Laboratorio de Bioqumica

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica de la Fosfatasa cida de germen de trigo.

Juna Brito Jonathan Muoz Stefanhia Vielma Universidad 13-6-2011 de Santiago de Chile, Ingeniera en Biotecnologa

Universidad de Santiago de Chile Ingeniera en Biotecnologa Departamento de Ingeniera Qumica

Introduccin
Las enzimas son los catalizadores de las reacciones en los sistemas biolgicos y son las protenas de mayor especializacin (1). Estas protenas poseen un gran poder cataltico, a menudo muy superior a los catalizadores sintticos o inorgnicos (2) y un alto grado de especificidad por su sustrato (3). Las enzimas participan con gran relevancia en todos los procesos bioqumicos. Actuando como un sistema organizado catalizan cientos de reacciones, tanto de catabolismo como de anabolismo, en donde la regulacin de estos sistemas enzimticos se coordina de un modo eficaz en las actividades metablicas necesarias en los procesos vitales. La reaccin ms sencilla que pueden catalizar las enzimas est representada por la ecuacin (4): E+S ES EP E+P Donde E, S y P, representan a la enzima, al sustrato y al producto, respectivamente, mientras que ES y EP representan los complejos transitorios enzima sustrato y enzima-producto. Las enzimas se clasifican de acuerdo a la reaccin que catalizan, pudiendo ser, segn la clasificacin internacional, oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas (5). La enzima estudiada en este prctico corresponde a la fosfatasa cida del germen de trigo (AcP por sus siglas en ingls), la cual se clasifica como una hidrolasa, que cataliza la reaccin de hidrlisis de fosfatos monosteres con la liberacin de fosfato inorgnico segn la siguiente reaccin:

En este prctico se determinarn las condiciones ptimas de temperatura de la actividad enzimtica de la AcP, utilizando p-nitrofenilfosfato (p-NPP) como sustrato artificial.

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La actividad enzimtica de la AcP ser determinada cuantificando el producto de la hidrlisis (p-nitrofenol) en NaOH, por espectrofotometra a 405 nm, longitud de onda a la que el p-nitrofenol presenta absorbancia mxima (6).

Materiales y Mtodos
1.1 Elaboracin de la curva de calibracin de p-nitrofenol. Se prepararon seis tubos Eppendorf que contienen cada uno 0, 125, 250, 500, 750 y 1000 L de una solucin de p-nitrofenol 60 M en NaOH 0,05 M. Posteriormente los seis tubos se completan hasta 1 mL con la solucin de NaOH 0,05 M. Finalmente se cargaron 200 L de las soluciones preparadas anteriormente sobre una placa de ELISA, para medir la absorbancia en el espectrofotmetro a 405 nm. Para confeccionar la curva de calibracin se grafic la absorbancia de las soluciones de p-nitrofenol versus la cantidad en moles de stas. 1.2 Determinacin de las condiciones ptimas de Temperatura de la actividad enzimtica de la AcP a pH 5. Se prepararon tres tubos Eppendorf A, B y C, a los cuales se le agreg a cada uno 200 L de p-NPP en buffer citrato (citrato de sodio 100 mM, EDTA 150 mM pH 5,0) y 200 L de buffer citrato. Los tubos A, B y C se incubaron por tres minutos a 4, 37 y 60 C respectivamente. Finalizado los tres minutos a los tubos A, B y C se le agrega 100 L de solucin de AcP 1:20 con respecto al stock (10 mg/ mL en buffer citrato). Se mezcl e inmediatamente se sac una alcuota de 100 L de los tubos A, B y C, reincorporndolos a sus temperaturas de incubacin. Las alcuotas extradas se adicionan a tres tubos que contienen 900 L de una solucin de NaOH 0,05 M. Este es el control denominado tiempo cero de reaccin. Anlogamente se repiti el procedimiento a los tiempos 5, 10 y 20 minutos obtenindose como resultado doce tubos. Se cargaron 200 L de las soluciones de los doce tubos a una placa de ELISA y se midi su absorbancia a 405 nm. Los resultados de absorbancia obtenidos se interpolan en la curva de calibracin descrita en 1.1 para calcular los moles de pnitrofenol y luego determinar la temperatura ptima de actividad enzimtica de la AcP.

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Resultados
Se estudi el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica de la fosfatasa cida de germen de trigo, a partir de la cuantificacin de producto liberado (pnitrofenol) a tres diferentes temperaturas de ensayo: 4, 37 y 60 C. Para la estimacin de la cantidad de producto liberado en mol se us la curva de calibracin de p-nitrofenol (figura 1), que fue confeccionada a partir de la tabla 1, en donde las absorbancias de las concentraciones conocidas de p-nitrofenol fueron medidas por espectrofotometra a 405 nm. La ecuacin de la recta de la figura 1 (y= 17,583x +0,0011) fue usada para interpolar las absorbancias de la soluciones de los 12 tubos Eppendorf, obtenidos a distintos tiempos, a partir de los tubos de reaccin A, B y C sometidos a las temperaturas 4, 37 y 60 C, respectivamente.
Curva de Calibracin de p-nitrofenol
1,2 1 Absorbancia 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 p-nitrofenol (mol) y = 17,583x + 0,0011 R2 = 1

pnitrofenol (mol) 0 0,0075 0,0150 0,0300 0,0450 0,0600

Absorbanc ia 0 0,132 0,268 0,530 0,788 1,058

Los resultados de la cantidad de p-nitrofenol obtenidos por la interpolacin de la absorbancia de los 12 tubos mencionados anteriormente se muestran en la tabla 2. Adems, se muestra en la tabla 2 la velocidad inicial (V0) de reaccin para las temperaturas 4, 37 y 60 C, las cuales corresponden a 0,0005, 0,0010 y 0,0021 mol/min, respectivamente. Considerando las temperaturas de ensayo y las velocidades iniciales respectivas a esas temperaturas se confecciona el grfico 2, el cual muestra el

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perfil de actividad enzimtica frente a la temperatura. En donde se observa que el mnimo de actividad es a los 4 C y el mximo a los 60 C.
Tabla 2: Datos de absorbancias de las soluciones de doce tubos para los tiempos 0, 5, 10 y 20 min, respecto a las distintas temperaturas de ensayo 4, 37 y 60 C, adems se muestra la cantidad de pnitrofenol (mol) en cada uno de los tubos y las velocidades iniciales a las temperaturas respectivas. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Temperatura C 4 Tiempo (min) 0 5 10 20 0 5 10 20 0 5 10 20 Absorbancia 0 0,043 0,082 0,093 0 0,085 0,174 0,356 0 0,165 0,335 0,728 p-nitrofenol (mol) 0 0,00238 0,00460 0,00523 0 0,00477 0,00983 0,02018 0 0,00932 0,01899 0,04134 V0 (mol/min) 0,0005

37

0,0010

60

0,0021

Actividad Enzimtica vs Temperatura

0,0025 0,002 V0 (mol/min) 0,0015 0,001 0,0005 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (C) 4 37 60

Grfico 2: Perfil de actividad frente a la temperatura de la fosfatasa cida de germen de trigo. En donde se observa que el mnimo de actividad es a los 4C y el mximo a los 60C. Esta curva se confeccion a partir de las medidas de las velocidades iniciales respectivas a cada temperatura de ensayo.

Discusin

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En este estudio se determin la temperatura ptima de actividad para la fosfatasa cida de germen de trigo. Para establecer la temperatura a la cual la actividad enzimtica es mxima, nos basamos en los resultados apreciables en el grfico 2, en donde se observa claramente que la mxima actividad de la enzima es a la temperatura de ensayo de 60C, con respecto a las otras dos temperaturas. Adems se observa, en el grfico 2, que al aumentar la temperatura tambin aumenta la actividad enzimtica. Lo anterior es un resultado esperado, ya que al aumentar la temperatura, crece la velocidad enzimtica de reaccin porque el sustrato (p-NPP) colisiona con el sitio activo con mayor frecuencia cuando las molculas se mueven con rapidez (7). Sin embargo la actividad enzimtica no aumenta indefinidamente con la temperatura, ya que la agitacin trmica de la enzima rompe los puentes de hidrgeno, los enlaces inicos y otras interacciones dbiles que estabilizan la estructura activa (8). Luego, el calor modifica su estructura terciaria y la enzima se desnaturaliza y pierde su funcin (9). Como la temperatura ptima de la AcP es de 60C (10), cabe esperar que a temperaturas superiores la actividad de la enzima disminuya debido a desnaturalizacin. Finalmente, es importante destacar, que si bien la temperatura de ensayo de mnima actividad es de 4C, el resultado no se debe a desnaturalizacin de la enzima, puesto que las temperaturas bajas detienen la actividad enzimtica pero no desnaturalizan a la enzima en cuestin. (11).

Referencias

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(1) NELSON, D.L.; COX, M.M. Principios de Bioqumica, 4edicin, p.190, Editorial
Ediciones Omega S.A, Barcelona, Espaa, (2005).

(2) Ibd, p. 190. (3) Ibd, p. 190. (4) Ibd, p. 193. (5) Ibd, p. 192. (6) DICKERSON, R.E., Principios de Qumica, 3 edicin, p. 855, Editorial Revert S.A.,
Espaa, (1992).

(7) CAMPBELL, N.A.; REECE, J.B., Biloga, 7 edicin, p. 154, Editorial Mdica
Panamericana S.A., Espaa, (2007). (8) Ibd, p. 154.

(9) SADAVA; HELLER; ORIANS; PURVES y HILLIS, Vida. La Ciencia de la Biologa, 8

Edicin, p. 134, Editorial Mdica Panamericana S.A., Espaa, (2008). (10)Revista Espaola de Fisiologa, Volumen 24, Consejo Superior de Investigaciones Cientfcas, Espaa (1968). (11) MONTOYA H.H., Microbiologa bsica para el rea de la salud y afines, 2 edicin, p. 61, Editorial Universidad de Antioquia, Colombia, (2008).