos pombos foi avaliada aps a inoculao via oculo-nasal ou intravenosa com estirpes dos subtipos de AIV alta patogenicidade (HPAIV; HP CK/PA H5N2 e HP CK/Australia H7N7) ou AIV no patognica (NPAIV; NP CK/PA H5N2 e NP emu/TX H7N1) na dose de 105 DIE50/dose de ave. Galinhas foram usadas como aves controles sensveis. Os pombos inoculados com HP CK/PA H5N2 ou HP CK/Australia H7N7 permaneceram saudveis por todos os 21 dias do experimento, no excretaram vrus nos dias 3, 7, 14 e 21 p.i. nem converteram ttulos de anticorpos sricos at o 21 dia p.i., enquanto 9/12 das galinhas morreram de influenza, tinham vrus nos tecidos respiratrio e digestrio e todas sobreviventes expressaram converso sorolgica, para ambas vias de inoculao. Os pombos inoculados com NP CK/PA H5N2 ou NP emu/TX H7N1 permaneceram saudveis durante todos os 21 dias de observao e nenhum ttulo de anticorpos foi detectado ao 21 dia p.i., com a deteco de NP emu/TX H7N1 no 3 dia p.i. de apenas um indivduo, possivelmente vrus do inoculo residual obtido com o swab traqueal. Os autores concluram que os pombos so resistentes e permitem apenas fraca replicao de AIV de alta ou baixa patogenicidade (Panigrahy et al., 1996). Um estudo das relaes entre a mudana estrutural no gene codificador da HA e na patogenicidade de uma estirpe de AIV H5N2 foi desenvolvido, analisando AIV de diversos nveis de virulncia isolados no Mxico. A patognese e mortalidade, causada por falha de mltiplos rgos, especialmente renal e/ou respiratria, pode ser associada presena de dois aminocidos bsicos e uma substituio no peptdeo de conexo da HA, sendo os HPAIV pantrpicos quanto aos stios de replicao e produo de leses, com as leses mais graves localizadas no crebro corao, glndulas adrenais e pncreas. A seqncia de aminocidos comuns no peptdeo de conexo da HA de isolados de baixa patogenicidade foi Prolina-Glutamina-Arginina-cido Glutmico-Treonina-Arginina (nenhum aminocido bsico) e entre os isolados de alta patogenicidade Prolina-Glutamina-Arginina-Lisina-Arginina-LisinaTreonina-Arginina (dois resduos do aminocido bsico Lisina). Entretanto, nenhuma razo molecular

foi encontrada para explicar as variaes de tropismo, leses e mortalidade entre os AIV de alta virulncia (Swayne, 1997). Mltiplos aminocidos bsicos prximos ao stio de clivagem, caracterstica de influenza vrus de alta virulncia, foram tambm encontrados na composio da HA de isolado de AIV que causou doena fatal em criana, sendo todos os oito segmentos do genoma caracterizados com de origem aviria, isolado, que em galinhas produziu mortalidade de 87,5-100 %. (Subbarao et al., 1998). As atividades da protease responsvel pela clivagem ativadora da HA de AIV foram avaliadas em AIV replicado em lquido alantide (LA) de embries com 10 ou 14 dias de incubao. A protease foi mais ativa em cultivos de AIV de LA de embries de 14 dias que 10 dias, degradando a HA. Os resultados indicaram que as atividades de proteases fortes encontradas em embries mais velhos prejudicam a replicao de AIV no patognico mas no prejudicam os ttulos de AIV patognico, que so ativados por proteases intracelulares, o mecanismo que indica haver a seleo de AIV mutantes patognicos por adaptao em ovos mais velhos (Horimoto & Kawaoka, 1998). Uma estirpe de AIV H10N7, isolada de emu (Dromaius novaehollandiae), com sinais clnicos respiratrios e conjuntivite, caracterizada como no patognica para galinhas, resultando em traquete, dispnia e sinais leves respiratrios, foi investigada, sendo a nucleoprotena (NP) do AIV detectada por imunohistoqumica em clulas epiteliais dos brnquios, parnquima pulmonar e mucosa traqueal e clulas inflamatrias mononucleares do exsudato do lmen bronquial. A NP no foi detectada na conjuntiva, sacos areos, rins, intestinos e fgado (Woolcock et al., 2000). Os efeitos da infeco com a estirpe A/chicken/Hong Kong/220/97 (H5N1) foram avaliados em 7 espcies de aves galinceas, incluindo galinhas, perus, codornas de penacho branco e japonesa, galinha da Angola, faiso e perdiz, nas quais resultou em mortalidade entre 75 e 100% em 10 dias. O quadro clnico incluiu depresso, diarria mucide e disfuno neurolgica e as leses mais proeminentes foram esplenomegalia, edema e congesto pulmonar, hemorragias em regies linfides do intestino, nas

superfcies serosas e musculatura esqueltica. Leses microscpicas foram observadas em mltiplos rgos, incluindo pulmes, corao, crebro, bao e adrenais, com exsudao, necrose hemorrgica e inflamao. A mortalidade antes de 48 horas foi relacionada com insuficincia respiratria aguda (edema e congesto pulmonar) e leses do endotlio vascular. A mortalidade aps 48 horas resultou do desequilbrio bioqumico e falha mltipla dos rgos, separadamente ou juntas. A transmisso direta de infeco e doena de aves para humanos foi descrita pela primeira vez para o vrus de alta virulncia A/chicken/Hong Kong/220/97 (Perkins & Swayne, 2001). A patologia comparada de estirpes de AIV de baixa e alta patogenicidade foi avaliada em galinhas SPF de 4 semanas de vida. As estirpes de baixa patogenicidade (LPAIV) A/chicken/Pennsylvania/21525/83 (H5N2) (LPAIV-Penn) e A/chicken/Alabama/7395/75 (H4N8) (MP-Alab) e de alta patogenicidade (HPAIV) A/chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2), A/chicken/Victoria/A185/85 (H7N7) e A/turkey/Ontario/7732/66 (H5N9) foram avaliadas. As estirpes de HPAIV ocasionaram necrose e inflamao na bolsa cloacal, timo, bao, corao, pncreas, rins, crebro, pulmes e msculos esquelticos, enquanto que as estirpes de LPAIV resultaram em leses restritas aos pulmes e traquia ou nenhuma leso aparente. A colorao especfica de protenas de AIV por imunohistoqumica foi mais comumente verificada no corao, pulmo, rins, crebro e pncreas para HPAIV e mais raramente na traquia e pulmo das aves inoculadas com LPAIV-Penn. A estirpe LPAIV-Ala no ocasionou leses e no foram detectados antgenos de AIV nos tecidos, apenas converso sorolgica nas aves. As estirpes de HPAIV demonstraram capacidade de disseminao para alm do trato respiratrio, confirmando o carter pantrpico dessas, embora existam diferenas de severidade e distribuio das leses causadas por HPAIV. As estirpes de LPAI, ao apresentarem tropismo restrito, ocasionaram leses e mortalidade apenas espordica (Mo et al., 1997). A patogenicidade de duas estirpes de eqinos foi avaliada em galinhas. As estirpes A/equi 1 (H7N7) e A/equi 2 (H3N8) foram inoculadas em pintinhos entre

4 e 18 dias de idade e amostras cloacais colhidas entre 1 e 15 dias p.i. e inoculadas em embries de galinhas com 11 dias de incubao. Os vrus reisolados foram identificados por IH utilizando anticorpos especficos contra cada estirpe, totalizando 12/633 (0,001%) reisolamentos, apenas para A/equi 2 e no para A/equi 1. Os soros dos pintinhos foram avaliados por IH entre 18 e 21 dias p.i. e evidenciaram resposta em 79,8% das aves. Nenhum sinal clnico foi detectado nas aves (Cunha et al., 1993).

DIAGNSTICO
A influenza aviria doena enquadrada no grupo A de epizootias da O.I.E. de notificao obrigatria no Brasil. O diagnstico de influenza aviria depende do isolamento e identificao do vrus, uma vez que os sinais clnicos e leses so muito variveis entre os episdios e esto dependentes da estirpe de AIV, espcie de ave, status imune especfico e no especfico, estado nutricional, doenas concomitantes etc. O isolamento e identificao viral segue normas oficiais previstas pelos centros internacionais de referncia para influenza (por exemplo, Central Veterinary Laboratory, no Reino Unido) e pelo Programa Nacional de Sanidade Avcola (PNSA) no Brasil. Os laboratrios de diagnstico devem ser credenciados pelo Ministrio da Agricultura e atender rgidas normas de biossegurana e qualidade. O laboratrio de referncia para a identificao de AIV no Brasil o LARA (Laboratrio de Referncia Animal) em Campinas, So Paulo. O diagnstico diferencial para a distino de AI de outras enfermidades de quadro clnico e patolgico semelhante necessrio, especialmente para doena de Newcastle, clera aviria, micoplasmose e clamidiose. Isolamento de identificao do vrus A amostragem oficial para o diagnstico de AIV em plantis comerciais pode apenas ser efetuada por fiscais do Ministrio da Agricultura ou mdicos veterinrios autorizados. As amostras

independentemente colhidas e isoladas devem ser caracterizadas no Laboratrio de Referncia Animal (LARA, Campinas) e, se necessrio, nova amostragem oficial agendada. O PNSA est implantando o projeto de vigilncia ativa da doena de Newcastle e influenza aviria, para o qual os abatedouros recebero materiais (kit) para a colheita de amostras, incluindo frascos, etiquetas, canetas, sacos plsticos, seringas, swabs, fitas colantes, gelo reciclvel e caixa isotrmica de transporte (Projeto de Vigilncia, 2001). H vrios manuais de prtica laboratorial (por exemplo, Isolation and Identification of Avian Pathogens da American Association of Avian Pathologists), nos quais os detalhes para o diagnstico de AI podem ser encontrados. Os tecidos e secrees das aves infectadas ou doentes so fonte de vrus para replicao e isolamento em laboratrio. Os tecidos recomendados para amostragem refletem o quadro clnico ou sistemas mais comumente atingidos pela infeco, principalmente sistema respiratrio e digestivo. As estirpes de HPAIV tm grande pantropismo infeccioso, atingem virtulamente todos os tecidos e de quaisquer tecidos podem ser isoladas. Altos ttulos de excreo fecal, que garantem alta transmissibilidade de aves reservatrio (Anseriformes, Procellariformes e Laridae) para domsticas, permitem o isolamento dos AIV das fezes ou por amostragem cloacal (swabbing). A infeco respiratria, por sua constncia, garante o sucesso de isolamento nasofarngeo (por exemplo, fenda palatina) e da traquia, mesmo na ausncia de sinais clnicos (Easterday et al., 1997). Diversos substratos celulares e animais de laboratrio podem ser utilizados. Todos, entretanto, devem ser livres de patgenos e anticorpos especficos, entre estes ovos embrionados, pintinhos e frangas/frangos e galinhas (Gallus gallus formadomestica), perus Meleagris gallopavo formadomestica) e patos (Anas). AIV tambm so replicados em mamferos como marta (ferret) e vison (mink) (musteldeos, marta Mustela putorius e vison Mustela vison), camundongos, hamsters, gatos e sunos. Embries de galinhas SPF (specific pathogen free) podem ser inoculados entre 9 e 11 dias de incubao via cavidade alantide com material de macerado de

tecidos ou excrees, tratados com antibiticos e antimictico so inoculados via cavidade alantidea (CA). Os lquidos alantide (LA) dos embries vivos, mortos ou com alteraes de desenvolvimento em at sete dias aps a inoculao so examinados para atividade hemaglutinante misturando-se LA e hemcias de galinhas SPF a 5% (50 l de cada) em lmina ou placa de vidro. A hemaglutinao visvel pela formao de grumos que separam as hemcias da fase aquosa. Os LA com atividade hemaglutinante so examinados para a caracterizao do agente em testes para a identificao de influenza A em reao contra anticorpos especficos para a NP (imunodifuso em gel de gar AGP), de inibio da hemaglutinao com anticorpos policlonais ou monoclonais especficos contra cada subtipo de AIV e para diferencial do vrus da doena de Newcastle (VDN). Cultivos primrios de fibroblastos, rins e fgado de embries SPF so tambm substratos para o cultivo de AIV. Estirpes patognicas de AIV podem infectar esses cultivos sem tratamento enzimtico prvio, enquanto estirpes no patognicas necessitam tratamento prvio com tripsina em pH cido, para a ativao da glicoprotena da fuso (poro da HA2). Cultivos de rgos, como anis de traquias, so tambm excelentes substratos por permitirem o isolamento e o desenvolvimento de ensaios de caracterizao especfica do subtipo (neutralizao da HA ou NA). Uma estirpe de HPAIV que atinge o sistema linfo-reticular pode ser isolada de diversos substratos celulares, por esses sistemas integrarem tambm estas clulas (Resende, 1980). Um eventual agente com atividade hemaglutinante de eritrcitos de galinhas isolado em embries deve ser caracterizado, primeiramente diferenciando de outros agentes com esta propriedade, em testes de inibio especfica da HA (inibio da hemaglutinao) e testes de identificao do tipo de vrus influenza (Projeto de Vigilncia, 2001) com anticorpos especficos, monoclonais ou policlonais, contra a nucleoprotena do tipo A, o nico que ocorre em aves. Um mtodo de separao para a protena da matriz de influenza A para imunoensaios foi descrito utilizando eletroeluio aps eletroforese de vrus

lisado, podendo ser os antgenos eludos de influenza A (no de B) utilizados em ELISA e immunoblotting de lavados nasais de humanos (Donofrio et al., 1986) para antgeno ou anticorpo anti-A. Em outro ensaio descrito para protenas internas, Coonrad et al. (1988) descreveram um ELISA para antgenos do cerne de influenza A, utilizando anticorpos monoclonais especficos, com alta sensibilidade para a matriz (1 ng) ou nucleoprotena (0,05 ng), em lavados nasais de humanos (Coonrad et al., 1988). A diferenciao de variantes de escape de influenza A, por deteco de determinantes antignicos da HA de influenza A (A/Brazil/11/78, H1N10), foram determinados por cultivo de vrus na presena de anticorpos monoclonais especficos para quatro determinantes da HA (Sa, Sb, Ca e Cb), todas as 400 projees de HA possuindo cada um dos determinantes (Drescher & Verhagen, 1993). Recomendaes do Programa Nacional de Sanidade Avcola A vigilncia ativa, com o objetivo de reduzir o risco da introduo de influenza nos lotes comerciais em territrio nacional, prev amostragens e quarentena de quaisquer aves entrando em territrio nacional, em aeroportos, portos ou fronteiras terrestres. A admisso de aves em territrio nacional est subordinada solicitao especfica para este fim junto Secretaria de Defesa Agropecuria do Ministrio da Agricultura (SDA/MA). A indstria avcola nacional mantm importao regular devidamente regulamentada e monitorada pelo SDA/MA. Aves capturadas por entrada clandestina no so admitidas e o proprietrio deve providenciar seu retorno ao pas de origem. Aves clandestinas capturadas sem dono so confiscadas e enviadas para quarentena oficial. O lote suspeito de infeco por AIV deve ser amostrado colhendo-se de 10 aves, 10 swabs de traquia e 10 swabs de cloaca. O meio de transporte das amostras deve conter, para traquia, 2000 U.I. de penicilina, 2 mg de estreptomicina, 50 g de gentamicina e 1000 U.I. de anfotericina B e para cloaca, 10000 U.I. de penicilina, 10 mg de estreptomicina, 250 g de gentamicina e 5000 U.I de anfotericina B, para 100 ml de PBS (soluo

salina tamponada por fosfato, pH 7,2). Os swabs so acondicionados em tubos plsticos, com tampa de rosca e meio de transporte, identificados individualmente com etiquetas padronizadas e conservados entre 2 e 8C durante o transporte. Colheitas oficiais so apenas executadas pelo fiscal agropecurio ou mdico veterinrio autorizado pelo PNSA. Sorologia Estudos sorolgicos de AIV podem ser implementados para a deteco de anticorpos especficos para a nucleoprotena (NP) de AIV, garantindo a deteco ampla de resposta contra o grupo A e baixos ndices de falsos negativos, sem, entretanto, poder identificar o(s) subtipo(s) prevalentes. Em contraste, estudos empregando ensaios para a deteco de anticorpos para as glicoprotenas da superfcie (HA e NA) permitem a demonstrao de anticorpos subtipo-especficos, com altos ndices de falsos negativos se entre os antgenos no forem includos todos os subtipos prevalentes. O PNSA no projeto de vigilncia ativa da doena de Newcastle e influenza aviria (Projeto de Vigilncia, 2001) prev a amostragem, na linha de abate, de 24 aves por lote para a sorologia, colhendo-se 2 a 3 mL de sangue por ave individualmente em tubos de plstico estreis com tampa de rosca, identificados por indivduo e colocados em repouso, idealmente nas condies de temperatura adequadas para a coagulao (37C/2 horas) e a seguir para contrao do cogulo e separao do soro (4C/2 horas). Os tubos devem a seguir soros ser centrifugados (aproximadamente 2000xg/10 min) e os soros sobrenadantes transferidos individualmente para frascos de conservao com rotulao e tampa (20C). Os soros das 20 amostras com melhor separao e pureza so selecionados para o envio ao laboratrio e congelados. A monitorao sorolgica para AI pode empregar o teste de inibio da hemaglutinao, inibio da neuraminidase ou ensaios imunoenzimticos (ELISA). ELISA comerciais esto disponveis para a deteco de anticorpos contra a nucleoprotena (NP) de AIV do

tipo A e outros para a caracterizao do subtipo de AIV quanto hemaglutinina (HA) durante a identificao de estirpes. Esses testes esto descritos em detalhe nos manuais dos fabricantes (ELISA) ou nos manuais de diagnstico de doenas avirias. A deteco de anticorpos contra a NP permite a demonstrao de contato prvio com AIV do tipo A, grupo em que esto todos os AIV. A caracterizao da resposta quanto especificidade dos anticorpos para as diversas HA existentes (subtipos) mais complexa e pode requerer um ensaio de captura de glicoprotena de cada subtipo (H1 a H15) e/ou anticorpos monoclonais. H variaes na intensidade da resposta imune natural para a NP conforme a espcie de ave, sendo os ttulos em patos muito baixos ou no detectveis em comparao com altos ttulos em perus e faises (Easterday et al., 1997). Para a diferenciao de estirpes sendo isoladas, a sorologia com o emprego de anticorpos especficos contra a NP ou HA empregada. A descrio oficial da tcnica de inibio da hemaglutinao para a diferenciao entre AIV e vrus da doena de Newcastle em material de diagnstico virolgico est publicada na Portaria da Secretaria de Defesa Agropecuria n 182 de 8/11/94 (Portaria, 1984). Mtodos sorolgicos de diagnstico foram avaliados na China, em cujos estudos foi observado que a resposta imune mediada por anticorpos especficos para AIV pode apresentar variao individual. Frangas SPF desafiadas com uma estirpe de patos expressaram nveis de anticorpos detectveis entre 7 e 79 dias p.i. por ELISA, este sendo o mais sensvel teste, ou IH (inibio da hemaglutinao) e entre 13 e 79 dias por imunodifuso em gel de agar (Lin et al., 1998). ELISAs competitivos foram desenvolvidos para a deteco de antgenos e anticorpos especficos para AIV. Um ELISA de competio baseado na utilizao de antgeno de nucleoprotena expresso em baculovrus e em anticorpos monoclonais foi desenvolvido para a deteco de anticorpos especficos para a nucleoprotena de AIV. O teste foi avaliado com soros de galinhas (756), perus (1123), emus [(Dromaius novaehollandiae) 707] e avestruzes [(Struthio camelus) 1261]. A sensibilidade relativa ao

teste de imunodifuso (AGP) foi de 100% para todas a 4 espcies e em relao ao IH foi de 100% para galinhas, perus e emu e de 96,2 para avestruzes. Mais de 90% das amostras de soros negativos ao AGP e positivas ao ELISA foram positivas ao IH para pelo menos um subtipo de AIV. A especificidade do ELISA relativamente ao AGP foi de 85,5 a 99,8%. O ELISA de competio foi considerado mais sensvel e especfico que o AGP e com a mesma sensibilidade e especificidade que o IH, sendo recomendado para a avaliao dos soros destas espcies de aves (Zhou et al., 1998). Um ensaio imunoenzimtico de captura de antgeno, desenvolvido para a deteco de influenza A em humanos, foi avaliado para a deteco de AIV em aves industriais. A sensibilidade e especificidade foram avaliadas para a deteco de H7N2 no patognico de ocorrncia natural em galinhas industriais e para permitir a adoo de estratgias em plantis durante a quarentena. A especificidade relativa foi de 100% e a sensibilidade de 79%, sendo considerado til para diagnstico de rotina (Davison et al., 1998). Outro ELISA competitivo foi descrito para a deteco de anticorpos especficos para AIV em soros de aves utilizando antgeno da nucleoprotena de A/Ann Arbor/6/60 expresso em baculovrus (poliedrose) de Autographa californica. Anticorpos monoclonais (AcM) especficos para a nucleoprotena de AIV foram utilizados para a captura do antgeno. O ELISA foi comparado com AGP na avaliao 1651 soros de referncia e experimentais. As amostras de soros com resultados diferentes no ELISA e AGP foram tambm testadas em imunofluorescncia (IF), IH e NI (inibio da neuraminidase). Um alto grau de correlao foi detectado entre o ELISA e AGP, com os resultados em especificidade validados por IF, IH e NI, permitindo a recomendao desse para a monitorao de grandes nmeros de amostras de soros (Shafer et al., 1998). AIV H10N7 de emu (Dromaius novaehollandiae), embora resultando em traquete, dispnia e sinais leves respiratrios em ems, foi caracterizado como no patognico para galinhas. A nucleoprotena (NP) do AIV foi detectada por imunohistoqumica em clulas epiteliais dos brnquios, parnquima pulmonar e mucosa traqueal e clulas inflamatrias

mononucleares do exsudato do lmen bronquial e no detectada na conjuntiva, sacos areos, rins, intestinos e fgado (Woolcock et al., 2000). O isolamento viral e testes sorolgicos do diagnstico de rotina de AIV foram avaliados em aves infectadas experimentalmente com H5/94, M5/94 ou J12/94 (todas resultando em doena espordica e mortalidade, classificadas como medianamente patognicas), Q1/95 (doena e morte em todas as aves infectadas altamente patognica) ou P11/94B (doena sem mortalidade). Swabs da orofaringe foram superiores para o isolamento durante o quadro clnico e swabs cloacais superiores aps o fim da doena clnica. Para a sorologia, a precipitao em gel de agar (AGP) foi superior durante a fase clnica e equivalente ao IH depois da recuperao. A passagem da estirpe de baixa patogenicidade P11/94B em embries de galinhas SPF de 14 dias de incubao ou diretamente em galinhas adultas resultou na emergncia de mutantes de alta patogenicidade para galinhas adultas. Os stios de clivagem das hemaglutininas de Q1/95 e P11/94B apresentaram-se idnticos e consistentes com estirpes de alta patogenicidade, discrepantes com as diferenas em patogenicidade, o que sugere que outros genes alm da HA podem estar associados com a alta letalidade das estirpes Mexicanas (Swayne et al., 1997). AIV A/Chicken/Puebla/1485-622/94 (H5N2) replicado na membrana crio-alantide de embries de galinha foi utilizado para comparaes entre os ensaios de imunodifuso (ID), microimunodifuso (MID) e inibio da hemaglutinao (IH) para anticorpos contra AIV. A sensibilidade do MID e ID, comparados entre si, foi de 98% e de ambos foi de 43%, comparados ao IH, detectando soros com ttulos de 320 ou mais altos (Loza et al., 1997). A imunidade cruzada celular entre isolados pode mudar o prognstico da doena em aves e pode resultar em perpetuao de infeco no letal. As galinhas do mercado de aves vivas em Hong Kong eram portadoras de H5N1 e no apresentaram sinais clnicos, embora a amostra fosse letal para aves e humanos. A imunidade celular derivada da infeco com H9N2, que co-infectava os plantis de galinhas,

e foi transmitido tambm para humanos, pode ter protegido as populaes de aves contra os efeitos da infeco com a amostra letal H5N1. (Seo & Webster, 2001). Soros de emus (Dromaius novaehollandiae) experimentalmente infectados com AIV foram reagentes em ensaios para a deteco de anticorpos em ELISA de competio (C-ELISA), imunodifuso e inibio da hemaglutinao, sendo o C-ELISA proposto para substituio da imunodifuso, em testes de varredura para deteco de anticorpos contra a nucleoprotena (Zhou et al., 1998). Em humanos, anticorpos das classes IgA, IgG e IgM foram detectados por imunofluorescncia utilizando eritrcitos formolinados adsorvidos com influenza A (A/Philippines/2/82, A/Brazi/11/78) ou B/Singapore, em teste complementar fixao de complemento (Doller et al., 1985). Os testes de inibio da hemaglutinao (HI) e hemlise simples radial (HSR) foram comparados para deteco de anticorpos sricos para influenza tambm em humanos (Mancini et al., 1983), cujos resultados pareceram indicar maior sensibilidade para a HSR. Diagnstico e Identificao por Gentica Molecular Ensaios para a deteco do genoma de AIV tm sido descritos na literatura. A deteco de regio conservada do gene da nucleoprotena (N) e/ou matriz (M1 e/ou M2) garante o diagnstico amplo de quaisquer estipes de quaisquer subtipos do tipo A. Ensaios de gentica molecular para a deteco de seqncias genmicas que codificam as glicoprotenas do envelope tm a vantagem de permitir a classificao da estirpe quanto ao subtipo (HA e NA) e a desvantagem de resultados falsonegativos, contornveis em parte pela utilizao de iniciadores para os principais subtipos prevalentes. A aplicao de uma PCR fluorognica para a tipificao e subtipificao de vrus influenza de amostras respiratrias foi descrita. A PCR emprega a tecnologia de sonda que explora a atividade de nuclease endgena 5'-3' da Taq DNA polimerase, permitindo a deteco do amplicon pela liberao de

um reagente fluorescente durante a PCR. O mtodo mostrou-se mais sensvel que isolamento e de excelente correlao para tipificao e subtipificao, sendo utilizado na Alemanha para estudos de vigilncia em humanos (Schweiger et al., 2000) Um ensaio PCR-imunoenzimtico foi desenvolvido para a identificao do RNA matricial do influenza A em amostras clnicas negativas para vrus cultivvel. O ensaio imunoenzimtico associado a PCR (PCR-EIE) foi empregado para a deteco de RNA viral do vrus da influenza A em secrees respiratrias. A PCR com transcrio reversa foi desenvolvida com oligonucleotdeos para uma regio altamente conservada de influenza A. O DNA complementar foi detectado por hibridizao com uma sonda aninhada (nested) biotinilada e quantificada por EIE. O PCR-EIE detectou trs subtipos de influenza A (Cherian et al., 1994). A deteco de influenza A de diferentes espcies foi obtida por amplificao com PCR de seqncias conservadas do gene matricial. Um painel de iniciadores, baseado em regies altamente conservadas do RNA, foi desenhado para RT-PCR (PCR aps transcrio reversa) em tubo nico, para deteco de influenza A de espcies mltiplas. Uma coleo de 25 isolados de aves, humanos, sunos, eqinos e focas, incluindo todos os subtipos conhecidos, foi utilizado. Onze vrus RNA heterlogos foram includos como controle. Os swabs fecais e de cloaca de aves confirmaram ser a PCR mais rpida e 100 vezes mais sensvel que os procedimentos clssicos de isolamento (Fouchier et al., 2000).

MEDIDAS DE CONTROLE E PREVENO

Vacinas Nos Estados Unidos, o controle das formas de alta patogenicidade de AIV tem sido atingido com programas de erradicao, assim como contra as formas velognicas da doena de Newcastle (Villegas, 1998)

Entretanto, novas estirpes de influenza vrus esto constantemente emergindo na populao humana e animal. Trs pandemias em humanos esto descritas na literatura, nas quais os subtipos cruzaram as barreiras de espcie hospedeira. Da mesma forma, o surto em Hong Kong em 1997 com H5N1 indica para o risco futuro de pandemia, contra a qual no haveria tempo suficiente para estabelecimento de proteo vacinal s populaes humanas. Estirpes de AIV em perodos interpandmicos podem apresentar variao antignica leve (antigenic drift) que podem evoluir para variao antignica forte (antigenic shift) e originar surto de doena. A vigilncia epidemiolgica base para a determinao de atualizaes vacinais e os agentes antivirais anti-neuraminidase devem ser considerados como adjuvantes para vacinas (De Jong et al., 2000). Mtodos de controle que contam com a ocorrncia de infeco baixa nos plantis no so aceitveis por gerao de oportunidade de mutao e recombinao. O controle ideal deve incluir preveno da exposio, biossegurana, vigilncia epidemiolgica e diagnstico, educao, quarentena e depopulao. Algumas tentativas de vacinao foram integradas a programas de controle e erradicao de AIV. HPAIV, embora, no estejam permanentemente infectando aves aquticas selvagens, elas so portadoras de AIV de baixa patogenicidade, que cruzam as barreiras especficas de hospedeiros, ocasionando doena leve em aves domsticas e podem evoluir para HPAIV por mutaes ou recombinao da HA. As estirpes de HPAIV de surtos em aves domsticas so comumente isoladas de aves selvagens durante o surto (Swayne & Suarez, 2000). Vacinas tm protegido contra HPAIV do subtipo H5 apesar das mudanas genticas dos AIV de campo durante alguns anos. Vacinas inativadas contendo vrus ntegro, hemaglutinina expressa em baculovrus ou recombinante de pox galinha expressando hemaglutinina foram eficientes em induzir proteo ao desafio com mltiplas estirpes de HPAIV do subtipo H5 de quatro continentes, de seis espcies hospedeiras diferentes e obtidas em um perodo de 38 anos. A proteo foi eficaz para sinais clnicos e mortalidade e reduziu o nmero de aves e o ttulo da excreo viral. A mudana gentica suave (drift) no

interferiu na proteo geral, embora tenha sido descrita para vrus humanos (Swayne et al., 2000b). Grupos de galinhas de 4 semanas de idade foram vacinados com HA de uma estirpe do subtipo H5, uma heterloga H7 ou lquido alantide (controle) e desafiados com uma estirpe de HPAIV H5. Todas dez HA avaliadas resultaram em proteo contra doena e mortalidade, com anticorpos detectados por IH e imunodifuso em gar (Swayne et al., 1999). Em contraste, falhas de uma vacina recombinante de pox galinha expressando a hemaglutinina de HPAIV do subtipo H5 foram descritas quando a vacina recombinante foi aplicada aps uma vacina de bouba, podendo limitar sua eficincia em aves previamente imunizadas contra a bouba aviria (Swayne et al., 2000a). A vacinao de galinhas com DNA plasmideal nu foi avaliada usando cinco promotores: dois de citomegalovrus (CMV), um de sarcoma de Rous, actina de galinha ou vrus smio SV40] e 5 plasmdeos diferentes, para a expresso da HA de uma estirpe do subtipo H5, sendo que todos expressaram HA detectvel em cultivo celular. O promotor pCI-neo de CMV proporcionou a melhor resposta em pintinhos vacinados no 1 dia de vida via intramuscular, considerando a proteo ao desafio com HPAIV s 6 semanas aps a vacinao e os ttulos de anticorpos. Melhores respostas foram obtidas com revacinao s trs semanas, stios mltiplos de inoculao e uso de lipossomos catinicos como adjuvante (Suarez & Schultz-Cherry, 2000). Uma vacina de DNA expressando a HA de H5 no protegeu camundongos contra infeco por H5N1 heterlogo, com diferena de 12% na HA1, embora tenha protegido contra a mortalidade (Kodihalli et al., 1999). Um adjuvante para a administrao de vacina de influenza vrus empregando Bifidobacterium breve estirpe YIT4064 foi avaliado em camundongos e os resultados, que apontaram para um aumento da resposta imune local anti-influenza, mediada por imunoglobulina A nas placas de Peyer, indicam para uma melhor distribuio de anticorpos de mucosa e de proteo s portas de entrada (Yasui et al., 1994).

Uma vacina recombinante de pox avirio (vrus da bouba das galinhas) expressando o gene da HA de estirpe mexicana do subtipo H5 foi aplicada em pintinhos de 1 dia. Nenhum pintinho apresentou converso sorolgica, no interferindo com o programa de monitorizao sorolgica por imunodifuso em agar de rotina para AIV dos EUA mas com 8% de positividade de baixos ttulos em IH. A proteo contra a doena clnica e mortalidade, aps desafio com HPAIV H5N2 isolada de galinhas no Mxico, foi de 90-100% entre 3 e 20 semanas ps vacinao, com reduo (50-75%) da excreo intestinal e respiratria do AIV de desafio nos vacinados, assim como reduo da transmisso por contato (Swayne et al., 1997). A inoculao direta (grupo 1-100 g antgeno AIV/ave; grupo 2-10 g e grupo 3-1 g; grupo 4-placebo) do plasmdeo psVH7 expressando a HA de uma estirpe do subtipo H7 em pintinhos de 3 semanas de idade via intramuscular resultou em proteo contra o desafio com a estipe HPAIV A/Afri. Star/Eng-Q/983/79 (H7N1), converso de ttulos sorolgicos, de 64 na primeira e 512-1024 na segunda semana ps desafio (grupos 1, 2 e 3) e reduo da excreo viral, mas apenas 16 e 128 para o grupo 4, nas 1 e 2 semanas ps desafio, respectivamente (Chen et al., 1998). Outra vacina recombinante empregando pox avirio (galinha) com a expresso da hemaglutinina H7 resultou em proteo contra o desafio homlogo (Boyle et al., 2000). Baculovirus foram utilizados para a expresso da hemaglutinina (HA) de isolados dos subtipos H5 e H7 de AIV. As protenas expressas no sistema baculovrus mantiveram atividade hemaglutinante e formaram rosetas em soluo, tanto quando expressas inteiras como quando expressas em partes, indicando que a conformao tridimensional foi obtida. As HA foram imunognicas per se, mas a melhor resposta foi obtida com preparaes oleosas (gua em leo), com ttulos de anticorpos inibidores da hemaglutinao comparveis queles derivados de inoculao com vrus completo, mais altos e uniformes em aves de 3 semanas (GMT 121 para H5 e 293 para H7), que em aves de um ou dois dias de idade. A proteo foi total ao desafio com estirpe de alta virulncia do subtipo homlogo, com nenhuma

ou reduzida excreo de vrus j em 3 dias aps o desafio. A ausncia de resposta imune aos demais componentes estruturais dos AIV permite a diferenciao das respostas imunes derivadas da vacina recombinante e infeces naturais por AIV (Crawford et al., 1999). Uma preparao de vacina recombinante expressando uma insero de H5 em vrus da bouba aviria protegeu galinhas contra sinais clnicos, mortalidade e excreo de vrus aps o desafio com HPAIV. A estirpe de desafio continha 87,3 a 100% de semelhana na seqncia de aminocidos deduzida para a HA, oriunda de regio geogrfica diferente. As seqncias da HA de vrus isolado da orofaringe aps o desafio foram semelhantes s seqncias do vrus de desafio. Entretanto, vrus isolado da cloaca no foi semelhante ao original de desafio (Swayne et al., 2000a), indicando drift antignico. Uma vacina no adjuvantada clssica preparada com subunidades de AIV e uma vacina baseada em complexos imunoestimulantes (ISCOM) preparada com glicoprotenas da membrana de AIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1) foram comparadas na proteo de galinhas contra o desafio com este mesmo HPAIV. A vacina de ISCOM induziu imunidade protetora, enquanto a preparao de subunidades no adjuvantada no (Rimmelzwaan et al., 1999). A produo de vacinas para as estirpes de AIV de alta patogenicidade (HPAIV) esbarra na virulncia dessas para o embrio, resultando em mortalidade muito precoce e baixos ttulos, assim como na necessidade de rigorosa biossegurana laboratorial. Vacinas inativadas por formol, preparadas com uma estirpe no patognica de H5N4 como doador gentico, uma estirpe de H5N1 como recombinante com uma H3N1 aviria ou uma no patognica de H5N1 gerada por reverso gentica foram inoculadas via intraperitoneal em camundongos, resultando em anticorpos de mucosa e sistmicos inibidores da hemaglutinao e protetores contra o desafio com H5N1 letal (Takada et al., 1999). Preparaes vacinais de AIV H5N9 A/mallard/Ohio/556/1987 (MOh87) viva ou inativada foram avaliadas em galinhas SPF administradas via oral. Anticorpos circulantes foram detectados aps a

aplicao de quaisquer das preparaes. As aves resistiram ao desafio com H5 letal, inclusive com a interrupo da excreo viral pela cloaca (Crawford et al., 1998). Embries (White Leghorn-WL ou White Rock-WR) de 18 dias de embriognese foram vacinados com vacina oleosa contra AIV in ovo em vrios volumes e concentraes de antgeno. Anticorpos sricos IH foram detectados a partir de duas semanas psecloso entre 85 e 100% dos pintinhos e houve proteo contra desafio com AIV de alta patogenicidade aos 34 dias de idade. A eclodibilidade dos embries inoculados com 100 l de vacina no foi diferente dos embries controles (Stone et al., 1997). Um estudo foi desenvolvido para avaliar a concentrao de hemaglutinina necessria para induzir proteo contra sinais de doena e a quantidade de antgeno necessrio para reduzir a excreo de vrus. Seis preparaes comerciais de vacinas inativadas e em emulso oleosa H5N2 foram comparadas na proteo contra desafio com a estirpe A/chicken/Queretaro/19/95. A concentrao de HA de 0,4 micrograma por dose preveniu o aparecimento de sinais. Todas as preparaes comerciais impediram o quadro clnico e reduziram a excreo viral (Garcia et al., 1998). Biossegurana O controle de AIV em regies de avicultura densamente povoadas difcil, especialmente onde j existe estirpe de HPAIV circulando e disseminada. Idealmente, a avicultura deveria ser planejada para impedir a concentrao de granjas em rea geogrfica com proximidade e multiplicidade de idades e tipos de aves. A implementao de estratgias de biossegurana nessas regies essencial para a reduo da disseminao de doenas infecto-contagiosas, entre estas influenza, reduzindo as despesas com medicao e melhorando a qualidade dos produtos. A implementao dessas estratgias, alm da ateno aos focos, conforme recomendado pelo Office International des Epizooties para a erradicao das doenas da lista A, nos episdios ocorridos na avicultura industrial americana

(Davison et al., 1999; Avian Influenza Task Force, 1984; Lasley, 1987), europia (Capua & Marangon, 2000) e asitica (Wei-Hua, 1998) impediu que os prejuzos econmicos ficassem fora do controle. Desinfetantes Produtos anticongelantes de gua (etileno glicol e propileno glicol) ou lquido de lavagem de pra-brisa (automobilsticos) foram adicionados na preparao de diluies de uso dos desinfetantes para o tratamento ambiental nos surtos de AIV na Pennsylvania para reduzir o risco de congelamento e manuteno da atividade virucida contra o AIV. Para avaliar os efeitos dessas combinaes, foram testados dois compostos fenlicos, um quaternrio de amnia e uma combinao de quaternrio de amnia-formaldedo (AF) e um hipoclorito de sdio. Os produtos fenlicos e quaternrio de amnia puro foram eficientes, enquanto a combinao AF e o hipoclorito de sdio tiveram sua eficincia reduzida pela adio do etileno glicol, sendo apenas afetada a eficcia do hipoclorito pela adio de propileno glicol. O lquido de parabrisas manteve a eficcia de todos os desinfetantes exceto a combinao AF (Davison et al., 1999). Perxido de hidrognio em vapor foi avaliado na desinfeco de vrus exticos, em cabine de descontaminao em unidades de isolamento. Representantes de Orthomyxoviridae, Reoviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Herpesviridae, Picornaviridae, Caliciviridae e Rhabdoviridae de aves e mamferos foram avaliados, especialmente estirpes exticas no Canad. As suspenses virais em meio de cultivo celular, lquidos de ovos ou sangue secas em superfcie de vidro e ao inoxidvel foram expostas durante 30 minutos ao vapor de prxido de hidrognio, reduzindo a zero a contaminao para os vrus de aves (influenza e Newcastle) ou menos de 10 doses infecciosas de cultivos de clulas para os vrus de mamferos (peste suna, peste suna africana, lngua azul, pseudo-raiva, doena vesicular dos sunos, exantema vesicular e estomatite vesicular), sem efeitos adversos sobre os equipamentos (Heckert et al., 1997).

TRATAMENTO
Resistncia temporria foi detectada em AIV ao interferon (IFN) alfa quando cultivado em clulas de galinha (Gallus) ou codornas (Coturnix), enquanto o restante (60-40%) da partida viral foi sensvel. Partidas de vrus contendo resistncia produziram populaes sensveis e resistentes. A inativao da quinase protica dependente do dsRNA e seu ativador dsRNA pela NS1 aumentaram a sobrevivncia de AIV em clulas infectadas por AIV e tratadas por IFN e 2aminopurina (Sekellick et al., 2000). O cido 4-guanidino-2-4-dideoxy-2,3-didehydro-Nacetilneuramnico (4-guanino-Neu5Ac-2en), Zanamavir, GG167, um inibidor especfico da neuraminidase dos vrus influenza, foi avaliado na profilaxia de influenza. A sensitividade do AIV ao produto depende do ensaio in vitro empregado para avaliao (inibio da formao, reduo do tamanho e alterao da morfologia das placas ou reduo da produo de vrus). Avaliaes in vivo demonstraram que o produto no apresentou efeito profiltico, embora tenha retardado o surgimento de febre e mortalidade em apenas uma estirpe e no em duas outras de AIV. Como experimentos-controle, foi utilizada a droga amantidina, bem estabelecida como antiviral para influenza, cujos resultados foram inibio da febre e mortalidade em aves desafiadas via intratraqueal. A aplicao e ao local de drogas antivirais no impede a disseminao do vrus para stios no atingidos pela droga (McCauley et al., 1994; Thomas et al., 1994). Esto atualmente autorizados nos EUA para uso na profilaxia e teraputica de influenza A o hidrocloreto de amantadina e a rimantadina. A concentrao que exerce inibio de formao de placas varia entre 0,2 e 0,4 g/ml. Ambas drogas agem aps a adsorso viral e antes da replicao primria, e prognie virais resistentes podem ser isoladas in vivo e in vitro. Estipes de alta patogenicidade resistentes amantidina so transmitidas para hospedeiros sensveis sem reduo da virulncia. O mecanismo primrio de ao de amantidina e rimantadina baseado na interrupo do fluxo de ons H dos endossomas acidificados para dentro do vrion, um

processo necessrio para a liberao do complexo de nucleoprotena e cido nuclico, que transportado ao ncleo para transcrio (Murphy & Webster, 1996). Compostos desenhados podem ter importncia no tratamento de influenza. Oligopeptdeos com seqncias de aminocidos semelhantes ao Nterminal do polipeptdeo HA2 tm atividade antiviral in vitro. Outra estratgia emprega anlogos do cido silico, os quais diminuem a taxa de replicao dos influenza vrus por impedirem a remoo do cido neuramnico dos receptores da superfcie da clula e do envelope do vrus. O stio de reao do cido silico na NA tem a conformao de uma bolsa para cada uma das quatro subunidades, nas quais os aminocidos so conservados para todos os influenza vrus (A e B). Dois compostos (4-amino ou 4 guanidino cido 2-deoxy-2,3 didehidro-D-Nacetilneuraminico e 4-amino ou guanidino-Neu 5Ac2en) so altamente eficientes inibidores da NA de influenza vrus. A e B. Entretanto, a gerao de resistncia tem sido preocupante, uma vez que a bolsa da NA no parece ser essencial para o substrato natural (cido silico) e vrions mutantes sem a cavidade podem eliminar a ao de bloqueio sobre a NA (Lamb & Krug, 1996). Vrus produzido em clulas cultivadas na presena de inibidores da neuraminidase no tem a remoo do cido silico aderido HA, NA e receptores da superfcie da clula, inibindo a atividade de adsoro do HA do vrus e receptor celular. Algumas drogas so desenhadas com o auxlio de computao grfica para definir precisamente, por exemplo, os stios relevantes na associao neuraminidase-cido silico (Lamb & Krug, 1996).

REFERNCIA BIBLIOGRFICA
Alexander DJ. Avian Influenza: recent developments. Veterinary Bulletin 1982; 52: 341-359. [ Links ] Alexander DJ. A review of avian influenza in different bird species. Veterinary Microbiology 2000; 74(1-2): 3-13. [ Links ]

Almond JW, Felsenreich V. Phosphorilation of the nucleoprotein of an avian influenza virus. Journal of General Virology 1982; 60: 295-305. [ Links ] Avian Influenza Task Force, United States Department of Agriculture, January 16, 1984. [ Links ] Anraku MMC, de Fario WC, Takeyama DC. Influenza aviria em aves silvestres brasileiras. I. Inqurito sorolgico atravs da imunodifuso. Revista do Instituto de Medicina Tropical 1971; 13: 292296. [ Links ] Austin FJ, Webster RG. Antigenic mapping of an avian H1 influenza virus haemagglutinin and interrelationships of H1 viruses from humans, pigs and birds. Journal of General Virology 1986; 67: 983992. [ Links ] Banks J, Speidel E, Alexander DJ. Characterisation of an avian influenza A virus isolated from a human - is an intermediate host necessary for the emergence of pandemic influenza viruses? Archives of Virology 1998; 143(4): 781-787. [ Links ] Bossart Whitaker P, Carson M, Babu YS, Smith CD, Laver WG, Air GM. Three-dimensional structure of influenza A N9 neuraminidase and its complex with the inhibitory 2-deoxy 2,3-dehydro-N-acetyl neuraminic acid. Journal of Molecular Biology 1993; 232: 1069-1083. [ Links ] Boyle DB, Selleck P, Heine HG. Vaccinating chickens against avian influenza with fowlpox recombinants expressing the H7 hemagglutinin. Australian Veterinary Journal 2000: 78: 44-48. [ Links ] Brown HH, Harris PA, McCauley JW, Alexander DJ. Multiple genetic reassortment of avian and human influenza A viruses in European pigs, resulting in the emergenceof na H1N2 virus of novel serotype. Journal of General Virology 1998; 79: 29472955. [ Links ] Capua I, Marangon S. The avian influenza epidemic in Italy, 1999-2000: a review. Avian Pathology 2000; 29: 289-294. [ Links ]

Capua I, Marangon S, Selli L, Alexander DJ, Swayne DE, Pozza MD, Parenti E, Cancellotti FM. Outbreaks of highly pathogenic avian influenza (H5N2) in Italy during October 1997 to January 1998. Avian Pathology 1999; 28(5): 455-460. [ Links ] Cauthern AN, Swayne DE, Schultz-Cherry S, Perdue ML, Suarez DL. Continued circulation in China of highly pathogenic avian influenza viruses encoding the hemagglutinin gene associated with the 1997 H5N1 outbreak in poultry and humans. Journal of Virology 2000; 74(14): 6592-6599. [ Links ] Chaves JRS. Ocorrncia de influenza em aves selvagens e pssaros ornamentais no Rio de Janeiro. Tese, Fundao Oswaldo Cruz, 1980. [ Links ] Chen H, Yu K, Tian G, Tang X, Lu J, Chen HL, Yu KZ, Tian GB, Tang XY, Lu JL.. Protective immune response against avian influenza virus in chicken induced by DNA inoculation. Scientia Agricultura Sinica 1998; 31(5): 63-68. [ Links ] Cherian T, Bobo L, Steinhoff MC, Karron RA, Yolken RH. Use of PCR-enzyme immunoassay for identification of influenza A virus matrix RNA in clinical samples negative for cultivable virus. Journal of Clinical Microbiology 1994; 32(3): 623628. [ Links ] Claas EC, Osterhaus AD, van Beek R, De Jong JC, Rimmelzwaan GF, Senne DA., Shortridge KF, Webster RG. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet 1998; 351: 472-477. [ Links ] Coonrad JD, Karathanasis P, Betts RF, Donofrio JC. Enzyme-linked immunosorbent assay of core antigens for clinical diagnosis of influenza. Journal of Medical Virology 1988; 25: 399-409. [ Links ] Couceiro JNSS, Machado RD. Artigo de reviso: Influenza Aviria. Arquivo Fluminense de Medicina Veterinria 1988; 3: 45-52. [ Links ] Couceiro JN, Chaves JR., Brando CT, Machado RD. Isolation and characterization of influenza virus type

A in ornamental birds in Rio de Janeiro. Anais de Microbiologia 1982; 27: 159-167 [ Links ] Cox NJ, Black RA, Kendal AP. Pathways of evolution of influenza A (H1N1) viruses from 1977 to 1986 as determined by oligonucleotide mapping and sequencing studies. Journal of General Virology 1989; 70: 299-313. [ Links ] Crawford JM, Garcia M, Stone H, Swayne D, Slemons R, Perdue ML. Molecular characterization of the hemagglutinin gene and oral immunization with a waterfowl-origin avian influenza virus. Avian Diseases 1998; 42: 486-496. [ Links ] Crawford J, Wilkinson B, Vosnesensky A, Smith G, Garcia M, Stone H, Perdue ML. Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes. Vaccine 1999; 17(18): 2265-2274. [ Links ] Cunha RG, Passos WS, Souza MC. Pathogenicity of equine influenza viruses in chickens. Revista Brasileira de Biologia 1993; 53: 29-36. [ Links ] Davison S, Benson CE, Ziegler AF, Eckroade RJ. Evaluation of disinfectants with the addition of antifreezing compounds against nonpathogenic H7N2 avian influenza virus. Avian Diseases 1999; 43: 533537. [ Links ] Davison S, Galligan D, Eckert TE, Ziegler AF, Eckroade RJ. Economic analysis of an outbreak of avian influenza, 1997-1998. Journal of American Veterinary Medicine Association 1999; 214(8): 11641167. [ Links ] Davison S, Ziegler AF, Eckroade RJ. Comparison of an antigen-capture enzyme immunoassay with virus isolation for avian influenza from field samples. Avian Diseases 1998; 42(4): 791-795. [ Links ] De Jong JC, Rimmelzwaan GF, Fouchier RA, Osterhaus AD. Influenza virus: a master of metamorphosis. Journal of Infection 2000; 40: 218228. [ Links ]

Doller PC, Doller G, Gerth HJ. Immunofluorescence test with antigen-loaded erythrocytes: detection of influenza virus specific IgG, IgA and IgM antibodies. Medical Microbiology and Immunology (Berlim) 1985; 173: 291-302. [ Links ] Donatelli I, Campitelli L, Di Trani L, Puzelli S, Selli L, Fioretti A, Alexander DJ, Tollis M, Krauss S, Webster RG. Characterization of H5N2 influenza viruses from Italian poultry. Journal of General Virology 2001; 82: 623-630. [ Links ]