Sei sulla pagina 1di 9

TINCIONES

Aunque los microorganismos se pueden examinar con un microscopio ptico a menudo i hay que fijarlos y teirlos para aumentar su contraste y mejorar si visibilidad, acentuar sus caractersticas morfolgicas y conservarlos para un posterior estudio. 1. Marcar con un rotulador cada portaobjetos a fin de identificar la tincin, marcar por el lado opuesto a la preparacin para evitar que las letras se borren durante la tincin. 2. La primera etapa en el proceso de tincin es la extensin de la muestra que debe tener aproximadamente 1 cm2 y no contener nunca un exceso de masa bacteriana. 3. Hay que esperar que la extincin este completamente seca proceso que debe transcurrir a temperatura fra. 4. Fijacin de la muestra: es el proceso por el cual se conserva y mantienen en su posicin las estructuras internas y externas de las clulas microbianas tambin sirven para inactivar encimas que podran alterar la morfologa celular y para endurecer las estructuras celulares de manera que no cambie durante la tincin y la observacin, tras el proceso de fijacin el microorganismo queda pegado o adherido fijado firmemente al portaobjetos. La forma ms habitual de fijacin es mediante calor. 5. Las preparaciones se fijan pasando el portaobjetos por el lado opuesto a la preparacin por encima de la llama de un mechero, son suficientes dos o tres pases rpidos. Para evitar quemaduras se pueden utilizar las pinzas. 6. Una vez fijada se coloca la preparacin en las paralelas sobre el cristalizador y se van aadiendo los colorantes propios de cada tincin en el orden adecuado y durante el tiempo necesario. 7. En la tincin los colorantes deben cubrir solo la superficie de la extensin. 8. Cuando sea necesario lavar la preparacin con agua para eliminar un colorante hay que hacerlo cuidadosamente para evitar salpicarlas. 9. En las tinciones se requiere calentar el colorante por ejemplo en las tinciones de endosporas o de acido alcohol resistencia se utiliza un hisopo que consiste en una varilla de vidrio con una torunda de algodn en un extremo, la torunda se sumerge en etanol se escurre para que no

gotee, se pasa por la llama del mechero para que prenda el alcohol y se coloca debajo de la preparacin moviendo la varilla suavemente hasta que se observa emisin de vapores en la preparacin. La llama se apaga soplando fuerte sobre ella, hay que tener la precaucin de comprobar que esta totalmente apagada antes de volver a sumergirla en el etanol para ello es aconsejable sumergir previamente el hisopo en un frasco con agua y escurrirlo antes de sumergirlo en etanol, la operacin se repite tantas veces como sea necesario 10.Algunas tinciones como la de capsula requiere la realizacin de un frotis este se lleva acabo con la ayuda de un segundo portaobjetos que se coloca sobre la gota del colorante a extender con una inclinacin de aproximadamente de 45o arrastrando firmemente sobre el portaobjetos que tiene la muestra. 11. Antes de observar en el microscopio las preparaciones deben estar completamente secas, se observan con el objetivo de inmersin. 12.Una vez finalizada la tincin los residuos con colorantes se almacenan en recipientes especiales para su eliminacin, nunca se debe de echar este lquido en los lavaderos.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA


Como se observa en este laboratorio tiene un cartel en la puerta que nos indica que es un Laboratorio de Contencin de Nivel 2 lo que significa que en el se manipula microorganismos del grupo 2. Agente Biolgico de grupo 1: Resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre. Agente Biolgico de grupo 2: Puede causar enfermedad en el hombre y puede suponer peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente Biolgico de grupo 3: Puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Agente Biolgico de grupo 4: Es aquel que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz. Que el laboratorio presente el Nivel 2 no quiere decir que todos los microorganismos que manipulamos sean de Nivel 2 si no que al menos uno de los microorganismos que se usa en este laboratorio es de Nivel 2. En esta prctica solo se maneja microorganismos del Grupo 1. En un laboratorio de Nivel 2 el acceso esta restringido a personal autorizado. El uso de bata es obligatorio. Las batas no deben salir del laboratorio durante las prcticas. Solo debe introducirse la bata, el protocolo y el material necesario para desarrollar las practicas. Los objetos personales, mochilas, carpetas, ropas de abrigo deben guardarse en las casilleros de los pasillos (se dejan fuera del laboratorio). No se puede comer, beber, fumar ni siquiera llevar a la boca cualquier objeto incluso las manos, ni tampoco se puede almacenar comida, bebida. El pelo largo debe estar recogido.

Es muy importante lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio, se utilizara jabn antisptico y el secado se realizara con papel. Comunicar los accidentes: Como heridas, cortes, quemaduras deben comunicarse al profesor. 1er RIESGO: El mayor riesgo que tenemos en el laboratorio es el Fuego ya que manipularemos los microorganismos en las proximidades de un mechero Bunsen, cada puesto de trabajo tiene un mechero Para abrir y cerrar el paso de gas cada mechero tiene una llave amarilla en la mesa, la llave de la mesa se abre y se cierra girndola. El mechero tiene una llave para abrir el paso del gas y un anillo que regula la entrada de oxigeno en la combustin, la llama adecuada para trabajar es en la que se ve un cono interior azul y para conseguirla hay que girar el anillo de paso de aire. Muy importante es que cada da antes de salir del laboratorio comprobemos que hemos cerrado las llaves del gas. En el caso de que se produzca un incendio existen Mantas Ignfugas en los laboratorios 2do RIESGO Manipulacin de Microorganismos, cada da al finalizar de las prcticas debemos desinfectar el rea de trabajo y lo mismo cuando se produce un derrame para ello tenemos el siguiente protocolo: Limpieza de mesas: La limpieza ser diaria, al finalizar el trabajo. Se empleara leja diluida al 1% con agua. El ltimo da se empleara cualquier resto de colorante utilizando alcohol al 70%. Derrames y accidentes: Sern comunicados directamente al profesor. Cubrir con un papel de filtro la zona para delimitar la superficie afectada. Verter leja diluida 1:10. Dejar actuar 20 minutos.

Retirar los desechos en un contenedor para material infeccioso. Enjuagar con agua. Un aspecto importante relacionado con la seguridad es que los cultivos deben de estar siempre rotulados, en el rotulo hay que indicar el nombre del microorganismo claramente y tambin la fecha. En la zona prxima a las fregaderas existen contenedores para residuos. El material contaminado debe desecharse en contenedores especiales para esterilizarlo antes de ser eliminado como basura convencional. Los cultivos unas ves utilizadas se depositan cerca al Autoclave en la zona indicada para ello. Los elementos contaminados de tamao grande como por ejemplo Placas Petri con cultivo se depositan en una papelera dentro de bolsas de Autoclave. Al lado del Autoclave existe instrucciones para una correcta esterilizacin. Quitar todas las etiquetas de restos de parafilm. Esterilizar siguiendo instrucciones de Autoclave. Vaciar los tubos que contengan agar en un recipiente (p.e. en una botella vaca de leja o detergente a la que previamente se le ha cortado el cuello). Una vez solidificado el agar tirarlo a la basura antes de que vuelva a contaminarse. Las placas se introducen en doble bolsa sin cerrar y dentro del cubo metlico. El Autoclave lo limpiara el tcnico dos veces al ao al final del cuatrimestre. Los elementos contaminados de menor tamao por ejemplo la pipeta se depositan en bolsas de plstico situadas en trpodes encima de las mesas. Cuando el material contaminado ya ha sido esterilizado puede desecharse en los cubos negros como basura convencional. Los portas y cubres se depositan en recipientes con leja durante 24 horas y posteriormente son lavados.

Nunca debe eliminarse un cultivo vivo en la basura o por los desages, todos los cultivos o material que ha estado en contacto con microorganismos debe esterilizarse antes de ser eliminado. Realizaremos tinciones y los residuos de las tinciones se eliminaran como residuos qumicos en bidones. Los colorantes usados en las tinciones deben manipularse con guantes. Tambin se disponen de contenedores para vidrio. Disponer de vitrinas de extraccin de gases para la manipulacin de productos qumicos peligrosos. Tambin disponer de una cabina de seguridad biolgica para manipular los microorganismos. En las puertas de los laboratorios debe haber una lista con telfonos de emergencia y tambin los planos de situacin y las salidas de emergencia. Estos son algunos equipos que se utilizaran durante las practicas: Balanza. Espectrofotmetro. Estufa de Incubacin. Bao. Centrifuga. Incubador. Agua destilada.

GOTA GRUESA
La gota gruesa puede hacerse de la sangre anticuagulada que se tenga del paciente o puede hacerse a partir de puncin capilar: Antes de hacer la puncin capilar preguntar al paciente cual es la mano no dominante y de esa mano el dedo ndice es el que se va a punzar, lo ideal es que la puncin sea de un lado no muy cerca a la ua ni muy debajo en el medio. Limpiar bien con algodn y alcohol, secar pinchar con lanceta, eliminar la primera gota, porque puede estar hemodiluida, a partir de la segunda gota con mucha suavidad tomar la lamina, colocar el dedo y poner la gota de sangre, lo ideal es no tocar la incisin para no promover la coagulacin. Por cada paciente se recomienda dos laminas cada una con dos gotas gruesas y una lamina para extender, aqu tenemos las laminas marcadas. Hay varias formas de hacer la gota gruesa:

En forma de N: colocar la muestra y con la lamina extensora y dejar que por capilaridad se extienda la muestra en forma de N mas o menos formando un cuadrado de 1cm x 1cm y dejar que se homogenice. Esta forma esta estandarizada para trabajar en Control de Calidad para todos los Laboratorios. La otra forma es poner la muestra en el centro de la lmina, partimos por la mitad con la lmina extensora, subimos arribaabajo y unimos en el medio y homogenizamos. Para el extendido tomamos una pequea cantidad de sangre y con la lmina extensora hacemos el extendido, dejar que las muestras se sequen.

Primero hacemos una pre-coloracin con azul de metileno fosfatado este proceso se hace para deshemoglobilizar(destruir los glbulos rojos), lo que quiere es ver el fondo homogneo para ver los parsitos. Luego introducir en una solucin de azul de metileno unos segundos e introducimos para lavar con bofer no hay que lavar con agua del cao o dejar mucho tiempo a chorro porque se puede desprender la muestra, la idea es preparar la muestra de coloracin que puede ser cualquiera de los derivados de Romanowsky, Giensa, Gram, Film, etc. Y vamos a colorear en una lamina cncava, vamos a colorear nuestra lamina de la muestra boca abajo porque eso ayuda a el proceso de deshemoglobilizacin. Poner la lamina de la muestra de 15 a 20 minutos (o el tiempo estandarizado en el laboratorio) una vez culminado el tiempo levantar la lamina, no lavar porque se puede desprender la muestra y ponemos a secar y observamos en el microscopio con el objetivo de inmersin.

Para el extendido que ya esta seco aqu si se necesita ver los glbulos rojos, lo que se va hacer es fijar con metanol y cuando se seque se va a realizar el procedimiento anterior de la gota gruesa, la nica diferencia por lo general es que el tiempo es el doble (30 minutos). El tipo de tincin que mas se utilizan son: el Film o Romanowsky modificado. En la preparacin de Giensa se utiliza colorante en polvo, metanol, glicerina se disuelve el colorante y dejarlo madurar en 37o en un promedio de 3 a 4 dias por lo cual implica mas tiempo y el manejo de mas metanol mientras que el Film o Romanowsky modificado son sales que simplemente se

preparan con un bofer que no absorbe tanta humedad, cosa que pasa con Giensa y Ray que no se contaminan tanto que son mas practicas para utilizar en campo. La Film o Romanowsky modificado se utilizan ms en el rea rural.

GOTA GRUESA II