UNIVERSIDAD CATLICA SANTO TORIBIO DE MOGROVEJO ESCUELA DE MEDICINA

ROL DE LA BIOLOGA MOLECULAR EN INFECTOLOGA

Blgo. Jos Llontop Nez, MSc

CONCEPTOS BSICOS
Infeccin
Virus o bacterias, invaden un organismo donde se reproducen; provocando sntomas, manifiestados por la reaccin del organismo frente a dichos grmenes. Estudia, diagnostica y trata las enfermedades originadas por distintos agentes infecciosos, tales como los virus, las bacterias, los parsitos, los hongos y otras varias.

Infectologa

Enfermedad Infecciosa

Conjunto de manifestaciones clnicas derivadas de un contagio y producidas por un microorganismo.

Causas de las Enfermedades Infecciosas

Multicausalidad: etiolgico, biolgico, ambiental, social, cultural, econmica, etc.

Estudio de las Enfermedades Infecciosas

Epidemiologa: Estudio de la relacin causa-efecto entre la exposicin y la enfermedad

CONCEPTOS BSICOS
Biologa Molecular
Estudia el comportamiento biolgico de las molculas que componen las clulas vivas con la finalidad de comprender todos los procesos celulares que hacen posible que la informacin gentica se transmita eficientemente entre los seres vivos. La Biologa Molecular en el Tratamiento de las Enfermedades Infecciosas Basado en la identificacin de grmenes patgenos con muestras directas usando PCR o sus variantes. Disminuye tiempos de obtencin de resultados contribuyendo al diagnstico temprano y a tratamientos especficos. Sensibilidad= 98 % Especificidad= 99 % Tiempo= 24/48 horas
Todas las tcnicas y procedimientos deben cumplir con todos los criterios de control de calidad y con la adecuada sensibilidad y especificidad para usarse en la prctica clnica de enfermedades infecciosas.

IMPORTANCIA y APLICACIONES
Deteccin Molecular de Virus, Bacterias, Hongos y Parsitos. Monitoreo de la Enfermedad y respuesta al tratamiento. Deteccin Molecular de Genes de resistencia.

Genotipificacin de patgenos.
Epidemiologa Molecular.

Susceptibilidad Gentica de enfermar por agente infeccioso.

APLICACIONES DE TEST BASADOS EN ACIDOS NUCLEICOS

PATOGENOS NO PUEDEN SER CULTIVADOS in vitro Virus Papiloma Humano Virus Hepatitis B PATOGENOS DE LENTO CRECIMIENTO O FASTIDIOSOS Mycobacterium tuberculosis Legionella pneumophilia PATOGENOS QUE SON ALTAMENTE PELIGROSOS DE CULTIVAR Francisella tularensis Brucella species Ebola, Coccidioidis immitis DETECCION IN SITU DEL PATOGENO Helicobacter pylori Toxoplasma gondii

APLICACIONES DE TEST BASADOS EN ACIDOS NUCLEICOS

PATGENOS PRESENTE EN BAJO NUMERO VIH en pacientes anticuerpos negativos CMV en rganos transplantados PATGENOS PRESENTES EN MUESTRAS DE PEQUEO VOLUMEN Fluido Intra-ocular Muestras forenses DIFERENCIACIN DE PATOGENOS ANTIGNICAMENTE SIMILARES Genotipos de virus asociados con cancer humano (Papilloma virus) SUSCEPTIBILIDAD DE DROGAS ANTIVIRALES Infecciones de HIV (carga viral) EPIDEMIOLOGA MOLECULAR Deteccion de brotes epidemicos

VENTAJAS DE USAR UN TEST MOLECULAR Alta sensibilidad

Puede tericamente detectar la presencia de un organismo

Alta especificidad

Puede detectar genotipos especficos Puede determinar resistencia a drogas Puede determinar virulencia

Rapidez

Mas rpido que cultivar in vitro a ciertos organismos

LIMITANTES DE USAR UN TEST MOLECULAR

Altos costos Es tan especifico que debe disponerse de los datos clnicos para apoyar la infeccin por tal organismo antes que el test sea iniciado Podra perderse la deteccin de nuevos organismos Podra ser un problema con cultivos mixtos tendria que ensayarse para todos los organismos que causan la infeccion Demasiado sensible?

MICROSCOPIO

Simple Deteccion directa del patogeno Diferencia morfologicamente a los organismos

Lento, laborioso y tedioso Baja sensibilidad No puede discriminar entre organismos similares Lento y costoso Diferentes cepas muestra un rango de respuestas No siempre especifico No distingue entre infecciones latentes y activas

CULTIVO

Detecta parasitos viables

SEROLOGIA

Simple y rapido Automatico Un gran numero de muestras

MOLECULAR

Rapido, sensible y especifico Detecta parasito directamente Puede distinguir entre especies Independiente de infecciones previas

Costoso y multi-etapas No distingue entre organismos vivos y muertos Posibles falsos positivos y falsos negativos

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
DIAGNSTICO MOLECULAR DIAGNSTICO PRECOZ DE BROTES EPIDMICOS INFECCIONES MIXTAS TIPIFICACIN MOLECULAR

ORIGEN Y DINAMICA DE TRANSMISION DE PATOGENOS

RESISTENCIA A DROGAS IDENTIFICACION DE CEPAS VIRULENTAS MONITOREO DE PROGRAMAS DE VACUNACION

DIAGNOSTICO MOLECULAR

DIAGNOSTICO MOLECULAR

IDENTIFICACION MOLECULAR DE ESPECIES

RECONOCIMIENTO DE CEPAS VIRULENTAS

IDENTIFICACION DE INFECCIONES MIXTAS

DIAGNOSTICO MOLECULAR
DIAGNOSTICO TEMPRANO ESCASA MUESTRA:
BIOPSIA ESPECIMEN: SANGRE CULTIVOS IN VITRO ADN Y ARN

INFECCIONES MIXTAS ESPECIFICIDAD

COSTOS
NO PARA RUTINA

PCR para Mycobacterium tuberculosis

Lnea 1:Peso Molecular

Lnea 2: M. tuberculosis

Lnea 3: M. bovis

Lnea 4: M. avium

Lnea 5: M. intracellulare Lnea 6: M. scrofulaceum Lnea 7: M. kansasii

Lnea 8: M. xenopi Lnea 9: M. szulgai Lnea 10: M. chelonae Lnea 11: M. fortuitum Lnea 12: M. marinum

PARTIR DE ESPUTO DE PACIENTES

Mycobacterium tuberculosis A

5 6

BK NEGATIVO
CULTIVO POSITIVO

P N
581 pb

GEN IS6110

DIAGNOSTICO PRECOZ EN BROTES EPIDEMICOS

DESDE EL PRIMER DIA DE LAS MANIFESTACIONES CLINICAS: VIRUS DENGUE

F A bp
D E N G U E

2072 1500 600 500 400

511

INTERPRETACION CORRECTA DE RESULTADOS

INFECCIONES MIXTAS

INFECCIONES MIXTAS

1 2 3 4 5

: P. falciparum : P. vivax & P. falciparum

: Control Negativo : Control Negativo

: P. vivax

Lane S: ladder). Lane 1: Lane 2: Lane 3: Lane 4:

Marcador de Peso molecular (50-bp

P. vivax (size: 120 bp) r P. malariae (size: 144 bp) P. falciparum (size: 205 bp) P. ovale (size: 800 bp)

DETECCIN MOLECULAR DE GENES DE RESISTENCIA

DETECCIN SIMULTNEA DE RESISTENCIA A RIF, INH y EMB DE Mycobacterium tuberculosis

CEPAS CONTROL SENSIBLE Y RESISTENTE

TIPIFICACION MOLECULAR

GENOTIPIFICACIN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO

Deteccin de Genotipos 16, 18, 33, 31, 58, 11 y 6 1 2 3 4

3 2 1 4

IDENTIFICACION DE LOS CUATRO TIPOS DEL VIRUS DENGUE

D3 D2 D4 D1 D4 D2 D1 D1 D2 D1

D2 D1 D2 D1 D2 D1

D1 D2

D2 D1 D3

482
D1 D3 D1

D1

D1 D2 D2 D1 CASOS AUTOCTONOS D3 CASOS IMPORTADOS D3

D 4 D3
D2

392 290

119

D1 D2 D3 D4

SEROTIPO SEROTIPO SEROTIPO SEROTIPO

1 2 3 4

PCR: GEN M DE LA MEMBRANA

SEIS VARIANTES GENETICAS DE Sporothrix schenckii CIRCULANTES EN ABANCAY

II

III

IV

IV

PCR/ FINGERPRINTING

DINAMICA DE TRANSMISION

TRES HERMANOS INFECTADOS CON M. tuberculosis

Kb 23,13 9,42 6,56 4,36

2,32 2,03

SECUENCIA DE INSERCION IS6110

TRANSMISION INTRAHOSPITALARIA

TIPIFICACIN MOLECULAR DE AISLAMIENTOS PERUANOS DE Mycobacterium tuberculosis

CLUSTER 1 CLUSTER 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1: MARCADOR DE PESO MOLECULAR

2-3: CEPA REFERENCIAL DE MYCOBACTERIUM

TUBERCULOSIS

14 323

4-12: PACIENTES COINFECCIN TBC-HIV DE

HOSPITAL
5, 6 ,7, 8 & 9: CLUSTER 1 11 & 12: CLUSTER 2

13 Y 14 CEPAS LIMA ESTE 1998

SECUENCIA DE INSERCION IS6110

ORIGEN & EXPANSION DE VARIANTES GENETICAS

ARBOL FILOGENETICO DE LOS AISLAMIENTOS DEL VIRUS DENGUE 2

MALASIA M3

PERU-00
BRASIL-90 TAILANDIA-80a JAMAICA-83 SRI LANKA-69 NUEVA GUINEA-44 SRI LANKA-68 TAILANDIA-64 TAILANDIA-80c TAILANDIA-80d TAILANDIA-80b MALASIA M1 MALASIA M2 FILIPINAS-83 TAIWAN-87 INDONESIA-76 BURKINA FASO-83 SOMALIA-84 SRI LANKA-82 SRI LANKA-90a SEYCHELLES-77a SEYCHELLES-77b SRI LANKA-85b SRI LANKA-85a SRI LANKA-89 SRI LANKA-90b TRINIDAD-53 INDIA-57

PERU-96
TONGA-74 PUERTO RICO-69 PUERTO RICO S1

0.01

VIRUS DE LA FIEBRE AMARILLA

NIGERIA - 86 NIGERIA - 91

1.00 SUBSTITUCIONES POR 100 RESIDUOS

SENEGAL - 65 KENYA1 - 93 KENYA2 - 93 UGANDA - 64 SUDN - 40 AFRICA - 85 AFRICA - 77 ETIOPA-61 TRINIDAD2-79 BRASIL-79 COLOMBIA-79 PER-77 AYACUCHO-81 ECUADOR-81 CUSCO-98 JUNN 95 PASCO 95 AYACUCHO 78 SAN MARTN 99

CEPAS AFRICANAS GRUPO I

CEPAS AMERICANAS GRUPO II

SECUENCIAS DE ADN REPORTADAS AL GENBANK

GenBank/EMBL/DBJ AF-097020: GenBank/EMBL/DBJ AF-093674: GenBank/EMBL/DBJ AF-044682: GenBank/EMBL/DBJ AF-045249: GenBank/EMBL/DBJ AF-045020: GenBank/EMBL/DBJ AF-120271:

Glicoprotena NS1 del virus Dengue 1 Glicoprotena E del virus Dengue 2 Histona H3 de L. (V) braziliensis Protena Acdica Ribosomal de tipo P1 de L. (V) peruviana Protena Acdica Ribosomal de tipo

P2-B de L. (V) braziliensis

Citocromo oxidasa sub-unidad 1

SUSCEPTIBILIDAD GENTICA DE ENFERMAR POR AGENTE INFECCIOSO

MCP-1 y TUBERCULOSIS

Perseverancia El que

arriesga gana mucho

GRACIAS