Sergio Domnguez Garcia Isai Gomez Paz

PRACTICA 1 Determinacion cualitativa de la cantidad de producto formado. Tabla 1. Comparacion de las cubetas de reaccion con las cubetas estandar. Tiempo (min) 0 8 1 2 4 6 8 Cubeta inicio fin E1 E2 E3 E4 E5 Estandar similar S1 S1 S2 S3 S4 S4 S5 mas Cantidad de pnitrofenol (nmol) 0 0 0 12.5 25 50 100

Determinacion cuantitativa de la cantidad de producto formado 1 Localizar las 5 cubetas de los estndar etiquetados S1-S5 en su mesa de laboratorio, ss concentraciones se observan en la tabla .El blanco del espectofotmetro a 410 nm se realiza con la cubeta S1. A continuacion medir y registrar la absorbancia a 410 nm para el resto de estndar en el cuadro 3.Se usara esta informacion para generar na nueva curva que relaciona la absorbancia a 410 nm con la cantidad presente de p-nitrofenol. Tabla 2 valores de absorbancia de las normas. Estandar S1 S2 S3 S4 S5 Cantidad de p-nitrofenol 0 12.5 25 50 100 Absorbancia a 410nm 0.063 0.247 0.448 0.853 1.666

Curva Absorbancia 410 nm

1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 100 120 Cantidad de p-nitrofenol mmol/L

2 Medir la absorbancia de nuestra cubeta de la reaccion catalizada (E1-E5) y su cubeta de control (inicio-fin) a 410 nm,y registrar sus resultados en la tabla 3.Usted usara esta informacion para determinar la cantidad de producto, p-nitrofenol formado en las cubetas de reaccion. Tabla 3: Determinacion de p-nitrofenol producido utilizando una curva estandar Tiempo (min) 0 8 1 2 4 6 8 Cubeta Inicio Fin E1 E2 E3 E4 E5 Cantidad nitrofenol 4,4 4,3 86.5 112,9 161,8 164,8 169,2 de p- Absorbancia a 410 nm 0,075 0.073 1,456 1.900 2,723 2.773 2.847

3 Determinar la cantidad de producto formado a partir de los valores de absorbancia. La absorcion del producto,p-nitrofenol, esta directamente relacionada cn la cantidad actual de nitrofenol en la cubeta. En otras palabras , la solucion mas amarilla la que mas nitrofenol tiene y mayor sera su valor de absorbancia a 410 nm.Trazando los valores de absorbancia de los estandares con cantidades conocidas de p-nitrofenol(llamada crva estandar), se puede determinar la cantidad de p-nitrofenol que esta presente en la encima de las muestras de ensayo.

Absorbancia

Curva Concentracion nitrofenol a lo largo tiempo

180 160 Concentracion (mmol/l) 140 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 Tiempo (min) 6 8 10

Recta Concentracin frente absorbancia

3 2,5 2 Absorbancia

1,5 1 0,5

0 0 50 100 Concentracion (mmol/l) 150 200

PRACTICA 2
1. Deberas ter 5 cubetas ou estndares etiquetados dende S1 a S5, na ta mesa de laboratorio. Colle as tas mostras de 0C, 22C e 37C e fai unha nota dos estndares que mellores resultados tiveron de cada temperatura de reaccin. Escribe abaixo a concentracin de ese estndar para cada unha das diferentes temperaturas de reaccin. Tboa 5. p-Nitrofenol estndares. Standard S1 S2 S3 S4 S5 Cantidade de p-Nitrofenol (nmol) 0 12.5 25 50 100

Tboa 6. Dterminacin do p-Nitrofenol producido a 3 temperaturas diferentes baseado en estndares de p-Nitrofenol. Temperatura 0C -22C (temperatura ambiente) 37C Estndar similar S4 S5 S5 que mis Cantidade de p-Nitrofenol producida (nmol) 51.6 78.0 140.3

2. Si non dispoemos de un espectrofotmetro, por favor avance cara Anlise de Resultados. Anlise cuantitativo da cantidade de producto formado a diferentes temperaturas. 1. Blanquea o teu espectrofotmetro co estndar S1 a 410 nm e logo mide os valores de absorbancia para as 3 cubetas. 2. Seguindo o mesmo protocolo que na actividade 1, convirte a cantidade de producto que tes, desde unidades de absorbancia medidas no espectrofotmetro a nmoles, e coloca eses valores na terceira columna da tboa 7. Tboa 7. Determinacin de p-Nitrofenol producido a tres temperaturas distintas baseado nunha curva de estndares. (similar ao mostrado na figura 8). Temperatura 0C 22C 37C Absorbancia a 410 nm Cantidade (nmol) 0.865 51.6 1.307 78.0 2.351 140.3 de p-Nitrofenol producido

Anlise de Resultados. 1. Calcular a tasa de reaccin inicial a cada unha das tres temperaturas. Xa que solo medimos a cantidade de p-Nitrofenol nun punto de tempo (2 minutos), asumir que a cantidade de p-Nitrofenol a tempo 0 de 0 nmol.
Concentracion frente a temperatura
80 70 60 concentracion 50 40 30 20 10 0 0 10 20 Temperatura 30 40 Serie1

Realiza estos clculos cos teus datos Tasa inicial de formacin de producto a 0C = 25.8 nmol/min Tasa inicial de formacin de producto a 22C (Temp. Ambiente)= 39 nmol/min Tasa inicial de formacin de producto a 37C = 70.15 nmol/min

PRACTICA 3
Anlisis cualitativo de la cantidad de producto formado a diferentes pH
1. Debe haber 5 cubetas estndares etiquetadas con S1-S5 en tu puesta de laboratorio. Coger tus cubetas con pH 5.0; pH 6.3 y pH 8.6 y apuntar el nmero estndar al que el color de la cubeta se aproxime mas. Apuntar la concentracin del estndar (tabla 8) en la tabla 9 para cada una de las muestras. Tabla 8. Estndares de p-nitrofenol Estndar Cantidad de p-nitrofenol (nmol*) S1 S2 S3 S4 S5 0 12.5 25 50 100

*1 nmol = 110-9 mol Tabla 9. Determinacin de p-nitrofenol producido a 3 valores de pH distintos basados en los estndares de p-nitrofenol. PH Estandar mas parecido Concentracion 5.0 S5 170.7 6.3 S5 172.7 8.3 S5 171.4 1. Si no se dispone de un espectrofotmetro pasar directamente a anlisis de los resultados.

Anlisis cuantitativo de la cantidad de producto formado a diferentes niveles de pH.

1. Usar el estndar S1 en el espectrofotmetro como blanco a 410 nm y luego medir los valores de absorbancia para las tres cubetas. Anota los valores en la tabla 10. 2. Siguiendo el mismo protocolo usando la actividad 1, convertir la cantidad de producto de que se dispone en unidades de absorbancia medidas en el

espectrofotmetro a unidades de concentracin (nmol). Anotar estos valores en la tercera columna de la tabla 10.

Tabla 10. Determinacin de p-nitrofenol producido a tres niveles de pH distintos basados en la cuerva estndar (similar a la mostrada en la figura PH Absobancia Concentracion 5.0 2.861 170.7 6.3 2.893 172.7 8.3 2.873 171.4

Anlisis de resultados.
1. Calcular el ndice de reaccin inicial a cada nivel de pH. Ya que solo se mide la cantidad de p-nitrofenol a los dos minutos se asume que la cantidad de p-nitrofenol en el minuto 0 es 0.
Ejemplo: Despus de dos minutos la muestra de pH 6.3 dio una lectura de absorbancia a 410 nm de 0.14 que se pareca mas al estndar S2. Cualitativamente (usando los estndares) significa que se tienen aprox. 12.5 nmol de p-nitrofenol. Cuantitativamente habra que usar la curva estndar generada en la actividad 1 para determinar que la cantidad de p-nitrofenol con una absorbancia de 0,14 corresponde a aprox. 9 nmol. El ndice inicial para los datos cualitativos = (12.5 nmol - 0 nmol) / (2 min-0 min) = 6 nmol/min El ndice inicial para los datos cuantitativos = (9 nmol - 0 nmol) / (2 min-0 min) = 4.5 nmol/min Realiza estos clculos: ndice inicial de formacin de producto a pH 5.0 = ___85.35_________nmol/min ndice inicial de formacin de producto a pH 6.3 = ___86.35_________nmol/min ndice inicial de formacin de producto a pH 8.6 = _____85.52_______nmol/min

2. Traza del efecto del pH en el ndice de la reaccin enzimtica.

ph frente concentracion
86,6 86,4 86,2 Concentracion 86 85,8 85,6 85,4 85,2 0 2 4 Ph 6 8 10

PRACTICA 4
Anlisis cualitativo de la cantidad de producto formado con diferentes concentraciones de enzima. 1. Debes tener 5 cubetas de patrn etiquetadas S1-S5 en tu mesa de laboratorio. Coge las cubetas de muestras H1-H3 y L1-L3, y toma nota de la cantidad estndar que cada color de la cubeta coincide con el ms cercano. Anota debajo la concentracin del patrn (de la Tabla 11) en la Tabla 12 los tiempos de reaccin para cada una de las muestras.

Tabla 11. Patrn p-Nitrofenol. Patrn Cantidad de p-Nitrofenol (nmol*) S1 S2 S3 S4 S5 0 12.5 25 50 100

*1nmol

1nanomol

1x

10

-9

mol

0.000000001mol

Tabla 12. Determinacin del p-nitrofenol producido usando enzimas de alta y baja concentracin sobre la base patrn de p-Nitrofenol. 2. Si no tienes un espectrofotmetro, vaya directamente a Resultados de los Anlisis.

Cubeta H1 H2 H3 L1 L2 L3

Patrn muy similar S3 S3 S4 S4 S4 S5

Cantidad de p-nitrofenol 30,9 32,6 45,8 61,8 69,6 91,2

Anlisis Cuantitativo de la cantidad de producto formado con enzimas de diferentes concentraciones. 1. Sitate en el blanco del espectrofotmetro con el patrn S1 en 410 nm y luego mide los valores de absorbancia de las 6 cubetas, y registra los valores de absorbancia en la segunda columna de la Tabla 13.

2. Utilizando los protocolos que has aprendido en la Actividad 1, calcula la cantidad de p-Nitrofenol formado en todas las muestras y regstralo en la tercera columna de la Tabla 13.

Tabla 13. Determinacin del p-Nitrofenol formado usando enzimas de alta y baja concentracin en base a la curva estndar (similar a la mostrada en la Figura 8).

Cubeta H1 H2 H3 L1 L2 L3

Absorbancia 0,521 0,548 0,770 1,041 1,170 1,535

Cantidad de p-nitrofenol 30,9 32,6 45,8 61,8 69,6 91,2

Anlisis de resultados. 1. Traza la cantidad de producto producido frente al tiempo para cada reaccin enzimtica de alta y baja concentracin en el mismo grfico a continuacin.

Alta Concentracin de Enzima

50 45 40 35 Concentracin 30 25 20 15 10 5 0 0 0,5 1 1,5 Tiempo 2 2,5 3 3,5

Baja Concentracin de Enzima

100 90 80 70 Concentracin 60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 Tiempo 2 2,5 3 3,5

2. Calcula la velocidad inicial de reaccin para cada una de las reacciones de las enzimas de concentracin alta o baja. Supn que la cantidad de producto en 0 minutos es 0 nmol. Usa la cantidad de producto en el minuto 1 para realizar el clculo de la velocidad inicial.

Velocidad inicial de la reaccin para el enzima de alta concentracin = Cantidad de producto en minuto 1 / 1 min = ________30,9______ nmol/min. Velocidad inicial de la reaccin para el enzima de baja concentracin = Cantidad de producto en minuto 1 / 1 min = _________61,8_____ nmol/min.

PRACTICA 5
Anlisis cualitativo de la cantidad de producto formado por diferente concentracin de sustrato 1. Usted debe tener cinco cubetas normalizadas etiquetadas como S1-S5 en su mesa de laboratorio. Tomar tus cubetas de muestra H1-H3 y L1-L3 y y tomar nota de la norma que mejor coincide con cada cubeta color. Anota la concentracin de esa norma (a partir de la Tabla 14) en la Tabla 15 para cada una de las muestras de punto de tiempo de reaccin.

Tabla 15. Determinacin de p-nitrofenol producido con alto y bajo una la concentracin de sustrato a base de p-nitrofenol normas. Cubeta Patrn muy similar Cantidad de p-nitrofenol H1 S3 30,9 H2 S3 32,6 H3 S4 45,8 L1 S4 61,8 L2 S4 69,6 L3 S5 91,2

2. Si usted no tiene un espectrofotmetro, vaya al anlisis de los resultados. Anlisis cuantitativo de la cantidad de producto formado en el sustrato diferente concentraciones 1. Colocar el patrn S1 en el blanco del espectrofotmetro a 410 nm. Medir los valores de absorcin de sus seis cubetas y registrar los valores de absorbancia en la Tabla 16 en la segunda columna. 2. Utilizando los protocolos que ha aprendido en la Actividad 1, calcular la cantidad de p-nitrofenol formado en todas sus muestras y registrarla en la Tabla 16 en la tercera columna.

Tabla 16. Determinacin de p-nitrofenol producido con alta y baja concentracin de sustrato sobre la base de una curva estndar (similar a la mostrada en la Figura 8). Cubeta H1 H2 H3 L1 L2 L3 Absorbancia 0,521 0,548 0,770 1,041 1,170 1,535 Cantidad de p-nitrofenol 30,9 32,6 45,8 61,8 69,6 91,2

Anlisis de los Resultados 1. Trama de la cantidad de producto producido en funcin del tiempo, tanto para alta y baja reaccin de concentracin de sustrato en el mismo grfico.
Baja concentracion Alta concentracion frente el tiempo
100 90 80 70 Concentracion 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 Tiempo 3 4 Alta concentracion Baja concentracion

2. Calcular la velocidad inicial de reaccin, tanto para el de alta reaccin de concentracin de sustrato como para el de baja reaccin de concentracin de sustrato. Supongamos que la concentracin del producto en 0 minutos es 0 nmol. Utilice la cantidad de producto en 1 minuto para hacer su clculo de la tasa inicial. Velocidad inicial de reaccin para la concentracin de sustrato = = (Cantidad de producto en 1 min) / 1 min = ____30.9_nmol / min Velocidad inicial de reaccin para la concentracin del sustrato bajo = = (Cantidad de producto en 1 min) / 1 min = ____61.8_nmol / min