III - TESTES PARA A IDENTIFICAO DE AMINOCIDOS E PROTENAS

INTRODUO Os -aminocidos fundamentais utilizados pelas clulas para a biosntese das protenas apresentam caractersticas estruturais diferentes. Em parte so essas diferenas que permitem que as protenas desempenhem papis muito variados nos seres vivos. Todos os -aminocidos fundamentais contm na sua estrutura um grupo funcional amino e um grupo funcional cido carboxlico ligados a um mesmo tomo de carbono, conhecido por carbono . Esses grupos funcionais deixam de existir nesta forma quando os aminocidos so ligados uns aos outros para originarem a molcula de uma protena (ficando apenas um grupo amino na extremidade inicial da cadeia polipeptdica e um grupo cido carboxlico na extremidade final). De facto so substitudos pelos grupos peptdicos, que resultam do estabelecimento das ligaes entre os resduos dos aminocidos, ou seja, entre o que resta dos aminocidos na estrutura da protena.

Frmula geral de um aminocido

Ligao peptdica

Exemplo de um tripeptdeo (AlaAlaAla), em que L = -CH3

Os resduos dos -aminocidos diferem uns dos outros apenas na sua cadeia lateral (L), tambm ligada ao carbono . As diferenas de estrutura dessa cadeia lateral resultam em diferenas de certas propriedades fsico-qumicas, que podem ser testadas de uma forma simples. Como exemplos, podem referir-se os seguintes: (i) a solubilidade em gua est relacionada com a hidrofilicidade e a capacidade de estabelecimento de ligaes de hidrognio; (ii) a deslocalizao electrnica, como a que se verifica nos anis aromticos da tirosina e do triptofano, conduzem existncia de um mximo de absoro da radiao electromagntica na regio do ultravioleta prximo (mx ~ 280 nm) para estes aminocidos e para as protenas que os contm; (iii) os grupos funcionais de natureza distinta que existem nas cadeias laterais (por exemplo, grupo tiol na cistena ou grupo indole no triptofano) permitem a sua identificao por meio de reaces caractersticas que conduzam ao aparecimento de precipitados ou de produtos corados. OBJECTIVO DO TRABALHO O trabalho consiste na realizao de um conjunto de testes simples de natureza variada, que exploram as diferenas existentes entre as caractersticas estruturais dos aminocidos, das protenas e de outras substncias. Alguns destes testes tm aplicao na determinao quantitativa de protenas em soluo aquosa. Para concretizar o trabalho ser feita a identificao de um conjunto de substncias slidas que so apresentadas em tubos rotulados com as letras A, B, C, D, E, F, G, H, I e J e que correspondem aos seguintes compostos biolgicos, no necessariamente pela ordem indicada: glucose, glicina, cistena, cido asprtico, lisina, arginina, tirosina, triptofano, prolina e albumina srica.

REAGENTES Reagente para o teste do biureto (dissoluo de 1,5 g de CuSO45H2O + 6 g de NaKC4H4O64H2O tartarato duplo de sdio e potssio, sal de Rochelle em cerca de 500 mL de gua, adio com agitao de 300 mL de soluo de NaOH a 10% (p/v) e diluio a 1 L com gua destilada); Reagente de Coomassie (dissoluo de 0,1 g de Azul Brilhante de Coomassie G250 em 47,0 g de etanol, adio de 85,0 g de cido fosfrico e diluio a 1 L com gua destilada); Soluo de ninidrina a 2 % (p/v) em etanol a 95 % (v/v); cido ntrico concentrado; Reagente de Millon (dissoluo de 15 g de sulfato de mercrio (II) em 100 mL de cido sulfrico a 15 % (v/v)); Soluo aquosa de nitrito de sdio a 1 % (p/v) Reagente de Hopkin-Cole (colocao de 10 g de Mg em p num Erlenmeyer, adio de gua at cobrir o metal, adio com agitao de 250 mL de soluo aquosa saturada de cido oxlico, filtrao, acidificao com cido actico diludo e diluio a 1 L com gua destilada); cido sulfrico concentrado; Soluo aquosa de acetato de chumbo 2 M; Soluo aquosa de hidrxido de sdio a 40 % (p/v); Soluo de -naftol a 1 % (p/v) em etanol; gua de bromo. tubos de ensaio 16 160 mm banho de gua-gelo buretas e pipetas de diversos volumes medidor de pH e elctrodos

MATERIAL tubos de ensaio 18 180 mm banho de gua a 100 C cronmetro espectrofotmetro UV-Vis

TCNICA (resumo) 1) Escrever na folha de resultados as frmulas qumicas estruturais para os aminocidos glicina, cistena, cido asprtico, lisina, arginina, tirosina, triptofano e prolina (para a forma predominante em soluo aquosa a pH 7), 2) Realizar os ensaios descritos a seguir para as amostras A, B, , J. Logo que identificar inequivocamente uma amostra, no realizar mais ensaios para essa amostra, 3) Preencher uma tabela com os resultados dos ensaios, 4) Concluir sobre a identidade de cada uma das amostras A, B, , J. ENSAIOS Observao prvia Alguns dos ensaios que envolvem adio de cidos ou bases fortes, ou aquecimentos em banho de gua tm riscos de projeco de lquidos que podem provocar queimaduras graves. Deve ter cuidados adicionais na realizao desses ensaios (normalmente so feitos nas hotes), usar sempre culos de proteco e confirmar que algum prximo no corre tambm o risco de sofrer as consequncias de um acidente. 2

I Solubilidade em gua 1) Cada uma das amostras A, B,, J apresentada num tubo contendo cerca de 10 mg da substncia slida. 2) Transferir o contedo de cada tubo para um tubo de ensaio 18 180 mm (seco), previamente marcado com a letra correspondente amostra e adicionar 15 mL de gua destilada. 3) Tentar dissolver o slido agitando suavemente. 4) Tomar nota do resultado de cada tentativa: dissoluo rpida (+), dissoluo mais difcil () ou impossibilidade de dissoluo (0). 5) Pipetar 0,5 mL de cada soluo para cada um de dez tubos de ensaio 16 x 160 mm marcados com a letra correspondente amostra e adicionar a cada um deles 9,5 mL de gua destilada. Homogeneizar cada soluo por agitao. Estas novas solues, obtidas por diluio 1:20 a partir das solues anteriores, sero designadas por solues diludas na descrio dos ensaios que se segue. II pH da soluo aquosa As cadeias laterais de alguns aminocidos possuem grupos funcionais com caractersticas cidas (por exemplo, cidos asprtico e glutmico), isto , tm tendncia para doar protes a molculas de gua em soluo aquosa; para outros aminocidos (por exemplo, lisina e arginina) os grupos funcionais das cadeias laterais comportam-se como bases, isto , captam protes fazendo com que o pH da soluo seja superior ao da gua. 1) Medir o pH de cada uma das solues preparadas em I 2). Lavar o elctrodo depois de cada medida; 2) Tomar nota do valor de pH medido para cada soluo. III Absoro da radiao electromagntica a 280 nm O espectro de absoro da radiao electromagntica para a tirosina, o triptofano e, de uma forma geral as protenas (que contm estes aminocidos) apresenta um mximo ao comprimento de onda de ~ 280 nm. 1) Ler a absorvncia da soluo amostra diluda ao comprimento de onda de 280 nm. 2) Tomar nota do valor de absorvncia lido. IV Teste do biureto As solues aquosas de compostos contendo duas ou mais ligaes peptdicas (por exemplo, protenas) do origem ao aparecimento de uma cor violeta caracterstica quando tratadas com uma soluo diluda de sulfato de cobre em meio alcalino. O nome do teste vem do composto biureto que d uma reaco tipicamente positiva. A cor devida formao de um complexo em que o io cobre se coordena a quatro tomos de azoto das ligaes peptdicas. O mtodo do biureto, um dos que se usam para a determinao quantitativa de protenas (para concentraes finais de protena entre 0,1 e 2 gL1), tem como base o desenvolvimento de uma cor violeta em soluo aquosa resultante da reaco da protena com o reagente mencionado. 1) Colocar 1 mL da soluo amostra num tubo de ensaio, adicionar 1 mL do reagente para o teste do biureto e misturar bem.

2) Observar o eventual aparecimento de uma cor distinta da cor do reagente. 3) Caso no observe mudana, junte mais 1 mL do reagente para o teste do biureto e voltar a misturar bem a soluo e a observar a cor. POSITIVO: Cor violeta.

H2NCNHCNH2 O O Biureto

| OC \ N(H) / CH | Cu2+ OC \ N(H) / CH |

| CO / N(H) \ CH | CO / N(H) \ CH |

V Teste de Bradford A existncia de substncias corantes que mudam de cor por ligao a determinados tipos de compostos em soluo aquosa permite, em certos casos, a sua deteco e at mesmo a sua quantificao. O Azul Brilhante de Coomassie G-250 um destes corantes; a sua ligao a uma protena em meio cido conduz a uma variao no comprimento de onda do mximo de absoro do corante de 465 nm para 595 nm com o consequente aparecimento de um tom azulado na soluo avermelhada. O mtodo de Bradford muito utilizado para a determinao quantitativa de protenas em soluo aquosa numa gama de concentraes cerca de cem vezes mais baixas do que o mtodo do biureto. 1) Colocar num tubo de ensaio 2 mL de reagente de Coomassie. 2) Adicionar 50 L da soluo amostra diluda ao tubo de ensaio que contiver o reagente de Coomassie e agitar suavemente. 3) Observar a eventual mudana de cor da soluo. POSITIVO: Aparecimento de uma tonalidade azulada. VI Teste da ninidrina O teste da ninidrina um teste geral para aminocidos, podendo ser usado de uma forma qualitativa, em geral para detectar a presena de aminocidos em meios de suporte para cromatografia ou electroforese (ver Electroforese de Aminocidos), ou de uma forma quantitativa (por exemplo, para dosear aminocidos aps separao cromatogrfica de hidrolisados proteicos, na determinao da composio em aminocidos de protenas). A reaco dos aminocidos com a ninidrina origina um composto de cor azulada para todos eles com excepo da prolina, que d origem a um composto de cor amarela. Colocar 2 mL da soluo amostra num tubo de ensaio. Adicionar 1 mL da soluo de ninidrina e agitar suavemente. 4

No caso de no verificar a formao de um composto corado, aquecer fervura num banho de gua durante 10 segundos (cuidado). Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor azulada para aminocidos em geral; cor amarela para prolina. VII Reaco xantoproteica um teste para a tirosina e triptofano, ou protenas que contenham estes aminocidos baseado na reaco de nitrao dos anis aromticos pelo cido ntrico concentrado. Colocar 2 mL da soluo amostra num tubo de ensaio. Adicionar cuidadosamente 1 mL de cido ntrico concentrado. No caso de no verificar a formao de um composto corado, aquecer fervura num banho de gua durante 2 minutos. Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor amarelada. VIII Teste de Millon um teste para compostos contendo monohidroxibenzeno (ou seja, com grupos fenlicos, como o caso da tirosina). Colocar 1 mL da soluo amostra num tubo de ensaio. Adicionar 5 gotas do reagente de Millon e agitar com cuidado. Aquecer fervura num banho de gua durante 10 minutos (cuidado!). Arrefecer o tubo em gua corrente e adicionar 5 gotas da soluo de nitrito de sdio. Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor avermelhada. IX Teste de Hopkin-Cole um teste para compostos contendo o grupo indole (ex. triptofano), em que o reagente o cido glioxlico (CHOCOOH) em cido sulfrico concentrado. Colocar 3 mL da soluo amostra num tubo de ensaio. Adicionar 1 mL do reagente de Hopkin-Cole e agitar (ateno, o reagente contm H2SO4 bastante concentrado). Adicionar cuidadosamente e lentamente uma pequena quantidade de cido sulfrico concentrado, deixando-o escorrer pela parede interna do tubo (que dever estar inclinado a 45), de modo que se formem duas fases. Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor na zona de juno dos dois lquidos. POSITIVO: Anel azulado. X Teste de Sakaguchi um teste para compostos contendo o grupo guanidilo (arginina). Colocar 3 mL da soluo amostra num tubo de ensaio. Adicionar 1 mL da soluo de hidrxido a 40 % (p/v) e agitar com cuidado.

Adicionar 2 gotas da soluo de -naftol e agitar com cuidado. Adicionar 5 gotas de gua de bromo (na hote, o bromo txico). Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor vermelha.

XI Teste do sulfureto de chumbo um teste para aminocidos sulfurados (cistena) ou protenas que os contenham. Colocar 2 mL da soluo amostra num tubo de ensaio. Adicionar 2 mL da soluo de hidrxido de sdio a 40 % (p/v) e agitar com cuidado. Ferver em banho de gua durante 2 minutos (cuidado com as projeces). Arrefecer o tubo em gua corrente e depois num banho de gua e gelo. Adicionar 2 gotas da soluo de acetato de chumbo e agitar com cuidado. Tomar nota do eventual aparecimento de um precipitado tnue. POSITIVO: Cor acastanhada ou precipidato castanho tnue. BIBLIOGRAFIA R.L.. Shriner, R.C. Fuson, D.Y. Curtin, T.C. Morrill, The Systematic Identification of Organic Compounds A Laboratory Manual, 6 ed. (ou outra) John Wiley & Sons, New York, 1980. A.I. Vogel, A Text-Book of Practical Organic Chemistry, including Qualitative Organic Analysis, 3 Ed., Longmans, London, 1966. C. Dickson, Medicinal Chemistry Laboratory Manual, CRC Press, London, 1999

TESTES PARA A IDENTIFICAO DE AMINOCIDOS E PROTENAS FOLHA DE RESULTADOS GRUPO: DATA: .............................. TURMA: .................... N ............................... N ............................... N ...............................

Nome .................................................................................... Nome .................................................................................... Nome ....................................................................................

Escreva as frmulas qumicas estruturais para os aminocidos utilizados como amostras (para a forma predominante em soluo aquosa a pH 7).

Glicina (Gly)

Cistena (Cys)

cido Asprtico (Asp)

Lisina (Lis)

Arginina (Arg)

Tirosina (Tyr)

Triptofano (Trp)

Prolina (Pro)

RESULTADOS DOS ENSAIOS

II

III

IV

VI

VII

VIII

IX

XI

Amostra

Identificao

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