Atividade antimicrobiana do mel da abelha nativa sem ferro Nannotrigona testaceicornis (Hymenoptera: Apidae: Meliponini).

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ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO MEL DA ABELHA NATIVA SEM FERRO NANNOTRIGONA TESTACEICORNIS (HYMENOPTERA: APIDAE, MELIPONINI)
A.L. Gonalves, A. Alves Filho, H. Menezes Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biocincias, Departamento de Bioqumica e Microbiologia, Av. 24A, 1515, CEP 13506-900, Rio Claro, SP, Brasil. E-mail: airtonlgoncalves@ig.com.br
RESUMO Diversas propriedades medicinais como antibacteriana, antifngica, cicatrizante e antioxidante so popularmente relatadas ao mel. Poucos estudos tm sido realizados sobre atividade antimicrobiana (AA) do mel de abelhas sociais da subfamlia Meliponinae. O objetivo deste estudo foi investigar a AA do mel de Nannotrigona testaceicornis, uma espcie de abelha indgena sem ferro. Para a avaliao da AA do mel foi empregado o mtodo da difuso em gar, utilizando-se discos de 6 mm de dimetro em presena de 10 diferentes microrganismos, obtidos de focos de infeces clnicas. Os testes indicaram resistncia em: Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus -hemoltico; e indicaram sensibilidade em: Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes, bem como Staphylococcus spp. coagulase. Vinte e trs antibiticos comerciais distintos foram tambm avaliados no presente estudo. Os resultados obtidos at o momento apontam para um excelente potencial teraputico deste produto apcola. PALAVRAS-CHAVES: Atividade antibacteriana, mel, abelha nativa, Nannotrigona testaceicornis. ABSTRACT ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF HONEY FROM NATIVE STINGLESS BEE NANNOTRIGONA TESTACEICORNIS (HYMENOPTERA: APIDAE, MELIPONINI). Several medicinal properties, such as antibacterial, antifungal, healing and antioxidant activities, are popularly reported for honey. Few studies have been done on the antimicrobial activity (AA) of honey produced by social bees from the sub-family Meliponinae. The objective of this study was to investigate the AA of honey produced by Nannotrigona testaceicornis, a native stingless bee. For the honey AA evaluation, the agar diffusion method was assayed against 10 different microorganisms isolated from inoculi obtained from clinically infected sites. Tests indicated resistance in Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, - hemolytic Streptococcus. Susceptibility was observed in Escherichia coli, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes as well as in negativecoagulase Staphylococcus spp. Twenty-three distinct commercial antibiotics were also assayed in the present study. Results obtained up to this date indicate an excellent therapeutical potential for this natural product. KEY WORDS: Antibacterial activity, honey, native bee, Nannotrigona testaceicornis.

INTRODUO O mel de abelhas um suplemento alimentar que, ultimamente vm recebendo um incremento no consumo comercial decorrente, principalmente, da comprovao cientfica de suas diversas propriedades benficas sade (ALLEN et al., 1991). Alm das propriedades nutricionais, a utilizao do mel na medicina popular se deve tambm s suas propriedades farmacolgicas. Dentre estas propriedades, a atividade antimicrobiana tem despertado interesse entre os pesquisadores devido ao seu potencial de aplicabilidade em casos clnicos (EFEM, 1988;

ZUMLA & LULAT, 1989; MOLAN, 1992; WILLIX et al., 1992; EFEM et al., 1992; EFEM, 1993; KROL et al., 1993). Propriedades cicatrizante ( UMAR et al., 1993) e K antioxidante (OSZMIANSKI & LEE, 1990) esto tambm relacionadas a este derivado apcola. Durante as ltimas dcadas, a utilizao indiscriminada de antibiticos em diversos setores da agricultura, bem como da sade humana, vm favorecendo a emergncia de linhagens de microrganismos patognicos apresentando resistncia aos mais variados antibiticos. Frente necessidade de desenvolvimento de novas classes de antibiticos, diversas pesquisas tm sido desenvolvidas com

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produtos naturais, sejam de origem vegetal como animal, visando a deteco e caracterizao de compostos qumicos com propriedades teraputicas, entre elas a antimicrobiana. No Brasil, alm da Apis mellifera introduzida por imigrantes europeus, so tambm encontradas abelhas sociais nativas, pertencentes subfamlia Meliponinae. Estas so popularmente conhecidas como abelhas-indgenas-sem-ferro, compreendendo mais de 200 espcies diferentes, algumas das quais freqentemente criadas para a produo do mel (KERR, 1987). O mel destas abelhas-sem-ferro utilizado em terapias populares, principalmente, nas zonas rurais (CORTOPASSI-LAURINO & G ELLI, 1991) e entre indgenas, que acreditam que diferentes tipos de mel possuem propriedades curativas especficas, sendo empregado para a cura de um amplo espectro de doenas (POSEY, 1987). O objetivo do presente estudo foi detectar a atividade antimicrobiana in vitro, do mel da abelha-indgena-sem-ferro Nannotrigona testaceicornis, frente a bactrias patognicas, isoladas de diferentes focos infecciosos humanos. Visando obter-se parmetros mais precisos desta atividade, foram concomitantemente efetuados ensaios de antibiose com vinte e trs diferentes antibiticos comerciais. MATERIAL E MTODOS Mel As amostras de mel utilizadas neste trabalho foram obtidas em maro de 2005, de colmias mantidas na regio de Rio Claro, SP, Brasil. O mel foi envasado em frasco mbar, estril e armazenado no escuro temperatura de 5,4 C. Discos de papel de filtro Framex 389, faixa preta, estreis com 6 mm de dimetro foram acrescidos de 100 g de mel e posteriormente mantidos em estufa a 35 C por 24h para secagem, acondicionados em recipientes estreis e armazenados em geladeira a 5,4 C, baseado na tcnica de BAUER et al. (1966). Antibiticos Foram utilizados discos de papel de 6 mm de dimetro contendo os seguintes antibiticos, nas respectivas concentraes: ampicilina 10 g (AMP), cefoxitina 30 g (CFO), cefalotina 30 g (CFL), cefotaxima 30 g (CTX), tetraciclina 30 g (TET), nitrofurantoina 300 g (NIT) , cloranfenicol 30 g (CLO), sulfazotrim 25 g (SFT), ciprofloxacina 5 g (CIP), eritromicina 15 g (ERI), penicilina G 10 g (PEN), imipinem 10 g (IPM), gentamicina 10 g (GEN), cefepime 30g (CPM), ceftriaxona 30g (CRO),

amicacina 30 g (AMI), aztreonam 30 g (ATM), ceftazidima 30 g (CAZ), oxacilina 1 g (OXA), rifampicina 5 g (RIF), vancomicina 30 g (VAN), levofloxacina 5 g (LVX), clindamicina 2 g (CLI), sendo testados contra os seguintes microrganismos: Enterobacter aerogenes (AMP, CFO, CFL, IPM, GEN, CPM,CRO); Enterobacter cloacae (AMP, CFL, CFO, AMI, CLO, GEN, IPM, CPM,CRO); Escherichia coli (AMP, CFL, ATM, IPM,CLO,CIP); Proteus mirabilis (AMP, CTX, TET, AMI, GEN, CAZ, IPM, ATM, CRO); Proteus spp. ( AMP, NIT, AMI, GEN, IPM, ATM); Pseudomonas aeruginosa ( CLO, SFT, AMP, CIP, CFL, AMI, GEN, CAZ, IPM); Staphylococcus aureus (ERI, SFT, CLO, OXA, RIF, TET, VAN); Staphylococcus spp. coagulase-negativa (PEN, SFT, CIP, LVX, VAN, RIF, CLI); Streptococcus -hemoltico (SFT,ERI, AMP, CLO, PEN,VAN); Streptococcus pyogenes (SFT, ERI, VAN, LVX, CRO, CLO). Padronizao do inculo e semeadura Os inculos foram coletados com swab de algodo em infeces clnicas. Dez microrganismos foram isolados de diferentes focos infecciosos: E. aerogenes (ferida na regio do osso ilaco), E. cloacae [infeco de membros inferiores (MMII)], E. coli (infeco intrabdominal), P. mirabilis (infeco intrabdominal), Proteus spp. (infeco urinria), P. aeruginosa (infeco de MMII), S. (infeco de MMII), Staphylococcus spp. coagulase-negativa (secreo de conjuntivite), Streptococcus -hemoltico (ferida na regio sacral) e S. pyogenes (infeco de orofaringe), sendo inoculados em nutriente gar e mantidos por 24h temperatura de 35 C. Aps este perodo os microrganismos foram ressuspensos em soluo fisiolgica 0,9% (p/v) at obter-se uma turvao equivalente ao padro 0,5 da escala de Mac Farland. Alquotas de 100 L dessa suspenso foram semeadas por superfcie em placas de Petri contendo cerca de 15 mL do meio Mueller-Hinton gar, com uma espessura de aproximadamente 4 mm (SHADOMY & SPNEL-INGROF, 1980). Ensaios de antibiose Para a avaliao da AA foi empregado o mtodo da difuso em gar (BAUERet al.,1966). Aps a semeadura dos microrganismos no meio, os discos com o mel e os discos com antibiticos comerciais foram distribudos e levemente pressionados sobre o gar. Foi mantida uma distncia de 40 mm entre os discos para evitar interferncia entre os halos de inibio. As placas foram incubadas 35 C, e aps 24h realizou-se a leitura dos resultados, que consistiu na medio do dimetro dos halos de inibio, incluindo o prprio disco de 6 mm.

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RESULTADOS E DISCUSSO Na Tabela 1 esto sumarizados os resultados obtidos nos ensaios de AA com o mel da abelha Nannotrigona testaceicornis, e os resultados obtidos nos testes com antibiticos comerciais frente a 10 diferentes microrganismos, indicando as resistncias e sensibilidades obtidas. Apesar de estudos de antibiose com produtos naturais comumente utilizarem cepas de microrganismos padres, neste estudo em especial, foram utilizados microrganismos oriundos de focos infecciosos, visando caracterizar a real potencialidade deste material no controle de infeces clnicas. Os resultados indicam uma ntida atividade antimicrobiana do mel de N. testaceicornis frente a E. coli, Proteus spp., P. aeruginosa, Staphylococcus spp. coag. e S. pyogenes, todas patognicas. Este trabalho permitiu verificar alguns dados importantes, tais como a constatao da alta AA do mel obtido da N. testaceicornis contra bactrias Gramnegativas (E. coli, Proteus spp. e P. aeruginosa), que nos testes de antibiose com antibiticos comerciais mostraram-se resistentes respectivamente (AMP, CFL); (AMP, NIT) e (CLO, SFT, AMP, CIP, CFL); tambm, a constatao da sensibilidade dos Gram-positivos Staphylococcus spp. coagulase-negativa e S. pyogenes que nos testes com antibiticos comerciais mostraram-se resistentes respectivamente (PEN, SFT) e (SFT, ERI). O mtodo da difuso em gar, baseado na tcnica descrita por BAUERet al. (1966) considerada de baixa

sensibilidade (JAMES et al., 1972), pois a substncia testada vai se diluindo conforme se difunde no gar. No entanto, considerado como o ensaio mais apropriado para agentes antibiticos tpicos, porque resgata a avaliao da difusibilidade (ALLEN et al., 1991), importante para a avaliao do mel, uma vez que este considerado um agente tpico ideal no tratamento de infeces cirrgicas, queimaduras e feridas infecciosas (EFEM et al., 1992). Poucas pesquisas cientficas foram direcionadas visando a caracterizao das propriedades farmacolgicas do mel produzido por meliponneos. CORTOPASSI-LAURINO & GELLI (1991), comparando a AA dos mis de alguns meliponneos em relao ao de Apis mellifera, constataram que do total de ensaios de antibiose realizados, 50% dos microrganismos mostraram-se sensveis. Ao se comparar na literatura, a AA de diferentes amostras de mel de A. mellifera, frente aos microrganismos sensveis ao mel de meliponneos constata-se que estes apresentam uma atividade nitidamente superior aos mis de A. mellifera. Vrias substncias tais como acares, cidos orgnicos, diversos elementos qumicos (WHITE, 1975), vitaminas e flavonides (SABATIER et al., 1992) foram identificadas no mel. Algumas enzimas secretadas por glndulas do aparelho digestivo das abelhas so introduzidas no nctar j a partir de sua coleta, como a glicose oxidase, que converte a glicose em glicolactona, produzindo tambm o perxido de hidrognio, este ltimo considerado por muitos autores como sendo responsvel pela AA constatada no mel (MENDES & COELHO, 1983).

Tabela 1 - Resultados da atividade antimicrobiana do mel da abelha Nannotrigona testaceicornis, frente a 10 diferentes microrganismos e os resultados dos testes de controle com antibiticos comerciais. Microrganismo Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Escherichia coli Proteus mirabilis Proteus spp. Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Staphylococcus spp. coag.Streptococcus -hemoltico Streptococcus pyogenes Mel Resistente Resistente Sensvel (19 mm) Resistente Sensvel (10 mm) Sensvel (11 mm) Resistente Sensvel (15 mm) Resistente Sensvel (14 mm) Resistente AMP, CFO, CFL. AMP, CFL, CFO. AMP, CFL. AMP, CTX, TET. AMP, NIT. CLO, SFT, AMP, CIP, CFL. ERI, SFT. PEN, SFT. SFT, ERI. SFT, ERI. Sensvel* IPM, GEN, CPM, CRO. AMI, CLO, GEN, IPM, CPM, CRO. ATM, IPM, CLO, CIP. AMI, GEN, CAZ, IPM, ATM, CRO. AMI, GEN, IPM, ATM. AMI, GEN, CAZ, IPM. CLO, OXA, RIF, TET, VAN. CIP, LVX, VAN, RIF, CLI. AMP, CLO, PEN, VAN. VAN, LVX, CRO, CLO.

AMI (amicacina), AMP (ampicilina), ATM (aztreonam), CAZ (ceftazidima), CIP (ciprofloxacina), CLI (clindamicina). CFO (cefoxitina), CFL(cefalotina), CTX (cefotaxima), CLO (cloranfenicol), IPM (imipinem), TET (tetraciclina), NIT (nitrofurantoina), SFT (sulfazotrim), ERI (eritromicina), PEN (penicilina G), GEN (gentamicina), CPM (cefepime), CRO (ceftriaxona), OXA (oxacilina), RIF (rifampicina), VAN (vancomicina), LVX (levofloxacina), Resistente= no houve desenvolvimento do halo de inibio; Sensvel= medida do halo de inibio em mm, incluindo o prprio disco. *Medidas padres em mm dos halos de inibio de antibiticos comerciais AMI(17), AMP(18), ATM(20), CAZ(18), CIP(18), CLI(19), CLO(17), CPM(18), CRO(20), GEN(15), IPM(15), LVX(16), OXA(12), PEN(20), RIF(30), TET(18), VAN(17).

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Estudos sobre antibiose em mis aquecidos constataram reduo nos valores da AA e uma concomitante reduo no contedo de perxido de hidrognio bem como da atividade cataltica da invertase (WHITE & SUBERS, 1964). Enzimas como diastase, catalase, -glicosidase, peroxidase, lipase, amilase, fosfatase cida e inulase, tambm foram detectadas na composio do mel (HUIDOBRO et al., 1995), podendo estar relacionadas com sua AA. Outros estudos, tambm constataram uma correlao direta entre a reduo no contedo de perxido de hidrognio e a reduo na AA de mis expostos a luz, conclundo-se que, quanto mais secrees as abelhas adicionam ao nctar ou a solues aucaradas, mais ricas estas ficam em glicose oxidase e, conseqentemente , a quantidade de perxido de hidrognio se torna maior, incrementando desta forma a AA destes mis (DUSTMANN, 1978). Entretanto outros autores (MOLAN & RUSSELL, 1988), aps efetuarem a remoo enzimtica do perxido de hidrognio contido no mel monofloral, constataram que o mesmo continuava inibindo o crescimento de S. aureus. Baseado nestes experimentos, estes mesmos autores sugeriram que substncias antibacterianas adicionais, e no apenas o perxido de hidrognio, proveriam uma significante parcela da AA do mel. Estes outros fatores estariam relacionados com as fontes florais do mel. CORTOPASSI-LAURINO & GELLI, (1984) aps observarem diferenas na AA de mis com diferentes origens florais, sugeriram que parte desta atividade estaria associada secrees glandulares introduzidas pelas abelhas. Estudos de ZUMLA & LULAT (1989), sugerem que o efeito osmtico, e o baixo pH encontrados no mel, contribuem para o rompimento da parede da clula bacteriana. Segundo MOLAN (1992), o efeito osmtico, o baixo pH e o acmulo de determinados ons, constatados por WHITE (1975) e por PAMPLONA (1994) certamente contribuem para a AA do mel. A presena de flavonides (S ABATIER et al., 1992), juntamente com o acmulo de perxido de hidrognio estariam sinergisticamente atuando na AA final deste composto (WHITE & SUBERS, 1963). Certamente os estudos efetuados at o presente momento no permitem concluir com clareza sobre a real participao de cada um dos fatores fsicoqumicos e bioqumicos sobre a AA do mel. Considerando os resultados obtidos at o momento, novos estudos esto sendo conduzidos com mis de outras espcies de abelhas-indgenas-sem-ferro, sendo interessante tambm, utilizar diferentes concentraes do mel para verificar qual possui melhor AA.

CONCLUSO O fato de se constatar in vitro, AA do mel da abelha N. testaceicornis, frente a diferentes microrganismos isolados de focos infecciosos, demonstra o excelente potencial teraputico deste produto natural e vem fortalecer o papel da medicina popular como depositria de conhecimentos milenares que devem ser analisados cientificamente.
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