II.

OBJETIVOS Observar os parmetros cinticos da fosfatase alcalina atravs da confeco de uma curva padro que fornecer a relao entre a concentrao de PNP e as absorbncias, e determinar a formao de produto em reaes da enzima com e sem inibidor, com utilizao desta curva padro. Examinar as influncias da variao de concentrao de substrato em uma reao enzimtica, e observar a influncia da variao inversamente proporcional entre a concentrao de substrato e inibidor. Confeccionar as curvas padro da reao enzimtica com e sem inibidor, atravs da relao entre Vo e concentrao de substrato.

III. MATERIAL a. Material por Grupo: Pipetas de 1, 2 e 5 mL Pr-pipetes Pipetador automtico 20 200 L Tubos de ensaio Cubetas Bckers

b. Equipamentos: Vortex

Marca: Vertex Modelo: QL 901 Voltagem: AC 110V Banho-maria (37C)

Marca: De Leo & Cia. Ltda. Espectrofotmetro

c. Reagentes: Soluo padro p-nitrofenol (PNP) 0,1mM em tampo Tris-HCl pH 9,5 Soluo de p-nitrofenolfosfato (PNPP) 1mM em tampo Tris-HCl pH 9,5 Soluo tampo Tris-HCl 0,2mM pH 9,5 Soluo de NaOH 2M/L Soluo de enzima: fosfatase alcalina 2 g/mL (E.C. 3.1.3.1)

IV. MTODOS a. CURVA PADRO DE PNP: Transferiu-se, com o auxlio de pipeta e pr-pipete, alquotas de soluo padro de PNP para tubos de ensaio numerados de 1 6, e para um stimo tubo, o branco, cujos valores se encontram na tabela 1. Em seguida, pipetou-se alquotas de soluo tampo TrisHCl (pH 9,5) para tais tubos, e, imediatamente aps, alquotas de soluo de NaOH 2M/L, cujos valores tambm se encontram na tabela mencionada acima. Ento, com auxlio do vortex, os tubos foram homogeneizados e, aps isso, as solues contidas nestes foram transferidas para cubetas, a fim de se realizar a leitura das respectivas absorbncias, a 405 nm, atravs do espectrofotmetro. Tabela 1 Tubo n B 1 2 Soluo padro Tampo de PNP (mL) 0,3 0,6 3,2 2,9 2,6 Tris- Soluo NaOH 2M/L 1,0 1,0 1,0 de Volume Total (mL) 4,2 4,2 4,2

HCl 9,5 (mL)

3 4 5 6

0,9 1,2 1,5 1,8

2,3 2,0 1,7 1,4

1,0 1,0 1,0 1,0

4,2 4,2 4,2 4,2

Tabela 1: Quantidade de soluo em cada tubo.

b. CURVA DE SUBSTRATO: Foram transferidas, com auxlio de pipeta e pr-pipete, alquotas da soluo tampo Tris-HCl (pH 9,5) e, em seguida, de soluo de PNPP, para tubos de ensaio, enumerados de 1 13 e para um 14 tubo, denominado branco. Os valores se encontram na tabela 2. Aps tais procedimentos, os tubos foram pr-encubados em banho-maria (37C) por 5 minutos. Com a ajuda de um pipetador automtico, acrescentou-se 0,2 mL da soluo de enzima aos tubos numerados de 1 a 13, em intervalos de 30, homogeneizando-os a cada adio. Feito isso, os tubos foram encubados em banho-maria, por 15 minutos. De acordo com o horrio especfico de cada tubo, adicionou-se aos mesmos 1,0 mL de NaOH 2M/L tambm em intervalos de 30, rigorosamente, homogeneizando-os a cada adio. Com relao ao tubo denominado branco, a soluo de NaOH foi adicionada primeiro e depois a soluo da enzima, e ento este pde ser encubado por 15 minutos. Ao trmino de tais mtodos, amostras das solues contidas nos tubos foram postas em cubetas, as quais foram levadas ao espectrofotmetro, a fim de ler as suas absorbncias, a 405 nm.

Tabela 2 Tubo n Tampo PNPP 1mM ENZIMA (mL) Soluo de Total

Tris-HCl pH (mL)

NaOH (mL)

9,5 B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 2,9 2,9 2,8 2,7 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0,1 0,1 0,2 0,3 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2

Tabela 2: Quantidade de soluo nos tubos de ensaio.

c. INFLUNCIA DO INIBIDOR: Com auxlio de pipeta e pr-pipete, transferiu-se alquotas (determinadas segundo a tabela 3) de soluo tampo Tris-Pi-HCl, pH 9,5, para tubos de ensaio numerados de 1 13 e para um 14 tubo, o branco. Tambm segundo a tabela 3, pipetou-se alquotas do substrato (soluo de PNPP, 1 mM) para os referidos tubos. Os tubos foram pr-incubados a uma temperatura de 37C durante 5 minutos. Com uma pipeta automtica, transferiu-se 0,2 mL de enzima para os tubos de 1 a 13, com intervalos de 30, e determinou-se o horrio exato do incio do ensaio. Os tubos foram incubados durante 15 minutos a uma temperada de 37C. Aps esse perodo, acrescentou-se as tubos 1,0 mL de NaOH e homogeneizou-se. No tubo branco, a soluo de NaOH foi transferida anteriormente a enzima, com utilizao dos mesmos mtodos; ele tambm foi incubado durante 15 minutos.

Tabela 3 Tampo Tubo n0 Tris-PI-HCl pH 9,5 ENZIMA PNPP 1 mM (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 ( m L) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Soluo H (mL) de NaO

B 2,9 0,1 1 2,9 0,1 2 2,8 0,2 3 2,7 0,3 4 2,6 0,4 5 2,4 0,6 6 2,2 0,8 7 2,0 1,0 8 1,8 1,2 9 1,5 1,5 10 1,2 1,8 11 0,9 2,1 12 0,6 2,4 13 0,3 2,7 Tabela 3: Composio das solues em cada tubo.

Assim como nos procedimentos anteriores, a leitura das absorbncias dos tubos foi realizada no espectrofotmetro e devidamente analisadas.

V. RESULTADOS a. CURVA PADRO DE PNP: Ao serem executados os procedimentos, foi realizada a leitura no espectrofotmetro da absorbncia, a 405 nm, de cada tubo. Os resultados obtidos constam na tabela a seguir: Tabela 4 Tubo N ABS. 405 nm Tabela 4: Relao entre os tubos e as suas respectivas Absorbncias. B 0,000 1 0,175 2 0,276 3 0,354 4 0,466 5 0,586 6 0,692

As diferentes diluies da soluo de PNP 0,1mM resultaram em diferentes concentraes finais. Estas concentraes foram calculadas atravs do fator de diluio, conforme demonstrado abaixo: Fator Diluio: (Volume inicial / Volume Final) x Concentrao Inicial: (0,3 / 4,2) x 0,1 = 0,7142857.10-2 O mesmo clculo acima foi utilizado para as outras cinco solues, e as concentraes resultantes esto tabeladas abaixo: CURVA PADRO DE PNP Soluo Padro Tubo 1 2 3 4 5 6 de PNP 0,1mM [PNP] x 10 (mM) (mL) 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 0,7142857 1,4285714 2,1428571 2,8571429 3,5714286 4,2857143
-2

Absorbncia (405nm) 17,5 27,6 35,4 45,6 58,6 69,2

10-2

Tabela 5: Volume e concentrao final de PNP em cada uma das solues, e as respectivas absorbncias.

A melhor reta foi traada entre os pontos marcados no grfico atravs do fator de calibrao mdio (FCM), que permite a obteno do valor do coeficiente angular desta reta. O clculo est demonstrado abaixo:

a = 16,9267 (mmol/l)-1

b. CURVA DE SUBTRATO: A partir da leitura das absorbncias em cada tubo, pde-se relaciona-las na tabela abaixo: Tabela 6 Tubo n0 1 2 3 4 5 6 7 Abs. 405 nm Tubo n0 Abs. 405 nm 0,536 0,610 0,577 0,605 0,609 0,690 0,000

0,207 8 0,274 9 0,333 10 0,418 11 0,471 12 0,441 13 0,556 B Tabela 6: As Absorbncias em seus respectivos tubos de ensaio. c. INFLUNCIA DO INIBIDOR:

Com o auxlio do espectrofotmetro, as absorbncias analisadas foram devidamente tabeladas, como se encontram a seguir: Tabela 7 Tubo n0 1 2 3 4 5 6 7 Abs. 405 nm Tubo n0 Abs. 405 nm 0,244 0,287 0,337 0,400 0,438 0,477 0,000

0,050 8 0,056 9 0,064 10 0,108 11 0,114 12 0,186 13 0,210 B Tabela 7: As Absorbncias e os tubos de ensaio.

VI. DISCUSSO a. CURVA PADRO DE PNP: Essa experincia serve para a anlise do efeito da concentrao do produto formado na leitura da absorbncia. Observe que esta uma relao linear, porque quanto maior a

concentrao de PNP na soluo, maior a absorbncia. Usando esta relao, poderemos analisar os dados obtidos nas prximas experincias, pois sabemos que a leitura realizada tem relao linear com o produto formado. A leitura do tubo "branco" serviu como referencial para a realizao das leituras de absorbncia nos tubos numerados de 1 a 6. A leitura da absorbncia no "branco" foi definida como 0, ou seja, o valor dela foi descontado do valor de absorbncia obtido nos outros tubos. Isso se deve ao fato de que a soluo tampo mais NaOH tambm absorver parte da luz incidida, alterando o resultado de todos os outros tubos analisados no aparelho, por isso foi necessrio a efetuao da correo dos valores medidos. Com os resultados obtidos no espectrofotmetro sobre a absorbncia de cada tubo com diferentes concentraes de soluo de PNP, foi possvel calcular o fator de calibrao para cada soluo e calcular o fator de calibrao mdio, o coeficiente angular desta reta. b. CURVA DE SUBSTRATO: O PNPP, um substrato comumente usado na identificao da enzima fosfatase alcalina em um meio, naturalmente se decompe, por ao da luz e do calor, em PNP, liberando uma molcula de Fosfato inorgnico, podendo ser visualizado facilmente com a mudana na colorao da soluo, de incolor para amarelo. Dessa forma, podemos demonstrar a reao:

Desse modo, na determinao da absorbncia de uma substncia, comumente se utiliza um tubo denominado branco. O branco ento, na curva de substrato, muito importante na tara do espectrofotmetro, descartando a Absorbncia correspondente formao de PNP inespecfico.

A partir dos dados, pde-se construir dois tipos de grficos: o de Michaelis-Menten e o de Lineweaver-Burk (ou Duplo-recproco). Segundo a anlise feita dos grficos, observou-se uma linearidade inicial e depois a formao de uma curva, seguida de uma espcie de plator. A linearidade indica que, conforme h o aumento da concentrao de substrato, a velocidade da reao tende a subir. Porm, como indicado pela curva, de forma cada vez mais lenta, at um ponto em que no ser mais possvel aumenta-la, j que todos os stios ativos da enzima estaro ocupados, efeito demonstrado pelo plator. c. INFLUNCIA DO INIBIDOR: De acordo com os valores obtidos, foi feita a construo de dois grficos, o de Michaelis-Menten e o de Lineweaver-Burk, juntamente com os da Curva de Substrato, pois necessria a comparao entre eles para se determinar qual o tipo de inibidor utilizado. A partir do grfico segundo Michaelis-Menten, pde-se observar que se trata de um inibidor competitivo, j que, tanto na curva de substrato quanto na de inibidor, as velocidades mximas eram as mesmas, alm do Km na curva de inibidor ser maior do que na curva de substrato. A posio da curva de inibidor muito mais abaixo em relao curva de substrato, o que pode ser explicado pela presena do inibidor na soluo. Este faz com que o substrato precise desloca-lo para se ligar enzima, sendo necessrio muito mais molculas de substrato para se chegar metade da Velocidade mxima. Desse modo, o Km muito maior, o que pode-se concluir que somente com uma concentrao muito alta de substrato a reao atingir sua velocidade mxima.