Ulsd057664 TM

Universidade de Lisboa Faculdade de Medicina de Lisboa
Aplicao da tcnica de espectrofotometria de absoro atmica na anlise de metais e metalides em amostras biolgicas.
Preparao de amostras por digesto com a tecnologia microondas
Carla de Jesus Grilo de Oliveira Mustra
Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses
2009
A impresso desta dissertao foi aprovada pela Comisso Coordenadora do Conselho Cientfico da Faculdade de Medicina de Lisboa em reunio de 2 de Junho de 2009.
Universidade de Lisboa Faculdade de Medicina de Lisboa
Aplicao da tcnica de espectrofotometria de absoro atmica na anlise de metais e metalides em amostras biolgicas.
Preparao de amostras por digesto com a tecnologia microondas
Carla de Jesus Grilo de Oliveira Mustra
Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses
Dissertao orientada e co-orientada por
Professor Doutor Francisco Corte Real e Professor Doutor Jorge Costa Santos
Todas as afirmaes efectuadas no presente documento so da exclusiva responsabilidade do seu autor, no cabendo qualquer responsabilidade Faculdade de Medicina de Lisboa
pelos contedos nele apresentados.
Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses
RESUMO
A espectrofotometria de absoro atmica (EAA), apresentada por Alan Walsh h mais de cinquenta anos como procedimento analtico, nos dias de hoje uma tcnica bem estabelecida em inmeros campos da anlise instrumental (Welz e Sperling, 1999). As diferentes tcnicas associadas EAA, como a chama, a cmara de grafite, a gerao de hidretos e o vapor frio, permitem determinar quantitativamente, com sensibilidade suficiente, mais de 60 elementos da tabela peridica (Skoog et al, 1992). O metalide arsnio (As) um desses elementos, sendo a espectrofotometria de absoro atmica com gerao de hidretos uma das melhores tcnicas disponveis para a sua anlise vestigial (ATSDR, 2005; Tsalev, 1995). O arsnio encontra-se presente em todos os organismos vivos apesar de at agora no ter sido completamente esclarecido o seu papel biolgico como elemento vestigial. Os seus efeitos txicos, assim como de alguns dos seus compostos so amplamente conhecidos. Sabe-se que os compostos inorgnicos de arsnio so os mais txicos, sendo preferencialmente acumulados no organismo comparativamente aos compostos orgnicos (Welz e Sperling, 1999). A intoxicao pelo arsnio continua na ordem do dia, no tanto devido a casos de intoxicao aguda, j que essa situao mais comum em pases em vias de desenvolvimento (e.g. Bangladesh, ndia) mas sim devido intoxicao crnica originada por exposio ambiental e profissional continuada (Moffat et al, 2004). As notcias, quer nacionais quer internacionais, demonstram a preocupao que existe ao nvel ambiental e de sade pblica relativamente a esta substncia. A determinao do arsnio total presente numa amostra extensamente influenciada pelo passo crucial de pr-tratamento dessa mesma amostra. A sua correcta avaliao possvel se for garantida a decomposio completa dos compostos orgnicos de arsnio persistentes, como so exemplo as espcies dimetiladas e feniladas, o que se consegue mediante a aplicao de processos de digesto adequados. Os processos de digesto podem ser de dois tipos: digesto hmida e digesto seca, podendo o primeiro ser em sistema aberto ou fechado. Neste trabalho, foram estudados os processos de digesto hmida em sistema aberto e fechado no entanto, apesar de existirem vantagens na aplicao do processo de digesto hmida em vaso fechado (digesto hmida pressurizada com aplicao da tecnologia microondas), o
trabalho desenvolvido no mbito desta dissertao mostra que a digesto hmida em vaso aberto mais eficaz na decomposio completa dos compostos de arsnio. Neste trabalho apresentam-se os resultados obtidos decorrentes da validao do mtodo analtico de determinao do arsnio total em amostras biolgicas. Os diferentes parmetros de validao estudados, como a especificidade, a eficincia e taxa de recuperao da digesto, a linearidade, limites de deteco e quantificao, preciso e exactido, robustez e estabilidade, mostram que o mtodo adequado confirmao da presena e quantificao de arsnio total em amostras de sangue, urina, cabelo, unhas e outras vsceras a nveis de concentrao fisiolgicos.
PALAVRAS-CHAVE
Toxicologia forense; Espectrofotometria de absoro atmica; Gerao de hidretos; Arsnio; Validao.
ii
ABSTRACT
Atomic absorption spectrometry (AAS) is today well established in numerous fields of instrumental analysis, after being proposed by Alan Walsh as an analytical procedure more than 50 years ago (Welz & Sperling, 1999). AAS and its techniques (flame, graphite furnace, hydride generation and cold vapour) provide a sensitive means of determining more than 60 elements (Skoog et al, 1992). The arsenic metalloid (As) is one of those elements and the hydride generation atomic absorption spectrometry (HGAAS) is among the best analytical techniques for trace arsenic (ATSDR, 2005; Tsalev, 1995). Arsenic is present ubiquitously in all organic tissues of human and animal organisms, although its biological significance as trace element has not been completely clarified. The toxicity of arsenic and some of its compounds are well known, its inorganic forms are the most toxic and preferentially accumulated in organisms (Welz & Sperling, 1999). Arsenic poisoning is still important among us, mainly due to chronic occupational and environmental exposure instead of acute poisoning, more common in undeveloped countries (e.g. Bangladesh and India) (Moffat et al, 2004). The national and international media shows the public health and environmental concern about this element. The total determination of arsenic is extensively dependent on the sample pretreatment crucial step. Its correct determination is possible if the total dissolution of persistent organoarsenicals, like dimethylated and phenylated species, is achieved. This is done by applying the proper digestion procedures. The digestion procedure can be done in two ways: wet decompositions or dry ashing. Wet decompositions can be performed in open vessels or pressurized vessels like microwave oven systems. Two wet digestion procedures were studied during this work, the open vessel and pressurized microwave digestion. Although several advantages are presented when microwave technology digestion step is applied, the work developed during this master thesis showed that this kind of procedure is not the most efficient for total determination of arsenic in biological samples. Wet digestion procedures in open vessels are more efficient for the total dissolution of arsenic species.
iii
This work presents the validation parameters of an analytical method for total arsenic determination in biological samples. The obtained results of the studied validation parameters: specificity, efficiency of digestion procedure, recovery, linearity, limits of detection and quantification, accuracy, ruggedness and stability shows that the presented method is appropriate to confirm and determine total arsenic in urine, blood, hair, nails and other organic samples at vestigial levels.
KEYWORDS
Forensic Toxicology; Atomic absorption spectrometry; Hydride generation; Arsenic; Validation.
iv
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Doutor Francisco Corte Real, Professor da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra e Director da Delegao do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal, I.P., o meu reconhecimento pela forma como me incentivou desde o primeiro momento em que prontamente aceitou orientar este trabalho e tornou possvel a sua realizao no Servio de Toxicologia Forense da Delegao do Centro. No esquecerei a confiana que depositou em mim e a sua constante disponibilidade que muito me honram.
Ao Professor Doutor Jorge Costa Santos, Professor da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa e Director da Delegao do Sul do INML, I.P., pelo incentivo e apoio concedido como co-orientador deste trabalho.
Dr. Paula Monsanto, Directora do Servio de Toxicologia Forense (STF) da Delegao do Centro do INML, I.P., pela forma como me recebeu, apoiou e aconselhou, proporcionando sempre os meios necessrios realizao deste trabalho.
A todos os que trabalham no STF da Delegao do Centro, pela maneira como fui recebida quer enquanto estudante de Mestrado, quer depois como colega de trabalho, por todo o apoio e disponibilidade demonstrados desde o primeiro momento. Um agradecimento em particular ao Fernando e Mrio pela forma me receberam e a abertura que demonstraram na transmisso dos
conhecimentos tcnico-cientficos adquiridos na rea de desenvolvimento deste trabalho.
Ao Professor Doutor Duarte Nuno Vieira, Presidente do INML, I.P., pelo apoio e incentivo concedido possibilitando a realizao deste trabalho.
A todos que, directa ou indirectamente, me apoiaram e contriburam para que este trabalho fosse avante.
Aos meus pais por todo o carinho, apoio, confiana e fora
Ao Pedro e ao Tiago por toda a pacincia e sacrifcios, pelo carinho, amor e coragem sempre presentes
vi
NDICE GERAL
Resumo Palavras Chave Abstract Keywords Agradecimentos ndice Geral ndice de Figuras/Tabelas/Quadros ndice de Anexos Lista de Smbolos, Unidades e Abreviaturas
i ii iii iv v vii x xii xiii
Captulo I INTRODUO
1.1. Justificao do tema escolhido 1.2. Objectivos 1.3. mbito do estudo
2 5 6
Captulo II REVISO DA LITERATURA
2.1. Enquadramento Terico - Estado da Arte 2.1.1. A Espectrofotometria de Absoro Atmica 2.1.2. Determinao de Metais e Metalides Evoluo e Importncia toxicolgica 2.1.3. O Metalide Arsnio e seus compostos 2.1.3.1 Metabolismo e excreo 2.1.3.2 Anlise de arsnio 2.1.3.3 Determinao de arsnio por espectrofotometria de absoro atmica em amostras biolgicas 2.1.4. A seleco das amostras 2.1.4.1 A amostra de sangue 2.1.4.2 A amostra de urina 2.1.4.3 As amostras de cabelo e/ou unhas 2.1.5. A intoxicao por arsnio alguns casos e curiosidades 2.1.6. O processo de digesto das amostras
8 12
13 15 17 17
21 23 25 25 26 28 34
vii
2.1.7. Estudo dos processos de digesto
35
2.2. Validao de mtodos analticos 2.2.1. Validao de mtodos de confirmao 2.2.1.1 Selectividade e Especificidade 2.2.1.1.1 Mtodo adio padro 2.2.1.2 Modelo de calibrao 2.2.1.3 Linearidade 2.2.1.4 Gama de trabalho 2.2.1.5 Preciso 2.2.1.6 Exactido (Veracidade) 2.2.1.7 Limites de Deteco e Quantificao 2.2.1.8 Incerteza da medio 2.2.1.9 Controlo de qualidade 2.2.1.10 Apresentao de resultados
36 36 37 39 40 42 43 44 45 45 47 47 48
2.3. Enquadramento Legal
50
Captulo III PARTE EXPERIMENTAL
55
3.1. Introduo 3.2. Concepo experimental 3.3. Material e Mtodos 3.3.1. Instrumentao e material utilizado 3.3.2. Reagentes, Padres e Materiais de referncia 3.3.3. Tratamento do material 3.3.4. Preparao de solues 3.4. Condies espectrofotomtricas 3.5. Tipo e origem das amostras 3.6. Preparao das amostras 3.6.1. Digesto aplicando a tecnologia Microondas 3.6.2. Digesto hmida em vaso aberto
56 56 57 57 58 59 60 61 62 62 63 69
Captulo IV Apresentao e Discusso de Resultados
75
4.1. Introduo
76
viii
4.2. Digesto em vaso aberto vs Digesto em vaso fechado 4.3. Validao do mtodo analtico de determinao de arsnio 4.3.1. Avaliao da especificidade 4.3.1.1 Estudo da especificidade em urina 4.3.1.2 Estudo da especificidade em sangue 4.3.2. Limite de Deteco (LD) e Limite de Quantificao (LQ) 4.3.3. Eficincia da digesto 4.3.4. Taxa de recuperao da digesto 4.3.5. Avaliao de arrastamento 4.3.6. Preciso 4.3.6.1 Preciso Intradia (Intra-ensaio) 4.3.6.2 Preciso Intermdia, repetibilidade e incerteza nas medies 96 4.3.6.3 Repetibilidade do equipamento 4.3.7. Exactido 4.3.8. Gama de trabalho e linearidade 4.3.9. Robustez 4.3.10. Estabilidade 4.4. Discusso de resultados
76 77 77 78 81 82 84 85 88 89 90
102 102 105 106 108 109
Captulo V Consideraes Finais
111
Referncias Bibliogrficas
114
Anexos Anexo I Anexo II
121 122 123
ix
NDICE DE FIGURAS, TABELAS E QUADROS

INDCE DE FIGURAS Fig. 1 Processo de excitao e decaimento. Fig. 2 Ilustrao de possveis transies electrnicas. Fig. 3 Processo de absoro atmica. Fig. 4 Exemplos de leses na pele devido ao consumo de gua potvel contaminada com arsnio no Bangladesh. Fig. 5 - Mapa que ilustra os nveis de contaminao com arsnio das guas subterrneas de Bengala Ocidental - ndia. Fig. 6 - Grfico que ilustra a aplicao do mtodo adio padro. Fig. 7 Espectrofotmetro de absoro atmica com sistema gerador de hidretos com fluxo e injeco automticos (FIAS-HG-AAS) da Perkin Elmer, disponvel no STF da Delegao do Centro do INML,IP. Fig. 8 Erlenmeyers com amostra e mistura de cidos antes de iniciar digesto. Fig. 9 Amostras durante digesto hmida em placa de aquecimento. Fig. 10 Amostras durante passo de pr-reduo aps digesto. Fig. 11 Amostras aferidas em bales volumtricos, prontas para anlise. Fig. 12 - Dados usados na avaliao da especificidade em urina e respectivo grfico. Fig. 13 - Dados usados na avaliao da especificidade em urina e respectivo grfico (experincia 2). Fig. 14 - Dados usados na avaliao da especificidade em sangue e respectivo grfico. Fig. 15 - Grfico e resultados usados no estudo dos limiares analticos do mtodo Fig 16 - Dados da curva de calibrao, respectivo grfico e resultados da quantificao da urina controlo, para clculo da eficincia da digesto. Fig 17 - Dados da avaliao da taxa de recuperao da digesto do As para os nveis de concentrao 0,5 e 4,0 g/L. Fig 18. Dados da avaliao da taxa de recuperao da digesto do As para o nvel de concentrao 1,0 g/L. Fig. 19 - Clculo da preciso no DIA1 para os nveis em estudo. PGINA 10 11 11 30 32 39 61
71 71 72 72 79 80 81 83 85 87 88 91
Fig. 20 - Clculo da preciso no DIA2 para os nveis em estudo. Fig. 21 - Clculo da preciso no DIA3 para os nveis em estudo. Fig. 22 - Clculo da preciso no DIA4 para os nveis em estudo. Fig. 23 - Clculo da preciso no DIA5 para os nveis em estudo. Fig. 24 - Clculos e resultados obtidos de preciso intermdia, repetibilidade e incerteza nas medies para Limite de Quantificao 0,30 ug/L (As). Fig. 25 - Clculos e resultados obtidos de preciso intermdia, repetibilidade e incerteza nas medies para o nvel de concentrao 0,75 ug/L (As). Fig. 26 - Clculos e resultados obtidos de preciso intermdia, repetibilidade e incerteza nas medies para o nvel de concentrao 2,50 g/L (As). Fig. 27 - Clculos e resultados obtidos de preciso intermdia, repetibilidade e incerteza nas medies para o nvel de concentrao 4,00 g/L (As). Fig. 28 - Dados e resultados do estudo de exactido. Fig. 29 - Dados e resultados do estudo de avaliao da gama de trabalho e linearidade.
92 93 94 95 97
98
99
100
103 106
INDCE DE TABELAS
PGINA
Tabela I: Valores de referncia da concentrao de arsnio em diversas amostras biolgicas. Tabela II: Resultados da quantificao de As de duas amostras reais de urina nas duas curvas analticas representadas no grfico da Fig 12. Tabela III: Resultados da quantificao de As de seis amostras reais de urina nas duas curvas analticas representadas no grfico da Fig 13. Tabela IV: Resultados da quantificao de As de seis amostras reais de sangue nas duas curvas analticas representadas no grfico da Fig 14. Tabela V: Dados usados no estudo dos limites de deteco e quantificao do mtodo. Tabela VI - Dados de Avaliao da repetibilidade do equipamento.
23 79 80 82 83 102
xi
INDCE DE QUADROS
PGINA
Quadro I - Classificao dos mtodos de espectrofotometria atmica. Quadro II - Resumo dos resultados obtidos de Repetibilidade, Preciso Intermdia, Exactido e Taxa de Recuperao da digesto do mtodo estudado.
9 109
INDCE DE ANEXOS
PGINA
ANEXO I Mtodo de Gutzeit.
122
ANEXO II Condies instrumentais do mtodo de determinao de arsnio 123 por HG-AAS.
xii
LISTA DE SMBOLOS, UNIDADES E ABREVIATURAS
g micrograma l - microlitro m - micrmetro AAS - Atomic Absorption Spectrometry AB - Arsenobetana AC Arsenocolina Al - Alumnio AR Analytical reagent As - Arsnio Atomizao processo atravs do qual a amostra convertida em tomos no estado gasoso. Etapa de produo de tomos no estado fundamental. Background Rudo de fundo Branco de reagentes Soluo que contem o/os solventes(s) e todos os reagentes usados na anlise sem presena da amostra. Cd Cdmio cdo Comprimento de onda Cu - Cobre CV - Coeficiente de variao; uma medida de disperso que se presta para a comparao de distribuies diferentes e corresponde razo do desvio padro pela mdia (Cv= / ).
DMA cido dimetilarsnico EAA Espectrofotometria de Absoro Atmica e.g. - exempli gratia, por exemplo Especiao qumica determinao da concentrao das diferentes formas qumicas de um elemento numa matriz, sendo que estas espcies em conjunto constituem a concentrao total do elemento na amostra.
xiii
et al. et alii, e outros Fe - Ferro g grama H2SO4 cido sulfrico H3PO4 cido fosfrico HCl cido clordrico HClO4 - cido perclrico Hg - Mercrio HNO3 cido ntrico i.e. id est, isto ICP-MS - Inductively coupled plasma - mass spectrometry INML, I.P. Instituto Nacional de Medicina Legal - Instituto Pblico IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry KI Iodeto de potssio l litro LD Limite de deteco Li - Ltio LMR Limite mximo de resduo LQ Limite de quantificao M Molar numero de moles por litro (mol/l) MAC maximum allowable concentration; concentrao mxima admissvel MAP- mtodo adio padro MgNO3 Nitrato de magnsio ml - mililitro MMA cido monometilarsnico NaBH4 Borohidreto de sdio NaOH Hidrxido de sdio Ni - Nquel
xiv
ng - nanograma NH2OH Hidroxilamina nm - nanmetro p.a. pro analysis, pour analise, para anlise Pb - Chumbo PET Polietileno pH medida de acidez ou basicidade em meios aquosos. PP Polipropileno ppb - partes por bilio ppm - partes por milho Se Selnio Sb - Antimnio SRM Standard reference materials, materiais de referncia STF Servio de Toxicologia Forense T1/2 perodo de semivida, tempo necessrio para eliminar metade da quantidade de uma substncia. TMA Trimetilarsina TOC total organic carbon Zn - Zinco
xv
CAPTULO I INTRODUO
1.1. Justificao do tema escolhido
Os metais e metalides formam um importante grupo de substncias txicas que apresentam muitas dificuldades quanto sua anlise qumica sistemtica. Nos pases desenvolvidos o maior nmero de casos conhecidos de intoxicao por estes agentes deve-se a intoxicao crnica, resultante da exposio ambiental ou ocupacional (Moffat et al, 2004). No entanto, a intoxicao aguda ainda comum em pases em desenvolvimento. A espectrofotometria de absoro atmica (EAA ou AAS - Atomic absorption spectrometry) uma tcnica bem estabelecida na anlise elementar ao nvel vestigial de diferentes tipos de matrizes. Trata-se da tcnica mais vulgarmente usada na determinao de metais e metalides (Moffat et al, 2004; Tsalev, 1995). As tcnicas analticas para determinao destas substncias em amostras biolgicas tm sofrido avanos considerveis desde incio dos anos 80, em particular a espectrofotometria de absoro atmica com atomizao electrotrmica em cmara de grafite e a espectrometria de massa com fonte de plasma acoplado indutivamente (ICP-MS - Inductively coupled plasma mass spectrometry). No entanto, estas tcnicas, principalmente o ICP-MS, so ainda relativamente dispendiosas, pelo que no se encontram disponveis em muitos hospitais e laboratrios forenses para anlises de rotina (Moffat et al, 2004). A AAS uma tcnica com elevada sensibilidade, tendo como maior desvantagem o facto de no permitir a anlise multi-elementar simultnea (6 elementos , at ao momento, o nmero mximo de elementos monitorizados com alguns dos instrumentos disponveis no mercado) (Freschi et al, 2000), o que pode ser limitante quando os volumes de amostra so diminutos e existem diferentes elementos a analisar. O desenvolvimento de tecnologias alternativas como o ICP-MS vem colmatar essa situao permitindo a anlise multi-elementar com elevada sensibilidade, apresentando no entanto como desvantagem o seu custo mais elevado de anlise e manuteno, bem como problemas de interferncias isobricas. A preparao das amostras para anlise por AAS envolve na maioria das situaes um passo importante de dissoluo ou digesto. A digesto pode ser hmida em vaso aberto ou fechado, ou ainda uma digesto seca (vide pontos 2.1.6. e 2.1.7., relativo aos processos de digesto).
A escolha do tema Aplicao da tcnica de espectrofotometria de absoro atmica na anlise de metais e metalides em amostras biolgicas. Preparao de amostras por digesto com a tecnologia microondas est associada fundamentalmente a trs aspectos:
O aspecto de maior relevncia a importncia toxicolgica que tem actualmente a determinao deste grupo de substncias em diferentes tipos de matrizes. Os limites mximos (LMR limite mximo de resduo) permitidos por lei em guas de consumo e alimentos e os nveis mximos de exposio ambiental e profissional so cada vez mais exigentes devido crescente preocupao quanto aos aspectos de sade pblica, conduzindo optimizao dos mtodos de determinao destas substncias no sentido de aumentar a sua fiabilidade e sensibilidade. O controlo desses mesmos limites cada vez mais abrangente (controlo dos nveis presentes no ar, gua, solos, alimentos, cosmticos, aditivos alimentares, plsticos, tintas, etc.), como se pode evidenciar pela legislao publicada neste mbito (vide ponto 2.3. Enquadramento legal). Paralelamente, o grupo de substncias controladas aumenta tambm acompanhando as questes de sade pblica que vo surgindo (e.g. extensa publicao de legislao relativa a novos produtos fitofarmacuticos que devem ser controlados, bem como actualizao dos limites mximos de resduo permitidos). Esta realidade tem suscitado uma significativa preocupao no sentido de serem optimizados os mtodos e tcnicas para a determinao destas substncias no mbito da Toxicologia Forense.
O segundo aspecto prende-se com o facto de o Instituto Nacional de Medicina Legal (INML, I.P.) dispor de um equipamento de espectrofotometria de absoro atmica com sistema gerador de hidretos e cmara de grafite e tambm um sistema microondas, no Servio de Toxicologia Forense (STF) da Delegao do Centro, equipamentos esses com elevado potencial na determinao de um extenso grupo de elementos desde que devidamente equipados, utilizados e assistidos. do interesse da Instituio em causa rentabilizar da melhor forma os equipamentos j adquiridos, permitindo responder s solicitaes de anlises toxicolgicas de metais e metalides em amostras biolgicas dirigidas aos diferentes Servios de Toxicologia Forense (Delegaes do Norte, Centro e Sul) do Instituto Nacional de Medicina Legal.
Finalmente, o terceiro aspecto, este de ordem pessoal, prende-se com o facto de constituir um importante desafio profissional o de desenvolver e validar mtodos numa tcnica que at ao momento me era pouco familiar. Esta seria uma forma de ampliar e aprofundar os meus conhecimentos nas reas de Qumica Analtica e Toxicologia Forense, aplicando a tcnica de espectrofotometria de absoro atmica a amostras biolgicas
1.2. Objectivos
Sabendo que os metais e metalides formam um importante grupo de substncias txicas a analisar no mbito da toxicologia forense, sendo normalmente associados a intoxicaes crnicas, resultantes da exposio ambiental ou industrial, importante desenvolver mtodos e tcnicas fiveis com sensibilidade suficiente destinados determinao destas substncias, que permitam dar resposta s solicitaes dirigidas aos diferentes Servios de Toxicologia Forense do INML I.P..
O primeiro objectivo deste trabalho estabelecer procedimentos e validar metodologias para usar em rotina na anlise de alguns metais ou metalides em amostras biolgicas, aplicando a tcnica de espectrofotometria de absoro atmica.
No mbito de um s processo forense frequente a requisio de um elevado nmero de anlises (e.g. lcool etlico, drogas de abuso, medicamentos, pesticidas) o que pressupe a existncia de uma quantidade razovel de amostra(s) que permita(m) satisfazer todas as necessidades, o que nem sempre acontece. Este facto, bastante limitante, deve merecer a maior ateno dos analistas e estar sempre presente cada vez que se inicia e valida um mtodo. Assim, objectivo deste trabalho que os mtodos criados permitam determinar o analito em estudo usando a menor quantidade de amostra possvel.
Tendo em considerao as vantagens amplamente descritas na bibliografia quanto ao uso da tecnologia microondas na digesto de amostras, mais concretamente, a rapidez do processo, os menores riscos de contaminao e perda de analito, assim como a necessidade de menor quantidade de reagentes tambm objectivo deste trabalho testar e validar procedimentos para digesto de amostras biolgicas no forno microondas.
1.3. mbito do Estudo
O trabalho foi desenvolvido tendo em conta os recursos, em termos de equipamento e reagentes, disponveis no Servio de Toxicologia Forense da Delegao do Centro do INML I.P., bem como as necessidades de resposta deste servio s anlises toxicolgicas solicitadas em amostras biolgicas. Assim, o estudo comeou pelo desenvolvimento do mtodo de determinao de arsnio em amostras biolgicas e sua validao, j que este o elemento de entre o grupo de metais e metalides cuja anlise mais vezes solicitada. O trabalho a desenvolver encontrava-se partida limitado ao estudo de quatro elementos: Arsnio, Chumbo, Cobre e Mercrio, devido ao equipamento disponvel adquirido pelo STF na sequncia das opes tomadas quanto aos elementos que consideraram importantes determinar. Esta dissertao incidir sobre o desenvolvimento e os resultados obtidos no mbito da validao do mtodo de determinao de arsnio em amostras biolgicas, tendo sido impossvel reunir em tempo til os dados necessrios validao dos mtodos de determinao dos restantes elementos. Esses mtodos envolvem o desenvolvimento de procedimentos de preparao e anlise de amostras individualizados. Relativamente s tcnicas analticas disponveis, a espectrofotometria de absoro atmica associada a diferentes equipamentos (com tcnicas de atomizao e condies espectrofotomtricas diferentes) consoante o elemento a determinar: mais concretamente, no caso da determinao de arsnio, a AAS associada ao sistema gerador de hidretos, na determinao de mercrio aplicada a tcnica de atomizao de vapor frio e na determinao de chumbo e cobre aplica-se o sistema de atomizao electrotrmica em cmara de grafite. Adicionalmente, a anlise de cada elemento implica o desenvolvimento de um procedimento da preparao da amostra individualizado. Estes factores contribuem para a elevada sensibilidade e selectividade das tcnicas de espectrofotometria atmica, sendo tambm a principal razo da dificuldade em determinar metais e metalides de forma sistemtica.
CAPTULO II REVISO DA LITERATURA
2.1. Enquadramento Terico - Estado da Arte
A espectrofotometria atmica usada em determinaes qualitativas e quantitativas de aproximadamente 70 elementos. A sensibilidade destes mtodos atinge tipicamente gamas de concentrao na ordem dos ppm (partes por milho) at ppb (partes por bilio) (Skoog et al, 1992). Outras vantagens destes mtodos so a rapidez, a elevada selectividade e custos relativamente moderados. O estudo espectrofotomtrico dos tomos (ou de ies elementares tais como Fe+, Mg+ ou Al+) atravs da aplicao da radiao ultravioleta ou visvel s possvel se estes se encontrarem no estado gasoso, onde os tomos ou ies se encontram bem separados uns dos outros. Consequentemente, o primeiro passo de todos os procedimentos de espectrofotometria atmica a atomizao, ou seja, o processo a partir do qual a amostra volatilizada e decomposta de forma a produzir um gs composto por tomos. A eficincia e reprodutibilidade do passo de atomizao determinam em grande parte a sensibilidade do mtodo, preciso e exactido. por isso, o passo mais crtico da espectrofotometria atmica (Skoog et al, 1992).
A classificao dos mtodos de espectrofotometria atmica baseada na forma como a amostra atomizada. No quadro que se segue resumem-se os mtodos existentes. Note-se que a temperatura de atomizao varia consideravelmente segundo o mtodo de atomizao adoptado.
Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Quadro I - Classificao dos mtodos de espectrofotometria atmica.
Mtodo de atomizao Chama
Temperatura de atomizao (C) 17003150
Base do mtodo Absoro
Nome
comum
do
mtodo
abreviatura (portugus/ingls) Espectrofotometria de absoro atmica (EAA) / Atomic absorption spectroscopy (AAS) Espectrofotometria de emisso atmica (EEA) / Atomic emission spectroscopy (AES) Espectrofotometria de fluorescncia atmica (EFA) / Atomic fluorescence spectroscopy (AFS) Espectrofotometria electrotrmica de absoro atmica (EEAA) / Electrothermal atomic absorption spectroscopy (ETAAS) Espectrofotometria electrotrmica de fluorescncia atmica (EEFA) / Electrothermal atomic fluorescence spectroscopy (ETAFS) Espectrofotometria de emisso com fonte de plasma acoplado indutivamente / Inductively coupled plasma emission spectroscopy (ICPAES) Espectrofotometria de fluorescncia com fonte de plasma acoplado indutivamente / Inductively coupled plasma fluorescence spectroscopy (ICPAFS) Espectrofotometria de emisso com fonte de plasma de corrente continua / Direct current plasma spectroscopy (DCP) Espectrofotometria de emisso com fonte de arco elctrico / Arc-source emission spectroscopy Espectrofotometria de emisso com fonte de fasca elctrica/ Spark-source emission spectroscopy
Emisso
Fuorescncia
Electrotrmico
1200-3000
Absoro
Fluorescncia
Plasma acoplado indutivamente
6000-8000
Emisso
Fluorescncia
Plasma de corrente continua
6000-10000
Emisso
Arco elctrico
4000-5000
Emisso
Fasca
40000(?)
Emisso
Adaptado a partir de Skoog et al, 1992.
A espectrofotometria atmica um mtodo que conjuga trs tcnicas com uso analtico, como constatado na tabela anterior: a emisso atmica, a absoro atmica e a fluorescncia atmica. Para perceber a relao entre estas tcnicas necessrio entender o prprio tomo e o processo atmico envolvido em cada uma das tcnicas. O tomo constitudo por um ncleo rodeado de electres. Cada elemento tem um nmero especfico de electres que est associado ao ncleo atmico e organizado sob a forma de uma estrutura orbital caracterstica de cada elemento. Os electres ocupam as orbitais de uma forma ordenada e previsvel. O estado mais baixo de energia, ou seja, a configurao electrnica mais estvel do tomo conhecido como o estado fundamental, a configurao orbital normal para o tomo. Se for transmitida ao tomo uma determinada quantidade de energia, esta ser absorvida pelo tomo e um electro da orbital vai ser promovido para uma orbital superior de energia, originando uma configurao electrnica menos estvel, o chamado estado excitado. Dada a instabilidade desta configurao, o tomo ir regressar ao seu estado fundamental imediata e espontaneamente. O electro ao regressar sua posio estvel na orbital, ir emitir radiao com energia equivalente inicialmente absorvida no processo de excitao (Beaty e Kerber, 1993). A figura seguinte ilustra o processo de excitao e decaimento. Note-se que no passo (1) do processo, a excitao conseguida devido ao fornecimento de energia, enquanto que o passo (2), o decaimento, ocorre espontaneamente.
Fig.1 - Processo de excitao e decaimento (Beaty e Kerber, 1993).
O comprimento de onda (designado abreviadamente como cdo) da radiao emitida est directamente relacionado com a transio electrnica que ocorreu. Como cada elemento tem uma estrutura electrnica nica, o cdo da radiao emitida caracterstico de cada elemento. Quanto mais complexa a configurao orbital de um tomo (maior o tomo, maior a complexidade) mais transies electrnicas podero ocorrer. Cada transio resulta na emisso de luz ou radiao com cdo caracterstico como ilustrado na figura seguinte ( 1,
2
ou
3).
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Fig.2 - Ilustrao de possveis transies electrnicas (Beaty e Kerber, 1993).
O processo de excitao e decaimento
aplicado nos trs campos da
espectrofotometria de absoro atmica. A energia absorvida no processo de excitao ou a emitida no processo de decaimento medida e usada com fins analticos.
Na emisso atmica, a amostra sujeita a uma elevada energia, temperaturas elevadas, para produzir tomos no estado excitado, capazes de emitir luz. A fonte energtica pode ser elctrica, a chama, e mais recentemente o plasma. O espectro de emisso de um elemento sujeito a esta energia constitudo por um conjunto de cdo de emisso permitidos, normalmente designados linhas de emisso, devido sua natureza discreta. Este espectro de emisso pode ser usado como nica caracterstica para identificar qualitativamente o elemento. A emisso atmica usando arco elctrico tem sido muito usada para anlise qualitativa. Na anlise quantitativa, a intensidade da luz emitida ao cdo do elemento a determinar medida, sendo a sua intensidade proporcional ao nmero de tomos do elemento presentes. A tcnica de fotometria de chama uma aplicao da emisso atmica para anlise quantitativa.
Se a luz de um cdo especfico atingir um tomo livre no seu estado fundamental, o tomo pode absorver essa luz, passando para o estado excitado por um processo denominado absoro atmica.
Fig.3 - Processo de absoro atmica (Beaty e Kerber, 1993).
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A capacidade que um tomo tem de absorver luz a um determinado cdo, usada na tcnica de espectrofotometria de absoro atmica.
2.1.1. A Espectrofotometria de Absoro Atmica

Atomic absorption spectrometry for (AAS) the is a
spectroanalytical
procedure
qualitative
detection and quantitative determination of elements employing the absorption of optical radiation by free atoms in the gaseous state (citado por Welz e Sperling, 1999, texto original de Norma Alem DIN 51401-1, Beuth-Verlag, Berlin; 1992).
Esta tcnica permite determinar quantitativamente, com sensibilidade suficiente, mais de 60 elementos. A sua aplicao apropriada a determinaes de rotina mesmo com operadores relativamente pouco treinados (Skoog et al, 1992).
Na absoro atmica a grandeza que interessa medir a quantidade de radiao que absorvida, ao cdo de ressonncia de um determinado elemento, aps atravessar uma nuvem de tomos. medida que o nmero de tomos existentes no caminho que a luz atravessa aumenta, a quantidade de luz absorvida tambm aumenta de uma forma possvel de prever, de acordo com os princpios da lei de Beer 1 . Medindo a quantidade de luz (ou radiao) absorvida, torna-se possvel a determinao quantitativa do analito (elemento) presente (Beaty e Kerber, 1993) A utilizao de fontes de luz especficas e a seleco cuidadosa dos cdo permite a determinao quantitativa de um determinado elemento na presena de outros. A nuvem atmica necessria s medies em absoro atmica produzida atravs do fornecimento de energia trmica suficiente amostra, de forma a permitir a dissociao dos compostos qumicos, molculas em tomos livres. Ao aspirar uma soluo contendo a amostra e lan-la numa chama devidamente alinhada relativamente ao feixe de luz do cdo de interesse, conseguimos atingir esse objectivo. Usando a chama em condies adequadas a maioria dos tomos
A Lei de Beer enuncia que a absorvncia directamente proporcional concentrao das espcies responsveis pelo processo de absoro, em determinadas condies experimentais: A=axbxc, onde A a absorvncia, a o coeficiente de absoro, uma constante que caractersticas das espcies absorventes, b o comprimento do caminho percorrido pela luz na clula de absoro, e c a concentrao das espcies absorventes.
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mantm-se no seu estado fundamental ficando aptos a absorver energia ao cdo caracterstico de uma fonte (lmpada) (Beaty e Kerber, 1993).
2.1.2. Determinao de Metais e Metalides Evoluo e importncia toxicolgica.

Historicamente verifica-se que os metais e metalides tm sido usados com alguma frequncia como substncias txicas. Isto acontece provavelmente porque a maioria destas substncias potente, grande parte no tem propriedades organolpticas (cheiro, sabor, cor), encontram-se disponveis com alguma facilidade e produzem sintomas pouco caractersticos, similares a inmeras doenas (Moffat et al, 2004). Consequentemente, a suspeita de intoxicao por este grupo de substncias raramente considerada. Por exemplo, a substituio de uma ou duas cpsulas de um medicamento prescrito por xido de arsnio, pode ter resultados fatais dando a aparncia de um suicdio por overdose. Os metais so provavelmente o grupo de substncias txicas mais antigo conhecido do homem. Supe-se que o chumbo comeou a ser utilizado perto do ano de 2000 a.C.. Hipcrates, em 370 a.C., descreveu a primeira clica abdominal de um homem que trabalhava na extraco de minrio (Casarett e Doulls, 1996). No sc. IV a.C., Aristteles escreve sobre um substncia que hoje conhecida como sendo o sulfureto de arsnio (De Guevara e Pueyo, 1995) O arsnio (As) e mercrio (Hg) so citados por Theophrastus de Erebus em 310 a 287 a.C. e por Plnio, O Velho, no sc. I a.C. (Casarett e Doulls, 1996; De Guevara e Pueyo, 1995). O arsnio era obtido a partir da fundio do cobre e estanho e foi usado como elemento decorativo dos tmulos egpcios. No entanto, muitos dos metais com importncia toxicolgica nos nossos dias so conhecidos do homem h relativamente pouco tempo. Por exemplo, o cdmio foi reconhecido pela primeira vez nas minas de carbonato de zinco em 1817. Cerca de 80 dos 105 elementos da tabela peridica so considerados metais, mas menos de 30 foram identificados como substncias txicas para o homem (Casarett e Doulls, 1996).
Normalmente os elementos deste grupo mais vulgarmente associados a intoxicaes so o arsnio, antimnio, chumbo, ltio, mercrio e tlio (Moffat et al, 2004).
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Este grupo de substncias poderia ser analisado por rotina quando se verificam sintomas como vmitos e diarreia. Se este fosse o procedimento escolhido, ento deveriam aplicar-se em primeira anlise, testes simples qualitativos, como exemplo o Teste de Reinsch (teste normalmente aplicado anlise de contedo de estmago e resduos, que detecta sete metais txicos entre eles o arsnio, antimnio, bismuto e mercrio). Ficam, no entanto, muitos outros metais por testar, no podendo ser considerado um teste completo de excluso de um grupo de txicos. Trata-se, por isso, como j atrs referido, de um grupo que apresenta muitas dificuldades quanto sua anlise sistemtica. Os sinais e sintomas de toxicidade aguda podem diferir dos associados toxicidade crnica. Algumas substncias deste grupo, como o arsnio, sofrem uma extensa metabolizao aps serem ingeridas. Estes factores so de elevada relevncia nas investigaes analticas aplicadas a amostras biolgicas e na sua interpretao. importante saber partida se a intoxicao resultante de exposio aguda, crnica ou de ambas em simultneo. De igual importncia o tempo que vai desde a ingesto ou exposio at colheita da amostra. A colheita das amostras deve ser efectuada com extremo cuidado, bem como a seleco das anlises toxicolgicas.
No existe uma via simples e sistemtica para investigar casos onde a histria incerta e a identidade das substncias txicas desconhecida. O investigador normalmente usa o processo de excluso de hipteses, iniciando a sua investigao nas causas mais comuns de intoxicao (substncias ilcitas e medicamentosas), seguindo-se um exame detalhado da histria do paciente ou vtima, em particular o possvel acesso a compostos de uso industrial ou agrcola. Da a importncia da informao disponibilizada ao investigador para a conduo da prpria investigao.
Os mtodos de anlise de metais mais vulgarmente usados so os colorimtricos, electroqumicos, a espectrofotometria de absoro atmica, a espectrofotometria electrotrmica de absoro atmica, a espectrofotometria de emisso com fonte de plasma acoplado indutivamente e a espectrometria de massa com fonte de plasma acoplado indutivamente (Moffat et al, 2004).
A investigao da exposio crnica a metais txicos deve revestir-se de grandes cuidados relativamente ao controlo da preciso e exactido dos resultados analticos.
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Deve recorrer-se a materiais que permitam efectuar um rigoroso controlo de qualidade interna dos resultados, assim como participar em exerccios de controlo de qualidade externa como o caso dos ensaios interlaboratoriais. S assim se podem obter resultados analticos irrefutveis e de elevado nvel de confiana que podem usar-se como elemento de prova.
2.1.3. O metalide arsnio e seus compostos.

O arsnio e alguns compostos dele derivados so considerados dos txicos de maior relevncia na histria da humanidade. J no sc. V a.C. o arsnio era considerado um veneno comum; a quantidade de personagens famosas supostamente envenenadas por esta substncia interminvel (Calabuig, 2004; De Guevara e Pueyo, 1995) (vide ponto 2.1.5 relativo a intoxicaes por arsnio). Paracelso, na primeira metade do sc. XVI, introduz compostos de arsnio na teraputica humana (De Guevara e Pueyo, 1995), tendo sido usado medicinalmente durante sculos. A sua fase urea como agente teraputico deu-se no final do sc. XIX a meados do sc. XX. Os compostos de arsnio eram empregues no tratamento de dermatoses como a psorase, eczemas, acne, lquen plano, leishmaniose e sfilis (Gontijo e Bittencourt, 2005).
O arsnio difcil de caracterizar como elemento nico, a sua qumica muito complexa, existindo inmeros compostos diferentes de arsnio. Est presente em mais de 200 espcies minerais sendo a mais comum a arsenopirite (Casarett e Doulls, 1996; INCHEM, 2001). Pode encontrar-se em quatro estados de oxidao diferentes: -3, 0, +3 e +5 e est extensamente distribudo na natureza, representando uma preocupao para a sade humana quando se concentra no meio ambiente, quer atravs de processos naturais, quer antropognicos (Germolec et al, 1998). Em ambientes redutores, a forma predominante o arsenito As (III) - e em ambientes oxidados, a forma mais estvel e geralmente encontrada o arsenato As(V) (INCHEM, 2001).
Do ponto de vista estrutural o arsnio As (0) - no um metal verdadeiro, mas sim um metalide, tambm designado semi-metal, apresentando caractersticas
intermdias entre os metais e os no-metais. Outros exemplos de elementos metalides so: o boro, silcio, germnio, antimnio e telrio. Alguns autores incluem arbitrariamente o polnio e o astato nessa lista.
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Trata-se do vigsimo elemento mais abundante na crosta terrestre. Encontra-se presente em todos os organismos vivos, podendo apresentar variaes considerveis na sua concentrao em tecidos humanos (vide Tabela 1) devido a factores como a dieta, a exposio ambiental e ocupacional. A mdia de consumo dirio de arsnio por um adulto cerca de 0,025 a 0,033 mg/kg/dia (Baselt, 2004). Segundo alguns autores, a maior fonte de exposio humana ocupacional nos nossos dias ao arsnio a produo de pesticidas, herbicidas e outros produtos agrcolas (Baselt, 2004; Casarett e Doulls, 1996; De Guevara e Pueyo, 1995), onde se consome 80% do arsnio usado industrialmente. Outras aplicaes deste elemento so a indstria farmacutica, a indstria do vidro, cermica e metalrgica. De acordo com relatrio da INCHEM, 2001 (Chemical Safety Information from Intergovernmental Organizations) os processos industriais considerados como maiores fontes de contaminao antropognica do ar, gua e solo com este elemento so a explorao mineira, a fundio de metais no-ferrosos e a queima de resduos e combustveis fsseis. Considera-se, tambm, que a maior fonte no-ocupacional de exposio a este elemento em primeiro lugar a ingesto de alimentos e de gua. Em algumas reas, a gua ingerida a principal fonte de exposio ao arsnio inorgnico (vide ponto 2.1.5. sobre casos de intoxicao por arsnio na ndia e Bangladesh). Pode concluir-se, com base na bibliografia consultada, que as maiores fontes de contaminao com arsnio variam consoante a rea geogrfica que estivermos a considerar (estrutura geolgica), assim como com o nvel de desenvolvimento e o tipo de indstria presente nessa rea.
Alguns dados, mas ainda algo limitados, indicam que 25% do arsnio presente nos alimentos inorgnico, mas isso depende muito do tipo de alimentos ingerido. No peixe e marisco o nvel de arsnio inorgnico baixo (< 1%), enquanto que na carne, cereais e outros alimentos ingeridos diariamente, esse nvel superior. Num fumador, a contribuio do arsnio inalado pode atingir aproximadamente os 10 g/dia, enquanto que num no fumador essa contribuio ronda o 1 g/dia (INCHEM, 2001). Existem trs modos principais de biotransformao do arsnio no meio ambiente (INCHEM, 2001): (a) Transformao redox entre arsenito e arsenato. (b) Reduo e metilao do arsnio. (c) Biosntese de compostos orgnicos de arsnio.
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Os compostos de arsnio so absorvidos pelo organismo por diferentes vias: inalao, ingesto ou contacto.
2.1.3.1 Metabolismo e excreo

Uma dose administrada de arsnio distribui-se por todo o organismo, encontrando-se em maior proporo nos msculos. excretada quase na sua totalidade (cerca de 90%) pelo rim num espao de 6 dias, encontrando-se uma pequena fraco nas fezes (Baselt, 2004; De Guevara e Pueyo, 1996). A maior parte do arsnio trivalente ingerido rapidamente excretado na urina, na forma de cido dimetilarsnico (50% - DMA/dimethylarsinic acid), cido metilarsnico (14% - MAA/methylarsonic acid), arsnio pentavalente (8%) e arsnio trivalente (8%); os compostos orgnicos de arsnio, como os encontrados em marisco, so excretados sem alterao na urina. Um estudo de Johnson e Farmer, 1991, referido por Baselt, 2004, mostrou que uma dose nica de arsnio pentavalente, ministrada a voluntrios, excretada na urina num espao de 7 dias, na forma de DMA (57-69%), MAA (9-18%), As(V) (9-10%) e As(III) (12-15%). O arsnio apresenta elevada afinidade pela pele e excretado pelo processo de descamao da pele e atravs do suor, principalmente durante os perodos de maior sudao. um elemento que se concentra nas unhas e cabelo. Quando se concentra nas unhas produz as chamadas linhas de Mee 2 (Casarett e Doulls, 1996). No cabelo pode tambm reflectir uma exposio anterior ao elemento, no entanto preciso distinguir o arsnio intrnseco ou sistematicamente absorvido, do arsnio depositado superfcie proveniente de fontes externas (vide ponto 2.1.4.3. sobre a importncia das amostras de cabelos e unhas na determinao de arsnio).
2.1.3.2 Anlise de Arsnio

O arsnio pode ser determinado por diferentes tcnicas analticas. A anlise por activao neutrnica (NAA- Neutron activation analysis) uma tcnica sensvel e fivel que permite a determinao deste analito ao nvel dos ng/g. No entanto, esta tcnica tem um uso limitado devido ao nmero restrito de reactores nucleares
Estrias ou bandas encontradas nas unhas, brancas e transversais.
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essenciais irradiao das amostras (Tsalev, 1995; ATSDR, 2005). Em Portugal dispomos de um nico reactor nuclear, o Reactor Portugus de Investigao (RPI), instalado no Instituto Tecnolgico e Nuclear situado em Sacavm, Lisboa.
Podem aplicar-se modernos mtodos voltamtricos que conseguem atingir limites de deteco na ordem dos 0,1 a 0,2 g/L. O ICP-AES (Inductively coupled plasma atomic emission spectrometry) no suficientemente sensvel para determinar arsnio em amostras biolgicas, sendo necessrio um passo de pr-concentrao da amostra, o que se consegue aplicando tcnicas como a gerao de hidretos, a destilao, a troca inica e armadilhas de frio. Estas tcnicas provaram ser eficazes na diminuio dos limites de deteco em cerca de uma a duas ordens de magnitude quando comparadas com os ensaios directos (Tsalev, 1995). A combinao HPLC-ICP-AES (High performance liquid chromatography - ICP-AES) tem sido til em estudos de especiao do arsnio. O ICP-MS (Inductively coupled plasma mass spectrometry) mais sensvel, tendo j sido aplicado a vrias matrizes biolgicas (ossos, peixe e marisco, alimentos, plasma/soro, sangue, tecidos, etc). Ao aplicar esta tcnica, preciso ter em conta a possibilidade de existirem interferncias espectrais devido presena de
40
Ar35Cl, o
que justifica a remoo do cloro das amostras de urina por precipitao na forma de cloreto de prata (AgCl). A tcnica HG-ICP-MS (Hydride generation-ICP-MS) permite atingir limites de deteco muito baixos. A combinao do ICP-MS com cromatografia inica e HPLC tem sido aplicada com sucesso, em estudos de especiao do arsnio. A tcnica FAAS (Flame atomic absorption spectrometry) no adequada determinao de arsnio, assim como a ETAAS (Electrothermal atomic absorption spectrometry) devido grande absoro de background e perdas por volatilizao.
Finalmente, a tcnica HG-AAS (Hydride generation atomic absorption spectrometry) est entre as melhores tcnicas disponveis para a anlise vestigial de arsnio (ATSDR, 2005; Tsalev, 1995), apresentando inmeros aspectos positivos, como exemplo a separao/enriquecimento on line, a automatizao atravs da aplicao de sistemas de injeco e fluxo contnuo (FIAS - Flow injection automatic system), a rapidez na anlise das amostras e a possibilidade de efectuar estudos de especiao.
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Apesar da indiscutvel popularidade da aplicao desta tcnica determinao de arsnio (mais de 500 publicaes), este ensaio envolve processos qumicos complexos, sendo muito susceptvel a vrias fontes de erro (Tsalev, 1995) devido a:
(a) Pr-tratamento da amostra. (b) Comportamento especfico das diferentes espcies de arsnio As3+, As5+. (c) Interferncias. A partir de solues contendo arsnio inorgnico trivalente As(III) ou As3+, AsO33-, AsO2- e outras espcies hidrolisadas/complexadas, produzida a arsina (AsH3) com elevado rendimento dentro de um vasto intervalo de pH (desde solues praticamente neutras at solues com 9 a 10M HCl). As concentraes tpicas de cido clordrico (HCl) encontram-se entre 0,5 a 2M, mas um aumento na acidez prefervel para melhor controlo das interferncias e maior rapidez na pr-reduo do As (V) a As (III). Por outro lado, impraticvel usar concentraes acima de 5-6M HCl devido obteno de brancos de reagentes com leituras elevadas de absorvncia, devido ao elevado consumo de reagentes, bem como devido maior corroso da clula de quartzo e de todo o equipamento analtico. Existe uma boa tolerncia utilizao de outros cidos como, H2SO4, HClO4 e H3PO4, que podem no entanto aumentar a leitura dos brancos e diminuir a sensibilidade (em medies de absorvncia em funo da altura do pico). Apesar de alguns autores aceitarem a presena de pequenas quantidades de HNO3, este cido pode oxidar o analito (passando para As (V)), e o Iodeto a I2, causando instabilidade na leitura das solues de As (III) e depresso no sinal.
O arsnio inorgnico pentavalente ou As (V) um dos estados de oxidao tpicos deste analito. Esta espcie forma arsina muito mais lentamente e s na presena de elevadas concentraes de cido (> 0,1M HCl). Sendo assim, o sinal produzido por esta espcie inferior ao produzido pelo As(III). Isto explica o facto de a maioria dos procedimentos na tcnica HGAAS serem baseados nas medies da espcie que produz um maior sinal, ou seja o As (III), envolvendo sempre um passo de pr-reduo de qualquer arsenato a arsenito. Salienta-se ainda o facto de que a aplicao da tcnica de gerao de hidretos ao arsnio pentavalente ser mais susceptvel ocorrncia de interferncias.
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A pr-reduo do analito ao estado trivalente demora cerca de 1 hora, sendo muito afectada quanto rapidez, extenso da reduo e estabilidade das solues pela presena de resduos de agentes oxidantes e da matriz.
A seguir apresentam-se os agentes de pr-reduo mais eficientes (Tsalev, 1995):
(a) KI-cido ascrbico-HCl diludo (para a maior estabilidade das solues e maior tolerncia a interferncias) (b) L-cistena (c) KI-tiouria-HCl diludo (d) Tiouria -cido ascrbico (e) KI- tiouria -cido ascrbico (f) NH2OH.HCl-KI-HCl diludo (g) NH2OH.HCl-KI-cido oxlico. A pr-reduo on line est a tornar-se cada vez mais vulgar devido aos sistemas de fluxo contnuo e fluxo e injeco automticos. A concentrao do agente redutor, NaBH4 (Borohidreto de sdio), no crtica para este analito e encontra-se habitualmente entre 2 a 3% m/v, 0,5 a 1% m/v e 0,2 a 0,6% m/v, caso se aplique um sistema onde a anlise feita na forma de lotes ou em fluxo contnuo. As solues redutoras a baixas concentraes, so preferveis para um melhor controlo das interferncias da fase lquida e obteno de brancos de reagentes com leituras de absorvncia mais baixas. Estas solues para serem mais estveis devem ser ligeiramente alcalinizadas (por exemplo, 0,05 a 1% m/v NaOH).
Para alm de algumas possveis interferncias, uma outra fonte de erro comum nas determinaes de arsnio a sub-estimativa do arsnio orgnico. Neste caso, o uso do mtodo adio padro totalmente ineficiente, aconselhando-se o uso da correco de background cada vez que se estuda uma nova matriz ou se aplica um novo procedimento.
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2.1.3.3 Determinao de arsnio por espectrofotometria de absoro atmica em amostras biolgicas.

A literatura dedicada determinao de arsnio por absoro atmica extensa. Como j referido anteriormente, existem problemas srios nestes ensaios devido ao passo crucial analtico de pr-tratamento da amostra. Estes problemas encontram-se referenciados em inmeros textos e so bem ilustrados pela falta de concordncia entre resultados interlaboratoriais. A contaminao com arsnio, durante a amostragem e armazenamento de amostras biolgicas menos provvel do que a contribuio dos brancos (ao nvel dos nanogramas) durante o passo de decomposio da amostra. O armazenamento a baixas temperaturas (-25C) de amostras frescas de fgado e amostras esterilizadas / liofilizadas (experincia efectuada com materiais de referncia - SRM) no evidenciou diferenas significativas quando comparado com os resultados de amostras armazenadas em azoto lquido (-80C) num perodo at cerca de 7 anos (Tsalev, 1995). Foi no entanto observado por Zeisler et al, 1988, uma tendncia de diminuio das concentraes de arsnio encontradas no material de referncia NIST SRM 1577 (fgado de bovino) aps 10 anos de armazenamento. Sabbioni e seus colaboradores (Sabbioni et al, 1990) estudaram perodos mais curtos de armazenamento a temperaturas mais elevadas, verificando que podiam manter amostras de soro em tubos de polipropileno durante 10 dias a 5C, e amostras de urina em tubos de polietileno durante pelo menos 45 dias, a -20C, sem verificar alteraes.
Alguns procedimentos tornaram-se populares devido decomposio incompleta da matria orgnica (por exemplo digestes pressurizadas em autoclaves), dando resultados inferiores ao esperado pela tcnica de HG-AAS. Sabe-se que se podem obter resultados de arsnio mais baixos quando se analisam tecidos marinhos e urina, porque estas amostras so ricas em espcies de arsnio dimetiladas. O mesmo acontece quando se aplicam as digestes em vaso aberto s com HNO3, mesmo sob condies de refluxo. As digestes pressurizadas podem ser usadas como um pr-tratamento de digesto e depois serem completadas em vaso aberto, usando uma mistura ternria de cidos (HNO3, HClO4 e H2SO4) ou ento por digesto seca na presena de MgNO3.
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As digestes mais fiveis e vulgarmente utilizadas so as digestes hmidas baseadas na mistura ternria: HNO3-HClO4-H2SO4 (Tsalev, 1995). Outras digestes hmidas que utilizam outras misturas de cidos como, por exemplo, as misturas HNO3-H2SO4 e HNO3-HClO4, no so recomendadas devido sua baixa eficcia na digesto de amostras com elevado teor em gorduras e amostras contendo compostos orgnicos de arsnio persistentes, como o caso das espcies de arsnio dimetiladas e feniladas. Recomenda-se a utilizao de temperaturas na ordem dos 250-300C para garantir a obteno de uma digesto completa, reduzindo consideravelmente os oxidantes residuais que se libertam sob a forma de vapores de SO3, no deixando chegar secura (Tsalev, 1995; Wasilewska et al, 2002). Os estudos de especiao do arsnio tm-se revelado um permanente desafio nas ltimas trs dcadas. Apesar de estar longe de ser aplicada de forma rotineira, a especiao do arsnio tem muito mais interesse para alm do acadmico e da pura investigao. Podem enumerar-se algumas implicaes do ponto de vista prtico que permitem esclarecer o interesse dos estudos de especiao do arsnio: as diversas espcies deste analito so muito diferentes quanto sua mobilidade, disponibilidade e tambm toxicidade. Podemos classificar as diferentes espcies de arsnio quanto sua toxicidade da seguinte forma (toxicidade decrescente) (Tsalev, 1995): As3- (arsina) >> [AsO33-] (arsenito) > [AsO43-] (arsenato) > [H4As+] X- (compostos de arsnio) > As, As3+ > As5+ > MMA > DMA > AB, AC. Geralmente considera-se o arsnio inorgnico mais txico que o orgnico e a forma trivalente mais txica que a pentavalente (INCHEM, 2001). Sendo assim, a diferenciao entre as diferentes fontes de arsnio, o arsnio resultante da exposio ocupacional ou nutricional, tm importncia para que se evite a m interpretao dos resultados. Alguns protocolos recomendam uma dieta excluindo peixe e marisco durante 3 a 5 dias antes de uma determinao de arsnio, pois se isso no for respeitado, o arsnio da proveniente (ao nvel dos g/g) contribui para a excreo urinria de espcies de As como AB, AC, DMA, TMA, etc., de baixa toxicidade e disponibilidade. A determinao de arsnio inorgnico em urina (considerado toxicologicamente relevante) por anlise directa com HG-AAS e o arsnio total (orgnico e inorgnico) aps decomposio da amostra j uma prtica comum. H, no entanto, que considerar as drsticas diferenas no comportamento das vrias espcies de arsnio, nomeadamente:
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(a) Diferentes respostas por HG-AAS. (b) Ineficincia dos modificadores qumicos. (c) Persistncia dos compostos orgnicos de arsnio em muitos processos oxidativos comuns.
2.1.4. A seleco das amostras

A seleco das amostras adequadas anlise e a sua correcta conservao so requisitos indispensveis a uma investigao toxicolgica. No ponto anterior 2.1.3.3, foram discutidas brevemente algumas questes relativas conservao das amostras destinadas anlise de arsnio. De seguida, apresentam-se os principais aspectos relacionados com a seleco de amostras para esta anlise. A concentrao de arsnio em amostras biolgicas muito baixa, apresentando variaes considerveis entre os diferentes tipos de amostra. Tambm apresenta muitas variaes de indivduo para indivduo (Tsalev, 1995; INCHEM, 2001). Na Tabela I encontram-se resumidos valores de referncia de diferentes amostras biolgicas compilados a partir de diversas fontes bibliogrficas.
Tabela I: Valores de referncia da concentrao de arsnio em diversas amostras biolgicas.
Valores de Referncia de Arsnio em Sangue (g/ml) : Normal 0,002 a 0,07 (TIAFT, 2007) 0,002 a 0,06 (Baselt, 2004) < 0,001 (ATSDR, 2007) 0,008 0,004 (Tsalev, 1995) < 0,03 (Calabuig, 2004) < 0,010 (Moffat et al, 2004) 0,001 a 0,004 (Casarett e Doulls, 1996) Txica 0,05 a 0,25 (TIAFT, 2007) 0,02 a 2,00 (Baselt, 2004) 0,1 a 0,2 (ATSDR, 2005) 0,004 a 0,050 (Casarett e Doulls, 1996) Letal 9 a 15 (TIAFT, 2007) 0,6 a 9,3; valor mdio 3,3 (Baselt, 2004) > 1 (ATSDR, 2005) > 0,5 (Moffat et al, 2004)
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Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Valores de Referncia de Arsnio em Urina (g/ml) : Normal 0 a 0,1 (TIAFT, 2007) 0,01 a 0,30 (Baselt, 2004) < 0,1 (ATSDR, 2007) < 0,01 (Moffat et al, 2004) < 0,01 (Casarett e Doulls, 1996) Intox. Crnica 0,2 a 1,0 (TIAFT, 2007) 0,02 a 2,00 (Baselt, 2004) > 0,1 (ATSDR, 2005) > 0,1 (Casarett e Doulls, 1996) Intox. Aguda > 1,0 (TIAFT, 2007) > 0,5 (Moffat et al, 2004)
Valores de Referncia de Arsnio em Cabelo (mg/Kg) : Normal < 1 (Baselt, 2004) < 1 (ATSDR, 2007) 0,06 0,55 e 0,002 0,85(Tsalev, 1995) < 1 (Calabuig, 2004) Intox. Crnica 1 a 5 (Baselt, 2004)
Valores de Referncia de Arsnio em Unhas (mg/Kg) : Normal 0 a 1,7; valor mdio 0,252 (Baselt, 2004) < 1 (ATSDR, 2007)
Valores de Referncia de Arsnio no Rim (mg/Kg) : Normal Intox. Fatais 0 a 0,068; valor mdio 0,011 (Baselt, 2004) 0,2 a 70; valor mdio 15 (Baselt, 2004)
Valores de Referncia de Arsnio em Figado (mg/Kg) : Normal Intox. Fatais 0 a 0,092; valor mdio 0,033 (Baselt, 2004) 2,0 a 120; valor mdio 29 (Baselt, 2004)
Valores de Referncia de Arsnio no Pulmo (mg/Kg) : Normal Intox. Fatais 0 a 0,085; valor mdio 0,007 (Baselt, 2004) ??
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Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Valores de Referncia de Arsnio no Crebro (mg/Kg) : Normal Intox. Fatais 0 a 0,025; valor mdio 0,009 (Baselt, 2004) 0,2 a 4,0; valor mdio 1,7 (Baselt, 2004)
Valores de Referncia de Arsnio no Bao (mg/Kg) : Normal Intox. Fatais ?? 0,5 a 62; valor mdio 8,8 (Baselt, 2004)
Sendo o arsnio um analito que apresenta grandes dificuldades na sua determinao, quer devido amostragem, quer devido a erros analticos, deve fazer-se uma ressalva de que muitos dos resultados encontrados na bibliografia podero estar incorrectos. No entanto, ser natural verificar uma grande variabilidade nos nveis de arsnio encontrados na urina, no cabelo, nas unhas, no sangue, no soro, na pele etc., porque a sua concentrao fortemente influenciada por diversos factores como, por exemplo, a exposio ambiental, ocupacional e a dieta.
Os principais indicadores biolgicos de exposio ao arsnio so, por diversas razes, como se explica em seguida, o sangue, a urina, o cabelo e tambm as unhas.
2.1.4.1 A amostra de sangue

Devido ao curto perodo de semi-vida do arsnio (T1/2: 7h) (Baselt, 2004), o estudo dos nveis deste elemento no sangue s tem utilidade poucos dias aps uma exposio aguda, no sendo til para avaliar se existe exposio crnica, a menos que se faa uma avaliao continuada dos nveis de arsnio de um indivduo exposto de forma crnica a este elemento (Casarett e Doulls, 1996; INCHEM, 2001).
Dados da colheita: 10ml de sangue em tubo com K-EDTA.
2.1.4.2 A amostra de urina

O arsnio encontrado na urina o melhor indicador de uma exposio actual ou recente, no entanto deve ter-se em considerao os alimentos ingeridos nos dias anteriores determinao, j que alguns organismos marinhos contm concentraes elevadas de arsnio orgnico que, como referido anteriormente, excretado sem qualquer metabolizao, alterando significativamente o resultado de arsnio obtido, podendo gerar interpretaes erradas.
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Apesar da anlise da urina colhida durante 24 horas (urina de 24h) ser considerada a amostra ideal, pois inclui as flutuaes registadas nas taxas de excreo do arsnio, a maioria dos estudos de exposio a este elemento usam a primeira colheita de urina da manh ou ento uma colheita ao acaso, devido maior facilidade do procedimento. De qualquer forma, verificou-se que a colheita da primeira urina da manh correlaciona-se bem com a urina de 24h (ATSDR, 2002). Para diagnosticar uma exposio crnica ao arsnio conveniente efectuar a sua determinao nas amostras de urina, cabelo e/ou unhas, sendo estas as amostras biolgicas de eleio nos estudos toxicolgicos de arsnio (Casarett e Doulls, 1996; Baselt, 2004; ATSDR, 2005).
Dados de colheita: 20ml de urina em contentor de plstico universal, sem necessidade de conservantes.
2.1.4.3 As amostras de cabelo e/ou unhas

O cabelo e unhas so essenciais na avaliao da exposio a este elemento no passado, no entanto podem existir problemas de interpretao devido possvel existncia de contaminao externa. A concentrao de arsnio na raiz do cabelo encontra-se em equilbrio com a concentrao no sangue. O arsnio depositado no cabelo medida que este vai crescendo. Isto acontece porque o cabelo rico em queratina, protena esta que contm muita cistena, um aminocido que proporciona a fixao do arsnio de forma irreversvel devido ao seu grupo tiol (tambm designado sulfidril: R{-S-H}). O mesmo fenmeno explica a afinidade do arsnio pela pele e sua concentrao nas unhas. Medindo a concentrao de arsnio ao longo do cabelo, podemos obter uma medida integrada da exposio ao arsnio durante o perodo de tempo correspondente ao crescimento do cabelo em estudo. Sabe-se que a taxa de crescimento do cabelo em mdia 1 cm/ms, portanto um segmento de cabelo com 5 cm de comprimento vai corresponder aproximadamente a 5 meses de crescimento (ATSDR, 2001). A contaminao externa pode originar nveis elevados de arsnio no cabelo. A contaminao pelo ar, gua, solo, ou mesmo partculas de p podem depositar-se no cabelo ligando-se sua superfcie. Este arsnio pode ser resistente s lavagens,
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originando resultados elevados de arsnio (vide ponto 3.6.2 sobre preparao das amostras de cabelo e/ou unhas para anlise). A contaminao externa do cabelo aumenta potencialmente em cabelos compridos, que estiveram durante muitos meses ou anos expostos. O arsnio externamente ligado ao cabelo no tem qualquer actividade biolgica ou significado toxicolgico.
Dados de colheita: 0,5 g de cabelo colhido o mais prximo da raiz, por exemplo, atrs junto nuca. Esta quantidade de cabelo corresponde a uma mecha de cabelo com o dimetro aproximado de um lpis de carvo. Convm ser colocado em tubo de plstico, percebendo-se qual o lado da raiz e assim se manter at chegar ao local onde se realiza a anlise. A anlise pode efectuar-se tambm em unhas, aconselhando-se a colheita de cerca 0.5 g de unhas acondicionadas em contentor de plstico.
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2.1.5. A intoxicao por arsnio alguns casos e curiosidades

Na Idade Mdia, o arsnio (mais precisamente o trixido de arsnio p branco, sem sabor, nem cheiro) foi o veneno de eleio, tendo-se mantido essa preferncia at incio do sc. XX (Gontijo e Bittencourt, 2005). Isto porque os sintomas eram semelhantes aos da clera, bastante comum na altura, resultando na no deteco das intoxicaes por arsnio.
A intoxicao com arsnio quer acidental, quer deliberada, associada a inmeras doenas e mortes de personagens muito conhecidas da histria. Apresentam-se, em seguida, alguns exemplos de (alegadas ou comprovadas) vtimas da intoxicao por arsnio.
A sade de George III da Inglaterra (1736-1820) foi sempre motivo de preocupao enquanto este reinou. Ele sofreu periodicamente de mal-estar fsico e problemas mentais sendo necessrio, por diversas vezes, afast-lo dos seus deveres. Em 1969, investigadores afirmaram que os episdios de loucura e outros sintomas fsicos eram devido a porfria, doena que tambm tinha sido identificada em outros membros da sua famlia. Em 2004, estudos efectuados em amostras de cabelo deste rei revelaram nveis de arsnio extremamente elevados, que poderiam justificar os sintomas que ele apresentava em vida. Em 2005, um artigo do jornal mdico The Lancet sugere que a fonte do arsnio encontrado nas amostras poderia ser o antimnio usado como constituinte do tratamento mdico do rei. Estes dois minerais so encontrados vulgarmente nos mesmos solos, e a extraco mineral efectuada naquela altura no era suficientemente eficaz para eliminar o arsnio dos compostos que contm antimnio (Wikipedia, 2006).
Existe tambm uma famosa teoria que defende que Napoleo Bonaparte (1769-1821), sofreu e morreu de intoxicao por arsnio durante o seu cativeiro na ilha de Santa Helena. Amostras forenses do seu cabelo mostraram nveis de arsnio 13 vezes acima do considerado normal. No entanto, isto no prova que tenha ocorrido intoxicao deliberada de Napoleo pelos seus inimigos. O arsenito de cobre era extensamente usado como pigmento nos papis de parede, muito usados na altura, pelo que surgiu a suspeita de que a libertao microbiolgica de arsnio para o meio ambiente pudesse causar intoxicao por este elemento. No entanto, a ausncia de amostras autnticas deste papel de parede, no permite sustentar esta teoria.
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Alm desta hiptese, existe tambm a suspeita de que o arsnio presente nas amostras de cabelo possa ser resultado de contaminao externa proveniente dos solos da sepultura onde Napoleo Bonaparte esteve inicialmente durante 20 anos, na ilha de Santa Helena (Wikipedia, 2006).
Charles Francis Hall (1821-1871), um explorador americano, morreu repentinamente durante a sua 3 expedio ao rctico, a bordo do navio Polaris. Depois de beber uma chvena de caf, ele sentiu-se gravemente doente, durante uma semana sofreu de vmitos e delrios, tendo acusado vrios companheiros de expedio de o envenenarem, devido a graves desentendimentos. Mais tarde, em 1968, o bigrafo de Hall, Chancey C. Loomis, procedeu exumao do corpo do explorador. Foram analisadas amostras de osso, unhas e cabelo, cujos resultados mostraram que ele teria sido intoxicado com elevadas doses de arsnio durante as suas ltimas duas semanas de vida. Causa de morte essa, que consistente com os sintomas relatados pelos companheiros de expedio (Wikipedia, 2006).
Os pintores impressionistas usavam frequentemente o pigmento designado como verde-esmeralda. Este pigmento constitudo essencialmente por compostos de arsnio, suspeitando-se que tenha sido responsvel pela intoxicao acidental de alguns pintores como Cezanne, que desenvolveu uma diabetes grave (trata-se de um sintoma caracterstico da intoxicao por arsnio). A cegueira de Monet ou mesmo as perturbaes psquicas de Van Gogh, podem tambm ter sido parcialmente devidas ao uso do verde-esmeralda. A intoxicao com outras substncias vulgarmente usadas, como o absinto, os pigmentos de chumbo e de mercrio e outros solventes como a turpentina 3 , podem ser factores que tambm contriburam para os casos aqui apontados (Steven Marcus, 2007).
So vrios os sistemas do nosso organismo que podem ser afectados pelo arsnio, nomeadamente a pele, o aparelho respiratrio, o cardiovascular, o imunitrio, o urinrio e rgos genitais, o sistema reprodutivo, gastrointestinal e o sistema nervoso (INCHEM, 2001).
Fluido obtido a partir da destilao da resina recolhida das rvores.
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Fig. 4 Exemplos de leses na pele devido ao consumo de gua potvel contaminada com arsnio no Bangladesh (Safiuddin e Karin, 2001) (imagem disponvel em: http://www.engconsult.com/pub/ArsenicIEB.pdf)
Os compostos inorgnicos solveis de arsnio so extremamente txicos, a sua ingesto em doses elevadas conduz ao aparecimento de sintomas gastrointestinais (dores abdominais fortes e vmitos), distrbios no funcionamento dos sistemas cardiovascular e nervoso (cefaleias, delrios), podendo causar a morte. Nos sobreviventes a uma intoxicao por arsnio podem observar-se os seguintes sintomas, depresso da medula ssea 4 , hemlise 5 , hepatomegalia 6 , melanoses 7 , polineuropatias 8 e encefalopatias 9 .
Inmeros estudos epidemiolgicos mostraram que a exposio crnica ao arsnio, por exemplo devido ingesto de guas contaminadas, est relacionada com o aumento do risco de cancro na pele, pulmes, bexiga, rim, fgado e prstata, assim como com outras alteraes na pele, tais como hiperqueratose 10 e alteraes na pigmentao (INCHEM, 2001; Germolec et al, 1998). A relao causa/efeito, quanto s propriedades cancergenas deste elemento, foi confirmada quando se verifica a ingesto de gua contaminada com As arsnio/litro. A exposio ocupacional ao arsnio, principalmente por inalao est associada ao aparecimento do cancro no pulmo. 50g
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Diminuio da produo das clulas sanguneas. Destruio dos eritrcitos e libertao de hemoglobina no sangue circulante. 6 Aumento do fgado ou fgado hipertrfico. 7 Hiperpigmentao da pele. 8 Distrbio neurolgico devido a leses nervosas perifricas. 9 Patologias cerebrais, transtornos do sistema nervoso central (SNC). 10 Resultante de uma produo excessiva de protenas, denominadas queratinas.
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A exposio crnica ao arsnio em Taiwan foi associada doena designada como Blackfoot disease (BFD), uma forma severa de doena do sistema vascular perifrico, que conduz a situaes de gangrena. Esta doena no foi documentada noutros locais do mundo e estes achados em Taiwan podero estar associados tambm a outros factores contributivos. Existem, no entanto, outras evidncias reunidas a partir de estudos efectuados em vrios pases, que sustentam a tese de que a exposio ao arsnio causa outras formas de doenas do sistema vascular perifrico (INCHEM, 2001).
A contaminao das guas subterrneas e o impacto negativo dessa contaminao no homem foi j registado em vinte e trs pases. A situao particularmente grave na ndia e no Bangladesh (Rahman et al, 2005). Estes dois casos de contaminao de guas subterrneas deram j origem a inmeras publicaes cientficas, onde so relatados os problemas de sade pblica encontrados, as tcnicas analticas e de amostragem usadas na avaliao desta contaminao (Van Geen et al, 2003; Smith et al, 2000; Roychowdhury et al, 1999; Tondel et al, 1999; Chowdhury et al, 2000; Rahman et al, 2001; Chowdhury et al, 2001; Chakraborti et al, 2002; Rahman et al, 2002; Mandal et al, 2002; Guha Mazumder et al, 2000). O estudo relativo contaminao de vrias regies da ndia j dura h mais de vinte anos. Analisando a figura que se segue (Fig.5) podemos ter uma ideia actualizada da extenso dessa contaminao.
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Fig.5 - Mapa que ilustra os nveis de contaminao com arsnio das guas subterrneas de Bengala Ocidental - ndia. Imagem retirada da Internet em 2008 Fev 20. Disponvel em: http://www.soesju.org/arsenic/wb.htm
Nos ltimos anos, surgiram evidncias de contaminao das guas subterrneas noutros pases asiticos, incluindo por exemplo o Cambodja, Myanmar e Paquisto. Estes nveis de contaminao e a sua relao com leses encontradas na pele tambm foram relatados no Nepal, Vietname, Iro e outras regies.
As notcias, quer nacionais, quer internacionais ilustram a preocupao que existe ao nvel ambiental e de sade pblica relativamente a esta substncia.
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De acordo com investigadores nesta rea, cerca de 140 milhes de pessoas, principalmente em pases em desenvolvimento, esto a ser envenenadas por arsnio na gua potvel (BBC, 2007).
Em Portugal, em diferentes regies, ao longo do tempo, foram-se registando nveis de arsnio em gua potvel acima do limite mximo permitido (10g/l), como se pode evidenciar pelas notcias recolhidas em vrios sites da internet ou atravs de consulta dos relatrios anuais sobre qualidade das guas de consumo do IRAR (Instituto Regulador de guas e Resduos; disponvel em www.irar.pt ):
Vilares continua a beber gua contaminada da rede () a pior situao verifica-se na aldeia de Valbom (Vila Flor) que h 4 anos consecutivos detm o galardo do mais alto nvel de arsnio do pas (Jornal de Notcias, 2004). Entre 2000 a 2003 encontraram-se valores de arsnio na gua da rede 15 a 80 vezes superiores ao limite mximo permitido.
Em
Baio,
autotanques
substituem
fornecimento
de
gua
contaminada com arsnio(RTP, 2005).
Cerca de 60 mil portugueses bebem gua com arsnio a mais () portugueses consumiram gua contaminada com doses excessivas de arsnio em 2004. Este um dos principais problemas que ressaltam dos dados de base do ltimo relatrio anual sobre a qualidade da gua em Portugal, divulgado pelo Instituto Regulador de guas e Resduos (IRAR) no final do ano passado.(Jornal O Pblico, 2006)
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2.1.6. O processo de digesto das amostras

Apesar da digesto ser um processo sobejamente conhecido e extensamente usado desde h muito tempo em inmeras determinaes analticas, muitos investigadores continuam ainda a procurar o mtodo de digesto ptimo. Este processo fundamental, j que a escolha inadequada do mtodo de digesto pode causar importantes erros que culminam na perda dos elementos de interesse, por exemplo, por adsoro na matria orgnica residual ou por contaminao das amostras atravs de contaminantes provenientes do ar, dos recipientes do laboratrio ou pelo uso de cidos com pureza insuficiente (Loska, 2006).
Normalmente so usados dois tipos de digesto: a digesto hmida ou a digesto seca. O processo de digesto seca consiste na incinerao da matria orgnica desde os 450 aos 800C em vasos abertos. O uso deste tipo de digesto encontra-se limitado devido volatilidade das ligaes de alguns elementos. A adio de determinados compostos como, por exemplo, xido de magnsio (MgO) ou nitrato de magnsio (Mg(NO3)2) diminui a volatilidade dos elementos e acelera a decomposio da amostra. Infelizmente, este processo tem a desvantagem de consumir muito tempo. No processo de digesto hmida a matria orgnica decomposta aplicando cidos concentrados com efeito oxidante. Os cidos ntrico, sulfrico e perclrico so os mais comuns. A digesto hmida pode ocorrer em sistema aberto ou fechado, vulgarmente designados por digesto hmida em vaso aberto ou digesto hmida em vaso fechado. De entre os sistemas anteriores, a digesto em vaso aberto a mais popular, no entanto esta encontra-se limitada devido s baixas temperaturas de decomposio que podem ser aplicadas. As temperaturas de digesto no podem exceder o ponto de ebulio de um determinado cido ou mistura de cidos presso atmosfrica. Outras desvantagens deste tipo de digesto so um maior risco de contaminao, a necessidade de usar maior volume de cidos e finalmente a perda de analito devido sua volatilidade. A digesto em vaso fechado diminui o risco de contaminao e perdas de analito causadas pela volatilidade dos elementos. Nos ltimos anos a digesto com microondas tem vindo a ganhar popularidade. A aplicao da tecnologia microondas, de um modo geral, diminui o tempo de
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preparao da amostra possibilitando igualmente a digesto completa da matria orgnica. Tambm reduz a perda de elementos e a contaminao da amostra quando comparada com outros mtodos de digesto. Um mtodo de digesto aplicando microondas pode ser 10 a 100 vezes mais rpido do que um mtodo tradicional, dependendo do material que est a ser tratado.
2.1.7. Estudo dos processos de digesto

Neste trabalho estudou-se a hiptese de aplicao da tecnologia microondas na digesto de amostras biolgicas para determinao de arsnio, assim como o processo de digesto hmida em vaso aberto.
O processo de digesto por microondas consiste na colocao da amostra, juntamente com cidos e/ou outros agentes oxidantes adequados, dentro de um vaso fechado equipado com vlvulas de libertao de presso. Este , por sua vez, submetido a energia microondas num forno devidamente construdo para o efeito. As condies de alta presso geradas no vaso, acopladas ao rpido aquecimento do contedo do vaso por aco da energia microondas fornecida s molculas de cido, conduzem dissoluo da amostra de uma forma rpida, menos sujeita a contaminaes e menos propensa a perdas de analito por volatilizao, factores estes mais problemticos na digesto em placa com vaso aberto (Vaz e Baio, s.d.). Este processo torna-se menos moroso e utiliza menor quantidade de reagentes quando comparado com os processos de digesto convencionais.
O processo de digesto hmida em vaso aberto consiste na colocao da amostra, juntamente com cidos e/ou outros agentes oxidantes adequados, mas desta feita num vaso aberto que , em seguida, submetido a aquecimento a temperaturas elevadas (200 a 300C aproximadamente). O aquecimento pode ser efectuado por diversas vias, como por exemplo em placa elctrica, numa manta de aquecimento ou ento em bicos de Bunsen. Neste estudo testaram-se diferentes combinaes de cidos, fazendo variar os seus volumes, com o objectivo de encontrar a combinao que proporcionasse os resultados mais satisfatrios. O objectivo deste estudo foi o de determinar o tipo de reagentes (mistura de cidos) a adicionar, e o seu rcio ptimo, com base nos resultados da recuperao de arsnio aplicando o mtodo de digesto a amostras com concentrao conhecida de arsnio.
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2.2. Validao de mtodos analticos

Validar um mtodo analtico consiste em demonstrar que ele adequado para o fim a que se destina. Ou seja, um laboratrio deve validar mtodos no normalizados, mtodos criados ou desenvolvidos pelo prprio laboratrio, mtodos normalizados utilizados fora do seu mbito de utilizao e extenses ou modificaes de mtodos normalizados, para confirmar que os mtodos so adequados utilizao a que se destinam (ISO/IEC 17025, 1999). A confiana nos resultados analticos um aspecto fundamental em toxicologia forense. Resultados no fiveis podem no apenas ser contestados em tribunal como, tambm, conduzir a decises legais injustificadas. Por tudo isto, a importncia da validao dificilmente poder ser sobrestimada, facto ainda mais relevante se o laboratrio estiver envolvido num contexto de gesto da qualidade e acreditao, aspectos que assumiram grande relevncia nos anos mais recentes (Peters e Maurer, 2002). Embora exista algum consenso quanto ao tipo de estudos a realizar no decorrer duma validao, subsiste grande diversidade de opinies quanto forma de os abordar. Por outro lado, o processo de validao de um mtodo no pode ser separado do seu desenvolvimento. O investigador no saber se as condies analticas so aceitveis at que o estudo de validao esteja completo. Por esta razo, o desenvolvimento e a validao de um mtodo constituem um processo iterativo: os resultados dos estudos de validao podem tornar necessria uma alterao no procedimento, que por sua vez carecer de novo estudo de validao (Franco, 2006). Em seguida, tecem-se alguns comentrios sobre os principais parmetros de validao habitualmente considerados.
2.2.1. Validao de Mtodos de Confirmao

No caso de mtodos de confirmao quantitativos, como o desenvolvido neste trabalho, existe algum consenso quanto necessidade de serem avaliados pelo menos os seguintes parmetros: selectividade/especificidade, modelo de calibrao (linearidade), estabilidade, preciso (repetibilidade, preciso intermdia), limites de deteco e quantificao. Deve ainda considerar-se a possibilidade de serem avaliados outros parmetros (e.g. recuperao, reprodutibilidade, robustez) (Peters e Maurer, 2002).
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2.2.1.1 Selectividade e Especificidade
Um dos aspectos mais relevantes da validao de um mtodo o de demonstrar a sua selectividade. Um mtodo analtico com reduzida selectividade ter como consequncia o surgimento de erros sistemticos. Os termos selectividade e especificidade so muitas vezes confundidos. Um mtodo instrumental de separao que produz resposta para uma nica substncia de interesse, normalmente um dado elemento, pode ser designado como especfico (e.g. mtodos espectrofotomtricos) e um mtodo que produz resposta para vrios compostos qumicos, com uma caracterstica em comum pode ser designado como selectivo (e.g. mtodos cromatogrficos). Os mtodos espectrofotomtricos asseguram resposta para uma nica substncia de interesse, devido aplicao de lmpada especfica que emite radiao ao comprimento de onda (cdo) caracterstico do elemento em estudo, por isso ser mais apropriado aplicar o termo especificidade (Ribani et al, 2004). Sendo assim, como esta dissertao incide sobre a aplicao de um mtodo espectrofotomtrico, a partir deste momento utilizar-se- o termo especificidade, como um dos parmetros de validao a estudar.
Pode descrever-se a especificidade de um mtodo analtico como sendo a capacidade de avaliar de forma inequvoca as substncias de interesse na presena de componentes que podem interferir com a sua determinao numa amostra complexa. A especificidade avalia o grau de interferncia de espcies como outros ingredientes activos, excipientes, impurezas e produtos de degradao, bem como outros compostos de propriedades similares que possam estar presentes (International Conference on Harmonization Q2(R1), 2005; Ribani et al, 2004).
Em absoro atmica podemos agrupar as interferncias em duas categorias: as interferncias espectrais e as no espectrais (Beaty e Kerber, 1993).
(a) As primeiras so aquelas em que a medio da energia absorvida errnea devido absoro por outras espcies que no o elemento de interesse. A interferncia espectral tipicamente encontrada a absoro de background que resulta do facto de que nem todos os materiais presentes na matriz so atomizados a 100%. Como os tomos tm linhas de absoro extremamente finas, existem alguns problemas de
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interferncia quando um elemento absorve ao comprimento de onda de outro elemento. Para resolver esta interferncia o equipamento de espectofotometria de absoro atmica tem disponvel a tcnica de correco de background atravs da emisso de forma contnua de luz branca, proveniente de uma lmpada designada como lmpada de background. Esta tcnica permite a medio e compensao automtica de qualquer componente de background que esteja presente numa medio de absoro atmica.
(b) Quanto s interferncias no espectrais, so aquelas que afectam a formao dos tomos do analito de interesse. As interferncias da matriz so as interferncias no espectrais mais comuns. Um mtodo especfico garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de interesse. Se a especificidade no for assegurada, a linearidade, preciso e exactido estaro seriamente comprometidas.
Uma maneira simples de avaliar a especificidade de um mtodo analtico consiste em demonstrar a ausncia de sinais analticos interferentes num conjunto de amostras brancas (mnimo de 6 amostras brancas de diferentes fontes) (Causon et al, 1997, International Conference on Harmonization Q2 B, 1996). No entanto esta abordagem foi criticada por alguns autores que, baseados em consideraes estatsticas, afirmaram que existe uma elevada probabilidade de que interferncias relativamente raras desta forma no sejam detectadas (Hartmann et al, 1998). Embora seja desejvel a total ausncia de interferncias na anlise, este objectivo frequentemente difcil de atingir, sobretudo quando se pesquisam substncias em amostras biolgicas complexas, como o sangue. Na prtica, ser necessrio aceitar a presena de pequenas interferncias, desde que no se comprometa de forma inaceitvel a identificao e/ou quantificao da substncia de interesse (Dadgar et al, 1995; Hartmann et al, 1998). Surge ento uma segunda abordagem na forma de avaliar a especificidade: sugere-se que amostras brancas sejam fortificadas com a substncia de interesse na concentrao mais baixa esperada, avaliando-se ento se os resultados so ou no aceitveis. Para este efeito, a presena de um interferente considerada inaceitvel quando afecta a capacidade de identificao e/ou a exactido da quantificao da substncia para concentraes prximas do respectivo limite de quantificao (Dadgar et al, 1995).
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Comparam-se, ento, os sinais analticos produzidos pela matriz isenta da substncia de interesse, a chamada amostra branca, com os sinais produzidos pela matriz adicionada com a substncia de interesse (Ribani et al, 2004). No entanto, nem sempre possvel ter uma matriz isenta da substncia de interesse. Neste caso, para avaliar a especificidade aplica-se o mtodo adio padro, onde se compara a curva analtica com adio da substncia de interesse na amostra com a curva analtica sem a presena da matriz (Ribani et al, 2004). Se as duas curvas forem paralelas, pode dizer-se que no h interferncia da matriz na determinao da substncia de interesse, portanto o mtodo especfico.
2.2.1.1.1 Mtodo adio padro

Quando no existe outra forma de compensar a interferncia da matriz pode usar-se o mtodo adio padro (MAP). Esta tcnica permite trabalhar na presena deste tipo de interferncia sem a eliminar e assim efectuar uma determinao do analito em estudo com nveis de exactido e preciso aceitveis. Neste mtodo construda uma curva de calibrao na presena da matriz. Aliquotas de padro a nveis de concentrao diferentes so adicionadas a pores de amostra, permitindo que qualquer interferente presente na amostra afecte de forma similar o padro. A figura seguinte (Fig. 6) ilustra o MAP. A linha que passa pela origem representa uma curva de calibrao tpica de um conjunto de calibradores aquosos. A absorvncia zero definida com um branco de reagentes (e.g. gua desionizada) e medida que a concentrao do analito aumenta, observado um aumento linear nas absorvncias.
Fig. 6 - Grfico que ilustra a aplicao do mtodo adio padro (Manual Perkin Elmer, 1996).
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Preparando um conjunto de aliquotas equivalentes da amostra, em que primeira aliquota nada adicionado, segunda aliquota adicionado uma determinada quantidade de padro, terceira aliquota adicionado uma quantidade maior de padro e assim sucessivamente, analisando este conjunto de amostras verifica-se o seguinte: Se no existir interferncia desta amostra, a representao grfica dos resultados obtidos da absorvncia versus concentrao das amostras fortificadas ser paralela curva de calibrao resultante dos calibradores aquosos. Se algum material presente na amostra causa interferncia da matriz, o nmero de tomos no estado fundamental responsveis pela absoro atmica ser afectado, assim como a absorvncia do analito na amostra no fortificada. A absorvncia lida nas amostras fortificadas a diferentes nveis vai ser tambm afectada na mesma proporo, j que a concentrao do interferente a mesma em cada uma das solues. Assim, resulta igualmente uma recta, mas que devido interferncia da matriz ter um declive diferente da calibrao com padres aquosos (Manual Perkin Elmer, 1996). A concentrao da substncia de interesse na amostra pode ser determinada grfica e matematicamente. O ponto onde a recta do MAP corta o eixo das ordenadas corresponde (nesta tcnica) leitura da absorvncia da substncia que est a ser determinada, sem qualquer adio de padro. A extrapolao da recta define no eixo das abcissas a concentrao da substncia na amostra analisada (Ribani et al, 2004).
O MAP um procedimento indirecto de determinao da concentrao, que nunca ser to exacto e preciso quanto uma determinao directa da concentrao a partir de uma curva de calibrao. sempre prefervel eliminar as interferncias atravs da escolha de condies analticas apropriadas ou, se possvel, atravs do tratamento qumico da amostra em vez de usar o mtodo adio padro. Este mtodo deve ser sempre encarado como ltimo recurso em vez de um mtodo de eleio.
2.2.1.2 Modelo de Calibrao

A escolha de um modelo de calibrao adequado fundamental para a obteno de resultados quantitativos fiveis. ento necessrio investigar a relao entre a concentrao de analito na amostra e a correspondente resposta do detector (Peters e Maurer, 2002).
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Tipicamente, so preparadas solues contendo concentraes conhecidas da substncia que se pretende pesquisar (calibradores) e procede-se, em separado, anlise instrumental de cada uma destas solues de acordo com um procedimento analtico bem definido. Para cada uma, o instrumento ir gerar um sinal proporcional concentrao da substncia. A curva de calibrao depois construda, representando os sinais obtidos no eixo y e as correspondentes concentraes no eixo x, a partir da qual, por interpolao, se estima a concentrao do analito. A deciso quanto ao tipo de linha (e.g. recta, curva) a desenhar entre os pontos de calibrao requer uma avaliao cuidada, pois isso ter repercusses no s no clculo das concentraes como tambm no valor dos limites de quantificao e de deteco do mtodo analtico (Miller, 1991). Normalmente os calibradores devem ser preparados atravs da fortificao de amostras brancas. Ou ento, na impossibilidade de existncia de amostras brancas (situao que se aplica ao arsnio sempre presente nas amostras biolgicas), pode aplicar-se o mtodo adio padro (vide ponto 2.2.1.1.1), em que so fortificadas aliquotas da amostra a quantificar e posteriormente so todas submetidas ao mesmo pr-tratamento. No entanto, a aplicao deste mtodo s possvel quando no existe escassez de amostra, situao que no mbito dos processos forenses rara. Sendo assim, sempre que existe a possibilidade de evitar a utilizao deste mtodo, sem que se diminua de forma significativa a qualidade dos resultados obtidos, deve optar-se por faz-lo, quer devido frequente escassez de amostra, quer devido ao aumento considervel no trabalho experimental e analtico que este mtodo impe. Nas amostras biolgicas habitualmente analisadas em contexto forense, o sinal analtico resultante da prpria matriz pode ser bastante relevante, mesmo quando se utilizam tcnicas com elevada especificidade como a AAS. Devemos contudo relembrar que a aplicao desta tcnica, na maioria das suas determinaes, pressupe a destruio da matria orgnica presente na amostra, o que partida dever minorar o efeito de matriz. Da que seja de extrema importncia estudar a especificidade do mtodo, que uma vez garantida, permitir o uso de calibradores aquosos sem comprometer a linearidade, preciso ou exactido do mtodo.
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2.2.1.3 Linearidade
A linearidade de um mtodo analtico, dentro de uma determinada gama de concentraes, consiste na sua capacidade em permitir obter resultados directamente proporcionais concentrao do analito numa amostra
(International Conference on Harmonization (Q2A), 1994). A existncia de linearidade deve ser sempre comprovada (Miller, 1991). As recomendaes quanto ao nmero de pontos de calibrao necessrios para o estudo da linearidade de um mtodo diferem bastante consoante os autores. De um modo geral, recomendada a utilizao de cinco a oito pontos para o estudo de relaes lineares e, eventualmente, mais pontos para as no lineares (Bressole et al, 1996; Causon, 1997; Lindner e Wainer, 1998). Outros autores consideram que, do ponto de vista da anlise estatstica, mais vantajoso a utilizao de um menor nmero de nveis de calibrao, mas com mais replicados (e.g. trs nveis de calibrao e at nove replicados), o que permite detectar mais facilmente a presena de pontos anmalos ou a necessidade de utilizar factores de ponderao na calibrao (Hartmann et al., 1998). Aps a verificao da linearidade do mtodo pode ser menor o nmero de calibradores utilizados na elaborao das curvas de calibrao para
quantificao de analitos em anlises de rotina, sendo que, para alguns autores, a utilizao de trs calibradores considerada suficiente (Society of Forensic Toxicology/American Academy of Forensic Sciences, 2002).
Os critrios de aceitao da calibrao devem tambm estar definidos de forma clara. O coeficiente de correlao 11 , permite estimar a qualidade da curva calibrao, sendo considerado aceitveis valores iguais ou superiores a 0,99. Podem, contudo, existir circunstncias em que este valor possa ser inferior, cabendo ao laboratrio evidenciar os motivos e definir os critrios de aceitao (Society of Forensic Toxicology/American Academy of Forensic Sciences, 2002). considerada uma boa prtica calcular a concentrao de cada um dos calibradores a partir da respectiva curva de calibrao, sendo aceites intervalos de 20% para a maioria das aplicaes (Society of Forensic Toxicology/American Academy of Forensic Sciences, 2002).
Quanto mais prximo de 1, menor a disperso do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regresso estimados.
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Em toxicologia forense, algumas amostras podem conter concentraes elevadas das substncias a analisar, podendo por isso influenciar o resultado da amostra seguinte (fenmenos de carryover ou arrastamento). Este facto deve merecer particular ateno dado ser normal as amostras serem agrupadas em lotes. Embora a avaliao de fenmenos de carryover deva ser objecto de estudo durante a validao do mtodo, recomenda-se que sejam sempre feitas quantificaes em duplicado. Esta precauo permite tambm detectar a ocorrncia de resultados anmalos, isto , resultados analticos que se desviam consideravelmente do valor verdadeiro. Devem tambm estar definidos quais os critrios de aceitao de resultados em duplicado (Franco, 2006).
2.2.1.4 Gama de Trabalho

Na quantificao duma substncia qualquer tipo de extrapolao deve ser evitada, pelo que deve estar definida quer a concentrao mais baixa, quer a mais elevada passvel de ser quantificada com nveis de preciso e exactido aceitveis. O intervalo entre estes dois valores define a gama de trabalho. Deve referir-se que a gama de trabalho no tem de coincidir obrigatoriamente com a gama de concentraes dos calibradores usados na elaborao da curva de calibrao. Em anlises biolgicas aceitvel quer diluir as amostras, quer extrair do dobro do volume para permitir o clculo de concentraes por interpolao, desde que fique demonstrado, nestes casos, a ausncia de efeito de matriz (Society of Forensic Toxicology/American Academy of Forensic Sciences, 2002; Hartmann et al., 1998). Caso no se justifique a quantificao exacta de um analito presente em concentraes baixas, o resultado deve ser expresso como sendo inferior concentrao do calibrador mais baixo, em alternativa expresso concentrao vestigial. Em concluso, a gama de trabalho corresponde ao intervalo entre a concentrao mais baixa da substncia na amostra (sem considerar a extraco de volumes superiores ao habitual) e a concentrao mais alta (sem proceder a diluies) para a qual seja possvel documentar valores de preciso e exactido aceitveis
(Hartmann, 1998).
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2.2.1.5 Preciso
A preciso de um mtodo bioanaltico representa a disperso de resultados entre ensaios independentes repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres (Ribani et al, 2004). A preciso expressa como o coeficiente de variao em percentagem ou o desvio padro relativo desses resultados. De uma maneira geral so considerados trs nveis de preciso: repetibilidade, preciso intermdia e reprodutibilidade (International
Conference on Harmonization (Q2A), 1994).
A repetibilidade exprime a preciso obtida em condies de trabalho idnticas 12 e num curto intervalo de tempo, representando a concordncia entre os resultados de medies sucessivas de um mesmo mtodo. A repetibilidade tambm frequentemente denominada como preciso intraensaio.
A preciso intermdia exprime a influncia das variaes que ocorrem num laboratrio (e.g. equipamentos, analistas ou dias diferentes). Este parmetro reconhecido como o mais representativo da variabilidade dos resultados dentro de um mesmo laboratrio e como tal, mais aconselhvel de ser adoptado (Ribani et al, 2004).
O termo reprodutibilidade exprime a preciso encontrada quando se comparam resultados obtidos a partir de diferentes laboratrios (e.g. ensaios
interlaboratoriais) (International Conference on Harmonization (Q2A), 1994). Alguns autores utilizam o termo reprodutibilidade na avaliao de resultados obtidos apenas por um laboratrio, em condies de preciso intermdia. Isto deve ser evitado de forma a prevenir problemas de interpretao quanto ao desempenho dos mtodos em avaliao (Peters e Maurer, 2002). Os dados provenientes de apenas um laboratrio no so suficientes para avaliar a reprodutibilidade. necessrio recorrer a estudos de colaborao
Tambm designadas condies de repetibilidade: mesmo procedimento, mesmo analista, mesmas condies, mesmo local, repeties num curto intervalo de tempo.
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entre laboratrios 13 , indispensveis para avaliar a reprodutibilidade e testar a exactido do mtodo (Ribani et al, 2004).
2.2.1.6 Exactido (Veracidade)

A exactido de um mtodo representa o grau de concordncia entre os resultados individuais encontrados por esse mtodo e um valor de referncia aceite como verdadeiro, sendo afectada por erros sistemticos e aleatrios. Contudo, por vezes utilizada apenas para descrever a componente de erro sistemtico, podendo expressar-se sob a forma de um desvio percentual (Causon, 1997; Peters e Maurer, 2002; Ribani et al, 2004). A veracidade deve exprimir o grau de concordncia entre o valor mdio de um grande nmero de medies e um valor aceite como referncia (Jornal Oficial das Comunidades Europeias (L221), 2002).
2.2.1.7 Limites de Deteco e Quantificao

O limite de deteco (LD) de um mtodo analtico corresponde menor quantidade de um analito que pode ser detectada mas no necessariamente quantificada como um valor exacto (International Conference on
Harmonization (Q2A), 1994). No caso de mtodos quantitativos, pode no ser fundamental estimar este parmetro, uma vez que o grande interesse recai em saber qual a menor quantidade que pode efectivamente ser quantificada. Contudo, usual a sua determinao (Hartmann et al, 1998).
O limite de quantificao (LQ) corresponde menor quantidade de um analito que pode ser determinada quantitativamente com uma preciso e exactido adequadas utilizando um determinado procedimento experimental. Por definio, a quantificao abaixo do LQ no aceitvel. Sendo assim, resultados abaixo deste valor apenas devem ser expressos como semiquantitativos ou qualitativos. Normalmente aceitvel que o LD e o LQ correspondam concentrao do calibrador mais baixo utilizado para construir a curva de calibrao (Society of Forensic Toxicology/American Academy of Forensic Sciences, 2002). Contudo,
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IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) aconselha estudos colaborativos no mnimo entre 5 laboratros, sendo recomendvel 8 laboratrios.
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caso se pretenda reportar valores inferiores concentrao do calibrador mais baixo, estes parmetros devem ser determinados. O clculo destes limites pode ser feito de diferentes formas, devendo, contudo, o analista estar consciente de que alguns mtodos de clculo podem conduzir a valores de LD e LQ desfasados da realidade. Uma das aproximaes mais prticas para o seu clculo baseia-se no estudo da razo sinal/rudo (S/R), aplicvel a procedimentos analticos que mostrem o rudo da linha de base. Para determinar a razo sinal/rudo feita a comparao entre a medio dos sinais de amostras com baixas concentraes conhecidas do analito de interesse e medio dos sinais produzidos por brancos (matriz isenta do composto de interesse) (Ribani et al, 2004). Na estimativa do LD e LQ usual considerar-se que as razes S/R devem ser pelo menos iguais a 3 e a 10, respectivamente (International Conference on Harmonization (Q2B), 1996). Por vezes, difcil a estimativa do S/R em mtodos bioanalticos. De qualquer modo, e independentemente da frmula de clculo utilizada, o laboratrio deve verificar se os valores estimados correspondem realidade. Para isso deve fortificar amostras brancas com o analito de interesse na concentrao estimada para o LQ e comprovar se, efectivamente, possvel obter resultados aceitveis para a preciso e para a exactido (e.g. 20%) (Peters e Maurer, 2002). O clculo destes limites pode tambm ser feito com dados obtidos de curvas de calibrao construdas a partir da anlise de amostras fortificadas no intervalo inferior da gama de trabalho (International Conference on Harmonization (Q2B), 1996; Peters e Maurer, 2002). Neste clculo no se devem utilizar dados obtidos de curvas de calibrao estabelecidas para toda a gama de trabalho, pois desse modo obter-se-iam valores de LD e LQ superiores aos que o mtodo efectivamente capaz de atingir (Peters e Maurer, 2002).
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2.2.1.8 Incerteza da Medio

A incerteza da medio definida como o parmetro que caracteriza a disperso dos valores que podem ser, razoavelmente, atribudos mensuranda (e.g. concentrao de uma substncia), e tambm considerado um conceito importante em qumica analtica (Eurachem/Co-operation on International Traceability in Analytical Chemistry, 2000). Tendo em considerao a complexidade dos mtodos utilizados em toxicologia forense, a avaliao da contribuio das componentes individuais para a incerteza combinada dos resultados seria demorada e dispendiosa. Por isso, prefervel estimar este parmetro a partir dos dados obtidos na validao, especialmente os referentes preciso e exactido. Contudo, podem existir componentes importantes para a estimativa da incerteza que no estejam abrangidos pelas experincias de validao (Peters e Maurer, 2002).
2.2.1.9 Controlo de Qualidade

Devem ser adoptados procedimentos de controlo de qualidade que permitam validar os resultados de maneira fundamentada. As amostras, habitualmente analisadas de forma agrupada (conjuntos ou lotes), so preparadas e analisadas contemporaneamente, o que requer cuidados acrescidos, nomeadamente a introduo de amostras de controlo. Estas so em tudo semelhantes s restantes amostras, diferindo por ser conhecida a identidade e a concentrao da(s) substncia(s) que se pretendem analisar. Em cada lote de amostras, e independentemente do seu nmero, os controlos de qualidade devem ser processados em paralelo (Franco, 2006). No caso de ensaios quantitativos, a anlise do controlo negativo deve ser capaz de evidenciar a ausncia de substncia a analisar ou produzir uma resposta analtica inferior ao limite de deteco do mtodo. Para o controlo positivo, e para a maioria das substncias pesquisadas, aceitvel esperar que o resultado quantitativo esteja dentro de um intervalo de 20 %. Contudo, e para concentraes prximas do limite de quantificao do ensaio, ser mais realista adoptar um intervalo de aceitao de 25-30 %. A anlise quantitativa da amostra controlo deve pois fornecer um resultado dentro de um intervalo de variao previamente definido ao redor de um valor terico. Caso contrrio, o resultado deve ser reportado como fora de controlo e, consequentemente, os resultados obtidos para as amostras desconhecidas no podem ser aceites
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como vlidos (Society of Forensic Toxicology/American Academy of Forensic Sciences, 2002). Dada a dificuldade de obteno de materiais de controlo comerciais representativos do tipo de matrizes analisadas em toxicologia forense (e.g. sangue ou tecidos decompostos), aceitvel a preparao de controlos a partir de amostras (e.g. sangues, urinas) oriundas de casos j analisados (Society of Forensic Toxicology/American Academy of Forensic Sciences, 2002).
Os resultados obtidos a partir da anlise de amostras controlo devem ser registados de maneira a permitir a deteco de tendncias que resultem da deteriorao de reagentes, calibradores ou controlos. A representao grfica dos resultados (e.g. grfico de Levey-Jennings, vulgarmente designado como carta de controlo ou control chart, que permite a aplicao das regras de westgard 14 ) e o clculo de coeficientes de variao podem fornecer informao bastante til sobre a preciso do ensaio (Society of Forensic
Toxicology/American Academy of Forensic Sciences, 2002).
2.2.1.10 Apresentao de Resultados

Os resultados de cada ensaio devem ser apresentados de forma exacta, clara, inequvoca e objectiva (ISO/IEC 17025,1999). A terminologia utilizada nos relatrios deve obedecer a critrios previamente definidos. Um resultado positivo significa que uma substncia foi
identificada de acordo com os critrios adoptados pelo laboratrio. As expresses negativo ou no detectado so utilizadas para indicar a ausncia das substncias pesquisadas. A expresso no detectado , contudo, prefervel, pois significa a ausncia dessas substncias dentro dos limites (e.g. limite de deteco) do mtodo utilizado (Franco, 2006). Os resultados expressos num relatrio podem ser qualitativos ou quantitativos. Um resultado qualitativo deve indicar o nome da substncia (ou classe de substncias) seguido da expresso positivo ou no detectado. Tambm a reduo no nmero de calibradores utilizados (para diminuir o tempo de anlise) pode obrigar a alguns cuidados na forma como elaborado um relatrio quantitativo. Assim, um valor de concentrao inferior ao limite de
As regras de westgard, so regras estatsticas que permitem verificar a fiabilidade dos resultados e quando aplicadas s cartas de controlo, permitem indiciar tipos de erro e decidir rapidamente a necessidade de repetir um ensaio ou a no-aceitao de um resultado.
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quantificao do mtodo deve ser reportado tendo em conta esse facto (e.g. resultado positivo para a substncia x numa concentrao inferior a y g/L). O mesmo deve ser tido em conta se a concentrao estimada exceder a concentrao do calibrador mais elevado (Franco, 2006). Nos casos em que exista forte justificao para o envio de resultados ainda no totalmente confirmados (e.g. anlises solicitadas por um servio de urgncia hospitalar ou equivalente), o laboratrio deve garantir que o destinatrio entende que esses resultados so passveis de alterao e/ou que o surgimento de resultados subsequentes pode afectar de modo significativo o relatrio final ou a sua interpretao (Society of Forensic Toxicology/American Academy of Forensic Sciences, 2002).
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2.3. Enquadramento Legal

A legislao que limita o uso, aplicaes e teores de arsnio e seus compostos muito extensa e cada vez mais exigente. Encontramos legislao relativa aos limites mximos permitidos de arsnio nas guas de consumo, em guas minerais, no ar ambiente, em produtos alimentares como o azeite, em materiais de plstico que entram em contacto com produtos alimentares, em aditivos alimentares, corantes, edulcorantes, etc. Em seguida apresenta-se alguma da legislao que aborda esta temtica. Tendo em considerao a importncia que a gua tem na dieta alimentar, comeamos por apresentar a legislao relativa ao valor paramtrico (VP) do arsnio (concentrao mxima de arsnio permitida) em guas de consumo humano e guas minerais.
O Decreto-Lei n. 58/2005, de 29 de Dezembro, e o Decreto-Lei n. 77/2006 que o vem completar, estabelecem um quadro de aco comunitria no domnio da poltica da gua, apresentando o arsnio e respectivos compostos, como sendo um dos principais poluentes das guas, apontando para a necessidade de monitorizao dos seus nveis em guas subterrneas, superficiais e zonas de proteco. O Decreto-Lei n. 243/2001, de 5 de Setembro, que regula a qualidade da gua destinada ao consumo humano e tem por objectivo proteger a sade humana dos efeitos nocivos resultantes de qualquer contaminao da gua destinada ao consumo humano, assegurando a sua salubridade e limpeza, apresenta 10 g/l como o teor mximo de arsnio permitido nas guas de consumo. Este diploma estabelece tambm os locais e a frequncia mnima de amostragem para os diferentes parmetros monitorizados. Verifica-se ento que o arsnio, deve ser monitorizado pelo menos uma vez por ano nos pontos obrigatrios de recolha. No recente Decreto-Lei n. 306/2007, de 27 de Agosto, procede-se reviso do Decreto-Lei n. 243/2001, de 5 de Setembro, que transps para o ordenamento jurdico interno a Directiva n. 98/83/CE, do Conselho da Europa, de 3 de Novembro, apresentado no pargrafo anterior. Este diploma vem estabelecer ainda os critrios de repartio da responsabilidade pela gesto de um sistema de abastecimento pblico de gua para consumo humano, quando a mesma seja partilhada por duas ou mais entidades gestoras.
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O arsnio definido neste diploma como parmetro conservativo, sendo este tipo de parmetros obrigatoriamente controlados pelas entidades gestoras que produzem gua para consumo humano. Para alm do arsnio, so considerados parmetros conservativos a acrilamida, o antimnio, o benzeno, o boro, bromatos, o cdmio, os cianetos, mercrio, os pesticidas, a radioactividade e o selnio entre outros. O parmetro arsnio faz parte do controlo de inspeco, um dos trs tipos 15 de controlos apresentados neste diploma, sendo monitorizado pelo menos uma vez por ano, em zonas de abastecimento que forneam um volume de gua 1000m3/dia.
Adicionalmente so especificadas caractersticas de desempenho dos mtodos analticos a utilizar na determinao dos diferentes parmetros, mais
concretamente, a determinao de arsnio deve apresentar valores de exactido, preciso e um limite de deteco na ordem dos 10% do valor paramtrico (ou seja, 1g/l).
O Decreto-Lei n. 72/2004, de 25 de Maro estabelece a lista, os limites de concentrao e as menes constantes do rtulo para os constituintes das guas minerais naturais, bem como as condies de utilizao de ar enriquecido em ozono para o tratamento das guas minerais naturais e das guas de nascente. Isto porque, em determinadas guas minerais naturais, podem estar presentes, no estado natural, constituintes que devido sua origem hidrogeolgica, podem representar um risco para a sade pblica a partir de uma certa concentrao. Assim, foi previsto a nvel comunitrio a possibilidade de se adoptarem limites de concentrao harmonizados para os constituintes das guas minerais naturais, aps consulta ao Comit Cientfico da Alimentao Humana, que emitiu parecer sobre o arsnio, o brio, o flor, o boro e o mangans, tendo validado, para outros constituintes das guas minerais, os limites recomendados pela Organizao Mundial de Sade (OMS) para a gua destinada ao consumo humano. Em guas minerais, o arsnio total deve ser inferior a 0,010 mg/l (ou 10 g/l). Na determinao analtica deste parmetro so exigidas as mesmas caractersticas de desempenho apresentadas atrs para a anlise das guas de consumo (10% do valor paramtrico para os valores de exactido, preciso e limite de deteco).
Os outros dois tipos de controlo referido no diploma em questo so: controlo de rotina 1 e controlo de rotina 2.
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O Decreto-Lei n. 351/2007, de 23 de Outubro, transpe para a ordem jurdica interna a Directiva n. 2004/107/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 15 de Dezembro, relativa ao arsnio, ao cdmio, ao mercrio, ao nquel e aos hidrocarbonetos aromticos policclicos no ar ambiente, e d execuo ao disposto nos artigos 4. e 5. do Decreto -Lei n. 276/99, de 23 de Julho, na redaco que lhe foi dada pelo Decreto Lei n. 279/2007, de 6 de Agosto. O presente diploma tem como objectivos: estabelecer um valor alvo 16 para as concentraes destes compostos no ar ambiente, assegurar a manuteno da qualidade do ar ambiente, estabelecer mtodos e critrios comuns para a avaliao das concentraes destes compostos e assegurar a obteno de informaes adequadas sobre as concentraes dos mesmos no ar ambiente e a sua deposio, bem como a respectiva disponibilizao ao pblico. Segundo o diploma, o poluente arsnio apresenta como valor alvo 6 ng/m3, devendo este valor referir-se mdia anual do teor total na fraco PM10 17 , calculada durante um ano civil.
A Portaria n. 246/2000, de 4 de Maio, define as caractersticas do azeite e do leo de bagao de azeitona destinados ao consumidor final, em que o arsnio apresentado como contaminante, cuja concentrao mxima admitida de 0,1 mg/kg. Os Decretos-Lei n.os 181/2002 de 13 de Agosto, 181/2004 de 28 de Julho e 150/2005 de 30 de Agosto, estabelecem critrios de pureza especficos de diversos aditivos alimentares, com excepo dos edulcorantes e corantes, onde o arsnio no deve apresentar na maioria das situaes teores superiores a 3 mg/kg. Relativamente aos corantes e edulcorantes, publicou-se legislao especfica, mais concretamente o Decreto-Lei n. 57/2007, de 13 de Maro e o Decreto-Lei n. 98/2000, de 25 de Maio, em que o arsnio deve apresentar, no caso dos corantes, um teor no superior a 3 mg/kg e no caso de edulcorantes tambm no superior a 3 mg/kg, expresso em relao ao resduo seco.
Uma concentrao no ar ambiente fixada com o objectivo de evitar, prevenir ou reduzir os efeitos nocivos para a sade humana e para o ambiente na sua globalidade, a ser alcanado, na medida do possvel, durante um determinado perodo de tempo. 17 PM10: as partculas susceptveis de passar atravs de uma tomada de amostra selectiva, como definido na norma EN 12341, com 50 % de eficincia para um dimetro aerodinmico de 10 m.
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O Decreto-Lei n. 243/2007, de 21 de Junho, vem estabelecer limitaes colocao no mercado e utilizao de substncias e preparaes perigosas, em cumprimento das Directivas n.os 2006/122/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 12 de Dezembro, e 2006/139/CE, da Comisso, de 20 de Dezembro, publicadas no quadro da Directiva n.o 76/769/CEE, do Conselho, de 27 de Julho, em consequncia do progresso cientfico e tcnico alcanado neste domnio e da necessidade de assegurar a coerncia entre as disposies desta directiva e as da Directiva n.o 98/8/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 16 de Fevereiro, relativa colocao de produtos biocidas no mercado. Est em causa minorar os efeitos prejudiciais para a sade humana e para o ambiente, associados utilizao de compostos de arsnio e de
perfluoroctanossulfonatos (PFOS). Aps entrada em vigor deste diploma passou a ser proibida a colocao no mercado e utilizao de compostos de arsnio destinados a ser utilizados para impedir a proliferao de microrganismos, plantas ou animais em cascos de embarcaes, gaiolas, flutuadores, redes e qualquer outro dispositivo ou equipamento utilizado em piscicultura ou conquilicultura. O mesmo acontece nas aplicaes destes compostos destinadas ao tratamento de guas industriais. igualmente proibida a utilizao destes compostos para conservao da madeira. Alm disso, a madeira tratada deste modo no pode ser colocada no mercado. Por derrogao, esta disposio no aplicvel a substncias e preparaes utilizadas no tratamento da madeira que utilizada em instalaes industriais e profissionais se a integridade estrutural da madeira for a exigida para a segurana humana ou de animais e se for improvvel o contacto com o pblico em geral atravs da pele, durante a sua vida til. Sendo assim, toda a madeira tratada colocada no mercado dever apresentar um rtulo com a meno Exclusivamente para uso profissional e instalao industrial, contm arsnio e as embalagens devero apresentar tambm um rtulo com a meno: Para manusear esta madeira, necessrio usar luvas. Usar mscara anti-p e proteco para os olhos para cortar ou efectuar outro tipo de trabalho nesta madeira. Os seus desperdcios devero ser tratados como resduos perigosos por uma empresa devidamente autorizada. O Decreto-Lei n. 4/2003, de 10 de Janeiro, relativo regulamentao do fabrico de materiais e objectos de matria plstica destinados a entrar em contacto com os gneros alimentcios, estabelece que a concentrao de arsnio presente nestes materiais no deve exceder 1 mg/kg de plstico.
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importante referir o Decreto-Lei n. 94/98, de 15 de Abril, que adopta as normas tcnicas de execuo referentes colocao dos produtos fitofarmacuticos no mercado. Este Decreto transpe as Directivas n.os 94/37/CE, 94/79/CE, 95/35/CE, 95/36/CE, 96/12/CE, 96/46/CE e 96/68/CE, da Comisso, actualizando a
transposio da Directiva n. 91/414/CEE, do Conselho, de 15 de Julho. O diploma contm o Anexo I, a preencher medida que forem inscritas na Lista Positiva Comunitria (LPC) as substncias activas avaliadas a nvel comunitrio para as quais foi possvel presumir que a utilizao dos produtos fitofarmacuticos que as contenham, ou os seus resduos, no tm efeitos prejudiciais para a sade humana ou animal, nem uma influncia inaceitvel sobre o ambiente, mediante determinadas condies a descritas. A lista de alteraes a este diploma extensa, tendo vindo a assistir-se constante adio e cancelamento de substncias LPC ao longo dos anos. O Decreto-Lei em causa foi j alterado pela seguinte legislao: Decreto-Lei n. 341/98 de 04.11; Decreto-Lei n. 22/2001 de 30.01; Decreto-Lei n. 238/2001 de 30.08; Decreto-Lei n. 28/2002 de 14.02; Decreto-Lei n. 101/2002 de 12.04; Decreto-Lei n. 160/2002 de 09.07; Decreto-Lei n. 198/2002 de 25.09; Decreto-Lei n. 72-H/2003 de 14.04; Decreto-Lei n. 215/2003 de 18.09; Decreto-Lei n. 22/2004 de 22.01; Decreto-Lei n. 39/2004 de 27.02; Decreto-Lei n. 22/2005 de 26.01; Decreto-Lei n. 128/2005 de 09.08; Decreto-Lei n. 173/2005 de 21.10; Decreto-Lei n. 19/2006 de 31.01; Decreto-Lei n. 87/2006 de 23.05; Decreto-Lei n. 234/2006 de 29.11; Decreto-Lei n. 111/2007 de 16.04 e finalmente o Decreto-Lei n. 206/2007 de 28.05. Os compostos inorgnicos de arsnio, como o arsenito de sdio, os arseniatos, o anidrido arsenioso foram usados na agricultura na qualidade de herbicidas, insecticidas, fungicidas, formicidas, rodenticidas e parasiticidas. No entanto, a sua aplicao e comercializao como produtos fitofarmacuticos (de que exemplo o arsenito de sdio e anidrido arsenioso com nome comercial Arsenical) foi proibida a partir de 31 de Dezembro de 2003 de acordo com consulta efectuada no site da Direco-Geral de Agricultura e Desenvolvimento Rural (DGADR, 2008).
Para finalizar, refere-se ainda, com a salvaguarda de que existe mais legislao para alm da que se apresenta neste trabalho, o Decreto-Lei n. 142/2005, de 24 de Agosto, relativo aos produtos cosmticos e de higiene corporal. Neste diploma o arsnio e seus compostos constam da lista de substncias que no podem entrar na composio deste tipo de produtos.
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CAPTULO III PARTE EXPERIMENTAL
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3.1. Introduo
O trabalho prtico deste mestrado decorreu nas instalaes do Servio de Toxicologia Forense da Delegao do Centro do INML, IP. Foram utilizados os equipamentos e meios disponveis nestas instalaes, mais concretamente o instrumento de espectrofotometria de absoro atmica (EAA) e acessrios, bem como o forno microondas para digesto de amostras e todos os recursos essenciais realizao do trabalho, como material de laboratrio, reagentes, padres e outros consumveis.
3.2. Concepo experimental

A primeira fase do trabalho foi constituda essencialmente por pesquisa bibliogrfica, onde se estudaram os conceitos e instrumentao associados tcnica de EAA. Procuraram-se aplicaes da tcnica EAA s cincias forenses, determinao de metais e metalides em amostras biolgicas por EAA com cmara de grafite e gerador de hidretos. Estudaram-se os cuidados especficos com a aplicao desta tcnica. Relativamente ao pr-tratamento das amostras, recolheu-se informao sobre a preparao das amostras biolgicas aplicando a tecnologia de digesto com microondas e digesto hmida em vaso aberto, assim como, os cuidados especficos com a aplicao da tecnologia microondas na dissoluo ou digesto de amostras biolgicas.
Posteriormente, deu-se incio ao trabalho do ponto de vista prtico onde se testaram e optimizaram os mtodos de determinao de diferentes elementos no equipamento de EAA usando solues padro e brancos. Paralelamente, testou-se e verificou-se o funcionamento do forno microondas com amostras de referncia antes de aplicar a tcnica a amostras desconhecidas, procurando optimizar tambm um mtodo de digesto das amostras biolgicas.
De seguida, aps seleccionar o elemento a partir do qual se iria desencadear a validao de mtodos (o arsnio), iniciou-se o estudo dos processos de digesto possveis: o primeiro aplicando a tcnica de digesto com microondas a amostras biolgicas (sangue e urina), o segundo aplicando a digesto hmida em vaso aberto, com a finalidade de comparar resultados entre as metodologias. A forma de avaliar e comparar as duas metodologias de preparao das amostras implicou a anlise do elemento em estudo, de acordo com as potencialidades do equipamento disponvel.
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Procedeu-se ento validao do mtodo de anlise de arsnio em amostras biolgicas por EAA com digesto hmida em vaso aberto, assim que foi possvel concluir que esta seria a forma de pr-tratamento das amostras mais indicada determinao deste elemento.
Estabeleceram-se procedimentos e metodologias para usar em rotina na anlise de arsnio em amostras biolgicas (sangue, urina, cabelos, unhas e vsceras) por EAA com tratamento prvio aplicando a digesto hmida em vaso aberto.
Por fim, na elaborao desta dissertao, procurou-se reunir toda a informao recolhida e descrever o trabalho efectuado, bem como apresentar os resultados e seu tratamento que permitiram chegar s concluses apresentadas mais frente.
3.3. Material e Mtodos 3.3.1. Instrumentao e material utilizado

Material - tubos de polipropileno (PP) SARSTEDT (15 e 50ml) - bales volumtricos (10ml e 20ml) - erlenmeyers de vidro (25 e 50ml) - pipetas de vidro de 1, 2 e 5ml - micropipetas de volume varivel 100-1000l e 20-200 l (Gilson e Eppendorf)
Instrumentos - placas de aquecimento (Heidolph MR2002) - hottes (Ktterman) - balana analtica (Mettler AE200) - vortex Janke e Kunkel (IKA-Labortechnik) Equipamento Espectrofotmetro de Absoro Atmica com cmara de grafite e sistema gerador de hidretos, composto pelos seguintes componentes: - Espectrofotmetro de Absoro atmica da Perkin Elmer, modelo AAnalyst 300. - Cmara de Grafite da Perkin Elmer, modelo HGA 800.
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- Amostrador automtico (para cmara de grafite) da Perkin Elmer, modelo: As 72. - Sistema de refrigerao (para cmara de grafite) da Perkin Elmer, modelo: Furnace cooling system. - Sistema Gerador de Hidretos com fluxo e injeco automticos da Perkin Elmer, modelo FIAS 100. - Amostrador automtico (para sistema gerador de hidretos) da Perkin Elmer, modelo: As 90.
Sistema de reaco com tecnologia microondas da CEM Corporation, modelo MARS 5 (Microwave accelerated reaction system).
3.3.2. Reagentes, Padres e Materiais de Referncia

Todos os solventes e reagentes utilizados so de grau analtico ou adequados aos mtodos espectrofotomtricos, desde que disponveis comercialmente. Todas as solues aquosas utilizadas neste estudo foram preparadas com gua desionizada obtida a partir de um sistema de purificao Milli-Q da Millipore.
Reagentes - cido ntrico 65% (HNO3) p.a. da Merck (Darmstadt, Germany) - cido sulfrico (H2SO4) AR da May & Baker Ltd (Dagenham, England) - cido perclrico 70-72% (HClO4) p.a. da Merck (Darmstadt, Germany) - cido clordrico 32% (HCl) da Panreac Qumica SA (Barcelona, Espanha) e da Riedel-de Han (Seelze, Germany) - borohidreto de sdio (NaBH4) puriss. p.a. da FluKa (Steinheim, Germany) - hidrxido de sdio (NaOH) puriss. p.a. da Merck (Darmstadt, Germany) - cido ascrbico (C6H8O6) Sigma ultra da Sigma Aldrich (Steinheim, Germany) - Iodeto de potssio (KI) p.a. da Merck (Darmstadt, Germany)
Padres - Soluo padro de arsnio (traceable to SRM from NIST) H2AsO4 em HNO3 0,5 mol/l 1000mg/l As. Padro de arsnio CertiPUR da Merck (Darmstadt, Germany).
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Materiais de referncia Urina controlo de nvel 1 - Lypochek Quantitative Urine Control da BIO RAD Level 1 (nveis normais). Concentrao de arsnio: valor mdio 13,4g/L, intervalo aceitvel 10,7 -16,0 g/L. A reconstituio da urina controlo foi feita atravs da adio de 10 ml de gua desionizada milipore, seguida de homogenizao e estabilizao temperatura ambiente.
3.3.3. Tratamento do material

Material de plstico (PP) Os tubos de polipropileno usados para guardar as solues padro e as solues diludas aps digesto, colocados no suporte associado ao sistema automtico de injeco FIAS 100, so mergulhados em HNO3 a 40% (v/v) durante aproximadamente 30 minutos. De seguida so passados por gua corrente de forma abundante para retirar resduos de cido e depois por gua milipore. O material plstico usado pela primeira vez na determinao de arsnio no foi sujeito a qualquer descontaminao prvia, no houve quaisquer evidncias de contaminao deste material com arsnio. No caso do material reutilizado, previamente sujeito descontaminao descrita anteriormente, tambm no foram registadas quaisquer evidncias de contaminao.
Material de vidro - Bales volumtricos para preparao de solues padro e diluio de amostras digeridas. Os bales volumtricos so primeiramente passados por gua, de seguida so mergulhados em HNO3 a 40% (v/v) durante aproximadamente 30 minutos. Posteriormente so passados por gua corrente de forma abundante para retirar resduos de cido e depois por gua milipore.
- Erlenmeyers de vidro para digesto hmida em placa de aquecimento. Os erlenmeyers usados numa digesto so passados inicialmente por gua corrente, depois adiciona-se um pequeno volume de HNO3 a 40% (v/v) e levam-se ao aquecimento em placa elctrica, onde ficam cerca de 1h temperatura de 250C. Findo esse perodo, deixa-se arrefecer a soluo cida, verte-se para reservatrio de resduos cidos prprio para o efeito e procede-se tal como descrito para os outros
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materiais, sendo passados por gua corrente de forma abundante para retirar resduos de cido e depois por gua milipore.
3.3.4. Preparao de solues

Solues padro Arsnio 100 g/ml em HCl 10% (v/v) - preparada a partir do padro de As 1000 mg/l: -Soluo me A para preparao de calibradores das rectas de calibrao e fortificao de amostras quando aplicado o MAP. -Soluo me B para preparao de solues controlo de verificao das rectas de calibrao.
Arsnio 2g/ml em HCl 10% (v/v): soluo intermdia A e soluo intermdia B, preparadas a partir das solues me A e B, respectivamente.
Arsnio 100 g/l em HCl 10% (v/v): soluo de trabalho I-A e soluo de trabalho I-B preparadas a partir das solues intermdias A e B, respectivamente.
Arsnio 10g/l em HCl 10% (v/v): soluo de trabalho II-A e soluo de trabalho II-B preparadas a partir das solues de trabalho I-A e I-B respectivamente.
Outras Solues HCl 10% (v/v): soluo de arraste (carrier) para o sistema FIAS100 no processo de gerao de hidretos e para usar na diluio de padres e amostras digeridas.
NaOH 0,05% (m/v): soluo para preparao de agente redutor para sistema FIAS100.
NaBH4 0,2% (m/v) em NaOH 0,05% (m/v): agente redutor (reductant) para sistema FIAS100 no processo de gerao de hidretos.
cido ascrbico 5% (m/v): soluo para preparar soluo redutora prvia. KI 5% (m/v) em cido ascrbico 5% (m/v): soluo redutora prvia (As5+ As3+).
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3.4. Condies espectrofotomtricas

De seguida apresentam-se as condies de funcionamento do espectrofotmetro de absoro atmica e do sistema gerador de hidretos. Esta informao
complementada pelo anexo II, onde se apresenta um exemplar das condies do mtodo de determinao de arsnio, tal como so impressas a partir do software que comanda o equipamento de AAS (AAWINLAB ANALYST verso 3.2).
Espectrofotmetro de absoro atmica Lmpada de ctodo oco (As) ao comprimento de onda :193,7nm Largura da fenda (slit width) : 0,7 nm Tipo de sinal: background correction Medio do sinal: altura do pico
Sistema Gerador de Hidretos com fluxo e injeco automticos Temperatura da clula: 900C Volume de amostra (loop): 500 l Programa de fluxo e injeco: Prefill - 18seg, passo 1 - 10s, passo 2 (leitura) - 15s Velocidade da bomba peristltica: 120 rpm Fluxo da soluo de arraste (carrier): 9-11 ml/min Fluxo do agente redutor (reductant): 4-7 ml/min Reaction coil: comprimento 110mm, dimetro 1,0mm
Fig. 7 Espectrofotmetro de absoro atmica com sistema gerador de hidretos com fluxo e injeco automticos (FIAS-HGAAS) da Perkin Elmer, disponvel no STF da Delegao do Centro do INML, IP.
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3.5. Tipo e origem das amostras

As anlises de rotina a realizar incidiro sobre as amostras que chegam ao STF no mbito dos processos forenses e hospitalares, de onde pode resultar uma grande variedade e tipo de amostras (amostras biolgicas como sangue, urina, cabelos, unhas, vsceras e contedo gstrico; alimentos; guas de consumo, etc).
Os pedidos de anlise dirigidos ao Servio de Toxicologia Forense da Delegao do Centro podem ser provenientes de diversas entidades, nomeadamente os Servios Hospitalares, os Servios de Patologia Forense das trs delegaes do INML IP, bem como da extensa rede de Gabinetes Mdico Legais dispersos pelo pas.
Constituindo um dos objectivos do presente trabalho a validao de mtodos analticos destinados a serem integrados na rotina de um laboratrio de toxicologia forense, as amostras de sangue, urina e cabelos, utilizadas neste estudo foram seleccionadas de modo a serem, tanto quanto possvel, representativas da realidade do laboratrio. Assim, as amostras usadas no estudo de validao resultaram de colheitas efectuadas in vivo, j que grande parte dos pedidos de anlise de arsnio enviados Delegao do Centro do STF, incide sobre amostras hospitalares. As amostras de sangue so procedentes do Instituto Portugus do Sangue, tratando-se de sangue humano excedente de transfuses. As amostras de urina e cabelo foram colhidas a partir de diferentes dadores voluntrios, neste caso em particular, funcionrios do prprio Servio de Toxicologia Forense da Delegao do Centro.
3.6. Preparao das amostras

Seguindo o procedimento habitual no STF todas as amostras biolgicas recebidas so congeladas, com excepo das amostras de cabelo e unhas que se armazenam temperatura ambiente. Antes da sua utilizao as amostras de urina e sangue foram descongeladas e homogeneizadas por agitao em agitador rotativo (vortex Janke e Kunkel).
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3.6.1. Digesto aplicando a tecnologia Microndas

A eficincia da oxidao em processos de digesto hmida de matria orgnica muito importante para a qualidade dos dados analticos de inmeras tcnicas quantitativas. Muitas tcnicas de determinao de elementos ao nvel vestigial, como a AAS, ICPOES e o ICP-MS na maioria dos casos exigem a decomposio da amostra. Neste contexto importante conhecer os factores relevantes para a completa decomposio das matrizes orgnicas, mais concretamente conhecer as
interferncias resultantes do carbono residual existente aps decomposio incompleta da amostra, por forma a obter resultados com a maior fiabilidade e o mnimo de incerteza possvel. No entanto, muito frequentemente o factor que mais afecta a exactido e repetibilidade de todo o procedimento analtico a decomposio da amostra (Wasilewska et al, 2002). Enquanto os erros sistemticos, resultantes por exemplo de contaminao e volatilizao, desempenham um pequeno papel quando se aplica o processo de decomposio de amostras pressurizado em vaso fechado (microondas), a oxidao insuficiente dos compostos orgnicos pode afectar de forma considervel as determinaes instrumentais.
Nos sistemas de digesto hmida pressurizados o reagente maioritariamente recomendado para o processo de oxidao da matria orgnica o cido ntrico concentrado.
Tal como referido inicialmente, um dos objectivos deste trabalho seria a aplicao da tecnologia microondas na digesto das amostras biolgicas, dado as vantagens que este procedimento comporta. Assim, um dos primeiros passos dados ao nvel de trabalho experimental, foi verificar a viabilidade de utilizao desta tecnologia na digesto de amostras biolgicas para determinao de arsnio total.
Experincia 1 digesto de amostras de sangue aplicando a tecnologia microondas.
Para estabelecer as condies de operao do microondas foram respeitados os seguintes pressupostos:
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(a) Usar uma pequena quantidade de amostra, por se tratar de uma amostra com grande carga orgnica, que naturalmente ir originar a libertao de grande quantidade de dixido de carbono (CO2) e xidos de azoto (NOx) aps adio de cido ntrico concentrado (HNO3), conduzindo a um aumento de presso dentro do vaso de reaco, o que pode originar a ruptura da membrana de segurana, inviabilizando a experincia (volume seleccionado 200l de sangue).
(b) Programao de um mtodo de digesto no microondas baseado numa rampa de temperaturas, em vez de rampa de presses, sendo esta outra das hipteses disponvel. Esta escolha mais indicada para amostras muito reactivas, i.e., amostras cujo processo de digesto pode conduzir a um aumento rpido da presso.
(c) Utilizar um mximo de 4 ml de cido ntrico concentrado, pois a massa de amostra muito reduzida o que ir diluir bastante o analito de interesse (Vaz e Baio, s.d.). Ter em ateno que o volume recomendado de cido no manual do equipamento do microondas de 10ml.
(d) Temperatura mxima a atingir ser de 180C e a presso mxima que poder atingir so 800 psi, dado que este microondas est equipado com vasos de reaco de elevada presso (vasos de teflon XP-1500).
(e) importante a programao de um aumento gradual de temperatura, j que se trata de uma amostra orgnica (EPA method 3052, 1996).
(f) Comear por usar a potncia mnima do microondas (300 Watt), pois estamos a usar um pequeno volume de amostra e cido (a potncia mxima deste equipamento 1200 Watt). Quanto maior o volume de cido usado, maior a energia necessria para atingir a temperatura pretendida. Deve referir-se que este equipamento possui 6 vasos de reaco de 50ml, permitindo desta feita a digesto simultnea de 6 amostras.
(g) Se no se verificar a digesto completa, programar novamente um mtodo onde se pode aumentar o tempo de digesto e potncia. Outra hiptese a testar ser a aplicao da mistura de cidos ntrico e clordrico (HNO3 e HCl -
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designada como aqua regia) que, segundo alguma bibliografia consultada, parece ser mais eficaz (Vaz e Baio, s.d.; Coopman et al, 1997). Salienta-se, no entanto, o facto de que nos sistemas de digesto hmida pressurizados o reagente maioritariamente recomendado para o processo de oxidao da matria orgnica o cido ntrico concentrado (HNO3 a 65%). Tendo em conta os pressupostos atrs enunciados, apresentam-se de seguida as condies de operao do equipamento e outros dados experimentais:
Volume de amostra: 200l. vaso 1 (controlo): 200l sangue fortificado com 200 l de padro de arsnio a 10ug/l. vaso 2: 200l sangue. vaso 3: 200l sangue. vaso 4: 200l soluo padro de arsnio a 10g/l. vaso 5: 200l soluo padro de arsnio a 50g/l. vaso 6 (branco): 200l de gua desionizada.
Volume de cido: 4ml de cido ntrico concentrado.
Potncia: 300 W (100%) Temperatura mxima : 180C Rampa (at 180C): 10min Plataforma (a 180C): 5min Tempo de arrefecimento: 15min
Anlise dos resultados Experincia 1:
Aps realizao desta experincia verificou-se que seria necessrio aumentar a potncia do microondas, visto os vasos reaco no terem atingido os 180C nos 10 minutos programados.
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Experincia 2 digesto de amostras de sangue aplicando a tecnologia microondas.
Visto ter surgido um contratempo (avaria do sensor de temperatura quando iniciava experincia 2) foi necessrio programar um novo mtodo, mas desta vez com rampa de presses, o que no to aconselhvel quando se digerem amostras orgnicas. Para esse efeito, programou-se o equipamento, de forma a tentar reproduzir a rampa de presses registada na Experincia 1.
Nesta experincia foi testada a aplicao da mistura de cidos HNO3 e HCl (3ml e 1ml respectivamente) para verificar se existia maior eficincia na digesto das amostras biolgicas.
Aps realizao desta experincia verificou-se que no se acrescentou nada experincia anterior, mantendo-se a necessidade de aumentar a potncia do microondas, com a desvantagem de no existirem dados relativos s temperaturas que se atingem nos vasos de reaco.
Experincia 3 digesto de amostras de cabelo aplicando a tecnologia microondas.
Na anlise de uma amostra de cabelo deve-se contemplar a possvel contribuio do arsnio exteriormente depositado na mesma. Para diminuir esta contribuio que poder dar origem a falsas interpretaes adoptou-se um procedimento de descontaminao antes de iniciar a digesto. A amostra de cabelos foi lavada com cido clordrico concentrado, seguindo-se a passagem por gua desionizada e finalmente a secagem em estufa a 100C durante aproximadamente 2h.
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Condies e dados experimentais: Quantidade de amostra: 0,1g de cabelo vaso 1 (controlo): 100 mg cabelo fortificado com 200 l de padro de arsnio a 100 g/l. vaso 2: 100 mg de cabelo fortificado com 200 l de padro de arsnio a 50g/l. vaso 3: 100 mg de cabelo. vaso 4: 200 l soluo padro de arsnio a 100 g/l vaso 5: 200 l soluo padro de arsnio a 50 g/l vaso 6 (branco): 200 l de gua desionizada
Volume de cido: 4ml de cido ntrico concentrado.
Aps realizao desta experincia verificou-se novamente que seria necessrio aumentar a potncia do microondas, visto os vasos reaco no terem atingido os 180C nos 10 minutos programados. Adicionalmente, verificou-se que os valores de presso atingidos foram diminutos, o que permite aumentar muito a potncia e temperatura atingidas. Verificou-se tambm que a digesto da amostra foi insuficiente, continuando-se a obter uma soluo amarelada aps digesto, indicadora da presena de HNO3 e verificou-se durante a anlise um elevado sinal de background.
Experincia 4 digesto de solues padro de arsnio aplicando a tecnologia microondas.
Nesta fase resolveu aumentar-se a potncia do microondas, mas s aplicando a solues padro de concentraes conhecidas. Diminuiu-se tambm a quantidade de
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cido ntrico com o intuito de verificar se as solues resultantes da digesto se mantm amareladas.
Condies e dados experimentais: Volume de amostra: 200l e 100l vaso 1 (controlo): 200l soluo padro de arsnio a 200g/l vaso 2: 200l soluo padro de arsnio a 200g/l vaso 3: 200l soluo padro de arsnio a 100g/l vaso 4: 100l soluo padro de arsnio a 200g/l vaso 5: 100l soluo padro de arsnio a 100g/l vaso 6 (branco): 200l de gua desionizada
Volume de cido: 0,5 ml de cido ntrico concentrado + 2ml gua desionizada
Experincia 5 digesto de solues padro de arsnio aplicando a tecnologia microondas.
Nesta fase resolveu aumentar-se a temperatura mxima a atingir durante a digesto e o tempo de digesto, para verificar se se diminua o volume residual de HNO3, responsvel pelo um elevado sinal de background. Procedimento aplicado somente a solues padro de concentraes conhecidas.
Condies e dados experimentais: Volume de amostra: 200 l e 100 l vaso 1 (controlo): 200 l soluo padro de arsnio a 200 g/l vaso 2: 200 l soluo padro de arsnio a 200 g/l vaso 3: 100 l soluo padro de arsnio a 200 g/l vaso 4: 100 l soluo padro de arsnio a 200 g/l vaso 5 (branco): 200 l de gua desionizada vaso 6 (branco): 200 l de gua desionizada
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Volume de cido: 0,5 ml de cido ntrico concentrado + 2ml gua desionizada
Anlise dos resultados das digestes aplicando a tecnologia microondas.
As experincias realizadas no permitiram obter as condies experimentais ptimas para utilizao da tecnologia microondas na digesto de amostras biolgicas para determinao de arsnio total, como discutido mais frente (vide ponto 4.2).
3.6.2. Digesto hmida em vaso aberto

Ao longo deste trabalho a digesto hmida em vaso aberto, tal como a digesto pressurizada em vaso fechado (microondas), sofreu bastantes alteraes desde a primeira experincia de digesto at adopo das condies finais. Apresentam-se, sucintamente, as alteraes que este procedimento sofreu com vista sua optimizao.
(a) Inicialmente testou-se a digesto efectuada de acordo com procedimento utilizado pelo laboratrio para determinao do arsnio pelo mtodo de Gutzeit (mtodo apresentado no anexo I). Como se trata de um mtodo que apresenta uma sensibilidade muito inferior tcnica de espectrofotometria de absoro atmica, este mtodo implica o uso de um volume ou massa de amostra muito superior e consequentemente um volume de cidos muito superior. No fim da digesto, as solues obtidas foram muito diludas para que as concentraes de arsnio lidas entrem dentro da gama de trabalho adequada tcnica EAA.
(b) A primeira alterao efectuada traduziu-se na diminuio dos volumes e massa de amostra utilizados na determinao (reduziu-se inicialmente para volumes de 2 ml, conseguindo gradualmente reduzir-se at volumes de 0,5 ml de sangue). Esta diminuio conduziu necessariamente tambm diminuio
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dos volumes de cido aplicados (nesta fase aplicou-se mistura de cidos HNO3, H2SO4 e HClO4). (c) Testaram-se diferentes combinaes em termos de proporo da mistura de cidos utilizada at ao momento (HNO3, H2SO4 e HClO4). (d) Testou-se uma combinao de cidos retirando o cido perclrico da mistura inicialmente usada devido aos riscos associados ao uso deste cido (risco de exploso e altamente txico).
(e) Testou-se a mistura de cidos HNO3 e HCl na proporo 3:1 (aqua regia). Aps diversas experincias que conduziram ao desenvolvimento e optimizao do mtodo digesto hmida em vaso aberto, adoptou-se o procedimento a seguir descrito.
Amostras de sangue (0,5ml), urina (1ml), cabelos e unhas (0,1g) e outras vsceras (1g), foram sujeitas a um processo de destruio da matria orgnica (digesto hmida em vaso aberto) atravs da adio de uma mistura de cidos (cido ntrico, sulfrico e perclrico) seguida de aquecimento a 250C.
Aps finalizada a digesto, as amostras sofrem um processo de pr-reduo, atravs da adio de uma soluo aquosa de cido ascrbico (5%) em iodeto de potssio (5%), seguido de diluio em soluo cida at perfazer o volume de 10ml (HCl a 10%). Finalmente, a soluo resultante analisada pela tcnica de espectrofotometria de absoro atmica com gerador de hidretos.
Sangue De cada amostra de sangue homogeneizada foi retirada uma alquota de 0,5 mL para um erlemeyer previamente descontaminado, qual se adicionou 3ml de HNO 3 (65%). Deixou-se ficar esta mistura em repouso durante algum tempo at obteno de uma soluo homognea de tom castanho (1h no mnimo) 18.
Tornou-se prtica comum deixar as amostras durante a noite na hotte em cido ntrico concentrado, para que a digesto no dia seguinte fosse mais rpida e menos violenta.
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Fig. 8 Erlenmeyers com amostra e mistura de cidos antes de iniciar digesto.
Adiciona-se em seguida 0,5ml de H 2 SO 4 concentrado e 1ml HClO 4 (70%), homogeniza-se esta mistura atravs de agitao manual e em seguida coloca-se em placa de aquecimento (Heidolph MR2002) sujeitando-se a um aquecimento gradual at atingir os 250C.
Fig 9 Amostras durante digesto hmida em placa de aquecimento.
Deixa-se a soluo a 250C at verificar a sua evaporao quase total 19 . Quando se verificar a existncia de um pequeno resduo translcido no erlenmeyer, sem deixar chegar secura, retira-se do aquecimento. Deixa-se arrefecer e normalmente por no ser possvel realizar a anlise no prprio dia, pois a digesto demora cerca de 4h no mnimo, tapa-se o erlenmeyer com parafilm e guarda-se no frigorfico at realizao da anlise.
Segue-se ento o passo de pr-reduo, onde se adiciona ao resduo resultante da digesto 1ml de cido clordrico concentrado e 1ml de soluo redutora prvia (Iodeto de potssio em cido ascrbico). Aps esta adio aguarda-se cerca de 1h para garantir a reduo de todo o arsnio pentavalente ao estado de oxidao trivalente.
19
Este processo demora aproximadamente 4 horas.
71
O volume de HCl concentrado e soluo redutora adicionados dependem do volume final de diluio da amostra: se o objectivo for a diluio at 10ml (volume final tipicamente aplicado neste estudo diluio efectuada com HCl a 10%), ento o volume a adicionar ser 1ml de cada soluo, se o volume final for de 20 ml, ento o volume a adicionar de cada uma destas solues ser 2ml. Esta relao (1 ml para 10 ml de volume final), assim como o perodo de espera, devem ser respeitados, de forma a garantir a pr-reduo do As(V) presente na amostra digerida.
Fig. 10 Amostras durante passo de pr- reduo aps digesto.
Fig. 11 Amostras aferidas em bales volumtricos, prontas para anlise.
Vsceras O procedimento descrito anteriormente foi aplicado a amostras de vsceras, com diferena relativamente colheita e homogenizao. Foram colhidas
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aproximadamente 1g de amostras de fgado, rim, pulmo e outras vsceras com a ajuda de pina e tesoura, para erlenmeyers previamente descontaminados e tarados. Todo o procedimento subsequente equivalente ao descrito para as amostras de sangue.
Urina De cada amostra de urina homogenizada foi retirada uma alquota de 1 mL para um erlemeyer previamente descontaminado, qual se adicionou 1ml de HNO 3 (65%). Deixa-se ficar esta mistura em repouso durante algum tempo at obteno de uma soluo homognea amarelada (1h no mnimo) 20. Adiciona-se em seguida, 0,25ml de H 2 SO 4 concentrado e 0,25ml HClO 4 (70%), homogeniza-se esta mistura atravs de agitao manual e em seguida coloca-se em placa de aquecimento (Heidolph MR2002) sujeitando-se a um aquecimento gradual at atingir os 250C. A partir deste momento segue-se o mesmo procedimento j descrito antes para amostras de sangue.
Cabelo e unhas Das amostras de cabelo e unhas analisadas foram colhidas aliquotas de aproximadamente 100mg. Dado a habitual escassez de amostra suficiente de cabelos e unhas, sempre que necessrio estas amostras foram reunidas e procedeu-se sua anlise em conjunto. Tendo em conta o problema j discutido anteriormente relativamente contaminao externa destas amostras com arsnio, adoptou-se o seguinte procedimento de descontaminao: Aps pesar as amostras de cabelo e unhas, foi-lhes adicionado cido clordrico concentrado (32%), agitando-se manualmente, garantindo a sua total imerso. Depois de bem agitado o cido clordrico vertido e em seguida adiciona-se gua desionizada de forma a retirar o cido remanescente. Decanta-se a gua de lavagem e em seguida a amostra est preparada para o processo de digesto. Depois de descontaminar as amostras de unhas e cabelos, adopta-se o mesmo procedimento j descrito para as amostras de sangue.
Tornou-se prtica habitual deixar as amostras durante a noite na hotte em cido ntrico concentrado, para que a digesto no dia seguinte fosse mais rpida e menos violenta.
20
73
Durante o processo de digesto acontece, por vezes, o enegrecimento da soluo, pelo que se deve retirar essa soluo do aquecimento, deixar arrefecer e adicionar um pouco mais de cido ntrico (1ml) e de cido perclrico (0,25ml).
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CAPTULO IV APRESENTAO E DISCUSSO DE RESULTADOS
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4.1. Introduo
Foi desenvolvido e validado um mtodo de determinao de arsnio total em amostras biolgicas por espectrofotometria de absoro atmica com gerador de hidretos (HG-AAS), com prvia digesto hmida em vaso aberto. Em seguida apresentam-se as principais razes que levaram adopo da digesto em vaso aberto e os parmetros de validao do mtodo de adoptado. Pretendia-se optimizar e validar um mtodo eficaz e rpido, aplicvel a diferentes amostras biolgicas como sangue, urina, cabelos, unhas e vsceras com sensibilidade suficiente, exactido e preciso adequadas segundo critrios aceites
internacionalmente. Esse mtodo foi desenvolvido para ser aplicado nas determinaes efectuadas no Servio de Toxicologia Forense da Delegao do Centro do INML, no mbito das anlises toxicolgicas de rotina.
4.2 Digesto em vaso aberto vs Digesto em vaso fechado

Aps realizao das experincias de digesto em vaso fechado 1 a 5, descritas no ponto 3.6.1 e com base em alguma bibliografia consultada, que apresenta alguns dos problemas e limitaes sentidas no decurso deste trabalho (Wasilewska et al, 2002; Damkrger et al, 1997; Muoz et al, 1999), chegou-se concluso que a digesto aplicando a tecnologia microondas na determinao de arsnio em amostras biolgicas no seria uma hiptese vivel, comprometendo, assim, um dos objectivos deste trabalho. O equipamento microondas disponvel no STF apresenta limitaes que no permitem melhorar a eficincia da digesto das amostras biolgicas conforme o desejado. Esta limitao deve-se essencialmente ao tipo de material de que so feitos os vasos de reaco, mais concretamente o Teflon, que apresenta como temperatura mxima de funcionamento 240C. Essa temperatura mostra-se insuficiente dissociao de parte dos compostos de arsnio presentes nas amostras, principalmente os compostos orgnicos de arsnio. Temperaturas de digesto abaixo dos 240C originam resduos de digesto com elevado contedo de carbono residual (TOC total organic carbon). Acontece muito vulgarmente a obteno de solues resultantes da digesto completamente incolores e lmpidas, no entanto o contedo em carbono orgnico residual elevado. Este carbono residual pode interferir em maior ou menor proporo nos mtodos de determinao adoptados. Segundo Wrfels et al, 1987, em digestes pressurizadas com aplicao de HNO3 concentrado necessrio atingir
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temperaturas de 300C para obter uma soluo com TOC<0,1%. Wasilewska et al, 2002, mostraram que temperaturas entre 250C a 300C so necessrias para obter solues com TOC volta de 10%. A capacidade oxidante do HNO3 depende muito da temperatura de digesto e o consumo do cido ntrico adicionado encontra-se dependente da eficincia da oxidao. Sendo assim, quanto mais elevada for a temperatura de digesto, maior a quantidade de matria orgnica oxidada e menor a concentrao de cido ntrico remanescente no resduo da digesto (Wasilewska et al, 2002). A variao da concentrao de cido ntrico no resduo resultante da digesto influencia claramente as determinaes de arsnio por HG-AAS. Estes factos mostram porque que as determinaes de arsnio em amostras biolgicas podem estar totalmente erradas, o que acontece quando se aplicam equipamentos de digesto pressurizada (microondas) que no permitem a utilizao de temperaturas de digesto at 300C. O aumento da temperatura at 300C conduz ao desaparecimento das espcies orgnicas de arsnio e presena nica de cido arsnico As (V) - (Wasilewska et al, 2002).
Esta limitao fsica do equipamento conduziu a escolha da digesto em vaso aberto, como mtodo de preparao das amostras biolgicas para determinao de arsnio total. Apesar desta metodologia apresentar algumas desvantagens, nomeadamente o tempo que demora, o maior volume de reagentes necessrios digesto, o maior risco de contaminao e perdas por volatilizao do analito em estudo, continua a ser uma metodologia frequentemente usada nesta determinao, com bons resultados em termos de recuperao e eficincia da digesto e que permite a obteno de resultados com preciso e exactido suficientes, aos limites de deteco e quantificao adequados.
4.3. Validao do mtodo analtico de determinao de arsnio 4.3.1. Avaliao da especificidade
O mtodo instrumental aplicado na determinao de Arsnio, a espectrofotometria de absoro atmica, pode ser designado como especfico como j discutido anteriormente no ponto 2.2.1.1 Selectividade e especificidade.
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Para estudar a especificidade do mtodo aplicou-se o mtodo adio padro, j que no possvel obter uma matriz isenta da substncia de interesse (o arsnio encontra-se presente em todos os organismos vivos). Comparou-se a curva analtica com adio da substncia de interesse na amostra, com curva analtica sem presena da matriz. Se as duas curvas forem paralelas pode-se afirmar que no h interferncia da matriz na determinao da substncia de interesse, portanto o mtodo especfico.
De acordo com bibliografia consultada, conforme j discutido anteriormente, consideram-se interferentes os compostos que originem erros e valores de repetibilidade superiores a 20%. Adicionalmente, descrito e/ou recomendado usualmente na literatura a aceitao de valores de preciso intermdia de 15%. Sendo assim, com fundamento nestes critrios, avaliou-se a especificidade do mtodo em dois tipos de matrizes, o sangue e a urina.
4.3.1.1 Estudo da especificidade em urina

Fez-se a leitura de duas amostras reais de urina a dois nveis distintos de concentrao em ambas as curvas de calibrao (recta urinas fortificadas e recta padres). A diferena entre concentraes obtidas atravs do clculo nas duas curvas analticas em avaliao apresentada percentualmente atravs da aplicao da seguinte expresso:
[(conc.As(recta fort) - conc.As(recta padres)) x 100] conc.As(recta padres) Na figura 12 podem observar-se as duas curvas analticas atrs descritas, bem como os dados necessrios sua construo e em seguida na tabela II, resumem-se os resultados da quantificao de duas amostras reais a nveis de concentrao diferentes (1ml de urina1 e 1ml urina2) lidas em ambas as curvas.
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Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Fig. 12 - Dados usados na avaliao da especificidade em urina e respectivo grfico.
Recta Padres Conc. (ug/L) 0,2 1,0 2,0 3,0 4,0 Abs. 0,004 0,034 0,069 0,113 0,143
Recta urinas fortificadas Conc. (ug/L) 0,2 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Abs.mdia 0,077 0,071 0,102 0,119 0,131 0,152 0,165 0,180 0,199
Avaliao Selectividade do Arsnio (0,2-4,0 ug/L)
0,250 0,200 Abs. 0,150 0,100 0,050 0,000 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 y = 0,0372x - 0,0033 R 2 = 0,9974
Linear (recta urinas fortificadas) Linear (recta padroes)
y = 0,0334x + 0,0654 R 2 = 0,9878
recta urinas fortificadas recta padroes
Conc.Arsnio (ug/L)
Tabela II: Resultados da quantificao de As de duas amostras reais nas duas curvas analticas representadas no grfico da Fig 12.
Clculo de concentrao de As (amostras reais) Amostra (Volume) Conc.As (ug/L) Conc.As (ug/L) Diferena calc.conc. (curva padres) (curva ur. fortificadas) (%) Urina 1 (1ml) 1,83 1,94 6,02 Urina 2 (1ml) 3,65 3,96 8,66
Como a diferena entre as leituras das duas amostras de urina nas duas rectas inferior a 15% (6,0% na amostra de urina 1 e 8,7% na amostra de urina 2), o mtodo considerado especfico, concluindo-se que a interferncia da matriz no significativa. A partir deste momento podemos efectuar a quantificao de amostras de urina resultantes do processo de digesto em rectas de calibrao preparadas com calibradores aquosos, sem produo de erros significativos.
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Visto a primeira avaliao da especificidade em urinas ter sido efectuada aplicando um nmero diferente de nveis de concentrao entre as duas rectas (9 nveis usados para traar recta de urinas fortificadas e 5 nveis usados para traar recta de calibradores aquosos) e tendo sido usado um nmero reduzido de amostras reais para avaliar resultados (2 amostras a dois nveis de concentrao diferentes), decidiu-se repetir esta experincia comparando rectas com o mesmo nmero de nveis quantificando seis amostras reais nessas mesmas rectas. De seguida apresentam-se os resultados obtidos na segunda experincia de avaliao de especificidade em amostras de urina.
Fig. 13 - Dados usados na avaliao da especificidade em urinas e respectivo grfico (experincia 2).
Recta Padres Conc. (ug/L) 0,2 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 Abs.mdia 0,008 0,021 0,046 0,088 0,133 0,175 Recta urinas fortificadas Conc. fortificao (ug/L) 0,2 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 Abs.mdia 0,142 0,150 0,164 0,183 0,225 0,276
Avaliao Especificidade do Arsnio (0,2-4,0 ug/L) 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 0,0
y = 0,0401x + 0,1433 2 R = 0,9965
recta padroes Recta urinas fortificadas Linear (recta padroes)
Abs.
y = 0,044x - 0,0004 2 R = 0,9997
Linear (Recta urinas fortificadas)
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Conc.Arsnio (ug/L)
Tabela III: Resultados da quantificao de As de seis amostras reais de urina nas duas curvas analticas representadas no grfico da Fig 13.
Clculo de concentrao de As (amostras reais) Amostra (Volume) Conc.As (ug/L) Conc.As (ug/L) (curva padres) (curva ur. fortificadas) urina fort.1 3,23 3,54 urina fort.2 3,40 3,73 urina fort.3 3,41 3,74 urina fort.4 3,43 3,75 urina fort.5 3,72 4,08 urina fort.6 3,81 4,18
Diferena calc.conc. (%) 9,6 9,6 9,6 9,6 9,6 9,6
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4.3.1.2 Estudo da especificidade em sangue

O procedimento e critrios deste estudo foram equivalentes ao descrito no ponto anterior (vide ponto 4.3.1.1). A diferena deste estudo foi a quantidade de amostra usada e o nmero de amostras reais utilizadas para avaliao da especificidade. O volume de amostra de sangue estudado foi 0,5ml e foram utilizadas 6 amostras reais de sangues fortificados a 6 nveis de concentrao diferentes, com o intuito de abranger a gama de trabalho seleccionada (0,2 a 4,0 g/L). Estas fortificaes foram efectuadas com nveis diferentes dos usados nos sangues que foram aplicados na construo da recta de calibrao com matriz. As 6 amostras foram lidas em ambas as curvas (recta sangues fortificados e recta padres).
Na figura 14 podem observar-se as duas curvas analticas atrs descritas, bem como os dados necessrios sua construo e em seguida na tabela IV, resumem-se os resultados da quantificao de seis amostras reais a nveis de concentrao diferentes (0,5 ml de sangue) lidas em ambas as curvas.
Fig. 14 - Dados usados na avaliao da especificidade em sangue e respectivo grfico.

Recta Padres Conc. (ug/L) 0,2 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 Recta sangues fortificados Conc. (ug/L) Abs.mdia 0,2 0,013 0,5 0,022 1,0 0,052 2,0 0,104 3,0 0,132 4,0 0,180
Abs.mdia 0,008 0,021 0,044 0,088 0,137 0,171
Avaliao Especificidade do Arsnio (0,2-4,0 ug/L) 0,200 0,150 Abs. 0,100 0,050 0,000 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Conc.Arsnio (ug/L) y = 0,0437x + 0,0001 2 R = 0,9979
Linear (recta sangues fortificados) Linear (recta padroes) recta sangues fortificados recta padroes
y = 0,0439x + 0,0052 2 R = 0,992
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Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Tabela IV: Resultados da quantificao de As de seis amostras reais nas duas curvas analticas representadas no grfico da Fig. 14.
Clculo de concentrao de As (amostras reais) Amostra (Volume) Conc.As (ug/L) Conc.As (ug/L) (recta padres) (recta sg. fortificados) sangue fort.1 0,70 0,69 sangue fort.2 0,90 0,90 sangue fort.3 1,36 1,35 sangue fort.4 1,82 1,81 sangue fort.5 2,50 2,49 sangue fort.6 3,29 3,28 Diferena calc.conc. (%) -0,1 -0,2 -0,3 -0,3 -0,4 -0,4
Com base na avaliao dos resultados obtidos, resumidos na tabela IV, onde a diferena registada entre as leituras das amostras de sangue nas duas rectas encontra-se entre 0,1 e 0,4%, pode afirmar-se que o mtodo especfico. Conclui-se que a interferncia da matriz no significativa, podendo efectuar-se a quantificao directa de amostras de sangue resultantes do processo de digesto, em rectas de calibrao preparadas com calibradores aquosos, sem produo de erros significativos.
4.3.2 Limite de deteco (LD) e limite de quantificao (LQ)
A determinao do LD e LQ foi efectuada atravs do estudo da curva de calibrao. Construiu-se uma curva de calibrao usando calibradores aquosos na zona do limite de deteco estimado 21 com 10 nveis de concentrao equidistantes (0,15 a 0,60 g/L de As). Depois de analisados os resultados excluram-se 2 dos nveis preparados (0,15 e 0,45 g/l) por se considerarem aberrantes e prejudicarem a qualidade da curva. Em mtodos quantitativos o coeficiente de correlao (r) deve ser igual ou superior a 0,99 e podem rejeitar-se pontos anmalos at ao limite de 20% dos pontos utilizados. Caso no se atinja esses objectivos deve aumentar-se a gama de trabalho 22 . Em seguida calcularam-se os LD e LQ com base nos dados da recta obtida, de acordo com equaes seguintes (International Conference on Harmonization (Q2B), 1996):
LD = 3,3 x
x/y
/ b e LQ = 10 x
x/y
/b
Limite de deteco estimado em 0,1g/L, por observao da resposta do equipamento a nveis baixos de concentrao. 22 Procedimento que julgmos dispensvel tendo em conta os resultados de preciso intermdia e exactido do limite de quantificao adoptado.
21
82
Em que obtida;
x/y
o desvio padro da curva de calibrao e b o declive da recta
Os dados utilizados neste estudo apresentam-se de seguida.

Tabela V: Dados usados no estudo dos limites de deteco e quantificao do mtodo.
Conc.(ug/L) 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,50 0,55 0,60 Abs.1 0,005 0,006 0,012 0,011 0,014 0,019 0,023 0,026 Abs2. 0,008 0,009 0,009 0,012 0,013 0,019 0,022 0,023 Abs.3 0,006 0,007 0,008 0,012 0,015 0,02 0,021 0,022 Abs.mdia 0,00633 0,00733 0,00967 0,01167 0,01400 0,01933 0,02200 0,02367 desvio padro 0,002 0,002 0,002 0,001 0,001 0,001 0,001 0,002 CV% 24,1 20,8 21,5 4,9 7,1 3,0 4,5 8,8 conc.calc. 0,20 0,22 0,28 0,32 0,38 0,50 0,56 0,60
Fig. 15 - Grfico e resultados usados no estudo dos limiares analticos do mtodo.

LOD e LOQ Arsnio
0,02500 0,02000
RESULTADO RESIDUAL Observao 1 2 3 4 5 6 7 8

0,70
0,01500 0,01000 0,00500 0,00000 0,10
y = 0,0459x - 0,0038 2 R = 0,9932
Y previsto 0,0053482 0,00764544 0,00994268 0,01223992 0,01453715 0,01913163 0,02142887 0,02372611
Residuais 0,000985 -0,00031 -0,00028 -0,00057 -0,00054 0,000202 0,000571 -5,9E-05
Absorvncia
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
Conc. (ug/L)
Varivel X 1 Desenho de residuais
SUMRIO DOS RESULTADOS Estatstica de regresso R mltiplo 0,99658719 Quadrado de R 0,99318604 Quadrado de R ajustado 0,99205038 Erro-padro 0,00059605 Observaes 8 ANOVA gl Regresso Residual Total SQ 1 0,0003107 6 2,1316E-06 7 0,00031283 MQ 0,000310702 3,55272E-07 F F de significncia 874,5448207 9,91202E-08
0,002 0,001 0 -0,0010,00 Residuais
LOD= 0,043 LOQ= 0,130
0,20
0,40 Varivel X 1
0,60
0,80
Interceptar Varivel X 1
Coeficientes Erro-padro -0,0038408 0,00064702 0,0459448 0,00155362
Stat t -5,936095019 29,57270398
valor P 0,001020203 9,91202E-08
95% inferior 95% superior -0,005423962 -0,00225757 0,042143223 0,04974637
Os limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ) obtidos a partir do estudo da curva de calibrao foram respectivamente 0,04 g/L e 0,13 g/L. Apesar do Limite de Quantificao calculado ser 0,13 g/l, optou-se por se realizar quantificaes apenas a partir de 0,3 g/l. Esta deciso foi baseada nos estudos de
83
preciso intermdia realizados a este nvel de concentrao que, como vamos ver mais frente no ponto 4.3.6.2., apresenta valores de preciso intermdia aceitveis. De salientar que, se no se optasse por excluir os 2 dos nveis da recta de calibrao para estudo da linearidade, obter-se-ia como LD e LQ os valores 0,1 g/L e 0,3 g/L respectivamente. No entanto a recta apresentaria um quadrado do coeficiente de correlao de 0,967 (r2= 0,967, r=0,983). No se considera que este mtodo seja suficientemente sensvel para quantificar amostras abaixo dos 0,3 g/l, sendo este um valor muito mais realista para o limite de quantificao, assim como o valor 0,1 g/l para limite de deteco. Nos pontos 4.3.6 e 4.3.7. apresenta-se a avaliao do nvel de concentrao 0,3g/l (LQ) quanto preciso e exactido.
4.3.3. Eficincia da digesto

Foi verificada a eficincia da digesto atravs da anlise em triplicado de um controlo quantitativo de urina (BIO-RAD Lypocheck ) com concentrao mdia de 13,4g/L.
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Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Fig. 16 - Dados da curva de calibrao, respectivo grfico e resultados da quantificao da urina controlo, para clculo da eficincia da digesto.
Digesto de urina control da BIORAD em triplicado com 13,4 ug/L (Arsnio) [10,7-16,0] Preciso Exactido CV% conc.calc. RSD%(bias) 11,11 0,22 8,45 7,05 0,51 1,22 3,53 1,00 0,08 2,90 1,99 -0,49 0,45 2,93 -2,46 0,56 4,05 1,31
Conc. (ug/L) 0,2 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0
Abs.1 0,009 0,022 0,045 0,084 0,128 0,177
Abs.2 0,01 0,023 0,042 0,089 0,128 0,176
Abs.3 Abs.mdia desvio padro 0,008 0,009 0,001 0,02 0,022 0,002 0,043 0,043 0,002 0,087 0,087 0,003 0,127 0,128 0,001 0,178 0,177 0,001
Calibrao Arsnio 070820
0,200 Absorvncia 0,150 0,100 0,050 0,000 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 Conc. (ug/L)
y=ax+b a= b= 0,0438 -0,0005

y = 0,0438x - 0,0005 R2 = 0,9992
Amostras de urina de concentrao conhecida digeridas para clculo de eficincia da digesto. Preciso Exactido Amostra control Abs.1 Abs.2 Abs.3 Abs.mdia desvio padro CV% conc.calc. RSD%(bias) Ur.BIORAD_1 0,133 0,137 0,135 0,135 0,002 1,48 15,47 15,43 Ur.BIORAD_2 0,128 0,123 0,125 0,125 0,003 2,01 14,36 7,20 Ur.BIORAD_3 0,111 0,114 0,112 0,112 0,002 1,36 15,46 15,35 Preciso CV% 4,2 Exactido RSD%(bias) 12,7
Conc. esperada (ug/L) 13,4
mdia 15,1
desvio padro 0,634
A concentrao obtida foi 15,1g/L, que se encontra no intervalo de aceitao apresentado pela BIO-RAD [10,7-16,0].
4.3.4. Taxa de recuperao da digesto

Para alm do estudo da eficincia da digesto, ou seja, para alm de verificarmos que a digesto dos compostos orgnicos de arsnio completa (ou praticamente completa) 23 importa verificar se a preparao das amostras envolve ou no perdas significativas do analito de interesse.
Os compostos orgnicos de arsnio so especialmente difceis de digerir implicando digestes extremamente agressivas. Para determinar arsnio total importante garantir a dissoluo de todos os compostos de arsnio presentes na amostra.
23
85
Para efectuar este estudo designado como taxa de recuperao da digesto, foram digeridas solues de referncia em triplicado a trs nveis de concentrao de arsnio diferentes (0,5; 1,0 e 4,0 g/L). Paralelamente digeriram-se brancos em triplicado (1ml de gua desionizada) e aps finalizar a digesto adicionou-se o arsnio correspondente aos nveis em estudo j identificados atrs (fortificao). Por fim, confrontaram-se os resultados das concentraes calculadas para as referncias digeridas, com os resultados das concentraes obtidas para os brancos fortificados aps a digesto (brancos digeridos e posteriormente fortificados).
Os resultados da taxa de recuperao da digesto so apresentados em termos percentuais aplicando a seguinte expresso:
Rec.dig.(%)=[(media conc.sol.referencia X 100)/ mdia conc.fortificao]
Em seguida apresentam-se os dados obtidos neste estudo. De salientar que o estudo foi efectuado em duas etapas diferentes. Os resultados relativos aos nveis de concentrao 0,5 e 4,0 g/L foram obtidos num dia, e noutro dia foram obtidos os resultados relativos ao nvel de concentrao 1,0 g/L.
86
Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Fig. 17 - Dados da avaliao da taxa de recuperao da digesto do As para os nveis de concentrao 0,5 e 4,0 g/L.
Conc. (ug/L) 0,2 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 Abs.1 0,007 0,019 0,035 0,075 0,112 0,14 Abs.2 0,01 0,02 0,038 0,078 0,116 0,141 Abs.3 Abs.mdia desvio padro 0,008 0,008 0,002 0,019 0,019 0,001 0,04 0,038 0,003 0,08 0,078 0,003 0,114 0,114 0,002 0,142 0,141 0,001 Preciso CV% 18,33 2,99 6,68 3,24 1,75 0,71 conc.calc. 0,16 0,47 0,98 2,10 3,12 3,88 Exactido RSD%(bias) -19,70 -6,26 -1,77 5,14 4,01 -3,08
0,160 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0,0
y=ax+b a= 0,0357 b= 2,60E-03

y = 0,0357x + 0,0026 R2 = 0,9962
Absorvncia
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Conc. (ug/L)
Conc. (ug/L) Abs.1 Abs.2 Branco de digesto fortificado a 0,5 ug/L 0,5 0,026 0,023 0,5 0,025 0,022 0,5 0,026 0,025
Abs.3 0,024 0,024 0,024
Abs.mdia desvio padro 0,0243 0,0237 0,0250 0,002 0,002 0,001
Preciso CV% 6,28 6,45 4,00
conc.calc. 0,61 0,59 0,63 mdia conc.fortificao 0,61 0,63 0,61 0,49 mdia conc. 0,57 Rec. da digesto (%) 94,4
Sol. referncia a 0,5 ug/L digerida 0,5 0,028 0,023 0,5 0,024 0,026 0,5 0,021 0,02
0,024 0,023 0,019
0,0250 0,0243 0,0200
0,003 0,002 0,001
10,58 6,28 5,00
Conc. (ug/L) Abs.1 Abs.2 Branco de digesto fortificado a 4,0 ug/L 4 0,158 0,161 4 0,155 0,162 4 0,157 0,154
Abs.3 0,154 0,158 0,160
Abs.mdia desvio padro 0,1577 0,1583 0,1570 0,004 0,004 0,003
Preciso CV% 2,23 2,22 1,91
conc.calc. 4,34 4,36 4,32 mdia conc.fortificao 4,34
Sol. referncia a 4,0 ug/L digerida 4 4 4 0,155 0,16 0,152 0,164 0,15 0,15 0,159 0,145 0,152 0,1593 0,1517 0,1513 0,005 0,008 0,001 2,83 5,04 0,76 mdia conc. 4,24 4,39 4,18 4,17 Rec. da digesto (%) 97,7
87
Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Fig. 18 - Dados da avaliao da taxa de recuperao da digesto do As para o nvel de concentrao 1,0 g/L.
Conc. (ug/L) 0,2 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 Abs.1 0,01 0,021 0,044 0,091 0,135 0,178 Abs.2 0,009 0,022 0,046 0,093 0,133 0,18 Abs.3 Abs.mdia desvio padro 0,011 0,010 0,001 0,021 0,021 0,001 0,047 0,046 0,002 0,095 0,093 0,002 0,135 0,134 0,001 0,176 0,178 0,002 Preciso CV% 10,00 2,71 3,34 2,15 0,86 1,12 conc.calc. 0,20 0,46 1,00 2,07 3,00 3,98 Exactido RSD%(bias) 1,12 -8,61 0,37 3,37 -0,12 -0,56
Absorvncia
y=ax+b 0,200 a= 0,150 b=

0,100 0,050 0,000 0,0
0,0445 0,001
y = 0,0445x + 0,001 R2 = 0,9994
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Conc. (ug/L)
Conc. (ug/L) Abs.1 Abs.2 Abs.3 Abs.mdia desvio padro Branco de digesto fortificado a 1,0 ug/L 1,0 0,048 0,053 0,053 0,0513 0,003 1,0 0,052 0,053 0,052 0,0523 0,001 1,0 0,049 0,050 0,052 0,0503 0,002
Preciso CV%
conc.calc.
5,62 1,13 1,10 1,15 3,03 1,11 mdia conc.fortificao 1,13 4,11 5,48 2,39 1,12 1,16 1,06 mdia conc. Rec. da digesto (%) 1,11 98,5
Sol. referncia a 1,0 ug/L digerida 1,0 0,053 0,049 1,0 0,056 0,051 1,0 0,049 0,049
0,05 0,051 0,047
0,0507 0,0527 0,0483
0,002 0,003 0,001
Os resultados da avaliao da taxa de recuperao da digesto demonstram que no h perdas significativas no processo de preparao da amostra, j que se obtiveram as taxas de recuperao 94,4, 98,5 e 97,7 %, para os trs nveis de concentrao estudados, 0,5, 1,0 e 4,0 g/l respectivamente.
4.3.5. Avaliao do arrastamento

Aps vrias sequncias analisadas, onde solues isentas de arsnio ou amostras com baixa concentrao deste analito foram injectadas, aps amostras ou solues com arsnio a concentraes elevadas, concluiu-se que seria prefervel modificar um parmetro do mtodo que minimizasse o risco de arrastamento (a contaminao entre amostras sequenciais).
88
Assim, o tempo de prefill do mtodo (tempo de aspirao da amostra para preencher tubagens at ao chemifold) foi aumentado de 15 segundos para 18 segundos (vide Anexo II).
Desde essa alterao no se registaram mais fenmenos de arrastamento dentro da gama de trabalho 0,2 a 4,0 g/L.
4.3.6. Preciso
Como j referido anteriormente so normalmente considerados trs nveis de preciso: repetibilidade, preciso intermdia e reprodutibilidade (International Conference on Harmonization (Q2A), 1994). Os resultados do estudo da preciso intermdia do mtodo validado foram estimados utilizando as expresses abaixo referidas (Peters e Maurer, 2002). Estes resultados podem ser analisados com a ferramenta informtica ANOVA (factor nico), atravs da qual podem ser obtidos os valores da repetibilidade e da preciso intermdia.
Dentro de grupos (p-1 graus de liberdade)
Entre grupos (p(n-1) graus de liberdade)
Em que p o nmero de sequncias de cada nvel de concentrao (uma sequncia para cada dia); n o nmero de replicados em cada sequncia; x ij representa um replicado individual (replicado j) obtido na sequncia i; x i representa a mdia de n replicados obtidos na sequncia i, e finalmente, x a mdia das mdias de p sequncias.
P(Sr) Preciso entre sequncias (Srun) Repetibilidade reciso intermdia(SI)
89
Se os CV forem aproximadamente constantes ao longo da gama de trabalho, aplica-se a frmula abaixo para calcular um CV ponderado.
Coeficiente de variao ponderado(CVpool)
A avaliao destes parmetros foi efectuada recorrendo a solues aquosas, visto j se ter concludo que os efeitos de matriz no so significativos, com base no estudo de especificidade apresentado.
4.3.6.1 Preciso Intradia (Intra-Ensaio)

Em seguida apresentam-se os resultados de preciso obtidos em 5 dias de aplicao do procedimento de ensaio nos nveis de concentrao 0,30(LQ), 0,75, 2,50 e 4,00 g/L. Todos os nveis de concentrao foram preparados em triplicado.
90
Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Fig. 19 - Clculo da preciso no DIA1 para os nveis em estudo.
ESTUDO PRECISO DIA 1 Conc (ug/L) Abs1 Abs2 0,2 0,010 0,008 0,5 0,024 0,024 1,0 0,050 0,049 2,0 0,097 0,097 3,0 0,152 0,153 4,0 0,204 0,202 preciso CV% 13,32 4,68 3,14 1,77 1,01 1,25 exactidao conc.calc. RSD%(bias) 0,20 2,03 0,52 3,81 0,99 -0,85 1,96 -1,87 3,02 0,63 4,00 0,08
Abs3 0,008 0,026 0,047 0,100 0,150 0,199
media 0,009 0,025 0,049 0,098 0,152 0,202
sd 0,001 0,001 0,002 0,002 0,002 0,003
y=ax+b a= b=
0,250 0,200
0,0508 -1,70E-03
Calibrao Arsnio DIA1
Absorvncia
0,150
0,100
0,050
y = 0,0508x - 0,0017 R2 = 0,9998

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
0,000
Conc. (ug/L)
Avaliao da preciso do mtodo 0,30 0,3A 0,3B 0,3C 0,75 0,75A 0,75B 0,75C 2,5 2,5A 2,5B 2,5C 4,0 4,0A 4,0B 4,0C Abs1 0,017 0,014 0,017 Abs1 0,035 0,038 0,036 Abs1 0,117 0,105 0,110 Abs1 0,198 0,206 0,203 Abs2 0,016 0,012 0,016 Abs2 0,035 0,038 0,036 Abs2 0,117 0,108 0,115 Abs2 0,198 0,202 0,199 Abs3 0,014 0,013 0,015 Abs3 0,038 0,035 0,037 Abs3 0,121 0,109 0,114 Abs3 0,197 0,198 0,198 media Conc.(ug/L). 0,016 0,34 0,013 0,29 0,016 0,35 media Conc.(ug/L). 0,036 0,74 0,037 0,76 0,036 0,75 media Conc.(ug/L). 0,118 2,36 0,107 2,15 0,113 2,26 media Conc.(ug/L). 0,198 3,92 0,202 4,01 0,200 3,97 mdia desvio padro CV%
0,327 mdia
0,032 desvio padro
9,9 CV%
0,751 mdia
0,010 desvio padro
1,3 CV%
2,256 mdia
0,108 desvio padro
4,8 CV%
3,968
0,043
1,1
91
ESTUDO PRECISO DIA 2 Conc (ug/L) Abs1 Abs2 0,2 0,006 0,005 0,5 0,018 0,018 1,0 0,039 0,034 2,0 0,074 0,079 3,0 0,114 0,115 4,0 0,166 0,155 Abs3 0,005 0,017 0,033 0,077 0,114 0,154 media 0,005 0,018 0,035 0,077 0,114 0,158 sd 0,001 0,001 0,003 0,003 0,001 0,007 preciso CV% 10,83 3,27 9,10 3,28 0,50 4,21 exactidao conc.calc. RSD%(bias) 0,21 4,17 0,52 3,33 0,96 -4,17 1,99 -0,42 2,93 -2,22 4,03 0,83
y=ax+b a= b=
0,180 0,160 0,140
0,04 -3,00E-03
Absorvncia
0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
y = 0,04x - 0,0033 2 R = 0,9994
Conc. (ug/L)
Avaliao da preciso do mtodo 0,30 0,3A 0,3B 0,3C 0,75 0,75A 0,75B 0,75C 2,5 2,5A 2,5B 2.5C 4,0 4,0A 4,0B 4,0C Abs1 0,009 0,010 0,010 Abs1 0,028 0,030 0,028 Abs1 0,092 0,093 0,093 Abs1 0,155 0,155 0,163 Abs2 0,010 0,011 0,010 Abs2 0,027 0,027 0,027 Abs2 0,096 0,091 0,094 Abs2 0,156 0,161 0,161 Abs3 0,011 0,010 0,009 Abs3 0,029 0,029 0,032 Abs3 0,094 0,094 0,096 Abs3 0,158 0,162 0,163 media Conc.(ug/L). 0,010 0,33 0,010 0,33 0,010 0,32 media Conc.(ug/L). 0,028 0,78 0,029 0,79 0,029 0,80 media Conc.(ug/L). 0,094 2,43 0,093 2,39 0,094 2,43 media Conc.(ug/L). 0,156 3,98 0,159 4,06 0,162 4,13 mdia desvio padro CV%
0,325 mdia
0,008 desvio padro
2,6 CV%
0,789 mdia
0,013 desvio padro
1,6 CV%
2,417 mdia
0,022 desvio padro
0,9 CV%
4,058
0,075
1,8
92
ESTUDO PRECISO DIA 3 Conc (ug/L) Abs1 Abs2 0,2 0,008 0,007 0,5 0,02 0,022 1,0 0,039 0,039 2,0 0,076 0,077 3,0 0,113 0,115 4,0 0,15 0,146 preciso CV% 7,87 5,59 1,49 0,75 2,18 1,40 exactidao conc.calc. RSD%(bias) 0,16 -20,25 0,52 3,58 1,00 0,18 2,02 1,16 3,06 2,09 3,95 -1,25
Abs3 0,007 0,02 0,038 0,077 0,118 0,149
media 0,007 0,021 0,039 0,077 0,115 0,148
sd 0,001 0,001 0,001 0,001 0,003 0,002
y=ax+b
0,160 0,140
a= b=
0,0372 1,40E-03
Absorvncia
0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
y = 0,0372x + 0,0014 2 R = 0,9992
Conc. (ug/L)
0,303 mdia
0,016 desvio padro
5,1 CV%
0,814 mdia
0,024 desvio padro
2,9 CV%
2,719 mdia
0,023 desvio padro
0,8 CV%
4,033
0,108
2,7
93
ESTUDO PRECISO DIA 4 Abs2 Conc (ug/L) Abs1 0,2 0,006 0,007 0,5 0,019 0,017 1,0 0,039 0,037 2,0 0,07 0,076 3,0 0,107 0,114 4,0 0,15 0,151 preciso CV% 8,66 8,18 3,01 4,36 3,40 0,67 exactidao conc.calc. RSD%(bias) 0,19 -6,86 0,51 1,43 1,03 3,30 1,98 -1,11 2,98 -0,51 4,02 0,47
Abs3 0,007 0,02 0,039 0,075 0,113 0,149
media 0,007 0,019 0,038 0,074 0,111 0,150
sd 0,001 0,002 0,001 0,003 0,004 0,001
y=ax+b
0,160 0,140
a= 0,0374 b= -3,00E-04
Absorvncia
0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
y = 0,0374x - 0,0003 2 R = 0,9998
Conc. (ug/L)
0,284 mdia
0,015 desvio padro
5,4 CV%
0,706 mdia
0,036 desvio padro
5,1 CV%
2,492 mdia
0,036 desvio padro
1,4 CV%
3,894
0,024
0,6
94
Cons ug/L 0,2 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 Abs1 0,008 0,017 0,037 0,075 0,114 0,153 Abs2 0,006 0,018 0,038 0,075 0,114 0,154 Abs3 0,008 0,02 0,038 0,076 0,113 0,152 media 0,007 0,018 0,038 0,075 0,114 0,153 sd 0,001 0,002 0,001 0,001 0,001 0,001 CV% 15,75 8,33 1,53 0,77 0,51 0,65 conc.calc. RSD%(bias) 0,21 4,87 0,50 -0,61 1,00 0,17 1,99 -0,74 2,99 -0,46 4,01 0,33
y=ax+b
0,180 0,160 0,140 0,120
Absorvncia
a= 0,0383 b= -7,00E-04
0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Conc. (ug/L)
y = 0,0383x - 0,0007 R2 = 0,9999

2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
0,349 mdia
0,023 desvio padro
6,6 CV%
0,755 mdia
0,010 desvio padro
1,3 CV%
2,484 mdia
0,050 desvio padro
2,0 CV%
3,883
0,069
1,8
95
4.3.6.2. Preciso intermdia, repetibilidade e incerteza nas medies

Em seguida, apresentam-se os dados e resultados obtidos de preciso intermdia, repetibilidade e a incerteza nas medies. Para calcular este ltimo parmetro (incerteza nas medies) utilizaram-se os dados provenientes do clculo da preciso intermdia, j que nesta fase, essa a informao mais relevante para o clculo da incerteza da medio (Franco, 2006), permitindo uma primeira avaliao deste parmetro. Para o clculo da incerteza adoptou-se um modelo de distribuio normal de resultados, com um grau de confiana de 95%. Assim, multiplicou-se o valor de preciso intermdia, calculado para cada um dos nveis de concentrao estudados, por um factor de expanso igual a 2 (k=2).
96
Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Fig. 24 - Clculos e resultados obtidos de preciso intermdia, repetibilidade e incerteza nas medies para Limite de Quantificao 0,30 g/L (As).
0,30 ug/L 0,30 Rep.1 Rep.2 Rep.3 xi x
DIA 1 0,34 0,29 0,35
DIA 2 0,33 0,33 0,32
DIA 3 DIA 4 DIA 5 0,29 0,29 0,38 0,32 0,29 0,33 0,29 0,27 0,34 0,30 CV% 7,8 0,28 0,35
0,33 0,33 mdia desvio padro 0,32 0,025
Msrun= MSr= Repetibilidade Preciso entre sequencias Preciso intermedia Incerteza das medies Sr= Srun= Si=
0,00183 0,00043 0,02062 0,02167 0,02992 0,059833 CV(%) 6,9 7,2 10,0 19,9
Anova: factor nico SUMRIO Grupos DIA 1 DIA 2 DIA 3 DIA 4 DIA 5 Contagem 3 3 3 3 3 Soma 0,98 0,98 0,91 0,85 1,05 Mdia Varincia 0,33 0,0010 0,33 0,0001 0,30 0,0002 0,28 0,0002 0,35 0,0005
ANOVA Fonte de variao Entre grupos Dentro de grupos Total SQ 0,007337 0,004253 0,011591 gl 4 10 14 MQ F valor P F crtico 0,001834374 4,31305686 0,02771 3,47805 0,000425307
97
Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Fig. 25 - Clculos e resultados obtidos de preciso intermdia, repetibilidade e incerteza nas medies para o nvel de concentrao 0,75 g/L (As).
DIA 1 0,74 0,76 0,75
DIA 2 0,78 0,79 0,80
DIA 3 0,79 0,82 0,83 0,81 CV% 5,4
DIA 4 0,67 0,74 0,71 0,71
DIA 5 0,75 0,75 0,77 0,76
0,00500 0,00044 0,02109 0,03898 0,04432 0,088631 CV(%) 2,8 5,2 5,9 11,8
ANOVA Fonte de variao Entre grupos Dentro de grupos Total
SQ 0,02001 0,004446 0,024455
gl
MQ F valor P F crtico 4 0,005002377 11,25149 0,001011 3,47805 10 0,000444597 14
98
DIA 1 2,36 2,15 2,26
DIA 2 2,43 2,39 2,43
DIA 3 2,74 2,70 2,72 2,72 CV% 6,7
DIA 4 2,46 2,53 2,49 2,49
DIA 5 2,46 2,54 2,46 2,48
0,08363 0,00331 0,05752 0,16362 0,17344 0,34688 CV(%) 2,3 6,5 6,9 13,9
SQ 0,33451 0,033085 0,367595
gl
MQ F valor P F crtico 4 0,083627488 25,27667 3,28E-05 3,47805 10 0,003308485 14
99
DIA 1 3,92 4,01 3,97
DIA 2 3,98 4,06 4,13
DIA 3 4,14 3,92 4,04 4,03 CV% 2,0
DIA 4 3,92 3,88 3,89 3,89
DIA 5 3,91 3,93 3,80 3,88
0,01893 0,00487 0,06981 0,06844 0,09776 0,195526 CV(%) 1,7 1,7 2,4 4,9
Anova: factor nico SUMRIO Grupos DIA 1 DIA 2 DIA 3 DIA 4 DIA 5 Contagem 3 3 3 3 3 Soma 11,90 12,18 12,10 11,68 11,65 Mdia 3,97 4,06 4,03 3,89 3,88 Varincia 0,0018 0,0056 0,0116 0,0006 0,0048
SQ 0,075708 0,048729 0,124437
gl 4 10 14
MQ F valor P F crtico 0,018926958 3,884121 0,037221 3,47805 0,004872906
Como referido anteriormente, podemos aplicar a expresso apresentada na pgina 90, para clculo do CV ponderado, se os CV forem aproximadamente constantes ao longo da gama de trabalho.
100
Os coeficientes de variao obtidos so respectivamente: 7,8 , 5,4, 6,7 e 2,0 % para os nveis de concentrao 0,30, 0,75, 2,50 e 4,00 ug/l. Sendo assim aplicando a expresso referida atrs obtm-se o seguinte valor para CV ponderado de 12,04%.
101
4.3.6.3 Repetibilidade do equipamento

O parmetro repetibilidade tambm foi avaliado para o equipamento, HG-AAS, atravs da injeco de solues de referncia (n=6) com trs nveis de concentrao distintos (0,5, 2,0 e 4,0 g/L), tendo-se calculado, para cada um dos conjuntos de resultados, os respectivos coeficientes de variao (CV). Na Tabela VI apresentam-se os dados e resultados deste parmetro.
Tabela VI - Dados de Avaliao da repetibilidade do equipamento.
Conc.(ug/L) 0,5_a 0,5_b 0,5_c 0,5_d 0,5_e 0,5_f Conc.(ug/L) 2,0_a 2,0_b 2,0_c 2,0_d 2,0_e 2,0_f Conc.(ug/L) 4,0_a 4,0_b 4,0_c 4,0_d 4,0_e 4,0_f
Abs.1 0,020 0,018 0,020 0,020 0,019 0,020 Abs.1 0,077 0,078 0,080 0,075 0,077 0,077 Abs.1 0,147 0,155 0,155 0,151 0,154 0,149
Abs.2 0,018 0,020 0,018 0,021 0,018 0,021 Abs.2 0,075 0,077 0,074 0,076 0,075 0,076 Abs.2 0,151 0,157 0,154 0,160 0,156 0,158
Abs.3 0,018 0,019 0,019 0,017 0,018 0,020 Abs.3 0,079 0,078 0,077 0,073 0,074 0,079 Abs.3 0,155 0,155 0,156 0,156 0,150 0,153
Abs.mdia 0,0187 0,0190 0,0190 0,0193 0,0183 0,0203 Abs.mdia 0,0770 0,0777 0,0770 0,0747 0,0753 0,0773 Abs.mdia 0,1510 0,1557 0,1550 0,1557 0,1533 0,1533
mdia
desvio padro
CV%
0,0191 mdia
0,001 desvio padro
3,6 CV%
0,0765 mdia
0,001 desvio padro
1,6 CV%
0,1540
0,002
1,2
4.3.7. Exactido
A exactido encontra-se expressa sob a forma de uma percentagem, traduzindo a diferena em relao concentrao alvo (100%), correspondente ao nvel de concentrao da referncia preparada. Os dados e resultados obtidos na avaliao da exactido (n=15) encontram-se resumidos na fig. 28.
102
Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Fig. 28 - Dados e resultados do estudo de exactido.
0,30 0,34 0,29 0,35 0,33 0,33 0,32 0,29 0,32 0,29 0,29 0,29 0,27 0,38 0,33 0,34 EXACTIDO
2,5 2,36 2,15 2,26 2,43 2,39 2,43 2,74 2,70 2,72 2,46 2,53 2,49 2,46 2,54 2,46 EXACTIDO
mdia desvio padro
CV%
0,75 0,74 0,76 0,75 0,78 0,79 0,80 0,79 0,82 0,83 0,67 0,74 0,71 0,75 0,75 0,77 EXACTIDO
mdia
desvio padro
CV%
0,32 105,8
mdia
0,029
9,1
0,76 101,7
mdia
0,042
5,5
desvio padro
CV%
4,0 3,92 4,01 3,97 3,98 4,06 4,13 4,14 3,92 4,04 3,92 3,88 3,89 3,91 3,93 3,80
desvio padro
CV%
2,47 98,9
0,162
6,6 EXACTIDO
3,97 99,2
0,094
2,4
Para avaliar a exactido, ou seja, para avaliar se existe algum erro sistemtico que sobrestime ou subestime as concentraes calculadas, podemos aplicar um teste estatstico para cada nvel de concentrao de forma a averiguar se a recuperao mdia significativamente diferente de 100% (PE-STF-012, 2007). Neste teste comparam-se dois valores o tExp, calculado com base nos valores obtidos do estudo de exactido, com um valor de referncia designado como tcrit, valor este que se retira da tabela de distribuio t-student para um nvel de confiana de 95% e n-1 graus de liberdade.
103
Como o estudo de exactido est a ser efectuado com base em 5 medies (n=5; mdias dos triplicados obtidos em 5 dias diferentes) ento o valor de tcrit a utilizar 2,78.
Se tExp < tcrit ento R no significativamente diferente de 100 e U(R) calculado com base nas equaes 4 e 5.
Se tExp > tcrit ento R significativamente diferente de 100%. Quando no so introduzidos factores de correco, U(R) calculado de acordo com a equao 5. Neste caso, a incerteza aumentada de forma a contemplar este factor adicional de incerteza. As expresses para realizar estes clculos apresentam-se de seguida:
Eq.1
Eq.2
Eq.3
Eq.4
Eq.5
Eq.6
Onde: Sobs o desvio padro de p valores de Ri obtidos em condies de preciso intermdia; Ri a recuperao media de n replicados obtidos em condies de repetibilidade; tcrit valor critico bi-caudal para p-1 graus de liberdade num intervalo de confiana de 95%.
Aplicando as expresses apresentadas anteriormente, obtm-se os resultados apresentados a seguir para os nveis de concentrao 0,75, 2,50 e 4,00 g/l.
104
AVALIAO EXACTIDO: R(0,75)= 1,01726
R(2,50)= 0,98940
R(4,00)= 0,99183
U%Rmedio= 0,01079 tcrit= 2,78 texp (0,75)= 1,60
Conclui-se ento que os valores de recuperao mdia no apresentam um desvio significativo de 100%, j que para os trs nveis estudados tExp inferior a tcrit. No existindo evidncias de erros sistemticos nestas determinaes.
4.3.8. Gama de trabalho e linearidade

A comprovao da linearidade foi feita atravs da anlise do coeficiente de correlao (r 2 >0,99), dos resduos (anlise visual da sua distribuio) e da intercepo da recta na origem, que deve incluir o valor zero para um grau de confiana de 95% (PE-STF-012, 2007). A linearidade foi verificada no intervalo de 0,2 g/l a 4,0 g/l, com o quadrado do coeficiente de correlao linear de 0,999 (r 2 ). Os dados de avaliao da linearidade apresentam-se em seguida na fig. 29.
105
Dissertao de Mestrado em Medicina Legal e Cincias Forenses Fig. 29 - Dados e resultados do estudo de avaliao da gama de trabalho e linearidade.
Conc. (ug/L) 0,2 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Abs.1 0,009 0,022 0,045 0,070 0,084 0,112 0,128 0,152 0,181 Abs.2 0,011 0,023 0,042 0,066 0,089 0,108 0,128 0,158 0,176 Abs.3 0,010 0,020 0,043 0,062 0,087 0,115 0,127 0,153 0,178 Abs.mdia 0,010 0,022 0,043 0,066 0,087 0,112 0,128 0,154 0,178 desvio padro 0,001 0,002 0,002 0,004 0,003 0,004 0,001 0,003 0,003 Preciso CV% 10,0 7,1 3,5 6,1 2,9 3,1 0,5 2,1 1,4 conc.calc. 0,23 0,50 0,99 1,50 1,97 2,54 2,90 3,51 4,05 Exactido RSD%(bias) 16,07 -0,60 -1,11 0,23 -1,37 1,61 -3,22 0,25 1,34
Linearidade do Arsnio (0,2-4,0 ug/L) RESULTADO RESIDUAL 0,200 0,150 Abs. 0,100 0,050 0,000 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 Conc.Arsnio (ug/L) y = 0,044x - 0,0002 2 R = 0,9989 Observao 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Y previsto 0,00858466 0,021799381 0,043823915 0,065848449 0,087872984 0,109897518 0,131922052 0,153946587 0,175971121 Residuais 0,00141534 -0,000132714 -0,000490582 0,000151551 -0,001206317 0,001769149 -0,004255386 0,000386747 0,002362213
Varivel X 1 Desenho de residuais
SUMRIO DOS RESULTADOS

Residuais
0,006 0,001 -0,004 0,0 -0,009 Varivel X 1 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
Estatstica de regresso R mltiplo 0,999444602 Quadrado de R 0,998889513 Quadrado de R ajustado 0,998730872 Erro-padro 0,002094464 Observaes 9 ANOVA gl Regresso Residual Total
SQ MQ F F de significncia 1 0,02762154 0,027622 6296,54227 1,32867E-11 7 3,0707E-05 4,39E-06 8 0,02765225 95% inferior 95% superior -0,00335 0,00290 0,04274 0,04536
Interceptar Varivel X 1
Coeficientes Erro-padro Stat t valor P -0,00022515 0,00132196 -0,17032 0,86957865 0,044049069 0,00055512 79,35075 1,3287E-11
4.3.9. Robustez
Ao longo do estudo do mtodo de determinao de arsnio por espectrofotometria de absoro atmica, verificou-se que uma das variveis com maior efeito no desempenho do ensaio a sensibilidade do equipamento. Esta sensibilidade est dependente de vrios factores 24 e varia consoante os dias, diminuindo
Um dos factores que mais afecta a sensibilidade o estado em que se encontra a membrana gs-lquido. Existem outros factores como as tubagens que ligam chemifold clula de quartzo e a prpria clula de quartzo. Todas estas componentes constituintes do sistema gerador de hidretos devem estar o mais secos possvel. Por isso a membrana gs lquido seca ao ar no fim das determinaes e as tubagens secas sob fluxo de azoto quando se encontram gotcolas. A clula de quartzo e o prprio chemifold podem necessitar de limpeza se notarmos um decrscimo significativo na sensibilidade.
24
106
consideravelmente quando injectamos uma sequncia muito longa de amostras, o que implica traar novas rectas de calibrao diariamente e repetir com alguma frequncia a calibrao depois da injeco de mais de 15 amostras. O estudo da robustez do mtodo contnuo, existindo ainda inmeras alteraes que se podem efectuar, cujo efeito ainda se encontra por verificar e quantificar. Parmetros avaliados no estudo de robustez: (a) Volume de cidos usados na digesto: No se verificaram alteraes significativas nos resultados de digestes efectuadas com volumes diferentes de cidos, mesmo por vezes no respeitando as propores utilizadas, desde que a digesto seja efectuada com a mistura de cidos HNO3, H2SO4 e HClO4. Esta avaliao resultou fundamentalmente do estudo da eficincia da digesto, onde previamente se testaram diferentes misturas de cidos, uma tcnica de digesto diferente, aplicando a tecnologia microondas e volumes e propores de cidos diferentes. (b) Tempo de uso da membrana gs-lquido: Quando se injectam mais de 10 amostras aps calibradores ( volta de 15 amostras na totalidade), deve secar-se a membrana gs-lquido, pois encontra-se demasiado hmida causando a diminuio da sensibilidade e de seguida deve verificar-se se a calibrao se mantm e, se isso no acontecer, traar nova curva de calibrao para quantificar restantes amostras (dados resultantes do estudo de preciso intermdia). (c) Materiais e reagentes com lotes de fabrico distintos: No se verificaram alteraes significativas nos resultados usando reagentes diferentes,
nomeadamente quando necessrio preparar mais reagentes (reagente de pr-reduo, soluo de arraste ou mesmo o agente redutor NaBH4) a meio de uma sequncia (concluso retirada fundamentalmente dos estudos de preciso intermdia, repetibilidade e exactido) (d) Digesto de resduos de extractos resultantes da extraco lquido-lquido usada para outras determinaes (e.g. extraco com solventes orgnicos para determinao de pesticidas): verificou-se que a digesto do resduo resultante da extraco de amostras (e.g. 1ml de sangue) no d resultados significativamente diferentes da digesto da prpria amostra desde que a extraco no inclua adio de solues tampo. Este estudo foi importante, porque infelizmente com alguma frequncia a quantidade de amostra to
107
reduzida que no permite efectuar todas as determinaes e assim, este procedimento, permite realizar a determinao de arsnio no resduo do extracto de uma amostra que j no teria utilidade nenhuma.
4.2.10. Estabilidade
Estudou-se a estabilidade das referncias usadas na calibrao, bem como das amostras preparadas para anlise, tendo-se verificado que at 72 horas aps esta preparao podemos repetir a anlise usando os mesmos calibradores, sem se verificar diferenas significativas. Todas as amostras e calibradores usados neste estudo foram mantidos no frigorfico a 5C, nos perodos em que no estavam a ser analisados. Verificou-se que o agente redutor NaBH4 no pode ser usado por um perodo superior a 48 horas, sem que se verifiquem diferenas significativas nos resultados.
108
No Quadro II encontram-se resumidos os resultados mais relevantes do processo de validao do mtodo de determinao de arsnio total em amostras biolgicas por espectrofotometria de absoro atmica.
Quadro II: Resumo dos resultados obtidos de Repetibilidade, Preciso Intermdia, Exactido e Taxa de Recuperao da Digesto do mtodo estudado.
Repetibilidade/ Preciso intermdia / Exactido / Taxa de Recuperao da digesto
Concentrao Repetibilidade As (ug/L) C.V.(%) (n=3) 0,30 (LQ) 0,75 2,8 6,9
Preciso intermdia C.V.(%) (n=15) 10,0
Exactido (%) (n=15) 105,8
Taxa recuperao da digesto (n=3) Concentrao (ug/L) (%)
5,9
101,7
0,50
94,4
2,50
2,3
6,9
98,9
1,00
97,7
4,00
1,7
2,4
99,2
4,00
98,5
4.4. Discusso de resultados
Da anlise dos resultados obtidos (Quadro II) conclui-se que o mtodo proposto adequado determinao de arsnio total em amostras biolgicas. Importa salientar que, dado a elevada sensibilidade deste mtodo, possvel quantificar amostras cuja concentrao de arsnio se encontra em nveis fisiolgicos.
Ao analisarmos uma amostra real de sangue, usando 0,5 ml dessa amostra e a diluirmos at um volume final de 10 ml (condies habitualmente adoptadas nas determinaes de rotina) consegue-se quantificar esta amostra desde valores de concentrao de arsnio na ordem dos 0,006 g/ml, ou seja o LQ na amostra de 0,006 g/ml, o que se encontra claramente dentro da gama de concentraes fisiolgicas apresentadas na tabela I (vide ponto 2.1.4).
109
Os mesmos clculos podem ser efectuados para as restantes amostras. Se considerarmos a anlise de 1 ml de urina, usando um factor de diluio 1:10, o limite de quantificao do arsnio na amostra aproximadamente 0,003 g/ml. Este valor deixa ainda espao de manobra para, se necessrio, diminuirmos o volume de amostra usado na determinao quando a quantidade de amostra for insuficiente. No caso de uma anlise de cabelo ou unhas, em que se usam cerca de 100mg de amostra e se dilui at ao volume de 10ml, consegue-se quantificar o arsnio presente na amostra at ao limite de 0,03 mg/kg. Aplicando o mesmo raciocnio, no caso da determinao de arsnio em vsceras, considerando que a anlise efectuada sobre uma amostra com 1g com diluio at 10ml, o limite de quantificao ser de 0,003 mg/kg. Em qualquer uma das amostras estudadas, este mtodo permite atingir limites de quantificao dentro dos nveis de concentrao de arsnio considerados fisiolgicos.
Adicionalmente os parmetros de validao cumprem largamente o habitualmente descrito e/ou recomendado na literatura (valores de preciso intermdia de 15%). Os limites de deteco (LD) e quantificao (LQ) adoptados foram 0,1 g/L e 0,3 g/L respectivamente. A linearidade foi verificada no intervalo de 0,2 g/L a 4,0 g/L, com o quadrado do coeficiente de correlao linear de 0,999 (r2). A preciso intermdia (n=15) apresenta coeficientes de variao entre 10 % (0,3 g/L As LQ) e 2,4 % (4,0 g/L As). A exactido calculada com base em 15 rplicas a 4 nveis de concentrao diferentes varia entre 98,9% e 105, 8%.
110
CAPTULO V CONSIDERAES FINAIS
111
A tcnica de espectrofotometria de absoro atmica (EAA) continua a ocupar um lugar de destaque na determinao de metais e metalides em inmeros campos da anlise instrumental. As vantagens desta tcnica incluem em primeiro lugar a extensa lista de elementos que possvel determinar, mais de 60 elementos, com elevada sensibilidade e a custo moderado. A rapidez das determinaes, bem como a simplicidade na sua utilizao torna a sua aplicao apropriada a determinaes de rotina mesmo com operadores pouco treinados. A principal desvantagem o facto de no permitir a determinao simultnea de diferentes elementos. Apesar de j terem sido desenvolvidos instrumentos de EAA para anlise multielementar, estas determinaes requerem condies de compromisso que conduzem deteriorao da sensibilidade e outros parmetros analticos para um grande nmero de elementos (Welz e Sperling, 1999). Por este facto esta deixou de ser, para os principais fabricantes deste tipo de equipamentos, uma das apostas de desenvolvimento desta tcnica. O ICP-MS vem colmatar esta situao apesar de ainda ser uma tcnica bastante dispendiosa e com alguns problemas devido s possveis interferncias isobricas.
Tm sido desenvolvidas muitas metodologias analticas para determinar arsnio ao nvel dos g/L nos ltimos anos, por HG-AAS, ET-AAS e outras tcnicas combinadas como o caso do HG-ICP-MS, HG-ICP-AES, etc. A espectrofotometria de absoro atmica, mais concretamente a
espectrofotometria de absoro atmica com sistema gerador de hidretos (HG-AAS) continua a ser uma das tcnicas mais vulgarmente aplicadas na determinao de arsnio vestigial, o que bem patente quando se constata o nmero de publicaes nesta rea que retratam as mais diversificadas aplicaes.
Nestas determinaes, o pr-tratamento da amostra o passo crtico. A matria orgnica bem como os compostos orgnicos de arsnio devem ser completamente decompostos e os oxidantes residuais totalmente eliminados da soluo final obtida aps digesto. De seguida, o analito deve passar ao seu estado de oxidao trivalente. As digestes hmidas, usando a mistura de cidos HNO3-HClO4-H2SO4 sob determinadas condies, tm-se mostrado as mais eficientes providenciando digestes suaves, seguras e completas e paralelamente brancos de reagentes aceitveis.
112
A digesto seca na presena de Mg(NO3)-MgO no entanto uma alternativa vivel mas no foi estudada no mbito deste trabalho.
Relativamente aos objectivos deste trabalho, podemos afirmar que o mtodo desenvolvido aplicando a tcnica de espectrofotometria de absoro atmica determinao de arsnio total em amostras biolgicas foi alcanado visto que o mtodo estudado se revelou suficientemente especfico e sensvel, sendo adequado determinao de arsnio em amostras de sangue, urina, cabelos, unhas, fgado, rim e outras vsceras no mbito da Toxicologia Forense, tendo sido adoptado nas anlises de rotina do STF da Delegao do Centro.
Outro dos objectivos deste trabalho era o de possibilitar a quantificao do analito em estudo usando o mnimo de amostra possvel. Esta questo de extrema importncia em toxicologia forense dada a vulgar escassez de amostra face s solicitaes de diferentes tipos de anlise no mbito de um s processo forense. O mtodo desenvolvido contemplou este factor pois, face ao anterior mtodo aplicado no STF (o mtodo de Gutzeit, ver anexo I), conseguiu-se diminuir significativamente a quantidade de amostra necessria determinao de arsnio. O mtodo foi validado tendo em conta a anlise de 0,5 ml de sangue, 1ml de urina, cerca de 100 mg de cabelo e/ou unhas e 1g de outras amostras biolgicas como o caso do fgado e rim. No entanto de salientar que este mtodo apresenta sensibilidade suficiente que permite reduzir ainda mais as quantidades de amostra de urina, cabelo, unhas e outras vsceras. Alis, frequente que a quantidade de amostra de cabelo e unhas enviada para anlise no exceda os 100mg. Nestes casos efectuaram-se
determinaes de arsnio usando menos de 100mg de amostra e mesmo assim foi possvel a sua quantificao. A diminuio da quantidade de amostra possibilita tambm a utilizao de um menor volume de cidos na digesto e menor gasto de reagentes. O mtodo proposto permite o tratamento em simultneo de um maior nmero de amostras (conseguem-se digerir em simultneo cerca de 10 amostras), o que conduz a uma maior rapidez de processamento. Sendo assim, o mtodo apresentado tornou a determinao de arsnio em amostras biolgicas mais rpida, econmica, com produo de menos resduos, apresentando maior sensibilidade, preciso e exactido que o mtodo anteriormente usado no STF.
113
Relativamente ao ltimo objectivo proposto, que diz respeito aplicao da tecnologia microondas na digesto das amostras biolgicas, este no foi possvel alcanar devido essencialmente a limitaes impostas pelo material de que constitudo o prprio equipamento. Mais concretamente, os vasos de reaco do microondas que, sendo de Teflon, s podem funcionar a temperaturas inferiores a 240C, o que compromete a digesto eficiente das espcies de arsnio persistentes. Assim, como discutido anteriormente, se fosse aplicada a tecnologia microondas no processo de digesto, esta teria que ser complementada por uma digesto hmida em vaso aberto, o que tornaria o procedimento mais demorado e com maior hiptese de perda do analito devido ao aumento de manipulao das amostras. Esta limitao verifica-se no caso da determinao de arsnio, mas no invalida a utilizao e adequao da digesto pressurizada com microondas como prtratamento para posterior anlise de outros elementos por GF-AAS ou HG-AAS.
Em seguida apresentam-se alguns aspectos que apesar de no terem sido aprofundados no decurso deste trabalho devem ser referidos.
Para averiguar a qualidade dos resultados de arsnio obtidos a partir deste mtodo seria importante participar em ensaios interlaboratoriais. Tambm seria importante adquirir e analisar outros materiais de referncia, o que nem sempre se encontra disponvel no mercado. Tendo em conta a sensibilidade do mtodo proposto, outro estudo que tem interesse desenvolver a confirmao da adequao do mtodo a um menor volume de amostra de urina (e.g. 0,5ml). Esta confirmao foi efectuada no caso das amostras de sangue, resultando na diminuio do volume de 1ml para 0,5ml, obtendo-se melhores resultados relativamente especificidade do mtodo devido ao menor efeito de matriz.
Para alm do arsnio existe um nmero considervel de outros elementos com importncia toxicolgica, por exemplo, o Hg, Pb, Cu, Al, Ni, Cd, Sb, Li, Se, Zn e o Fe, cuja determinao pode ser efectuada pelas tcnicas disponveis no STF, da que se deva ponderar a importncia de desenvolver e validar mtodos de determinao destas substncias.
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120
ANEXOS
121
ANEXO I - Mtodo de Gutzeit.
122
ANEXO II - Condies instrumentais do mtodo de determinao de arsnio por HG-AAS.
123
124

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pelos contedos nele apresentados.

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conhecimentos tcnico-cientficos adquiridos na rea de desenvolvimento deste trabalho.

Aos meus pais por todo o carinho, apoio, confiana e fora

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i ii iii iv v vii x xii xiii

1.1. Justificao do tema escolhido 1.2. Objectivos 1.3. mbito do estudo

Captulo II REVISO DA LITERATURA

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2.1.7. Estudo dos processos de digesto

2.3. Enquadramento Legal

Captulo III PARTE EXPERIMENTAL

Captulo IV Apresentao e Discusso de Resultados

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102 102 105 106 108 109

Captulo V Consideraes Finais

Anexos Anexo I Anexo II

121 122 123

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NDICE DE FIGURAS, TABELAS E QUADROS

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ANEXO I Mtodo de Gutzeit.

ANEXO II Condies instrumentais do mtodo de determinao de arsnio 123 por HG-AAS.

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LISTA DE SMBOLOS, UNIDADES E ABREVIATURAS

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1.1. Justificao do tema escolhido

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1.3. mbito do Estudo

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CAPTULO II REVISO DA LITERATURA

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2.1. Enquadramento Terico - Estado da Arte

Mtodo de atomizao Chama

Temperatura de atomizao (C) 17003150

Base do mtodo Absoro

Plasma acoplado indutivamente

Plasma de corrente continua

Adaptado a partir de Skoog et al, 1992.

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Fig.1 - Processo de excitao e decaimento (Beaty e Kerber, 1993).

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Fig.2 - Ilustrao de possveis transies electrnicas (Beaty e Kerber, 1993).

O processo de excitao e decaimento