PRCTICA 2: OBTENCIN DE UN FROTIS SANGUNEO Y TINCIN DE GIEMSA

Materiales: Frotis Sanguneo: - 2 portaobjetos. - 1 cubreobjetos. - Gasas estriles. - Lanceta. - Alcohol metlico absoluto (libre de acetona). - Alcohol de 70 - (Guantes) Tincin de Giemsa: - Colorante de Giemsa. - Tampn PBS. - Pipeta Pasteur. - Cubeta. - Agua destilada. - Tubo de ensayo. Obtencin de un frotis sanguneo: 1. Obtencin de la muestra (sangre capilar). Con la lanceta realizar un pequeo corte en la yema del dedo ndice o corazn previamente desinfectado con alcohol de 70. 2. Desechar la primera gota. 3. Depositar una gota en el extremo de un portaobjetos y colocarlo encima de la mesa. 4. Proceder a tapar el dedo pinchado y desechar la lanceta en un contenedor de residuos. 5. Realizar la extensin de la muestra. Colocar el segundo portaobjetos por delante de la muestra (que se encuentra en el primer portaobjetos colocado encima de la mesa), con una inclinacin de 45 respecto al que contiene la muestra. Primero se proceder a un deslizamiento hacia el extremo donde se encuentra la gota de sangre. De esta forma se consigue que por capilaridad, la sangre ocupe toda el borde del segundo portaobjetos. Seguidamente se proceder a la extensin en sentido contrario de forma rpida y uniforme. 6. Dejar secar al aire. 7. Etiquetar el portaobjetos. Si el frotis est bien realizado deberemos observar tres partes: la cabeza, el cuerpo y la cola (forma de pluma). Es en el cuerpo realizaremos la observacin y el estudio.

FROTIS DE SANGRE

I) Material -Portaobjetos -Alcohol metlico -Colorante (Giemsa) -Microscopio -Aceite de cedro

II) Mtodo y algunas experiencias sobre el desarrollo de la prctica Se coloca una gota de sangre cerca de uno de los extremos del portaobjetos. Se pone en contacto con la gota uno de los bordes menores de otro portaobjetos y se deja que la sangre se extienda por capilaridad a lo largo de la arista (ver fig.). Entonces se desliza suavemente el portaobjetos hacia el otro extremo, de manera que la sangre se extienda uniformemente. Es conveniente hacer varias extensiones y escoger la mejor. Una vez hecha la extensin, se deja secar (unos 10 min.)

-Fijacin de los frotis. Cuando se emplean colorantes hematolgicos habituales, la fijacin se produce durante la aplicacin del colorante concentrado, ya que estos colorantes llevan alcohol metlico absoluto como disolvente. Cuando se prefiere trabajar con un colorante acuoso diluido, los frotis secados al aire deben ser fijados con

alcohol metlico absoluto. -Coloracin de los frotis. Los colorantes cidos se unen a los componentes bsicos de las clulas (citoplasma). Los colorantes bsicos son atrados por los componentes cidos de la clula (ncleo). Existen varios tipos de coloracin: la de Wright, la de May-Grnwald-Giemsa, la de Giemsa, el mtodo panptico rpido, etc. En este caso se utilizar el colorante Giemsa, que est constituido por distintos compuestos de azur, eosina y azul de metileno. El protocolo de la prctica quedara como sigue: 1. Hacer la extensin de sangre en el porta (tal y como hemos dicho antes, conviene hacer varias por si alguna sale mal: es mejor pasarse en la extensin, pues cuando se quedan los glbulos apelmazados resulta imposible reconocer leucocitos). 2. Dejar secar (unos 10 min.) 3. May Grunwald durante 2 min. 4. Se echa agua del grifo, suavemente, encima del colorante durante 15 min. 5. Giemsa diluida en agua corriente: unas 15 gotas de Giemsa por cada 10 ml de agua (dejar durante 15-20 min.) 6. Lavar con un chorro suave de agua . 7. Deshidratar en acetona. 8. Acetona-xilol a partes iguales. 9. Xilol. 10. Montar. Algunos de estos pasos se pueden recortar, para hacer ms breve la preparacin. La experiencia dice que conviene hacer varios frotis antes de realizar la prctica con los alumnos y guardar alguno (1 2) en los que se vean y distingan bien los leucocitos. Si no sera la primera vez que esto sucede- nos salen mal todos los frotis el da de la prctica, siempre podrn observan los alumnos cmo se ven los distintos tipos de leucocitos en el frotis que hemos guardado de una prctica anterior.

III) Descripcin de los componentes formes (celulares o de origen celular) de la sangre: Hemates Los hemates, glbulos rojos o eritrocitos carecen de ncleo. Tienen forma esfrica, con un dimetro globular de 7-8 micras; vistos de perfil, tienen forma de lente bicncava. El nmero de hemates por mm de sangre es de 4,5-5 millones en el hombre y de 4-4,5 millones en la mujer. Contienen un pigmento rojo llamado hemoglobina. La funcin que realizan estas clulas es el transporte de gases por el sistema circulatorio. La vida media de los hemates es de aproximadamente 120 das. Morfologa y funciones de los leucocitos Los leucocitos o glbulos blancos son verdaderas clulas nucleadas de la sangre. Estn encargadas de proteger al organismo frente a los agentes nocivos propios o provenientes del exterior. Su nmero normal es de 6.000 a 9.000 leucocitos por mm de

sangre. Se diferencian stos en granulocitos (neutrfilos, eosinfilos, basfilos), linfocitos y monocitos. La frmula leucocitaria normal, que expresa la cantidad porcentual de los mismos, queda expresada en el hemograma de Schilling:
mielocitos metamielocitos neutrfilos (cayados) neutrfilos (polinucleares) eosinfilos basfilos Linfocitos Monocitos Clulas plasmticas 0 0-05% 3-5% 45-62% 1-3% 0-1% 25-35% 3-8% 0-05%

Granulocitos

Agranulocitos

-Neutrfilos En circunstancias normales son los leucocitos ms abundantes de la sangre. Su tamao es mediano (9-14 micras, aproximadamente el doble que un eritrocito). El ncleo, que se tie fuertemente con un colorante bsico, posee varios lbulos unidos entre s mediante filamentos delgados. Por esta razn reciben tambin el nombre de neutrfilos segmentados. En casos patolgicos pueden aparecer en sangre algunas formas inmaduras: es relativamente frecuente encontrar el estadio inmediatamente anterior, llamado neutrfilo en banda o en cayado por la forma del ncleo, que se encuentra an sin segmentar. Las granulaciones del citoplasma son en todos los casos de color rojo violeta. Los neutrfilos son muy importantes en casos de inflamacin aguda, ya que se responsabilizan de la fagocitosis; por tanto, en esas situaciones aumenta el nmero de neutrfilos y se observa la denominada desviacin a la izquierda, que es la aparicin en el torrente circulatorio de un gran porcentaje de clulas inmaduras. -Eosinfilos Su tamao es un poco mayor que el de los neutrfilos (10-15 micras). Tienen forma redondeada y su citoplasma se encuentra cubierto enteramente por una granulacin gruesa de color naranja o marrn anaranjado, dependiendo del tipo de tincin. El ncleo posee dos lbulos (en raras ocasiones, tres). Los eosinfilos tienen tambin una funcin fagoctica: actan en reacciones anafilcticas y en casos de infecciones parasitarias. -Basfilos Son los leucocitos ms raros de la sangre. Su tamao es pequeo (812 micras). El ncleo puede aparecer segmentado o con forma irregular y se tie menos que el de los neutrfilos. El citoplasma tiene granos gruesos que se tien intensamente de un color prpura casi negro. La funcin de estas clulas no est del todo clara; parece ser que intervienen en procesos alrgicos y en situaciones de alarma como los eosinfilos. -Linfocitos

Son los leucocitos ms abundantes despus de los neutrfilos. Su tamao es pequeo, similar al de un eritrocito (6-10 micras). El ncleo es de forma redondeada, con cromatina muy densa que se tie intensamente de azul oscuro. El citoplasma, que se tie de azul celeste, es pequeo y forma una especie de aureola alrededor del ncleo. Las formas jvenes son ms grandes. Existen dos clases de linfocitos, T y B, si bien no pueden ser reconocidos al microscopio ptico. Su funcin es inmunitaria: los linfocitos B originan los anticuerpos especficos, y los linfocitos T actan en la inmunidad celular. Lgicamente, el nmero de linfocitos circulantes se ver muy aumentado en caso de infecciones generalizadas prolongadas. -Monocitos Son las clulas mayores de la sangre (12-20 micras). El ncleo puede ser ovoide o en forma de rin o herradura gruesa. La cromatina de los ncleos no se tie tanto como la de los linfocitos. El citoplasma es de color grisceo o ligeramente rosado. A veces puede tener granulaciones finas. Su funcin es similar a la de los neutrfilos. Debido a la misma y a su gran tamao reciben tambin el nombre de macrfagos. Plaquetas Los trombocitos o plaquetas son las clulas ms pequeas de la sangre. Se hallan en nmero normal de 150.000 a 300.000 por mm de sangre. Intervienen activamente en los procesos de homeostasia y coagulacin.

Fuente de la imagen: http://html.rincondelvago.com/000759832.png

Tincin de Giemsa: 1. Fijar el frotis con alcohol metlico absoluto durante 3 minutos. 2. Preparar en un tubo de ensayo una solucin con una proporcin de 1:9 con Giemsa y tampn PBS (1ml Giemsa y 9 ml PBS). 3. Sumergir la muestra de forma vertical en la solucin preparada durante 10 minutos. 4. Lavar el portaobjetos con agua destilada. 5. Dejar secar. 6. Aplicar el cubreobjetos sobre la preparacin. 7. Listo para su observacin en el microscopio. La tincin de Giemsa es un mtodo habitual para el examen de frotis sanguneos, cortes histolgicos y otro tipo de muestras biolgicas. Es muy til para la identificacin de riketsias (plasmodium), protozoos

La tcnica de Giemsa est formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte bsico y la eosina como tinte cido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromtico, de ah que muchas estructuras se tian de prpura y no de azul. El pH de la solucin de coloracin es crtico, entre 6.4 y 6.9 por lo que se debe ajustar idealmente segn diversos fijadores. Cmo vemos las clulas con esta tincin? 1. Citoplasma: rosa 2. Ncleos: azul 3. Eritrocitos: rojo 4. Grnulos de las clulas cebadas: violeta 5. Bacterias: azul 6. Parsitos: azul

PRCTICA 2: Obtencin de un frotis sanguneo:

Objetivos de la prctica:
-Conocer las propiedades de las diferentes tinciones usadas para realizar el frotis sanguneo. -Familiarizarse con el material de laboratorio y aprender su manipulacin para luego poder realizar correctamente los diferentes pasos para un frotis sanguneo. -Realizar un frotis sanguneo con sangre del alumno, etiquetarlo y guardarlo para analizarlo ms adelante.

Materiales:
-Dos portaobjetos. -Un cubreobjetos. -Lanceta para puncin digital. -Torundas de algodn. -Guantes y bata. -Una cubeta forrada en aluminio para mantener el portaobjetos con el que trabajamos. -Microscopio de laboratorio. -Alcohol 70o. -Tincin con colorante Giemsa (formado por una mezcla de eosina, azul metileno y azures en solucin acuosa). -Alcohol metlico absoluto (sin acetona) -Tampn de PBS -Agua destilada

Causas de error en la tincin del frotis sanguneo:

-Coloracin excesivamente azul: Frotis muy grueso, lavado insuficiente, Tincin muy prolongada, colorante demasiado alcalino. -Coloracin muy rosada: El agua del lavado, el colorante o el tampn demasiado cidos. -Aparicin de artefactos debido a suciedad, deterioro o presencia de grasa en portaobjetos. -Hidratacin de los hemates: Fijacin inadecuada por uso de alcohol metlico no absoluto.

Metodologa:
1. Preparamos el material que vamos a utilizar y nos colocamos los guantes. 2. Procedemos a desinfectar el dedo del cual extraeremos el frotis sanguneo (por lo general el dedo ndice o el anular). 3. Pinchamos con lanceta en el pulpejo del dedo, sobre la zona anterior o lateral. Una vez hecho, apretamos el dedo para bombear sangre haca afuera. Una vez se haya formado una gota la acercamos al portaobjetos poco a poco hasta que pase a ste. 4. Limpiaremos el dedo y pondremos una tirita, tiraremos las lancetas y torundas utilizadas al contenedor de residuos biolgicos. 5. Realizamos la extensin del frotis sanguneo:

Tras realizar la extensin, se obtienen tres partes de la muestra: - Cabeza (con demasiados eritrocitos). - Cuerpo (zona ptima para la observacin, existe un reparto equilibrado de clulas). - Cola (eritrocitos en escaso nmero). 6. Tras dejar secar el frotis durante un par de minutos, aplicaremos el metanol sobre la muestra que actuar como fijador, lo dejamos reposar durante tres minutos 7. Teimos la muestra con el colorante Giemsa (diluido con PBS en proporcin 1G:9PBS). Las partes cidas de la muestra (como por ejemplo el DNA del ncleo) se teirn de un color azulado mientras que las bsicas se teirn de un color rosado. 8. Limpiamos la muestra con agua destilada para sacar el colorante tras haberlo dejado sobre la muestra unos diez minutos. 9. Aplicamos el cubreobjetos sobre el cuerpo del frotis, ya est listo para la visualizacin en el microscopio.