Establecimiento de tcnicas confiables para la determinacin de nitrato, nitrito y amonio en muestras de fertilizantes orgnicos

I. Aguilera*, R. M. Prez*, A. M. Maran**, A. balos*, A. Fernndez H.** *Centro de Estudios de Biotecnologa Industrial, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, **Departamento de Qumica, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente

Resumen
El uso de fertilizantes orgnicos ha adquirido nuevamente gran importancia debido a sus mayores ventajas sobre los fertilizantes qumicos; es por ello, que se hace necesario contar con mtodos analticos adecuados y accesibles para la caracterizacin de los mismos. La validacin de mtodos de ensayos constituye una premisa para la realizacin de servicios y una garanta de la calidad de los resultados por brindar. En el presente trabajo se realiza la validacin de las determinaciones de los iones nitrato (NO3-), nitrito (NO2-) y amonio (NH4+); para lo cual se calculan los parmetros siguientes: linealidad, precisin, exactitud de los mtodos con la utilizacin del patrn de referencia interno, anlisis de recobrados, y se comparan con los resultados que se obtienen para las muestras objeto de estudio en un laboratorio de reconocido prestigio nacional, a travs de pruebas de hiptesis, pruebas de Fisher, test de Student, demostrndose que no existen diferencias significativas para un 95 % de confiabilidad entre los mismos. Palabras clave: validacin de mtodos analticos, nitrato, nitrito, amonio, bioabono.

Abstrcat
The use of organic fertilizers has acquired great importance again due to its biggest advantages on the chemical fertilizers; for this reason it is necessary to have appropriate and accessible analytic methods for the characterization of the same ones. The validation of methods of assay constitutes a premise for the realization of services and a guarantee of the quality of the results to propose. In the present work it is carried out the validation of the determinations of the ions nitrate (NO3-), nitrite (NO2-), ammonium (NH4+) ions; for that which the following parameters are calculated: lineality, precision, accuracy of the methods with the use of internal reference patterns, recovered analysis and they are compared with the results that they are obtained for the samples study object in a laboratory of grateful national prestige, through ypothesis tests, Fisher tests, of Student test, being demonstrated that significant differences don't exist for 95 % of dependability among the same ones. Key words: validation of analytical methods, nitrate, nitrite, ammonium.

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Introduccin
En el Centro de Estudios de Biotecnologa Industrial, se realizan investigaciones para el aprovechamiento de residuales agroindustriales, mediante procesos de fermentacin, generndose bioabonos que pudieran ser aplicados como fertilizantes orgnicos /1, 2/. Para utilizar un bioabono, es necesario conocer su composicin fsica, qumica y microbiolgica, para, de esta forma, poder establecer con certeza su posible uso en la agricultura /3/. Uno de los factores ms importantes, es la especiacin de nitrgeno inorgnico, por lo que resulta imprescindible, establecer tcnicas analticas que permitan determinar, de manera confiable, el contenido de nitrito, nitrato y amonio para las muestras objeto de estudio. Se realizan las determinaciones utilizando los procedimientos analticos descritos para aguas y aguas residuales /4/, por lo que, al aplicar los mismos fuera del alcance previsto, es necesario evidenciar que se han cumplido los requisitos para el desempeo de los mtodos en el uso especfico planteado. Sobre la base de este criterio en las muestras objeto de estudio, se evalan los parmetros: linealidad, precisin, exactitud, con la utilizacin del patrn de referencia interno, anlisis de recobrado, y se comparan estos resultados con los obtenidos en un laboratorio de reconocido prestigio, y de esta forma, realizar la validacin de adecuacin de la determinacin espectrofotomtrica de NO3-, NO2-, NH4+ en muestras de fertilizantes orgnicos.

Determinacin de nitritos: Se realiz por el mtodo espectrofotomtrico de reactivo de Griess modificado segn NC 79-00/81 /5/. Determinacin de amonio: Se realiz por el mtodo espectrofotomtrico del indofenol segn, Standard Methods /4/. Los parmetros de calidad del ensayo, determinados segn /6, 7, 8/, fueron los siguientes: Linealidad: De una solucin patrn de referencia interno, se tomaron las alcuotas correspondientes para obtener la concentracin determinada, y se realiz el procedimiento correspondiente para n= 10. Precisin: Se realiz por la determinacin de la desviacin estndar y la desviacin tpica relativa (coeficiente de variacin) de los resultados del anlisis para n= 5. Exactitud o veracidad: Se evalu mediante un ensayo de recuperacin para n= 5. Se tom una muestra de concentracin conocida y se le adicion una cantidad del patrn de referencia interno que deba corresponder con la cantidad del analito presente en la muestra. Se calcul el valor medio, desviacin estndar, y se aplic un anlisis estadstico mediante una prueba t de Student, comparndolo con el 100 % del recobrado. Procesamiento estadstico: Se realizaron prueba de hiptesis, test de Student para comparacin de medias, y prueba de Fischer para comparacin de varianzas; adems, se evalu la regresin y la correlacin lineal mediante el programa STARGAPHICTM.

Materiales y mtodos
Las determinaciones se realizaron en el espectrofotmetro U.V-visible 53 W, Repblica Popular China. La cristalera utilizada fue verificada por la Oficina Territorial de Normalizacin, y los reactivos empleados son de calidad puro para anlisis (ppa ).

Resultados y discuusin
Determinacin de nitrato
Se procedi a obtener el espectro de absorcin en la regin de 215-295 nm de una solucin del patrn de referencia interno, nitrato de potasio de concentracin 0,5 mg\L, observndose un mximo de absorcin en 220 nm; posteriormente se procedi a la determinacin del espectro de absorcin de una muestra del residual, encontrndose dos mximos de absorcin en 225 nm

Mtodos de anlisis
Determinacin de nitratos: Se realiz por el mtodo espectrofotomtrico U.V., segn Standard Methods /4/.

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y 275 nm , pudiendo asignrsele el de 275 nm a compuestos orgnicos presentes en el residual /4/. Al realizar las diluciones necesarias para que los valores de absorbancia de la muestra estn en el intervalo ptimo de la curva, no se observ en el espectro de absorcin de la misma el mximo de 275 nm, eliminndose con la dilucin el efecto de la matriz; por lo que este mtodo puede ser aplicable a este tipo de muestras bajo las condiciones descritas. Se realiz la evaluacin de la linealidad del mtodo, al aplicar la regresin lineal con el objetivo de obtener la recta de mejor ajuste Y = 0,5202 X . Se obtuvieron los coeficientes de regresin y de correlacin lineal 2 (r= 0,9972 y r = 0,9967) que muestran una alta correspondencia entre la concentracin y la seal analtica del mtodo para las determinaciones realizadas, con un 95 % de confiabilidad.

La precisin y exactitud del mtodo se evalu en tres niveles de concentracin de la solucin del patrn de referencia interno, encontrndose, como se muestra en la tabla 1, que los valores de la desviacin tpica relativa son muy pequeos, cuestin sta que nos indica la precisin del mtodo. Al comparar los resultados obtenidos experimentalmente con los del patrn de referencia interno, se observ que no existen diferencias significativas, pues en todos los casos t cal << tcrit para un 95 % de confiabilidad. As mismo, al comparar los errores absolutos con el intervalo de confiabilidad de las medias, se encontr que los errores verdaderos estn dentro de los limites de los errores experimentales, por lo que se plante que el mtodo no est afectado por errores sistemticos.

TABLA 1. EVALUACIN DE LA PRECISIN Y EXACTITUD EN LA DETERMINACIN DE NITRATO CON SOLUCIN DE NITRATO DE POTASIO 0,5 mg/L COMO PATRN DE REFERENCIA POR EL MTODO U.V

Patrn (mg /L) terico experimental 1,20 2,30 3,50 1,16 2,28 3,54 DE 0,017 0,017 0,017 CV (%) 1,49 0,75 0,48 EA 0,04 0,02 0,04 ER 0,23 0,15 0,20 tcal 0,40 0,50 0,40 tcrit 4,3 4,3 4,3

DE: Desviacin estndar, CV: Coeficiente de variacin, EA: Error absoluto, ER: Error relativo
Se realiz la determinacin de nitrato en tres muestras del residual objeto de estudio, calculndose los valores de media, desviacin tpica, desviacin tpica relativa y por ciento de recuperacin . Se observ que el valor del coeficiente de variacin oscila entre 0,06-0,17; valores pequeos, cuestin que indica la buena precisin del mtodo. Se aplic el test de student con datos pareados, y se comprob que los por cientos de recobrado obtenidos (97-101) no presentan diferencia significativa para un 95 % de confiabilidad con respecto al 100 %, lo que demuestr la exactitud del mtodo.

Determinacin de nitritos
Se registr el espectro de absorcin en la regin de 400-600 nm de una solucin de patrn de referencia interno de nitrito de sodio de concentracin 0,3 mg\L, observndose un mximo de absorcin a 520 nm . El espectro de la muestra presenta solamente un mximo a 520 nm. La ecuacin de la recta a travs de la cual se determin la linealidad del mtodo, es Y= 0,305X. Los coeficientes de regresin y correlacin lineal para un 95 % de confiabilidad (r= 0,9991y r2 =0,9928) demuestran la correspondencia que existe entre la concentracin y la seal analtica obtenida.

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TABLA 2. CONTENIDO DE NITRATO EN LAS MUESTRAS ESTUDIADAS

Muestra

X (mg/L)

DE

CV (%)

Recobrado (%)

Prueba t t p

17,81

0,031

0,17

98,7

1,054

0,319

11,15

0,017

0,15

101,0

1,222

0,231

19,92

0,012

0,06

99,5

0,753

0,471

DE: Desviacin estndar, CV: Coeficiente de variacin.

La precisin y exactitud del mtodo se evalu de la misma forma que en el caso anterior, utilizando como patrn de referencia interno, solucin de nitrito de sodio, encontrndose que no existen diferencias significativas entre los valores de concentracin del patrn y los encontrados experimentalmente, para un 95 % de confiabilidad, demostrndose, de esta manera, la exactitud del mtodo. Los valores de desviacin tpica relativa (CV) son pequeos, lo que indica que

el mtodo es preciso. As mismo, al comparar los errores absolutos con el intervalo de confiabilidad de las medias, se concluy que el mtodo no est afectado por errores sistemticos. Sobre esta base, se procedi a la determinacin de nitrito en tres muestras del residual objeto de estudio; calculndose los valores de media, desviacin estndar, desviacin tpica y por ciento de recobrado.

TABLA 3. EVALUACIN DE LA PRECISIN Y EXACTITUD EN LA DETERMINACIN DE NITRITO CON SOLUCIN DE NITRITO DE SODIO 0,3 mg/L COMO PATRN DE REFERENCIA POR EL MTODO ESPECTROFOTOMTRICO REACTIVO DE GRIESS MODIFICADO

Patrn (mg /L) terico 0,100 0,180 0,320 experimental 0,103 0,179 0,321 DE 0,002 0,001 0005 CV(%) 2,9 0,83 1,6 EA 0,003 0,001 0,001 ER 0,007 0,003 0,002 tcal 0,15 1,5 0,7 tcrit 4,3 4,3 4,3

DE: Desviacin estndar, CV: Coeficiente de variacin, EA: Error absoluto, ER: Error relativo

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El valor de la desviacin tpica relativa (c.v.) y el elevado del por ciento de recobrado, demuestraron la exactitud y precisin del mtodo para este tipo de matriz (tabla 4).

Se realiz un test de student (t) con datos pareados, comprobndose que no existen diferencias significativas entre los por cientos de recobrados obtenidos y el 100 %, para un 95 % de confiabilidad.

TABLA 4. CONTENIDO DE NITRITO EN LAS MUESTRAS ESTUDIADAS

Muestra X ( mg/L)

DE

CV (%)

Recobrado (%)

Prueba t t p

1 2 3

0,49 1,07 2,47

0,009 0,011 0,05

1,8 1,0 2,0

99,4 98,8 101,0

0,761 1,054 1,222

0,466 0,321 0,231

DE: Desviacin estndar, CV: Coeficiente de variacin.

Determinacin de amonio
Son muchos los mtodos reportados para la determinacin de amonio, pero, dada la sensibilidad y selectividad del mtodo indofenol (4), se escogi el mismo para realizar las determinaciones. Se procedi segn el mismo esquema de trabajo detallado anteriormente. En el espectro de absorcin en la regin de 600-700 nm de una muestra y del patrn de referencia , cloruro de amonio de concentracin de 5 mg\ L, existe un solo mximo de absorcin a 640 nm. Los coeficientes de regresin y correlacin (r= 0,9976 y r2 = 0,9928 ) para un 95 % de confiabilidad, demuestran la dependencia lineal que existe entre la concentracin y la seal analtica en el intervalo evaluado, la ecuacin de la recta a travs de la cual se evalu la linealidad del mtodo es Y= 0,2113 X. La precisin y exactitud del mtodo se comprob con soluciones estndar interno de cloruro de amonio en 3 niveles de concentracin, observndose una buena precisin (tabla 5); no se observaron diferencias

significativas entre los valores de concentracin obtenidas experimentalmente, y los tericos (patrn de referencia) para un 95 % de confiabilidad de la media. La diferencia entre el resultado promedio del anlisis y el valor real fue menor que el probable error accidental. Posteriormente, se procedi a la determinacin de amonio en las muestras residuales estudiadas. En la tabla 6 se aprecia, que el coeficiente de variacin no excede del 1,76 %, lo que demuestra que la precisin del mtodo y los recobrados alcanzados oscilan entre 99,3-100,4 %, mostrando la exactitud de la determinacin. Al aplicar el test de student con datos pareados, no se presentaron diferencias significativas con respecto al 100 % de recobrado, para un 95 % de confiabilidad, evidenciando la exactitud del mtodo para este sustrato. Comparacin de los resultados obtenidos en el presente trabajo con los reportados por un laboratorio de reconocido prestigio.

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TABALA 5. EVALUACIN DE PRECISIN Y EXACTITUD EN LA DETERMINACIN DE AMONIO CON SOLUCIN DE CLORURO DE AMONIO 5mg/L COMO PATRN DE REFERENCIA, POR EL MTODO ESPECTROFOTOMTRICO DEL INDOFENOL

terico 1,0 3,0 5,0

Patrn experimental 0,98 2,99 4,99

DE 0,002 0,001 0,005

CV(%) 0,007 0,05 0,09

EA 0,7 1,6 1,8

ER 0,02 0,01 0,01

tcal 0,9 0,10 0,7

tcrit 4,3 4,3 4,3

DE: Desviacin estndar, CV: Coeficiente de variacin, EA: Error absoluto, ER: Error relativo

Al comparar los resultados obtenidos con los reportados por el laboratorio de referencia para las determinaciones de nitrito, nitrato y amonio, se cumple la hiptesis de igualdad, tanto

de medias como de varianzas, por lo que los resultados obtenidos por ambos laboratorios no difieren significativamente para un 95 % de confiabilidad.

TABLA 6. CONTENIDO DE AMONIO EN LAS MUESTRAS ESTUDIADAS

Muestra 1 2 3

X 6,02 3,63 5,65

DE 0,04 0,02 0,10

CV ( %) 0,66 0,55 1,76

Recobrado (%) 100,4 99,5 99,3

Prueba t t 1,212 0,753 0,759 p 0,228 0,471 0,459

DE: Desviacin estndar, CV: Coeficiente de variacin

TABLA 7. RESULTADOS DE LA COMPARACIN ESTADSTICA ENTRE LOS ANLISIS REALIZADOS EN EL LABORATORIO DEL CEBI (A) Y LOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE REFERENCIA (B)

X (A) 17,81 11,15 19,92 0,49 1,07 2,47 6,02 3,63 5,65

CV (%) 0,17 0,15 0,06 1,8 1,0 2,0 0,66 0,55 1,76

Recobrado (A) X (B) (%) 98,7 101,0 99,5 99,4 98,8 101,0 100,4 99,5 99,3 17,79 11,13 19,90 0,48 1,10 2,45 6,00 3,65 5,70

CV (%) 0,20 0,17 0,10 1,5 0,7 1,0 0,70 1,00 2,00

Recobrado (B) (%) 98,5 99,5 102,0 98,0 99,5 101,0 99,5 101,3 99,7

Prueba Fisher F 1,041 1,026 1,039 1,025 1,57 1,042 1,40 1,26 1,057 p 0,952 0,968 0,957 0,969 0,955 0,962 0,960 0,968 0,955

Prueba t t p 0,596 0,526 0,559 0,680 0,553 0,425 0,527 0,528 0,558 0,558 0,565 0,547 0,602 0,543 0,415 0,563 0,567 0,546

NO3-

NO2-

NH4+

En todos los casos se cumple p> 0,05; luego A= B y A= B.

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Bibliografa
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