UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA CURSO DE AGRONOMIA

JEANE FERREIRA PEREIRA

VARIAO DA COMPOSIO BIOQUMICA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS EM REGIO DE CLIMA TROPICAL

FORTALEZA 2009

JEANE FERREIRA PEREIRA

VARIAO DA COMPOSIO BIOQUMICA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS EM REGIO DE CLIMA TROPICAL

Monografia

submetida

ao

curso

de

Agronomia, do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Cear, como prrequisito para obteno do ttulo de Bacharel em Agronomia. Orientador: Profa. Dra. Ana Cludia

Nascimento Campos.

FORTALEZA - CEAR 2009

P492v

Pereira, Jeane Ferreira Variao da composio bioqumica do plasma seminal de caprinos em regio de clima tropical / Jeane Ferreira Pereira, 2009. 35f. ; il. enc. Orientadora: Profa. Dra. Ana Cludia Nascimento Campos Monografia (graduao) - Universidade Federal do Cear, Centro de Cincias Agrrias. Depto. de Fitotecnia , Fortaleza, 2009. 1. Caprinos 2. Fosfolipase A2 3. Minerais I. Campos, Ana Cldia Nascimento (orient.) II. Universidade Federal do Cear Graduao em Agronomia III. Ttulo

CDD 631

JEANE FERREIRA PEREIRA

VARIAO DA COMPOSIO BIOQUMICA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS EM REGIO DE CLIMA TROPICAL

Monografia submetida ao curso de Agronomia, do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Cear, como pr-requisito para obteno do ttulo de Bacharel em Agronomia. Monografia aprovada em __/__/____

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________ Professora Dra. Ana Cludia Nascimento Campos ORIENTADORA

____________________________________________ Ana Gludia Vasconcelos Catunda EXAMINADORA (Doutoranda em Zootecnia)

Gyselle Viana Aguiar EXAMINADOR (Bolsista de Fixao de Recm doutor/ FUNCAP)

minha

me,

Marfisa,

pelo

amor

incondicional dedicado a mim. DEDICO

AGRADECIMENTOS

A Deus, autor supremo da existncia de todas as coisas, e fonte de toda sabedoria. Aos meus pais Francisco das Chagas e Maria Marfisa, por terem acreditado no meu potencial e investido no meu futuro. Ao meu irmo, Jerlan, por mostrar que a famlia mais importante que qualquer coisa no mundo, a minha tia Marlcia e a minha prima Micheline, pelo carinho e apoio nas horas difceis. Aos amigos Gyselle, talo, Jsy, Gislaine, Rafael Soares, Emanuel, Michele, Bruno, Alex e Katiane, pelos momentos de descontrao que fizeram o dia-a-dia mais agradvel. Professora Dra. Ana Cludia Nascimento Campos, pelo apoio, pacincia, riqueza de ensinamentos, compreenso e por tornar essa monografia uma realidade para mim. Ana Gludia Vasconcelos Catunda, pela ajuda na execuo dos experimentos, pacincia nos ensinamentos e pelos momentos de descontrao na faculdade. Aos professores do curso de graduao da Universidade Federal do Cear que enriqueceram e amadureceram meus conhecimentos. Aos colegas do curso de graduao, que atravessaram comigo essa fase de aprimoramento. Universidade Federal do Cear UFC e Curso de Graduao em Agronomia, por proporcionar minha capacitao profissional. A Fundao Cearense de Apoio Cientfico e Tecnolgico FUNCAP, pelo financiamento do projeto. Aos alunos dos cursos de graduao em Agronomia e Zootecnia da UFC, Airton, Gabriel, Wellingthon, Pedro, Camila, Marco Antonio, Sarah, Fabiano, Assis Rubens, Wando, Karol, Sskia, Etho, Adlia e Diego pela disponibilidade e apoio na execuo do experimento. A todos que contriburam de forma direta ou indireta para superao desse grau acadmico. Meus sinceros agradecimentos!

RESUMO

O objetivo desse estudo foi avaliar a variao de Ca, P e Mg, bem como a atividade da fosfolipase A2 no plasma seminal de caprinos sem padro racial definido criados em clima tropical mido, entre as pocas e os meses do ano e a ocorrncia de variao individual. O experimento foi conduzido no Departamento de Zootecnia da UFC durante os meses de agosto de 2005 a setembro de 2006. Foram utilizados 17 machos caprinos criados sob condies intensivas e alimentados segundo NRC caprinos. Os ejaculados foram coletados semanalmente por meio de vagina artificial. Aps a coleta, o smen de cada animal foi centrifugado a 3.417 g /20 min. Em seguida, o sobrenadante foi mensurado e acondicionado em tubos eppendorfs, mantidos a 18C at que fossem realizadas as anlises bioqumicas. Para as dosagens de Ca, P e Mg foram utilizados os kits comerciais da marca LABTEST. A atividade da FLA2 foi mensurada atravs da metodologia de Haas et al. (1968). Para a anlise dos dados utilizou-se o programa estatstico SAS. Os volumes de smen e de plasma seminal variaram entre os meses do ano, onde os maiores valores encontrados para ambos foram no ms de maro, ou seja, na poca chuvosa. J os menores valores encontrados foram no ms de outubro (seca). A atividade da FLA2 apresentou baixos nveis, variando de 5,25 (outubro) a 6,95 U/mL (maro) e foi constatada uma variao de 4,96 (animal 7) a 8,12 U/mL (animal 1), apresentando diferena significativa. A maior concentrao de clcio foi observada no ms de outubro e a menor em novembro (seca). O fsforo atingiu a maior concentrao em maio e a menor em setembro, ou seja, em pocas diferentes. A maior concentrao de magnsio foi observada em junho e a menor em maro (chuvosa). Concluiu-se que a fosfolipase A2 presente no PS de caprino em condies tropicais, apresentou variao na atividade quanto poca, ms do ano e indivduo e que com base na composio mineral do PS sugere-se que a melhor poca para utilizao do smen caprino a chuvosa.

ABSTRACT

This work aimed to evaluate the variation of Calcium (Ca), Phosphorus (P), Magnesium (Mg) levels and the Phospholipase A2 (PLA2) activity in the seminal plasma of crossbreed goats raised in tropical region. The variation among these seminal components was compared in different periods and months of the year, and animals. The experiment was realized in Animal Science Department of Federal University of Ceara during August of 2005 to September of 2006. The ejaculates of 17 male goats were obtained and evaluated weekly in artificial vagina and centrifuged at 3417 g/ 20min. After that, the supernatant was separated, measured and stored at -18 C in eppendorfs until the biochemical analyzes. Commercial kits (LABTEST) were used to determinate the Ca, P and Mg levels and the methodology of Haas (1958) was used to measured the seminal PLA2 activity. The statistical analyzes were realized in the SAS program. The higher values to volume of semen and seminal plasma were observed in March (rainy season) and the lower volumes were detected in October (dry season). The PLA2 activity had lower variation among the months of the year: 5.25 U/mL (October) to 6.95 U/mL (March). However, there was individual effect on the PLA2 activity and significant difference was detected among the animals: 4.96 U/mL (animal 7) to 8.12 U/mL (animal 1). The higher Ca level was observed in October and lower was obtained in November, both in dry season. The P level was higher in May (rainy season) and lower in September (dry season). The Mg level was higher in June and lower in March, both in rainy season. In conclusion, the PLA2 activity in seminal plasma of goats raised in tropical regions underwent effect of the period and month of the year and individual effect. In addition, the mineral composition of seminal plasma obtained in rainy season suggests that this period of the year is better for utilization of goat semen.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Valores mdios e desvio padro dos parmetros bioqumicos do smen de caprinos SPRD, nas pocas de transio seca / chuvosa, chuvosa, transio chuvosa / seca e seca, no Estado do Cear..................................................................................................pg. 24 Tabela 2 Mdias e desvios-padro mensais dos parmetros bioqumicos do PS de caprinos SPRD criados no Estado do Cear...................................................................................pg. 26 Tabela 3 Variao individual mdia e desvio-padro da composio bioqumica do PS de caprinos SPRD.................................................................................................................pg. 28

SUMRIO

RESUMO........................................................................................................................ pg. 07 ABSTRACT................................................................................................................... pg. 08 LISTA DE TABELAS.................................................................................................... pg. 09 1 INTRODUO.......................................................................................................... pg. 11 2 REVISO DE LITERATURA................................................................................. pg. 13 2.1 Caractersticas do Plasma Seminal............................................................................. pg. 13 2.2 Principais eletrlitos do Plasma Seminal e sua importncia sobre o metabolismo espermtico................................................................................................................. pg. 15 2.3 Fosfolipase A2............................................................................................................ pg. 16 2.3.1 Caracterizao das Fosfolipases..................................................................... pg. 16 2.3.2 Ao da fosfolipase na smen caprino........................................................... pg. 18 3 OBJETIVOS............................................................................................................... pg. 20 3.1 Objetivo geral............................................................................................................. pg. 20 3.2 Objetivos especficos.................................................................................................. pg. 20 4 MATERIAL E MTODOS....................................................................................... pg. 21 4.1 Local do experimento................................................................................................. pg. 21 4.2 Determinao das pocas do experimento................................................................. pg. 21 4.3 Animais experimentais................................................................................................pg. 22 4.4 Colheita e tratamento do smen..................................................................................pg. 22 4.5 Anlise dos parmetros seminais................................................................................pg. 22 4.6 Anlise estatstica........................................................................................................pg. 23 5 RESULTADOS E DISCUSSO................................................................................pg. 24 6 CONCLUSO.............................................................................................................pg. 29 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................................................pg. 30

11 1. INTRODUO

O plasma seminal uma complexa mistura de componentes que tm efeito benfico (AZEREDO et al., 2001, BARRIOS et al, 2000) e/ou deletrio (BRINSKO et al., 2000; LEBOEUF et al., 2000) sobre os espermatozides. Por vrias razes, a bioqumica do plasma seminal (PS) dos mamferos tem recebido considervel ateno, seja pela sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial do espermatozide ou pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em rgos especficos. Conhecer a concentrao destes constituintes importante para avaliar a capacidade secretora de vrias glndulas sexuais anexas, as quais dependem da produo de andrgenos pelos testculos para desempenhar suas funes (MANN, 1974). O plasma seminal o produto das secrees das glndulas anexas do macho (prstata, vescula seminal e glndula bulbo-uretral), epiddimo, ducto deferente e ampola dos ductos deferentes (MANN, 1974; EVANS e MAXWELL, 1990). FRAZER & BUCCI (1996) afirmaram que o PS composto de acares, lipdios e minerais, bem como de um elevado teor de protenas especiais, incluindo enzimas, hormnios, fatores de crescimento, inibidores, imunossupressores, substncias ligadas a andrgenos, inibina e imunoglobulinas, onde a presena ou ausncia de muitos destes componentes pode estar envolvida com a fertilidade. Diversos eletrlitos esto presentes no plasma seminal e dentre os mais importantes foram encontrados Na, K, Mg (GONZALES et al., 1984; PINHEIRO et al., 1996a); Cl, fosfatos (JAISWAL & CONTI, 2003) e Zn0 (KVIST, 1980). Os nveis de cloreto no smen influenciam o potencial de membrana do espermatozide e a motilidade em associao com ctions. Os ons Cl, Na e K esto diretamente relacionados com a manuteno da excitabilidade dos espermatozides, pH timo do smen e presso osmtica constante dentro e fora das clulas espermticas (DHAMI e SAHNI, 1993). A distribuio da maioria dos ons entre a frao espermtica e o PS poder promover as bases para a variao da qualidade do smen e dever ser considerada na interpretao dos resultados obtidos na avaliao da fertilidade de ovinos (ABDEL-RAHMAN et al., 2000). Em mamferos, os ons Ca e HCO3 desempenham um papel crtico na regulao da funo espermtica, mais precisamente na regulao dos nveis de AMPc (JAISWAL & CONTI, 2003). Alm disso, o clcio induz a ativao de um contedo enzimtico proveniente das glndulas bulbouretrais, a

12 fosfolipase A2 e a reao do acrossoma, ambos os processos so inibidos pelo zinco (THAKKER et al., 1983). O conhecimento da variao na composio mineral do plasma seminal poder ajudar na escolha da poca mais adequada para conservao do smen caprino, partindo-se do princpio de que a variao mensal afetaria a qualidade do smen, mesmo que a alimentao esteja atendendo s exigncias nutricionais dos animais. Apesar dos considerveis avanos, os conhecimentos sobre a funo do PS na espcie caprina ainda so escassos. O tratamento do smen in vitro ocasiona variaes no metabolismo e/ou sobrevivncia dos espermatozides e, alm disso, a inexistncia de mecanismos de eliminao das clulas espermticas mortas submete os gametas vivos a uma convivncia com os produtos de sua decomposio (CORTEEL, 1980). Neste sentido, SKANDHAN (1981) reconheceu que as alteraes de muitos dos componentes do PS so responsveis pela incapacidade de fecundao do gameta. O objetivo desse estudo foi avaliar a existncia de variao dos macroelementos, Ca, P e Mg, bem como a atividade da fosfolipase A2, entre as pocas (pocas seca, transio seca / chuvosa, chuvosa e transio chuvosa/ seca), entre os meses do ano e a ocorrncia de variao individual no plasma seminal de caprinos sem padro racial definido (SPRD) criados intensivamente em clima tropical mido, no Estado do Cear e mantidos sob rigoroso controle alimentar.

13 2. REVISO DE LITERATURA

2.1. Caractersticas do Plasma Seminal

O plasma seminal exerce papel essencial na reproduo, medida que serve de nutriente para os espermatozides, estimula o metabolismo espermtico e transporta as clulas espermticas at o trato genital feminino. Sobretudo, os constituintes do plasma seminal mantm a motilidade espermtica e a habilidade de alcanar, reconhecer e se ligar ao ocito (MAXWELL e JOHNSON, 2000; EVANS e MAXWELL, 1990). Segundo Guerra et al. (2004) o plasma seminal contm antioxidantes importantes para a preservao dos espermatozides. Hafez e Hafez (2000) constataram que o plasma seminal contm diversos ons tais como, sdio, potssio, cloreto, clcio e magnsio. Estes autores relataram que o potssio est correlacionado com a viabilidade espermtica e o clcio regula a fisiologia do espermatozide. Contudo, as glndulas vesiculares secretam acares como a glicose, ribose, sorbitol, inositol e frutose que atuam no metabolismo energtico do espermatozide (Hafez e Hafez, 2000). No tocante a isto, Catunda (2007) concluiu que existe influncia da poca do ano sobre a variao na composio bioqumica do plasma seminal de caprinos e tais variaes se do sobre o clcio, fsforo, magnsio, protenas totais, cido ctrico e frutose. Alguns estudos demonstraram haver diferenas na qualidade do ejaculado de pequenos ruminantes entre as estaes do ano em clima temperado (EATON e SIMMONS, 1952; COLAS, 1980; NUNES, 1982; COLAS, 1983; ROCA et al., 1992; TULI e HOLTZ, 1995), e muitos deles atriburam tais diferenas ao fotoperodo. Em ovinos, a freqncia de coleta pode influenciar a composio inica e a atividade enzimtica no PS, bem como, os parmetros espermticos e produo diria de espermatozides (KAYA et al., 2002). A literatura mostra uma divergncia no papel do plasma seminal sobre os espermatozides. Uma vez que relatos sugerem que o plasma seminal contm fatores que influenciam beneficamente a fertilidade do macho (AURICH et al., 1996). Enquanto outros trabalhos sugerem que a presena do plasma seminal no meio de conservao interfere no comportamento dos espermatozides em suportar a congelao, alm de conter fatores que impedem a reao acrossmica e inibe a capacitao espermtica nos processos de fertilizao in vitro (CORTEEL, 1974; KATSKA et al., 1996).

14 Estudos previamente realizados demonstraram haver diferenas entre as membranas espermticas dos espermatozides epididimrios e do ejaculado, devido influncia do PS (HENAULT et al., 1995). Estas observaes sugerem que alguns fatores presentes nas secrees das glndulas anexas aumentam a fertilidade de touros de alta fertilidade ou alguns fatores que inibem a fertilidade esto presentes em animais de baixa fertilidade (HENAULT et al., 1995). Nesse sentido, as secrees das glndulas anexas dos touros e eqinos so fatores determinantes para a fertilidade do macho (HENAULT et al.,1995; AURICH et al.,1996). Yamashiro et al. (2006), tentando diminuir o efeito do PS sobre os espermatozides de caprinos, coletaram o ejaculado em tubos j contendo diluidor e observaram uma melhora significativa sobre a motilidade espermtica e integridade acrossmica. Sugerindo que as caractersticas funcionais in vitro so abruptamente modificadas pelo contato rpido com o fluido das glndulas acessrias na ejaculao. Dott et al. (1979) demonstraram que a incubao do espermatozide em altas taxas de diluio prejudica a motilidade, pois parece possvel que haja algum fator essencial associado clula para o desempenho da funo espermtica e que a proximidade das clulas necessria para a proviso de nveis adequados deste fator. Tem sido sugerido que a presena do plasma seminal de caprinos no meio de conservao interfere no comportamento dos espermatozides em suportar a congelao (CORTEEL, 1974). Talvez a principal razo desse impasse seja devido grande diversidade do plasma entre as espcies, ocorrncia e concentrao de muitos constituintes seminais importantes (RODGER, 1975). Alguns estudos demonstraram haver ampla variao nos nveis bioqumicos de muitos constituintes do plasma seminal entre bovinos e bubalinos (DHAMI & SAHNI, 1993). Esta variao pode ser responsvel pelas notveis diferenas na qualidade, congelabilidade e fertilidade do smen nestas espcies (DHAMI & SAHNI, 1993). Esta diversidade no somente encontrada entre as espcies de mamferos, mas tambm entre as raas de uma mesma espcie, como observada em caprinos (EATON & SIMMONS, 1952; PINHEIRO et al., 1996a). O problema agravado pela falta de informao e desconhecimento da fisiologia do espermatozide in vivo. Estas limitaes tm resultado em contnua identificao de constituintes bioqumicos seminais e especulaes sobre o papel de cada novo constituinte (RODGER, 1975).

15 2.2. Principais eletrlitos do PS e sua importncia sobre o metabolismo espermtico

Ao contrrio de outros nutrientes, os minerais no podem ser sintetizados pelos organismos vivos, sendo as suas principais funes: a composio de rgos e tecidos, constituintes de tecidos e fluidos corporais como eletrlitos e catalisadores em sistemas hormonais e enzimticos (SENGER, 2007). Em ovinos, a concentrao de ons Na, Cl e PO4 no plasma seminal excedem quelas do espermatozide, enquanto a de potssio, clcio e magnsio so maiores no espermatozide (ABDEL-RAHMAN et al., 2000). Nveis mais altos de K e Ca no espermatozide causam reduo na atividade espermtica em ovinos nativos e Merinos. Os dados tambm sugerem uma relao recproca entre o contedo intracelular de K, Ca e PO4 com relao percentagem de espermatozides vivos, onde uma percentagem mais alta de clulas vivas foi associada com altos nveis de K e Ca e baixa de PO4 (ABDEL-RAHMAN et al., 2000). Neste sentido, estudos demonstraram que algumas enzimas tm correlao direta com o Na e K, como por exemplo, a fosfatase cida, indicando que a mesma tem importante papel na atividade eletroltica do smen (DHAMI e KODAGALI, 1987). A elevada quantidade de ons P no PS revela a atividade da fosfatase alcalina em liberar ons a partir dos processos metablicos dos espermatozides (DHAMI e SAHNI, 1993). Alguns autores constataram que o metabolismo espermtico das clulas testiculares difere daquele do ejaculado em muitos aspectos, visto que a adio de PO4 ao meio de incubao deprimiu a respirao do espermatozide do ejaculado e estimulou as clulas do testculo (MANN & WHITE, 1957; OSHEA & VOGLMAYR, 1970). OShea e Voglmayr (1970) observaram que a adio dos ons Mg e K ao smen ovino aumentou a entrada de oxignio, a oxidao da frutose e o acmulo de lactato extracelular. Kaya et al. (2002) observaram que o aumento na freqncia de colheita de smen em ovinos provocou um aumento significativo na concentrao de Na e K no plasma seminal, todavia os nveis de Ca e Mg reduziram marcadamente. No mesmo estudo, observou-se uma reduo progressiva da motilidade das clulas espermticas no ejaculado e foi associado com as concentraes de Na e K. O Ca atua ainda na regulao de enzimas usando a calmodulina como mediador, o complexo Ca-calmodulina ativa diferentes enzimas, dentre elas a fosfolipase A2. O on clcio

16 (Ca++) o gatilho da reao de acrossoma no espermatozide dos mamferos, e h evidncia substancial de que este on est diferencialmente envolvido na motilidade espermtica dependendo do estgio de maturao da clula. A prstata e vesculas seminais so ricas em clcio, estudos gerais tm investigado a associao do Ca com a subfertilidade em humanos (WONG et al., 2001). O magnsio est presente em altas concentraes no smen fazendo parte de quase todos os sistemas enzimticos atuando como modulador especfico, enzima-substrato, tendo papel fundamental como cofator em mais de 300 reaes enzimticas envolvendo o metabolismo energtico e sntese de cidos nuclicos. O Mg considerado como marcador das vesculas seminais e tem ao intracelular antagnica com o Ca (WONG et al., 2001; SENGER, 2007). O fsforo tem participao no metabolismo dos carboidratos, lipdeos, protenas e cidos nuclicos (DNA e RNA). Uma deficincia alimentar de fsforo pode levar a infertilidade em mamferos (BACILA, 1980). A distribuio da maioria dos ons entre a frao espermtica e o plasma seminal poder promover as bases para a variao da qualidade do smen e dever ser considerada na interpretao dos resultados obtidos na avaliao da fertilidade de ovinos (ABDELRAHMAN et al., 2000).

2.3 Fosfolipase A2

2.3.1 Caracterizao das fosfolipases

A fosfolipase uma enzima que converte os fosfolipdeos em cidos graxos e outras substncias lipolticas. Existem quatro principais classes de fosfolipases, terminadas em A, B, C e D distinguidas pelos tipos de reao que elas catalisam. Fosfolipase A (FLA2); FLA1 cliva a molcula de fosfoglicerdio na posio sn-1; FLA2 cliva o fosfoglicerdeo na posio sn-2. Fosfolipase B a clivagem da molcula ocorre em ambas as posies sn-1 e sn2, tambm conhecida como uma lisofosfolipase. Fosfolipase C a clivagem feita antes do fosfato, liberando diacilglicerol e um grupo contendo uma extremidade fosfato. As FLAs C tm um papel central na transduo do sinal, liberando o segundo mensageiro o inositol

17 trifosfato. Fosfolipase D cliva a cadeia aps o fosfato, liberando cido fosfatdico e um lcool. Os tipos C e D so considerados fosfodiesterases (WIKIPEDIA, 2007). As fosfolipases A2 (FLA2) ou fosfatidil-acl-hidrolase so enzimas que catalisam especificamente a hidrlise da ligao acil-ster, na posio sn-2 de fosfoglicerdeos. Esta reao libera quantidades equimolares de cidos graxos livres e lisofosfolipdeos. De modo geral a ativao da FLA2 depende de sua interao com grandes agregados lipdicos, em interfaces de lipdeo/gua, o que permite a difuso do substrato para o stio ativo (CHACUR, 2004). No PS de bovinos, o nvel de FLA2 foi purificada e caracterizada como uma enzima de 60 KDa (SOUBEYRAND, 1997). Ainda segundo Chacur (2004) diversas FLA2 tm sido identificadas, baseado na localizao, regulao, seqncia de gene e estrutura. Atualmente, as FLA2 esto divididas em 12 grupos, com base na estrutura primria e na presena de pontes dissulfdicas intramoleculares. As FLA2 dos grupos I, II, III, V, IX, X, XI e, mais recentemente, do grupo XII, utilizam como unidade cataltica a histidina na posio 48 e o aspartato na posio 99. Estas FLA2 requerem quantidades milimolares de clcio para a catlise e so tambm denominadas FLA2 secretadas (sFLA2). Por outro lado, as enzimas dos grupos IV, VI, VII e VIII utilizam a serina 228 como stio cataltico, e no requerem clcio para atividade enzimtica. As FLA2 do grupo I compreendem as enzimas encontradas no pncreas de mamferos, e em venenos de serpente apresentando peso molecular de 13 a 15 kDa, sendo constitudas de aproximadamente 120 resduos de aminocidos ligados por sete pontes dissulfdicas. Essas enzimas so secretadas como zimognios, manifestando atividade enzimtica de forma limitada e somente atravs da clivagem protica (CHACUR, 2004). Upreti et al, (1999) afirmaram que a FLA2 uma enzima encontrada em diversos locais do organismo animal, estudos morfolgicos em espermatozides tratados com lisolecitina revelaram a fuso do acrossoma e membrana plasmtica durante a reao de acrossoma (como pr-requisito para a habilidade fertilizante do espermatozide). Consequentemente, o papel potencial da FLA2 na reao de acrossoma e controle da fertilizao em mamferos tm sido evidenciados durante a capacitao espermtica em hamster dourado. A ativao da FLA2 induzida pelo clcio bem como a reao de acrossoma, e ambos os processos so inibidos pelo zinco (THAKKER et al., 1983). As FLA2 no smen so dependentes de clcio tendo pH timo em torno de 7.0 a 8.5 e so inibidas por zinco e magnsio. Baseado nesses achados sugere-se que a FLA2 espermtica pode ter ao

18 moduladora da fuso da membrana nos eventos da fertilizao em mamferos (UPRETI et al., 1999). A FLA2 no foi identificada na superfcie dos espermatozides epididimrios de bovinos (RONKKO, 1992). Sugerindo que diferentes FLA2 podem estar presentes no PS, e que a FLA2 pode ligar-se superfcie espermtica durante a ejaculao (ROLDAN, 1998). Os mesmos autores sugerem que seria interessante verificar se a quantidade da atividade da FLA2 detectada no espermatozide corresponde as FLA2 do PS que esto ligadas superfcie espermtica.

2.3.2 Ao da fosfolipase no smen caprino

A ao da fosfolipase no smen caprino catalisa a hidrlise de lecitinas em lisolecitinas produzindo cidos graxos livres. As lisolecitinas, devido a sua ao detergente sobre os lipdios da membrana plasmtica e os cidos graxos so consideradas txicas aos espermatozides. Em adio, a lecitina o principal fosfolipdio nas membranas plasmticas dos espermatozides e est contida na gema de ovo, sendo, portanto, substrato perfeito para ao hidroltica da fosfolipase (ARAJO & CAMPOS, 2005). A principal fosfolipase ativa mensurada no smen caprino a fosfolipase do tipo A1, enquanto que a fosfolipase do tipo A2 tem sido relatada em outras espcies, incluindo a humana (KUNZE et al.,1974). A atividade da fosfolipase A pode ser mensurada por meio do decrscimo de lecitina, pelo aumento da liberao de cidos graxos livres ou pelo aumento das lisolecitinas no PS (HAYAISHI, 1955). Em regies de clima temperado, h um significativo efeito individual do macho caprino em relao ao efeito da fosfolipase A. Sua atividade depende da presena de clcio, de pH timo, temperatura, concentrao da mesma no plasma seminal, estao do ano e at mesmo da espcie de ave que fornece a gema de ovo para o preparo do diluidor (MANN & LUTWAK-MANN, 1981, CHEMINEAU et al., 1991). Durante a estao no reprodutiva, as glndulas bulbouretrais hipertrofiam e aumentam sua atividade, sob influncia das altas concentraes plasmticas de prolactina e produzem mais fosfolipase A (NUNES, 1982). Sias et al. (2005) demonstraram que a GoPLRP2 ou BUSgp 60 tambm dispara a atividade da fosfolipase, e que esta enzima provavelmente idntica a enzima da coagulao da gema de ovo, descrita primeiramente por Roy (1957). O artigo de Roy sobre a enzima de

19 coagulao da gema de ovo no smen e glndulas de Cowper de caprino foi provavelmente o primeiro relato sobre a PLRP2 (ROY, 1957). J que a GoPLRP2 est presente no PS de caprino, esta enzima pode estar associada com a atividade reprodutiva de caprinos.

20 3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral:

Verificar a existncia de variao na concentrao dos macroelementos (Ca, P e Mg) e da atividade da fosfolipase A2, entre as pocas (pocas seca, transio seca / chuvosa, chuvosa e transio chuvosa/ seca) e meses do ano, bem como a ocorrncia de variao individual no plasma seminal de caprinos sem padro racial definido (SPRD) criados intensivamente em clima tropical mido, no Estado do Cear mantidos sob rigoroso controle alimentar.

3.2. Objetivos especficos:

1) Constatar por meio de anlise bioqumica se h diferena na composio mineral do plasma seminal entre as pocas (pocas seca, transio seca / chuvosa, chuvosa e transio chuvosa/ seca); 2) Verificar se h variao na composio mineral do plasma seminal durante os doze meses do ano; 3) Avaliar a existncia desta variao entre os caprinos SPRD (individual), mantidos sobre manejo intensivo e alimentao balanceada; 4) Determinar a existncia de variao individual, anual e mensal na atividade da FLA2 .

21 4. MATERIAL E MTODOS

4.1. Local do experimento

O experimento foi conduzido nas instalaes do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal do Cear (Fortaleza Cear), situado a 3 45 02 de Latitude Sul, 38 32 35 de Longitude oeste e 15,5 m acima do nvel do mar. O clima, segundo a classificao de Koeppen, do tipo AW, com clima quente e mido, suas mdias trmicas so de 26C a 27C, com mximas de 30C e mnimas de 19C, a umidade relativa do ar de 82% no litoral cearense. O experimento foi conduzido durante os meses de agosto de 2005 a setembro de 2006, apresentando neste perodo temperatura mdia de 27,28 0,54C e umidade relativa do ar 75,75 4,88%. Os dados climatolgicos foram cedidos pela estao metereolgica da FUNCEME/Campus do Pici.

4.2. Determinao das pocas do experimento

Para determinao das pocas consideradas no estudo, tomaram-se por base os dados climatolgicos de precipitao e umidade referentes ao perodo em que transcorreu o experimento. Ficando as pocas assim definidas: poca seca: setembro, outubro, novembro, dezembro, com precipitao de 0 mm e umidade relativa de 71,50 1,50 %; poca de transio seca/chuvosa (TS/C): janeiro a fevereiro, com precipitao mdia 65,15 9,87 mm, e umidade relativa 75,00 2,03%, poca chuvosa: maro, abril, maio e junho, com precipitao mdia 298,18 101,44 mm, e umidade relativa 81,19 2,97%, poca de transio chuvosa/seca (TC/S): julho a agosto, com precipitao mdia 35,13 21,76 mm, e umidade relativa 74,74 4,55%.

22 4.3. Animais experimentais

Foram utilizados 17 machos caprinos Sem Padro Racial Definido (SPRD), com idade mdia de 22,41 5,91 meses, com peso vivo mdio de 36,22 6,91 Kg e permetro escrotal (PE) mdio de 24,73 1,53 cm. Criados sob condies intensivas e alimentados segundo NRC (1981) para caprinos. A mineralizao foi incorporada rao, e a gua foi fornecida ad libitum. O controle sanitrio (anti-helmntico e suplementao vitamnica) foi realizado conforme critrios pr-estabelecidos. Mensalmente os animais foram pesados, e por ocasio da pesagem, a cada dois meses, mensurou-se o permetro escrotal de cada macho.

4.4. Coletas e tratamento do smen

Os ejaculados foram coletados por meio de vagina artificial. Ao final do perodo experimental foram realizadas 52 colheitas. Aps a coleta, o volume de cada ejaculado foi mensurado individualmente e a concentrao espermtica determinada por espectrofotometria. O smen de cada animal foi centrifugado em centrfuga refrigerada (+ 4C), a 3417 g /20 min. Em seguida, o sobrenadante (PS) foi mensurado e acondicionado em tubos eppendorfs, mantidos sob refrigerao a 18C at que fossem realizadas as anlises da composio bioqumica. Ao final do perodo de coletas, em virtude do baixo volume de PS de alguns animais, procedeu-se realizao de um pool de quatro amostras de cada indivduo totalizando 240 observaes. Resultando uma amostra por ms de cada animal.

4.5. Anlises dos parmetros seminais

Para as dosagens de Ca, P e Mg foram utilizados os kits comerciais da marca LABTEST. A atividade da FLA2 foi mensurada atravs da metodologia de Haas et al.
(1968), descrita a seguir. Como substrato, preparou-se uma soluo de gema de ovo com 50

23 mL de gua destilada e a uma amostra de 15 mL desta soluo foram adicionados 10 mL de deoxicolato de sdio a 0,03 M e 1 mL de CaCl2 a 0,6 M. gua destilada foi adicionada em seguida, at completar 100 mL, de forma que a concentrao final do deoxicolato de sdio e o CaCl2 foram de 3 x 10-3 e 6 x 10-3, respectivamente. O pH desta soluo foi corrigido para 7,8 a 8,0 utilizando-se NaOH 0,5 M. Desta soluo, uma alquota de 10 mL foi retirada e levada ao pHmetro e adicionada de 20 L de plasma seminal caprino. Uma alquota de 3 L de NaOH a 0,11 N foi adicionada sempre que o pH da soluo diminua em 0,03 e o tempo (em segundos) aferido, de modo que o ensaio teve durao de trs minutos. No final do ensaio, foi calculada a mdia das diferenas dos tempos anotados, multiplicada por um fator de correo, com a finalidade de determinar a unidade de consumo de NaOH /minuto/ 20 L de plasma seminal caprino adicionado soluo de uso. Todas as determinaes dos componentes bioqumicos do plasma seminal foram realizadas em triplicata e a mdia dos trs resultados foi utilizada para as anlises estatsticas.

4.6. Anlise estatstica

Para a anlise dos dados utilizou-se o programa estatstico SAS. O delineamento experimental empregado foi o de blocos casualizados, onde cada animal constituiu um bloco para retirada dos efeitos de idade e peso. Foram retiradas as mdias e desvios-padro mensais dos parmetros bioqumicos do PS. Foi feito um estudo de anlise de varincia para avaliao dos efeitos de poca, ms e animal. Ao serem detectados efeitos significativos pelo teste F, s mdias foram comparados pelo teste de Duncan, com uma probabilidade de 5% de erro.

24 5. RESULTADOS E DISCUSSO

O estudo de alguns componentes bioqumicos do PS pode ser uma alternativa vivel para avaliao do funcionamento do aparelho reprodutivo e da qualidade seminal de bodes (PINHEIRO et al., 1996a; SANTOS et al., 2000). Os valores mdios e desvios-padro para a composio bioqumica do PS nas diferentes pocas (seca, transio S/C, chuvosa e transio C/S) so apresentados na Tabela 1.
Tabela 1- Valores mdios e desvio padro dos parmetros bioqumicos do smen de caprinos SPRD, nas pocas de transio seca / chuvosa, chuvosa, transio chuvosa / seca e seca, no Estado do Cear.

Varivel PE (cm) Vol smen (mL) Vol OS (mL) FLA2 (U/mL) Ca (mg/dL) P (mg/dL) Mg (mg/dL)

poca Seca 23,38 1,50c 0,72 0,24b 0,44 0,20c 5,75 1,63b 11,86 2,50ab 9,66 3,60c 8,30 3,30bc

poca tranSC 24,81 0,99b 0,92 0,21a 0,71 0,20a 6,91 1,99a 11,59 2,00bc 10,63 3,64b 7,38 3,23c

poca Chuvosa 25,26 1,25ab 0,88 0,22a 0,71 0,21a 5,97 1,73b 12,25 1,88a 12,45 2,48a 9,89 4,06a

poca tranCS 25,78 1,06a 0,74 0,20b 0,53 0,20b 6,22 1,88b 11,10 1,71c 10,69 2,30b 9,41 4,00ab

Letras minsculas: comparao entre as pocas do ano (p< 0,05).

O maior valor de PE foi observado no ms de agosto, que est dentro da poca de TC/S (Tabela 1 e 2), contudo esse ms no diferiu significativamente dos meses compreendidos entre maro a julho. J os menores valores foram observados nos meses de setembro e outubro compreendidos dentro da poca seca. Estes meses diferiram significativamente dos outros meses estudados. Os volumes de smen e de plasma seminal tiveram uma ampla variao entre os meses do ano, de forma que os maiores valores encontrados para ambos foram no ms de maro, ou seja, na poca chuvosa. J os menores valores encontrados para o volume de smen e de plasma seminal foram no ms de outubro que foi classificado na poca seca. O ms de outubro diferiu significativamente dos outros meses (P<0,05) para estes parmetros. Acreditase que na poca chuvosa as condies climticas possam ter sido mais favorveis, de forma que promoveram um maior equilbrio orgnico, com conseqente melhores valores seminais. No que se refere FLA2, observou-se variaes mensais em sua atividade (Tabela 2). Os resultados encontrados demonstraram que, em clima tropical, a atividade desta enzima encontrou-se em baixos nveis, pois variou de 5,25 (outubro) a 6,95 U/mL (maro). Contudo,

25 mesmo a maior atividade sendo encontrada no ms de maro, a poca de TS/C (6,91) foi a que apresentou a maior mdia de atividade desta enzima. Em clima temperado, onde h variao estacional no comportamento reprodutivo, esta atividade variou de 15 U/mL (junho) e a 60 U/mL (setembro), quando se utilizou a mesma metodologia para determinao da atividade enzimtica da FLA2 em caprinos (SIAS et al., 2005). Os resultados do experimento atual sugerem que, apesar de haver variao significativa entre as pocas e os meses do ano e at individual, a FLA2 pode no ser a principal responsvel pela diminuio da qualidade de conservao do smen encontrada em alguns animais em clima tropical. Vrios estudos tm demonstrado que a FLA2 presente no PS de caprinos exerce efeito deletrio sobre a viabilidade dos espermatozides conservados em meio base de leite desnatado ou contendo gema de ovo constituindo um problema especfico para conservao do smen caprino (LEBBOEUF et al., 2003; PELLICER-RUBIO et al., 1997). Para contornar os efeitos da FLA2 sobre a qualidade de congelao do smen caprino tem sido preconizado que o smen deve ser lavado, antes da conservao, para remover o PS, e consequentemente, a FLA2 (CORTEEL, 1974; CAMPOS et al., 2004). Outros estudos tm tentado desenvolver diluidores pobres em fosfolipdios, como a gua de coco, desse modo, contornado, tambm, os efeitos deletrios da FLA2 (SALLES, 1989; TONIOLLI, 1989; RODRIGUES et al., 1994; NUNES, 1998). Um estudo recente, conduzido pela mesma equipe e com os mesmos animais deste experimento, no encontrou diferenas significativas quanto atividade da FLA2 e as qualidades seminais (vigor e motilidade) entre animais de boa e m qualidade de conservao (MATOS-BRITO, 2007), ou com alta ou baixa atividade dessa enzima no PS (SILVA, 2009). Apesar disso, outros estudos tm mostrado que a remoo do PS antes da conservao melhorou a qualidade espermtica (CAMPOS et al., 2003). Os mesmos autores sugeriram um estudo para pesquisar se havia atividade da FLA2 no smen caprino em condies de clima tropical. Conforme exposto, estudos mais elaborados precisam ser conduzidos para identificar as reais causas da m qualidade de preservao do smen, visto que a FLA2 encontra-se em baixo nvel de atividade. Na Tabela 3 pode-se observar uma variao individual para atividade da FLA2, resultados semelhantes foram encontrados por Marques et al. (2000) em um experimento com bovinos. Em regies de clima temperado, h um significativo efeito individual do bode em relao ao efeito da FLA2 (CHEMINEAU et al., 1991). Foi constatada uma variao de 4,96 (animal 6 e 2) a 8,12 U/mL (animal 1), cuja diferena foi significativa. Acredita-se que em

26 animais sem padro racial definido (SPRD) e perfeitamente adaptados, a baixa atividade seja um atributo da adaptao ao meio, entretanto, sugere-se que a atividade da FLA2 seja determinada em animais no nativos e no adaptados de modo a verificar-se se h animais com maior atividade enzimtica mesmo em condies tropicais. Foi constatada diferena significativa (P<0,05) dos macroelementos entre os meses do ano. Neste estudo, o mineral em maior concentrao no plasma seminal foi o clcio, seguido pelo fsforo e depois pelo magnsio (tabela 2).
Tabela 2 Mdias e desvios-padro mensais dos parmetros bioqumicos do PS de caprinos SPRD criados no Estado do Cear.

Letras minsculas: diferenas entre os meses dentro no mesmo parmetro.

A maior concentrao absoluta de clcio foi observada no ms de outubro e a menor em novembro, este ltimo ms diferiu significativamente de todos os outros meses (P<0,05), voltando a aumentar a concentrao em dezembro; estas variaes foram observadas dentro da poca seca. A concentrao de clcio diferiu significativamente dentro da mesma poca do ano, entretanto, no h dados na literatura desta variao mensal em caprinos e nem mesmo em ovinos, para que a mesma possa ser comparada. Acredita-se que este seja o primeiro relato de variao de clcio entre meses to prximos (outubro e novembro). Todavia, PINHEIRO et al. (1996a) realizaram estudo comparativo entre as pocas seca e chuvosa, no encontrando diferena entre elas para este mineral, entretanto, no experimento atual foram encontradas as maiores concentraes de clcio nos meses chuvosos (poca chuvosa); esta caracterstica foi observada para todos os macroelementos estudados. Segundo Senger (2007) o clcio atua na ativao da atividade da adenosinatrifosfatase liberando um grupo fosfato da molcula de ATP, transformando-a em ADP, nos processos de mobilizao de energia nas clulas espermticas. Jaiswal & Conti (2003) afirmam que o clcio um regulador fisiolgico da adenilciclase, pois esta regulao pelo clcio abre a possibilidade de que as mudanas na permeabilidade inica da membrana do

27 espermatozide so acoplados s mudanas no AMPc com a ativao pela adenilciclase. Segundo os mesmos autores, os resultados indicam um papel importante de clcio na funo espermtica de mamferos na fertilizao. Wong et al. (2001) concluram que embora os ons clcio, magnsio, zinco e cobre desempenhem um papel essencial na espermatognese e fertilidade, a determinao desses elementos no sangue e plasma seminal no discriminou bases de fertilidade no homem. O fsforo atingiu a maior concentrao em maio e a menor em setembro, ou seja, em pocas diferentes. A menor concentrao observada em setembro diferiu dos outros meses do ano (P<0,05) a exceo de dezembro que tambm foi baixa. Tambm foi encontrada diferena significativa entre as pocas do ano (P<0,05) e os maiores nveis de fsforo foram observados na poca chuvosa, e os menores na poca seca. No foi observada diferena entre as pocas de transio (P>0,05). Estes resultados diferiram dos encontrados por Pinheiro et al. (1996a) que identificaram os maiores nveis de fsforo na poca seca (meses sem precipitao pluviomtrica). Esta diferena pode ser atribuda ao maior controle alimentar adotado no estudo atual, pois os animais foram manejados intensivamente, j no experimento de Pinheiro et al. (1996a) os animais foram manejados semi-intensivamente, de modo que dependiam da pastagem nativa para suprir parte de suas necessidades metablicas, porm na poca seca ela apresenta-se com baixo valor nutritivo. No tocante ao magnsio, a maior concentrao absoluta foi alcanada em junho e a menor em maro, ou seja, dentro da mesma poca (chuvosa). O resultado diferiu do encontrado por Pinheiro et al. (1996a), que observaram maiores nveis de magnsio no perodo seco. Pinheiro et al. (1996a) constataram que os nveis de clcio, fsforo e magnsio no PS caprino podem variar conforme a poca do ano (seca ou chuvosa) e a raa, sugerindo que a disponibilidade e qualidade do alimento entre os perodos chuvoso e seco provavelmente influenciam o equilbrio eletroltico do smen desta espcie. Esta situao no foi mesma no estudo atual, pois os animais foram manejados intensivamente, recebendo, portanto, alimentao controlada. Apesar do controle alimentar, observou-se variao dos macroelementos, Ca, P e Mg presentes na composio bioqumica do plasma seminal entre os meses do ano. Segundo Rodrigues (1997) o mtodo de coleta teve efeito significativo sobre a composio bioqumica do plasma seminal de caprinos e ovinos. Porm, tal fato foi observado quando os dois mtodos foram empregados no mesmo animal. Neste estudo, o

28 mtodo de coleta no foi considerado como fonte de variao, pois em todos os animais empregou-se a vagina artificial como mtodo de coleta. Segundo Abdel-Rahman et al. (2000) a discrepncia na composio inica (Na, K, Cl, Ca, P, Mg) do ejaculado entre diferentes raas de ovinos pode ser devida, em parte, a fatores de ordem ambiental, como, temperaturas elevadas e baixa umidade, fatores estes que tm influncia relevante nos estudos da qualidade seminal em carneiros, visto que os animais em questo receberam a mesma dieta durante o experimento.
Tabela 3 Variao individual mdia e desvio-padro da composio bioqumica do PS de caprinos SPRD.

Letras minsculas: comparao entre indivduos no mesmo parmetro.

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6. CONCLUSO

A fosfolipase A2 est presente no plasma seminal de caprino mesmo em condies tropicais, apresentando variao na atividade quanto poca, ms do ano e indivduo, todavia, apresentou uma baixa atividade. A concentrao dos minerais variou ao longo dos meses do ano no plasma seminal de caprinos, provavelmente devido influncia de elementos climticos tais como umidade e temperatura. Com base na composio mineral do plasma seminal sugere-se que a poca mais propcia para utilizao do smen caprino a chuvosa. Todavia, mais estudos so necessrios para identificar as causas primrias destas variaes. Os volumes de smen e de plasma seminal apresentaram variaes similares ao dos minerais sugerindo-se que os parmetros seminais so controlados por agentes comuns.

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