CURSO DE MESTRADO INTEGRADO EM CINCIAS FARMACUTICAS GENTICA - 1 SEMESTRE Ano lectivo 2011/2012

TRABALHO PRTICO 1

EXTRACO DE DNA DE CLULAS DE

SANGUE ANIMAL

Tatiana Antnio

Data de Entrega: 19 de Outubro de 2011

Introduo Terica
Existem vrias tcnicas para extraco do DNA, que utilizam diferentes metodologias e espcimes biolgicos. O sangue o padro-ouro de material utilizado para extraco de DNA porque fonte abundante de informao gentica e por fornecer amostra fresca para anlise. No entanto, muitos outros materiais podem ser efectivamente analisados: clulas epiteliais da mucosa oral; unhas, plos e fios de cabelo (regio do bolbo capilar); manchas de material biolgico (lquido seminal, urina, saliva) em vidro, faca, txtil; ossos carbonizados, ossadas ou dentes; material anatomopatolgico; e inclusive clulas deixadas por impresso digital. A extraco do DNA a partir de sangue perifrico consiste numa srie de etapas, que se baseiam na eliminao do material no passvel de ser analisado, at a obteno do cido nucleico em questo. Portanto, parte-se do princpio de que devem ser lisados os eritrcitos (anucleados), os leuccitos, o RNA e as protenas, para obteno do DNA. A extraco do DNA baseada em trs passos bsicos que dependem do tipo de amostra de onde se vai ser extrado e das substncias que podem vir a interferir com o resultado final. O DNA ir ser extrado de uma amostra de sangue de cavalo e assenta em 3 princpios fundamentais: 1) Dispensa das hemcias, tendo em conta o uso de baixas concentraes de EDTA para que os leuccitos no sejam danificados 2) Desintegrao da membrana, pela aco da SDS, e decomposio de componentes celulares, nomeadamente enzimas do DNA, por aco da protease K 3) Precipitao do DNA, por etanol ou isopropanol gelados, uma vez que o DNA insolvel em lcool e permanece aglomerado Este ltimo passo importante na remoo de sais. Atravs deste processo ser possvel realizar a extraco de sangue de bovinos, que ir ser a amostra utilizada para obter DNA genmico que contm o DNA mitocondrial e o DNA nuclear. Se a extraco for feita a partir de plantas, o DNA dos cloroplastos tambm ser obtido. No caso dos mamferos a extraco do DNA ocorre apenas nos leuccitos, visto que so as nicas clulas nucleadas.

Objectivo
Obter cido desoxirribonuclico (DNA) a partir de sangue total. Visualizao do DNA isolado. Familiarizao de um modo geral com as diferentes tcnicas de extraco de DNA usadas em investigao e medicina forense.

Material e Procedimento
Material: - amostras de sangue de cavalo (Brio) - tampes previamente preparados - soluo de Proteinase K (20 mg/ml) - soluo de NaCl 3 M - lcool etlico 100% (ETOH) - lcool etlico 70% (ETOH) - SDS 10% - tubos eppendorf (microtubos) - vrtex - centrifugadora - micropipetas e respectivas pontas

Procedimento descritivo: Inicialmente, colocaram-se 25mL de sangue num tubo cnico de 45mL e adicionaram-se 10mL de lysis buffer I (155mM HN4CL; 10mM KHCO3; 1mM EDTA; pH 7,4). Depois misturou-se com o auxlio do vrtex e colocou-se no gelo durante 10 minutos. Seguidamente, centrifugou-se por 10 minutos, 2500 rpm, 4C.

Posteriormente, descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o sedimento em 10mL lysis buffer I e levou-se ao vrtex. Centrifugou-se novamente, durante 10min, 2500 rpm, 4C e seguidamente removeu-se o sobrenadante, ressuspendeu-se o sedimentos em 4mL de lysis buffer II (10mM Tris-HCl; 400mM NaCl; 2mM EDTA; pH 7,5) e misturou-se utilizando o vrtex. Adicionaram-se 20L de Proteinase K (20mg/ml) e 110L de 10% SDS. Em sdeguida colocar-se-ia em banho-maria a 60C durante 30minutos, mas por questes de tempo, foram-nos disponibilizadas solues de trabalho que tinham ficado, durante a noite, submetidas a 4C. Depois adicionaram-se 700uL de 3 M NaCl, agitou-se no vrtex por 15 segundos e centrifugou-se por 15 minutos a 3000 rpm, 20C. Seguidamente foi necessrio transferir o sobrenadante para um tubo novo e adicionar 2 volumes de 100% etanol. O sobrenadante ocupou um volume de 4mL, por isso adicionaram-se 8 mL de etanol, obtendo-se assim, um volume total de 12mL.
Fig. 1 - aspecto da soluo aps a incubao "overnight"

De seguida, inverteu-se gentilmente o tubo algumas vezes e retirou-se o aglomerado de DNA com uma pipeta transferindo-o para o novo microtubo. Lavou-se com 70% etanol (500 l) por 15 minutos, centrifugouse por 5 minutos a 13 000 rpm, retirou-se o sobrenadante e deixou-se secar para no haver etanol residual. Finalmente, ressuspendeu-se o DNA obtido em 300L de gua ultra-pura e armazanou-se a 4C.

Fig. 2 - Aglomerado de DNA

Resultados
Recorrendo ento ao NanoDrop, fez-se a quantificao de: DNA a = 260 nm protenas a = 280 nm Faz-se portanto um rcio para os valores resultantes nos comprimentos de onda indicados, obtendo-se assim o Grau de Pureza, que nos dar a ideia do quo puro em DNA o nosso material recolhido. Assim, este ser tanto mais puro quanto mais este rcio se aprocimar do valor de 2,00, valor ideal terico.
Amostra 6 Brio DNA (ng/l) 142,4 260/280 nm 1,52

Os valores obtidos so bastante aceitveis, pelo que se poderia prosseguir para a anlise do material gentico extrado atravs da PCR.

Discusso
A actividade laboratorial foi bem sucedida, visto que foi possvel extrair DNA genmico de sangue de cavalo. Procedeu-se eliminao dos minerais, protenas, glbulos vermelhos e de todas as impurezas e obteve-se apenas clulas brancas. Para tal, utilizou-se o tampo lysis buffer I que permite isolar apenas as clulas nucleadas que contm o DNA, os leuccitos, tendo em conta que as hemcias so anucleadas. A desintegrao das enzimas do DNA e a remoo de sais foi feita atravs de uma protease, a Protenase K que digeriu as protenas do sangue aps o SDS provocar a desintegrao da membrana. Por fim, o etanol absoluto foi usado para a precipitao da molcula de DNA, pois, tendo em conta que o DNA insolvel em etanol, este ir surgir na forma de um fio esbranquiado visvel a olho nu. Assim, foi possvel visualizar o DNA superfcie da soluo, sendo deste modo fcil de o captar.