NTRODUCCIN

clonacion

Los plsmidos como vectores de clonacin: Los plsmidos se replican independientemente del cromosoma delhospedador. Adems de llevar los genes requeridos para su propia replicacin,la mayora de los plsmidos son vectores naturales porque con frecuencia lleban otros genes que confieren propiedades importantes a sus hospedadores.Tales genes pueden ser adquiridos por recombinaciones dentro del ospedador. En biotecnologia, los biotecnologso aaden genes a un plsmido en un tubo de ensayo o matriz .Los plsmidos poseen propiedades muy tiles como vectores de clonacin.En esta propiedad se incluyen: 1.Su pequeo tamao, que hace que este DNA sea fcil de aislar y demanipular. 2.Su origen de replicacin independiente, de manera que la replicacin delplsmido en la clula ocurre independientemente del control directo delcromosoma. 3.Su nmero mltiple su numero mltiple de copias, de manera que en laclula pueden estar presentes varias o numerosas copias, lo queposibilita la amplificacin del DNA. 4.La presencia de marcadores seleccionables, tales como genes deresistencia a antibiticos, haciendo as ms fcil la deteccin y seleccinde los clones que contiene el plsmido.Aunque en el ambiente natural los plsmidos conjugados se transfierengeneralmente por contacto clula a clula, los plsmidos vectores de clonacinhan sido modificados a fin de evitar su transferencia por conjugacin y aslograr su contencin biolgica. Sin embargo, en el laboratorio es posible realizar la transferencia por transformacin o electroporacin. Fundamento que consiste la clonacin Las molculas de ADN plsmidico, adoptan una conformacin tipo doble hlice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definicin, se encuentran fuera de los mismos. Se han encontrado plsmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosomal, los plsmidos no tienen protenas asociadas. En la mayora de los casos se considera gentico dispensable. Sin embargo, pocee informacin gentica importante para las bacterias. Por ejemplo,los genes que codifican para las protenas que las hace resistentes a los antibiticos estn, frecuentemente, en los plsmidos. Hay algunos plsmidos integrativos, vale decir tienen la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano. Digamos que rompe el cromosoma y se sita en medio, con lo cual, automticamente la maquinaria celular tambin reproduce el plsmido. Cuando ese plsmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.

Los plsmidos se utilizan en ingeniera gentica por su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal como as tambin por que es relativamente fcil manipularlos e insertar nuevas secuencias genticas. Los plsmidos usados en biotecnologa suelen contener uno o dos genes que les confieren resistencia a antibiticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay otros mtodos de seleccin adems de la resistencia a antibiticos, como los basados en fluorescencia o en protenas que destruyen las clulas sin uso de antibiticos. Estos nuevos mtodos de seleccin de plsmidos son de uso frecuente en agrobiotecnologia, debido a la fuerte crtica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de antibioticos en los organismos modificados genticamente.

TCNICAS PARA LA GENERACIN Y SEPARACIN DE FRAGMENTOS DE DNA el tratamiento de un DNA con enzimas de restriccin permite generar fragmentos especficos a partir del DNA original. Es importante recalcar que esta tcnica hace posible que este tipo de experimento se repita siempre con los mismos resultados (para el mismo DNA), ya que los sitios de reconocimiento de las endonucleasas son secuencias especficas en el DNA. Hay, sin embargo, mtodos alternativos para generar fragmentos de DNA. Uno de estos mtodos alternativos al uso de las nucleasas de restriccin para generar fragmentos de DNA, ha sido la ruptura mecnica. La ruptura mecnica del DNA, en condiciones controladas, ha sido especial- mente til para generar, al azar, fragmentos de DNA no homlogos. imposibles de obtener con endonucleasas de restriccin, ya que segn un clculo de probabilidad, stas cortan una vez en cada 4 000 nucletidos si su secuencia de reconocimiento es de seis nucletidos, o bien una vez cada 400 si reconocen secuencias de cuatro nucletidos. Este mtodo de ruptura mecnica ha sido utilizado para construir los llamados bancos, libreras o genotecas de genes, que son colecciones de molculas recombinantes que contienen el DNA genmico de un organismo y en algunos caso se puede saber el sitio donde actan elemento como el calcio y fosoforo o su lugar de corte. Otra alternativa para obtener fragmentos especficos de DNA ha sido el uso del copiado enzimtico de molculas de RNAm para producir una copia de DNA complementario (DNAc), al RNAm. Lo anterior es posible gracias a un tipo de enzima de origen viral conocida con el nombre de transcriptasa reversa. Un elemento indispensable para obtener una copia de DNA a partir de un RNA es el llamado prmero o iniciador; ste es un fragmento pequeo de DNA de hlice sencilla (un oligo- nucletido), de 10-30 nucletidos que debe hibridizar o aparearse con el extremo 3' del RNA que se desea copiar. Hoy en da la mayor parte de los iniciadores son sintetizados qumicamente en el laboratorio. A partir del extremo 3' del iniciador, la transcriptasa reversa sintetiza un DNA complementario, de cadena sencilla, de forma anloga como la enzima DNA- polimerasa sintetiza DNA a partir de DNA. Una vez que se obtiene la cadena de DNA, el RNA es removido y la misma enzima es capaz de sintetizar la segunda cadena complementaria de DNA. Despus de obtenido el DNA de doble cadena, las

regiones de DNA de cadena sencilla son digeridas con una nucleasa que degrada especficamente este tipo de cadena sencilla. SEPARACIN DE FRAGMENTOS DE DNA POR ELECTROFORESIS La figura muestra una fotografa de un gel de acrilamida en la que aparecen como pequeas bandas, los fragmentos de DNA que se generan con diferentes enzimas de restriccin. Al digerir una molcula de DNA con una o varias enzimas de restriccin de DNA, se le puede cortar en uno o varios sitios. Los fragmentos de DNA sometidos a electroforesis se pueden visualizar si se les tie, por ejemplo, con sustancias que fluorecen al ser irradiadas con luz ultravioleta, como es el caso del bromuro de etidio. Para ello, los geles de agarosa o acrilamida se sumergen directamente en una solucin de este compuesto, el cual se intercala entre las dos hlices del DNA, y as las bandas de DNA se observan de color blanco-naranja al irradiar el gel con luz ultravioleta. Importa destacar que la intensidad de la tincin es directamente proporcional al tamao de los segmentos de DNA; en consecuencia, las bandas de mayor peso molecular tendrn fluorescencia ms intensa que las bandas de menor peso molecular. Cada fragmento de DNA observado en el gel representa una poblacin homognea en tamao de molculas de DNA, de modo que el anlisis de patrones de restriccin de genomas pequeos o segmentos de DNA clo- nados constituye un poderoso mtodo para el estudio de estos DNAs. SNTESIS QUMICA DE DNA

La sntesis por mtodos qumicos de oligonucletidos ofrece la posi- bilidad de generar secuencias de DNA que no existen en la naturaleza. Se han desarrollado mtodos manuales y automticos de gran eficiencia para sintetizar cadenas sencillas de DNA (de longitud hasta de 150 nucleo- tidos), mediante la adicin progresiva de nucletidos en direccin 3' a 5'. Se ha demostrado que los fragmentos de DNA y los genes sintticos son totalmente funcionales in vivo. Generalmente se utilizan fragmentos pequeos de DNA de secuencias especficas para adaptar y conectar mol- culas de DNA durante los procesos de clonacin y de expresin. As, es posible editar las molculas de modo anlogo como se editan las pel- culas cinematogrficas. Recientemente, el uso de oligonucletidos sintticos de DNA se ha incrementado notablemente por la demanda y requerimiento de este tipo de reactivo en la reaccin en cadena de polimera- sa o PCR, tcnica que se describe ms adelante, as como para determinar la secuencia de fragmentos de DNA utilizando el mtodo descrito por Sanger, como se muestra en la siguiente seccin

Glosario: Episoma:es una unidad extracromosmica replicante que funciona autnomamente o con un cromosoma. Puede integrarse, en muchos casos mediante un proceso de recombinacin, en un cromosoma del organismo que lo porta. Los episomas ms conocidos son los plsmidos. Uno de estos es el plsmido-F (que le confiere a la bacteria husped la capacidad de formar el pili-F (o pili sexual) por el que podr transferir informacin gentica a otra bacteria) al que se le llama episoma-F cuando se ha integrado dentro del genoma de la bacteria hospedera. El episoma es un plsmido capaz de existir bien integrado en el cromosoma del husped bacteriano

electroporacin: es un significativo aumento de la conductividad elctrica y la permeabilidad de la membrana plasmtica celular causado por un campo elctrico aplicado externamente. Es habitual en biologa molecular como forma de introduccin de diferentes sustancias en clulas, como por ejemplo sondas moleculares, un frmaco que puede cambiar las funciones celulares o un fragmento de DNA codificante, como puede ser un plsmido

La agobiotecnologia: es la tecnologa basada en la biologa, especialmente usada en agricultura, farmacia, ciencia de los alimentos, ciencias forestales y medicina. Se desarrolla en un enfoque multidisciplinario que involucra varias especialidades y ciencias como biologa, bioqumica, gentica, virologa, agronoma, ingeniera, fsica, qumica, medicina y veterinaria entre otras. Tiene gran repercusin en la farmacia, la medicina, la microbiologa, la ciencia de los alimentos, la minera y la agricultura entre otros campos. Probablemente el primero que us este trmino fue el ingeniero hngaro Karl Ereki, en 1919, quien la introdujo en su libro Biotecnologa en la produccin crnica y lctea de una gran explotacin agropecuaria

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