UniversidadCatlicadelNorte

MagisterenAcuicultura 20082009

CultivodeMoluscosyCrustceos

AplicacindeTcnicasdePoliploidaparala ObtencindeTriploidesdealmeja(Venusantiqua)


Alumno AvelinoMuozManterola Coquimbo,Mayode2008

Cultivo de Moluscos y Crustceos

Produccin de Triploides de Almeja (Venus antiqua)

Contenido Introduccin.............................................................................................................3 Objetivos..................................................................................................................4 ObjetivoGeneral...................................................................................................4 ObjetivosEspecficos.............................................................................................4 AntecedentesGenerales..........................................................................................5 Nombrecientfico .................................................................................................5 . Distribucin...........................................................................................................5 Biologahistoriadevida......................................................................................5 TcnicasdeProduccin.........................................................................................5 EstadodelArte......................................................................................................6 ObtencindeGametosyCultivolarval..................................................................12 Obtencindegametos........................................................................................12 Fecundacin........................................................................................................12 Cultivolarval........................................................................................................13 MtodosdeAplicacin...........................................................................................15 MtododeTriploidizacinPropuesto.................................................................17 MtodosdeVerificacin........................................................................................20 RecuentodeCromosomas..................................................................................21 RecuentodeNucleolos.......................................................................................21 CitometradeFlujo..............................................................................................22 ResultadosEsperados............................................................................................23 Bibliografa.............................................................................................................24

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Introduccin

LaalmejaVenusantiquadeampliadistribucinenChile,hasidosometidaauna intensoesfuerzodepescaporloquelascapturashandisminuidodrsticamente en los ltimos aos. Por tal motivo se ha realizado un esfuerzo interesante por parte de algunas instituciones como el Instituto de Fomento Pesquero y de la Universidad de Valparaso en el desarrollo de tcnicas de produccin controlada de juveniles con resultados auspiciosos que permiten visualizar a corto plazo la iniciacindeactividadesdeacuiculturacomercialagranescaladeestaespeciey de otras variedades de almejas nativas. Venus antiqua por sus caractersticas organolpticas se asimila a dos tipos de almejas de alto valor comercial, MercenariamercenariayVenusgallina.Laprimerasecultivacomercialmenteen la costa del Atlntico y Golfo de Mxico de USA siendo los principales Estados productoresFloridayVirginiaconproduccionesvaloradasenunosU$50millones anuales con ejemplares idealmente de unos 35 mm de longitud, talla que es la msvalorada.ElprecioaproductorenUSAalcanzaaunosU$0.15launidad observndose un precio a pblico a U$ 0.53 la unidad en supermercados de Wiilliamsburg,VirginiaenNoviembrede2005. El presente trabajo propone la produccin de ejemplares triploides en una primarafasepormediodeinduccinqumicayproducirlneasreproductorasde hembras triploides para luego establecer un stock reproductor tetraploide. Una vez obtenidos los ejemplares tetraploides se puede establecer una base para la produccin de juveniles 100% triploides sin la induccin qumica sino que solamenteporcruzasselectivasentremachosdiploidesconhembrastetraploides. Triploides y tetraploides son aquellos organismos con tres y cuatro sets de cromosomas respectivamente. Los moluscos triploides tales como ostiones y almejas, son de gran inters para la acuicultura ya que son mayoritariamente estriles y como consecuencia de esto poseen una mayor tasa de crecimiento y rendimientoencarnequesussmilesdiploides.Laproduccindetetraploideses de suma importancia ya que no son estriles y en el cruzamiento de machos normalesdiploidesconhembrastetraploidesseconsiguenejemplaresenun100 %triploides.
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Objetivos

ObjetivoGeneral Aplicacindemtodosbiotecnolgicosparalaobtencindeejemplarestriploides de almeja (Venus antiqua) tcnica y econmicamente rentables para el mejoramientodetasasdecrecimientoyfactordecondicinenlafasedeengorda factiblesdesertransferidosalsectorproductivoconlafinalidaddeaumentarsu competitividad con la incorporacin al mercado de nuevos productos de mejor calidad. ObjetivosEspecficos Definir y aplicar tcnicas de induccin qumica de triploida en almeja (Venusantiqua)enbaseamanipulacincromosmica. Identificacin e induccin al desove de hembras triploides, anormalmente frtileseinduccindetetraploidaenloshuevosporaccinqumica. Evaluarparmetrosdesobrevivencia,crecimientoyfactordecondicinen ejemplarestriploidesynormalesdealmejasencondicionesdecultivo.

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AntecedentesGenerales

Nombrecientfico Venusantiqua(King&Broderip,1831) Distribucin PerPuertoWilliams(Chile),UruguayaIslasMalvinas(Zagaletal.2001). Biologahistoriadevida Moluscobivalvo,quepresentaunaconchagruesa,decoloracinblanquecinagris, a veces con manchas caf. La superficie externa presenta estras radiales y concntricas definidas. Seno paleal anguloso y corto, no alcanza un tercio de la longitud total de la concha. Longitud mxima 8.4 cm (Zagal et al. 2001). Vive semienterradaenfondosarenososdelintermarealysubmarealalcanzando40m deprofundidad.Sealimentafiltrandoplanctonydetritusdelacolumnadeagua. Es depredada por moluscos gastrpodos, aves y el hombre. Presenta sexos separados.Laprimeramadurezsexualocurrea3.64.0cmdelongitudenambos sexos. En Metri, el ciclo reproductivo de esta especie presenta dos periodos de desove durante el ao (Zagal et al. 2001). Se consume fresco y conservas. El desembarque de "almejas" alcanz su mximo (43.761 t) en el ao 1988. El promedio de extraccin entre 1998 y 2002 fue de 17.895 t. Las estadsticas pesquerasincluyenlosdatosdeotrasespecies(Osorio,2002). TcnicasdeProduccin Las tcnicas de produccin de semillas y de cultivo de almejas estn bien desarrolladas en pases como Italia y USA. En USA se desarroll fuertemente el cultivo de almejas como consecuencia del desarrollo de tcnicas de produccin desemillasensistemascontroladosydesiembrayengordaenplayasdelazona intermareal, originadas y perfeccionadas a nivel comercial por el Eastern Shore LaboratoryenWacahpreaguepertenecientealVIMS(VirginiaInstituteofMarine Science)aprincipiosdelosaos80. La experiencia en Chile con la almeja Venus antiqua indica que la primera madurezseproducealos32mmdelongitudysetienequeunejemplardetalla
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comercialparaelmercadodeexportacinde40mmdelongitudseobtienealos 26mesesdecultivo.Enlosmercadosmundialeslademandadealmejasesporlas de una talla de entre 30 y 40 mm lo que requiere en forma obligatoria la produccin de semillas en ambiente controlado debido a que el aumento en la demanda de almejas en Chile motiv un aumento del esfuerzo de pesca desproporcionado en relacin con la abundancia del recurso, lo que oblig a la autoridad pesquera a establecer una talla mnima de extraccin de 55 mm de longitud de valvas para todas las variedades de almejas (D. S. N 683 del 14 de Enero de 1981) Por lo tanto las nicas almejas liberadas de esta norma son aquellasproduccionesprovenientesdelaacuicultura. Por otro lado, es importante hacer notar que hay un nicho interesante para el mercadodelaalmejachilenaenestadovivo,frescaensuconchatantoenlaCEE comoenelmercadodeUSA.Esteltimopasimportduranteelao2005U$24 millonesenalmejasfrescasrefrigeradasensuconchadesdediferentespasescon un precio medio de U$ 10.94 por kilo con valores que fluctuaron entre U$ 33.14/kgparaalmejasdelasIslasMarshallyU$1.58/kgparalasprovenientesde Vietnam. Como ejemplo se puede indicar que el precio en playa para la almeja Quahog (Mercenaria mercenaria) en el Estado de Virginia (Eastern Shore) en Noviembrede2005fuedeU$0.18porunidadyensupermercadosdelaciudad deWilliansburgenelmismoEstadoymismafechaelprecioapblicoobservado fuedeU$0.53porunidad(HernndezJ.M.2005)Estospreciosindicanqueexiste un potencial de desarrollo enorme ms todava si Chile es el nico pas SudamericanoquecuentaconunConveniodeEntendimientoentreelFoodand Drugs Administration y el Servicio Nacional de Pesca de Chile para autorizar la exportacindemariscosfrescosvivos. EstadodelArte Latriploidizacinesunaherramientademanejogenticoqueconsisteeninhibir elprocesodemeiosisen la maduracindel huevoqueocurre inmediatamente despusdelafecundacineinduceunadotacincromosmicade3nfrentealos 2n normal de las clulas. La aplicacin de manipulaciones cromosmicas en moluscos se inici a mediados de la dcada de los 80, observndose que su aplicacin produca ventajas similares a lo ocurrido con los peces ya que se
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observa un incremento en el crecimiento somtico al no distraer energa metablica en la produccin de gametos. En bivalvos es posible inducir la triploidizacindelhuevoporbloqueo,enelprocesodelameiosis,deloscuerpos polarespormediodeagentesfsicosoqumicos. Latriploidiaesunacondicingenticaenlacualhaytressetsdecromosomasen vezdedosqueeslonormal.Ungrannmerodeespeciesagrcolasdeconsumo comn han sido mejoradas utilizando la triploidizacin tal es el caso de sandas sin semillas, pltanos y naranjas tipo navel como ejemplo. Ostras triploides y otros bivalvos son en general reproductivamente estriles, incapaces de tener unamaduracinsexualnormal.Estotieneventajasparamejorarlacalidaddela carne, especialmente en verano y se mejoran las tasas de crecimiento comparados con diploides normales y este fenmeno es conocido como polyploidgigantism(GongN.etal2004). Porefectodeunamutacinespontnealatriploidizacinocurreenformapoco frecuenteencasitodaslasespeciesdelreinoanimal,mientrasqueenalgunasde ellas el fenmeno es letal. Asociada con anormalidades severas en mamferos y aveslatriploidaesviableyhastamorfolgicamenteirreconocibledesdeelpunto devistafenotpicoencomparacinconanimalesdiploidesnormalesenmuchas especies de invertebrados, anfibios y peces (Fankhauser, 1945 ) Los animales triploides son estriles pero existen posibilidades de encontrar ejemplares hembras viables , que son la base para la formacin de un plantel reproductor tetraploide4nalcruzarhembras3nconmachos2nyrealizarlasupresindela expulsin de uno de los cuerpos polares en la fase de la divisin mittica logrndose una descendencia tetraploide 4n la cual por ser sexualmente viable servir de base para implementar un plantel reproductor para la produccin individuos triploides por cruzas normales con hembras 2n normales y sin la adicindeagentesqumicosalproceso.(Guoetal.2000)(ZebalR.com.per.2007) Existen varios mtodos principales descritos para la induccin de triploida en moluscos bivalvos. Estos consisten en tratar los huevos con shock trmico, inmersinensolucindeCitocalasinaB(Wadaelal1989)otambineninmersin en6dimethylaminopurine(Wenshanetal.2004)avariosintervalosdespusde
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lafecundacinconelfindeinhibirlaexpulsindelosCuerposPolares1y2(PB1y PB2). Para la determinacin del xito del proceso se emplean tcnicas de citometra de flujo (Huiping et al. 2004) o seleccin por tamao mediante la utilizacin de tamizado en mallas de diferentes aberturas (Zebal R. com. per. 2007)yaqueloshuevostriploidessondeapp.un30%demayortamaoquelos huevosnormales2n.EnexperienciasconostrasC.gigastriploidesseencontr,al cabo de 26 meses de cultivo, que ejemplares triploides obtuvieron un 30% de gananciaenrendimientodecarnerespectoaejemplaresdiploidesnormales(4Cs BreedingTech.Inc2006) En Japn se han realizado experiencias de induccin de triploida en ostra perlfera Pinctada funcata (Wada et al. 1989) para el efecto huevos de ostra perlfera se trataron con shocks trmicos de fro, calor y citocalasina B (CB) a diferentes intervalos de tiempo despus de la fecundacin para inducir la triploida.. Los dos primeros tratamientos fueron inefectivos al producir daos afectandoeldesarrollodeloshuevosconaltasmortalidadesycrecimientodelas larvas.Eltratamientomsefectivoencontradoenestaexperienciaconsistienla inmersindeloshuevosenunasolucincon0.5mg/ltdeCBpor20a50minutos despus de la fecundacin lo que entreg un 100% de juveniles triploides. En otraexperienciaconbaosenunasolucincon0.1mg/ltdeCBentratamientos conlosmismosintervalosdetiemposeobtuvoun80%detriploidesalos3meses decultivo. EnexperienciasconabalnHaliotisrubra(Weshanetal2004)latriploidizacin serealizutilizandocomoinductor6dimethylaminopurine(6DMPA)tomndose como signo de calidad de triploide la inhibicin del segundo cuerpo polar en la divisinmeitica.Estacondicinseconstatmedianteanlisis encitometra de flujo. Tratamientos con 6 DMPA en dosis de 100 mg/lt produjeron los mejores resultados con tratamiento de los huevos a los 1520 minutos despus de la fertilizacin y con una duracin de 30 minutos. Se obtuvo un 93% de triploides conunasupervivenciade43%. EnChilesehanrealizadoexperienciasdeinduccindetriploidaenOstindel NorteyostraJaponesa,pormediodeinductoresqumicosyfsicos(VonBrandE.
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1998, 2002; Toro Jorge et al 1995) Choro Zapato (Lepez I. 2001) con resultados experimentalesprometedores.Sinembargoelmayorescolloparadesarrollaruna lnea de reproductores triploides frtiles para poder obtener en forma masiva semillastriploidespasaporlaobtencindehuevosoespermiostriploidesviables parapoderinducirlatetraploidaporcruzasnormalesdehembras2nconmachos 4noviceversamachos2nconhembras4nsintenerqueutilizaragentesqumicos ofsicosparaelobjeto(McCombieetal.2005). EnanlisishistolgicosrealizadosagnadasdeejemplarestriploidesdeOstindel Norte(LorhmanK.etal2005)seencontraronanomalasmorfolgicastantoenlas gnadas masculinas como femeninas, suponindose su infertilidad lo que no permitira en principio lograr ejemplares tetraploides por induccin qumica o fsica. Respecto a este punto es interesante indicar de que en los inicios de los trabajosentriploidaenC.virginicallevadosacaboporlaUniversityofMaineen 1978yluegoaplicadosaC.gigasenelEstadodeWashingtonaprincipiosdelos 80(ZebalR.com.per.2007.)seasumiquelasgnadasdeaspectoanormalcon manchasoscuraseranesencialmenteestriles.Fuesolamentedespusderealizar strip spawning en forma masiva en hembras triploides que se descubri un pequeoporcentajedehembrasmutantesfrtilesyviables.Deestaobservacin naci el mtodo de 3n strip spawn/1st PB para inducir tetraploida en ostras (ZebalR.com.per.2007)(DesovepordiseccineinhibicindelPrimerCuerpo Polar). Solamente la observacin de gran cantidad de ejemplares triploides y paciencia pueden lograr descubrir los pocos ejemplares mutantes que pueden existirenlapoblacintriploide(ZebalR.com.per.2007)yaqueporejemplo de 200300millonesdehuevosobtenidosdehembras3n,pormediodeseparacin portamaoyobservacinmicroscpicanoselogransepararmsde5.000huevos 3nfactiblesdeserfertilizadosconespermios2nparainducirlatetraploida(Zebal R.com.per.2007).Loshuevosobtenidosporstripingynoporinduccinnatural del desove necesitan un estmulo para activarlos y as permitir su fecundacin. (Zeba R. Com.per. 2007; Allen Robert 1953) ya que de no realizar esta accin es difcil lograr resultados medianamente exitosos. Este ltimo autor utiliza diferentes agentes para realizar la activacin del huevo en la almeja surfclam Spisulasolidsimaconagentespartenognicostalescomoirradiacinultravioleta,
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aumentodelaconcentracindelinKenelaguademantencin,protaminaentre otras,observndosebuenasrespuestasalaumentoenlaconcentracindelinK. Elxitoparalaproduccinenformacomercialymasivadetriploidesenbivalvos marinossebasaenlametodologadenominadacruzadiploidetetraploideque consisteenelcruzamientodeunahembradiploide(2n)conunmachotetraploide (4n)lograndoindividuos100%triploides.(ZebalR.com.per.2007) Estemtodosebasaenquelosindividuostetraploidessonfrtilesyenlacruza conanimalesnormales2nseobtienendescendientestriploidesenformadirecta sin la aplicacin de qumicos y con un mayor porcentaje de xito en el proceso. Para utilizar este mtodo hay que establecer un plantel de reproductores tetraploides(ZebalR.2007;LuoX.etal.2000) Para la obtencin de ejemplares tetraploides en C. gigas se han realizado experiencias con cruzamiento de hembras diploides (2n) con machos tetraploides (4n) (McCombie et al 2005) por medio de la inhibicin del PB2 por mediodeCBCitocalasinaB(2nx4n+CB).Elmtodopresentadificultadesyaque normalmente los ejemplares triploides son infrtiles pero existen ejemplares mutantes que son frtiles y que deben ser identificados por observacin microscpica para separarlos y utilizarlos como reproductores en base a observacin de gran nmero de ejemplares examinados. Esta metodologa ha dadoresultadossatisfactorios.Asimismosehanobtenidoresultadospositivosen cruzas 4n x 2n + CB (hembras en primer lugar) (McCombie et al. 2005). Esta metodologa se basa en que si se eligen los huevos de mayor tamao se obtienenmayoresposibilidadesdexito(Zebalcom.per.2007). EnalmejaMercenariasp.sehanrealizadoexperienciasdetetraploidizacin(Guo et al. 2001) con resultados negativos, ya que en induccin de triploida por bloqueoPB1yPB2yseobtuvoun100%dexitoconelbloqueodePB2.Luego con los ejemplares triploides obtenidos se trat de obtener tetraploides por inhibicindePB1logrndoseunbuenxitoenlaobtencindelarvasperoestas nosobrevivieronalestadodejuveniles.

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LosresultadosdelasinvestigacionesrealizadasenChileenelcultivodelaalmeja por Institutos y Universidades permiten afirmar que en los prximos aos se producir un crecimiento espectacular en esta actividad y la consiguiente necesidad de semillas de buena calidad que abastezca la industria. Hay que considerarqueanivelmundialelcultivodediferentesespeciesdealmejasesuna industria que tiene ms de 20 aos con tcnicas desarrolladas y comprobadas tantoparalaproduccindesemillasenhatcheriescomoentcnicasdecultivoen playa. El incrementar las tasas de crecimiento y factor de condicin en especies sometidasaprocesosdecultivoconllevandirectamenteaunamejoraenlastasas derentabilidaddelaoperacinaldisminuirlainversinporlaanticipacindelos flujosdecajapositivosydisminucindelcapitaldetrabajodelaempresa.

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ObtencindeGametosyCultivolarval

La obtencin de gametos y el cultivo de larvas de Venus antiqua para realizar la experiencia y determinar el xito de los tratamientos que se aplicarn sern obtenidos desde reproductores silvestres los cuales sern acondicionados e inducidosaldesovedeacuerdoalametodologadescritaporMatus(2006)para M.edulis.

Obtencindegametos
La induccin al desove se realizar por mediodelatcnicadeshocktrmico,laque consiste en someter a los reproductores, previamente seleccionados, a cambios bruscos de temperatura, provocando un estrs, que estimula la evacuacin de gametos. Para ello, los reproductores se ubicarn en una bandeja de 20 L con agua de mar filtrada a 1m, esterilizada con luz ultravioleta (UV) y temperada a 17 C. Despus de 30 minutos, se cambiar el volumen total, por agua a 19 C, la que se mantendr por otros 30 minutos, se efectuarauntercercambioconaguaa21C,mantenindoseporunos30minutos ms,alcabodelcualdebieraproducirseeldesove.

Fecundacin
Losgametos,tantodemachoscomodehembrassecolectaranenformaseparada yluegoseevaluarnycontabilizaranutilizandounmicroscopio.Seutilizarcomo criterio de buena calidad, la forma esfrica de los ovocitos y tamao y la alta movilidaddelosespermatozoides.Losovocitossetamizaranconunamallade60 m, posteriormente se depositaran en un recipiente con agua de mar filtrada y esterilizada con luz UV; la fecundacin se realizara agregando los espermatozoides,enrelacin1:5(ovocito:espermio).

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Los huevos que se obtengan, en un tamiz de 75 m, se depositaran en un estanquede500Ldeformacnicaaunadensidadfinalde20huevos/mL,enagua demara17C(temperaturadelaguaenelambiente),filtradaa1myesterilizada conluzUV.

Cultivolarval
Transcurridas las primeras 48 hrs. despus de la fecundacin, aparecern larvas tipooenformadeD,lasquesernseleccionadasatravsdetamicesde90,60y 44 m de abertura de malla. El primer tamiz (90 m) se utilizar para retener partculas grandes y basura; en el tamiz de 60 m quedarn las larvas en buen estado;yeneltamizde44mseretendrnlosovocitosnofecundadosylarvas deformes, las que se eliminarn. Las larvas retenidas en el tamiz de 60 m se contarn tomando una alcuota y observndolas por medio de un microscopio. Inmediatamente se dejarn en un estanque de 500 L, a una densidad de 2 larvas/mL,conaguademarfiltrada(1m),esterilizadaconluzUV,temperaturaa 17C ysernalimentadasdiariamenteconla microalgaIsochrysisgalbana(clone TIso)aunaconcentracinde50.000cl/mL.Los cambiosdeaguaylimpiezade estanquesdecultivoseefectuarncadadosdas.
Embriones(44um)LarvaD(62um) 13
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LarvasPediveligeras(230um)Postlarvas(400a600um) SemillasBabyClams

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MtodosdeAplicacin

Los triploides se producen al impedir la meiosis del huevo para que ste permanezca en estado diploide (2n). Cuando los espermatozoides en fase haploide(1n)fecundanunhuevodiploideelresultadoesunanimaltriploide. Para el bloqueo de la salida de polocitos, se han utilizado tanto tratamientos fsicos como qumicos. Los tratamientos fsicos se refieren principalmente a la aplicacindetemperaturasyaltaspresionesqueinhibenlasalidadelospolocitos (Arai et al., 1986). Dentro de los qumicos se ha utilizado citocalacina B, (Beaumont&Fairbrother,1991;Nell,2002;Liuetal.,2004)yenlosltimosaos la6Dimetilamino purina (6DMAP) (Desrosiers et al., 1993; Grard et al., 1994; Nelletal.,1996;Zhangetal.,1998;Liuetal.,2004) Sepuedeevitarqueloshuevosdelosbivalvospasenporlameiosisyalcancenla fase haploide sometindolos a un tratamiento trmico o qumico. Al principio la mayora de los triploides se producan mediante el tratamiento qumico de los huevos con la Citocalasina B. Los huevos de las hembras se obtenan manualmenteysefecundabanconespermatozoides.Semantenanalosgametos separadoshastaqueestuvieranlistosparalafecundacinparacontrolardecerca el proceso y despus de la aparicin del primer cuerpo polar, se aplicaba la citocalasina B en los huevos fecundados, impidiendo as la meiosis. De esta manera, los huevos permanecan en el estado diploide y con el juego de cromosomas del macho, dando como resultado un embrin triploide. Con el tiempo se ha conseguido perfeccionar la tcnica con un nivel de xito en la produccindetriploidesdel90%.

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Sin embargo este mtodo plantea dos problemas; en primer lugar, no produce triploides en el 100% de los casos y en segundo lugar, la citocalasina B es cancergenayaunquesloseutiliceenlafecundacindelosanimalesypresente pocas posibilidades de acumular toxicidad el pblico ha expresado su preocupacin.Yanosueleemplearseestemtodoqumicoenloscriaderospara producirostrastriploides. Ahora algunos criaderos prefieren el mtodo del choque trmico. Los huevos fecundadosnormalmentesemantienena25C,peroselessometeauncambio brusco de temperatura a 32 C durante dos minutos y luego se restaura la temperaturaa25C.Elchoquetrmicoseaplicadespusdelaemisindelprimer cuerpo polar, unos veinte minutos despus de la fecundacin. Este mtodo tambinsehaperfeccionadoyelniveldexitoenlaproduccindetriploidesesel mismo que con el tratamiento qumico, es decir un promedio de xito del 90%. Tantoelmtodoqumicocomoeltrmicosonefectivos,perolamayordesventaja esqueraramenteseconsiguentriploidesenel100%deloscasos.Senecesitaba unmtodoquepudieraproducirtriploidesconstantementeconcadaseleccinen
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el100%deloscasos.LasinvestigacionesrealizadasenEuropaylosEstadosUnidos han ayudado al desarrollo de mtodos para producir ostras tetraploides (4n). Hastalafechaslosehanproducidomachostetraploidesycomoelmtodoest patentado, se conocen pocos detalles. Sin embargo se puede llegar a acuerdos con las empresas que producen tetraploides para obtenerlos y utilizarlos en el criadero como reproductores. Cuando se cruzan con ostras diploides siempre producen triploides. El mtodo es efectivo y probablemente llegar a emplearse de manera extensiva por los criaderos y la industria de engorde conforme aumenteladisponibilidaddetetraploides.

Fecundacin y reanudacin de la Meiosis Anafase de la 1 divisin meitica y eliminacin del primer corpsculo polar Clula diploide 2n=4

MECANISMO DE OBTENCIN DE TRIPLOIDES

Ovocito con la meiosis detenida

Anafase de la 2 divisin meitica sin bloquear la eliminacin del segundo corpsculo polar

Cigoto con la dotacin cromosmica normal para la especie 2n=4

Metafase de la 1 divisin meitica

Metafase de la 2 divisin meitica

Anafase de la 2 divisin meitica con bloqueo de la eliminacin del segundo corpsculo polar

MtododeTriploidizacinPropuesto ParalainduccindelatriploidasedebebloquearlameiosisIyIIdelhuevorecin fertilizadodebidoaquelosgametosseliberanpreviosalaexpulsindelprimer polocito. Este proceso se obtiene utilizando elementos qumicos o fsicos tales como presin y temperatura. En el caso nuestro se realizarn las pruebas utilizandodosagentesqumicosquehanresultadoeficientesenlogrartriploida enmoluscosestossonCitocalasinaB(CB)y6Dymetilaminopurine(6DMPA).

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Despus de fertilizados se proceder a realizar inmersiones de los huevos de almejasenCitocalsinaB(CB)ensolucionesde0.5mg/lty1mg/ltportiemposde 25y40minutos,yen6DMPAensolucionesde50mg/lty100mg/ltportiempos de15y20minutos. Una vez que el porcentaje de triploidizacin alcance niveles adecuados se continaconelbatchencultivo.LlegadoelestadodelarvatipoDseseleccionan las larvas tamizndolas con mallas de 90, 62, y 44 micrones desechando los tamizadosde90y44micronesporcorresponderprobablementeaimpurezasde mayortamaoyahuevosnofecundados.Elpasosiguienteconsisteenelconteo de las larvas con la ayuda de una cmara Sedgewick y dejar densidades de 2 larvas/mlenestanquesde500lts.Conaguademarfiltradaa1micrnyadicin de microalgas a razn de 50.000 cel/ml. Al cabo de unos 20 das se inicia el proceso de metamorfosis con la aparicin de la disoconcha y las larvas se tamizan a 250 micrones para retener las de mejor crecimiento y continuar el cultivo. Cuando las semillas alcanzan una talla de 1 milmetro se trasladan al sistemadenursery. Lasetapasdefinidasenelprocesodeobtencindetriploidessonlassiguientes: Etapa1:Produccindetriploidesporinduccinqumicadesdehuevos2n Etapa2:Generacindestockdereproductorestriploidesporidentificacin yseleccindeejemplares3nanormales,funcionalmentefrtiles. Etapa 3: generacin de stock de reproductores tetraploides a partir de la fertilizacindegametos3n+n. Etapa4:Obtencindeejemplares100%triploidesapartirdelafertilizacin degametos2n+n Lasiguientesecuenciadescribelasetapasantesmencionadashastalaobtencin detriploidesporcruzamientodegametos2n+n:

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MtodosdeVerificacin

LaverificacindelosefectosdelaaplicacindelosmtodosdeTriploidizaciny tetraploidizacin pueden ser evaluados por varios mtodos, entre los cuales se encuentran el recuento directo de cromosomas, recuento de nuclolos o por citometra de flujo, la aplicacin de cualquiera de estos procedimientos entrega resultados confiables para la evaluacin final de la dotacin cromosmica de los ejemplarestratados. RecuentodeCromosomas
2n3n

RecuentodeNucleolos
2n3n

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CitometradeFlujo

La Citometra de Flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparamtrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensin de partculas (generalmenteclulas)alineadasydeunaenunapordelantedeunhazdelser focalizado. El impacto de cada clula con el rayo de luz produce seales que corresponden a diferentes parmetros de la clula y que son recogidos por distintos detectores.Estosconvierten dichassealesen sealeselectrnicas que posteriormente sern digitalizadas para permitir la medida simultnea de varios parmetrosenunamismaclula.Estosparmetrosson: Parmetros relacionados con caractersticas intrnsecas de la clula, como sutamaoylacomplejidaddesuncleoycitoplasma. Parmetros relacionados con caractersticas antignicas de cada clula (inmunofenotipo). Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una clula por medio de sus caractersticas antignicas y/o por sus caractersticas morfolgicas de tamao y complejidad.(www.citometriadeflujo.com)

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ResultadosEsperados

Desarrollo y validacin de una tcnica para la produccin de ejemplares triploides de almeja (Venus antiqua) por medio de la tcnica de cruzas de ejemplares2ncon4n. Definicin de mtodos de seleccin de triploides frtiles de almeja (Venus antiqua). Generacin de planteles de reproductores de almeja (Venus antiqua) triploidesytetraploidesseleccionados. Produccin de ejemplares triploides con mejores tasas de crecimiento y factordecondicinconelobjetodemejorarlosndicesderentabilidadde laindustria

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Bibliografa

AllenS.EtalInducedTriploidyinthesoftshellclam.JournalofHeredity,Vol.73N 6.1982 Allen S. Et al. Hatchery manual for producing triploid oysters. Univ. Wash. ISBN 02957304711:27pp.1989 Arai, K., Naito, F. & Fujino, K. 1996. triploidization of the Pacific abalone with temperatureandpressuretreatments.NipponSuisanGakkaishi,52:417422 Brake John et al. Field observation on growth, gametogenesis and sex ratio of triploidanddiploidMytilusedulis.Aquaculture236(2004)179191 C4BreedingTechnologiesInc.InducedTriploidShellfih.2006 GongNetal.ChromosomeinheritanceintriploidoysterCrassostregigasheredity Vol.93,Number5pp408415 GuoX.andKraeuterJ.TriploidtetraploidTechnologyforHardClamAquaculture HaskinShellfishRresearchLab.RutgesUniversity,NewJersey2000. Jones Gordon G. Sandfor Cathy LL Jones Bruce L. Manila Clams : Hatchery and Nurserymethods.InnovativeAquacultureproductsLtd.1993 Huping Y. And Guo X. Tetraploid Induction by Meiosis in the Dwarf Surf Clam Mulinia lateralis : effects of Cytochalasin B Duration . Aquaculture research Vol.35nov.2004 Inland Water Resources and Aquaculture Services. Cultured Aquatic Species InformationService LaingI,Lees,PageDJandHeshilwoodK.ResearchonShellfishCultivationdefra Contract10942004 LepezI.BiotecnologaAplicadaalaProduccindeChoroZapatoparaPotenciarsu CultivoenChile2001ProyectoFONDEFDO1I1110
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LiuetAl.OptimizationoftriploidyinductionintheblacklipabaloneHaliotisrubra using6dimethylaminopurine.AquacultureResearchVol35Num.112004 Lohrman Karin B. Histological study of gonads in triploid scallops Argopecten purpuratusJournalofShellfishResearch,8/1/05 Luckembach M. Estimating the effects of large scale clam aquaculture on phytoplanktonproductionandwaterqualityVIMS2005 Matus, Juan. 2006. Efecto de compuestos comnmente usados para inducir metamorfosis sobre el crecimiento y supervivencia de almeja taquilla Mulinia edulis(king,1831).Memoria. NellJ.A.etPerkinsB.StudiesontriploidoystersinAustralia:farmingpotentialof alltriploid Pacific oysters in Port stephens, New south Wales Australia. AquacultureResearchVol.,p530.Apr.2005 North .Carolina Dpt. Of Agr. And Consumer Services. Aquaculture in North CarolinaClams.Inputs,OutputsandEconomics2001 ScarpaJ.ElWazzan.CytologicalEvaluationofTriploidInductioninthehardClam MercenariamercenariaAquacultureAmerica2005 Spencer, B. Edwards , D.B. and Millan , P.F. 1992 . Protecting Manila Clam Beds withPlasticNetting.Aquaculture105:251268 Toro.J,SanhuezaM,ParedesL,CanelloF.1995.InductionofTriploidEmbryosBy Heat Schock in the Chilean Northern Scallop Argopecten purpuratus . New ZealandofMarineandFreshWaterResearch,1995:Vol.29:101105 UttingS.D.andChildA.R.1994GeneticManipulationoftheManilaClam(Tapes phillipinarum)usingCytocalasinBtoInduceTriploidyAquaculture120:271282 Von Brand E. Investigacin y Desarrollo de una Tecnologa Limpia para la Induccin de la Triploida de Ostra Japonesa y Ostin del Norte. 1998 Proyecto FONDEFD98I1044

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Produccin de Triploides de Almeja (Venus antiqua)

Wada K.T. Komura . A and Uchimura Y. Triploid Induction In the Japanese Pearl Oyster,Pinctadafucatamartensii1989Aquaculture76:119 WendellJ.LorioandSandraMaloneBiologyandCultureoftheNorthernQuahog Clam(Mercenariamercenaria),SRAC1995 WenshanL.HeasmanM.SimpsonR.2004.AqucultureResearch,Vol.35Num.11 Sept2004,pp10761085 YangH.etGuoX.YTetraplodinductionbymeiosisinhibitioninthedwarfsurfclam Mulinialateralis:effectsofcytochalacinBdurationAquac.ResearchVol.35Issue 132004 YangH.Li.LGuoX.PreliminaryStudyonInductingPoliploidyinJapanesescallop (Patinopecten Yessoensis) by Cytochalasin B Acta Zoologica Sinica Ag.2001,47 (Issue4) ZebalRon,2005Comunicacinpersonal.

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