RESISTENCIA DE ANTIBITICOS-ANTIBIOGRAMA

2.-OBJETIVOS Determinaremos la sensibilidad de la bacteria (Escherichia coli) problema a cierto antibitico (amoxicilina). 3.-FUNDAMENTO TERICO Un antibitico ha sido definido como una sustancia qumica producida por un microorganismo capaz de inhibir el desarrollo de otros microorganismos, dotado de actividad antibacteriana. Se utilizan pruebas esencialmente cualitativas aunque en muchos casos se requieren determinaciones cuantitativas. Las pruebas cualitativas o antibiograma se efectan con la bacteria problema mientras que las cuantitativas con una bacteria conocida (Escherichia coli). Las pruebas que vamos a realizar se basan fundamentalmente en la difusin del antibitico sobre una placa de medio a partir de un punto central, una cantidad concreta de antibitico se encuentra includo en un disco de papel que se deposita sobre una placa de agar comn, que ha sido previamente inoculada con una fuerte dosis de la bacteria a ensayar. As el disco de papel absorbe agua de la placa, se disuelve el antibitico y se inicia el proceso de difusin de ste hacia las zonas que lo rodean, generndose un gradiente de concentracin cuyo nivel mximo se encuentra bajo el disco. Las bacterias que se inocularon crecern durante su incubacin all donde la concentracin del antibitico sea lo suficientemente baja como para no impedrselo, mientras que no podrn hacerlo en las proximidades del disco donde las concentraciones del antibitico son elevadas. Ya que los lmiters de concentracin del antibitico que afectan al cultivo son por regla general muy estrechos, se suelen formar halos de inhibicin, es decir, zonas sin bacterias alrededor de los discos, de bordes bastantes definidos y cuyo dimetro tiene que ver con la concentracin de antibitico que haba en el disco y con la sensibilidad a ste de las bacterias ensayadas. De hecho todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos antibacterianos. Las pruebas ms utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano estn basadas en el enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente. Concentracin mnima inhibitoria (CMI) se define como la menor concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana dada Concentracin mnima bactericida (CMB) se define como la menor concentracin de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana. La resistencia se debe a una serie de genes que suelen estar asociados a elementos genticos transferibles, de forma que aquella bacteria que adquiere estos elementos se hace resistente a la accin de los antibiticos. Su extensin en el uso de los antibiticos en la prctica clnica ha hecho

que se seleccionaran las bacterias resistentes, sucumbiendo aquellas que no lo son, en consecuencia, existen cepas bacterianas que son resistentes a varios antibiticos. Por ejemplo, los Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA). La cepa llamada Ibrica, adems de ser resistente a la penicilina, estreptomicina, tetraciclina, eritromicina y meticilina, tambin es resistente a la mayora de los antibiticos genricos que han sido desarrollados en los ltimos 50 aos, a excepcin de la vancomicina, usado como ltima solucin a las infecciones producidas por MRSA. Se dice que un microorganismo es sensible a un antibitico cuando ste es capaz de inhibirlo o matarlo. Se dice que un microorganismo es resistente si el microorganismo no se ve afectado por la presencia del antibitico. Hay organismos que son de forma natural resistentes, sencillamente porque no tienen una diana para el antibitico, por ejemplo, Micoplasma no tiene pared celular y, por lo tanto, es de forma natural resistente a los antibiticos del tipo betalactmicos. La resistencia adquirida se debe a la modificacin del contenido gentico de la bacteria, esta modificacin puede venir por dos vas: mutacin y seleccin de los mutantes resistentes por la presencia del antibitico en el medio, menos frecuente que al adquirida por mecanismos de transferencia gentica. Por esta segunda va entran en la clula los genes que confieren la resistencia a los antibiticos a travs de plsmidos, transposones e intrones, elementos genticos mviles que pueden ser transferidos entre las bacterias. Los mecanismos de resistencia son fundamentalmente evitar que el antibitico alcance su diana, la alteracin del antibitico y la alteracin de la diana. En el primer caso, lo ms simple es impedir que el antibitico entre en la clula, mutando las porinas, alterando el sistema de transporte o creando mecanismos de transporte que eliminen el antibitico del interior de la clula con el fin de que no se acumule en cantidades suficientes como para que pueda producir la muerte del microorganismo. El segundo mtodo es la alteracin del antibitico, bsicamente consistira en sintetizar enzimas que degradaran o modificaran el antibitico impidiendo que reconociera su diana. Por ltimo, otra estrategia, quiz la ms sencilla, es modificar la diana, ya que pequeos cambios en la molcula que reconoce el antibitico pueden hacerla invisible.

Las combinaciones son infinitas, es decir, una bacteria puede tener resistencia a varios antibiticos y distintas formas de resistencia para un mismo antibitico. De ah la importancia de no usar de forma indiscriminada los antibiticos. Su uso sin control ejerce una presin selectiva que favorece el establecimiento de cepas resistentes. Al utilizar los antibiticos, sobreviven nicamente los que son resistentes, por tanto con el uso de los antibiticos se seleccionan de forma artificial aquellos microorganismos que no se ven afectados. Existen microorganismos que de forma natural son resistentes, pero la mayora han adquirido la resistencia a travs de mutaciones, los menos, o por medio de elementos genticos mviles.

Antibiograma: Consiste en el estudio de la sensibilidad o resistencia de determinado microorganismo (o grupo de ellos) a varios antibiticos. Se puede utilizar para tratar un patgeno, aadir a alimentos, en definitiva para saber como se comporta un germen frente a determinado antibitico. Los antibiticos en general pueden ser de amplio espectro o de espectro reducido, estos ltimos van a matar grmenes ms especficamente. Dependiendo del origen o localizacin de la infeccin, se va a utilizar uno u otro. Por ejemplo en una infeccin de garganta no se debera utilizar uno de amplio espectro ya que matara tambin a la microbiota tan importante para nosotros. El antibiograma se puede hacer tanto en medio lquido como en medio slido. Por ejemplo utilizando un agar ordinario pero modificado de manera que grmenes y antibiticos puedan difundir correctamente: agar de Muller-Hinton (El caldo ms comnmente usado En los mtodos de dilucin en caldo, base de casi todos los mtodos utilizados en la actualidad, se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que sostendr el desarrollo del microorganismo). Se utilizan para poner los antibiticos, unos discos impregnados que llevan unas letras que nos indican el antibitico del que se trata y un nmero que indica la concentracin en mg/ml que tena la disolucin en la que se impregnaron. Ej: Cloranfenicol a concentracin 30mg/ml Unas pinzas para poner los discos sobre el agar. Pipetas estriles para sembrar la placa. Un hisopo estril para extender por la superficie el inculo. Y asa de siembra y mechero para esterilizar. Se parte de un cultivo puro de 48 horas. La cepa es potencialmente patgena de humano y como crece en nuestro cuerpo, la incubacin se ha hecho a 37C. Se siembra 0.5ml que se coge con la pipeta (agitando para resuspender las clulas del fondo) y se vierte sobre la placa. Con el hisopo estril se extiende bien el inculo por toda la superficie de la placa. Con las pinzas se cogen cinco discos de antibiticos y se ponen en la placa bien separados entre si y de los bordes. La placa se pone a incubar 24 horas a 37C y en posicin invertida. Tras la incubacin va a aparecer toda la superficie llena de colonias y alrededor de cada disco aparecer o no un halo de inhibicin dependiendo de que el germen sea sensible a ese antibitico. El tamao del halo nos va a permitir conocer el grado de sensibilidad al antibitico o si es resistente. Se valora el dimetro de la zona de inhibicin que se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias oportunas. Con esta referencia podemos informar si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente (S, I, R) a cada uno de los antibiticos ensayados en las placas. Puede aparecer un pequeo halo aun siendo resistente, esto se debe a la alta concentracin de antibitico en el medio inmediato al disco. Puede aparecer alguna colonia dentro de los halos, esto se debe a mutaciones espontneas que hacen a algunas bacterias resistentes.

En esta fotografa se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por el mtodo de difusin en agar por medio de discos. En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento bacteriano y con seis discos de antibiticos. La zona de color claro que ocupa la mayor parte de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Los crculos negros que rodean a cinco de los seis discos marcan las zonas en que los respectivos antibiticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio. El sexto disco (AM-10) no tiene a su alrededor halo de inhibicin lo que indica la resistencia del microorganismo a ese antibitico. La foto de la derecha, un plano ms cercano de la mitad superior de la placa, permite observar con ms detalle lo sealado en el prrafo anterior. Puede verse adems, con gran claridad, la especial disminucin de la intensidad de crecimiento del microorganismo en la zona interior del halo de inhibicin del disco de CTX-30, debido probablemente a la aparicin de mutantes resistentes de dicho microorganismo capaces de soportar en mayor medida que el resto el efecto inhibitorio del antibitico. El antibiograma por el mtodo de disfusin de agar es una prueba en la que se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una solucin antibitica absorbida en discos de papel de filtro. Este mtodo esta estarn estandarizado y los halos de inhibicin han sido obtenidos correlacionndolos con las CMI. Hay varios factores que afectan al halo de inhibicin: la carga del antibitico en los discos, la difusin del antibitico en el medio de cultivo, el tamao del inculo bacteriano, la composicin y el grosor del medio de cultivo, la velocidad del crecimiento bacteriano y el tiempo de incubacin. Los discos la cantidad establecida de antibitico y ser conservados a 4C de temperatura protegidos de la humedad. El inculo debe tener una turbidez similar al 0.5 de la escala de McFarland, aproximadamente 108 UFC por ml y ser preparado en solucin salina estril o caldo de cultivo. Sensible (S) si el dimetro del halo es mayor a 15 mm Resistente (R) si el dimetro del halo es menor de 13 mm

Intermedio (R-S) si el dimetro del halo est comprendido entre 13 y 15 mm.

4.-PROCEDIMIENTO Antibitico: Amoxicilina Bacteria: Escherichia coli Placa: De agar (nnutriente) 4.1. Preparamos el inculo: De un cultivo puro tomamos con el asa de siembra colonias de la bacteria y lo disolvimos en el caldo de cultivo.

La turbidez es equivalente al estndar 0.5 de McFarland (100 ufc/ml). Disolvimos bacterias hasta encontrar esta turbidez:

4.2. Inoculamos la superficie de la placa de agar con el hisopo pasndola uniformemente por toda la superficie y lo dejamos 5 minutos.

4.3. Ponemos los discos.

4.4. Hicimos distintas soluciones antibiticas: 1:4, 1:8, 1:16

4.5. Colocamos con un gotero las diferentes concentraciones en diferentes discos, los 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a difundir los antibiticos.

4.6. Incubamos la placa en posicin invertida a 37C durante 24 horas.

5.-OBSERVACIONES:
A continuacin la imagen mostrada es despus de haberlo incubado por 24 horas.

Observamos que en el disco 1 se form un halo de mayor dimetro presisamente al disco 1 y 4 le agregamos la solucin antibitica de menor concentracin (1:16) A los discos 2 y 4 le agregamos las solucin antibitica 1:8 . Y al disco 3 le agregamos las solucin antibitica de mayor concentracin. Observamos que en el disco 5 se form un halo de dimetro igual a 11 mm pero en el interior del halo se observaron pequeas colonias. Adems de eso notamos que la incubacin tena un olor nauseabundo.

6.-RESULTADOS / DISCUSIONES Resultados: Sabamos que el orden de las concentraciones en los discos fue de la siguiente manera: Concentraciones de menor a mayor:

[] Disco 1 = []Disco 4 <[] Disco 2 =[] Disco 5 <[] Disco 3

Dimetros: Disco 1---> 34 mm Disco 4 --> imperceptible Disco 2 --> 16 mm Disco 5 --> 11 mm Disco 3 --> imperceptible Discusiones: Debido al tamao de los dimetros podemos ver si las bacterias son resistentes o no a los diferentes tipos de solucin antibiticos: Disco 1---> 34 mm > 15 mm --> Sensible Disco 4 --> imperceptible < 13 mm --> Resistente Disco 2 --> 16 mm > 15 mm --> Sensible Disco 5 --> 11 mm < 13 mm --> Resistente Disco 3 --> imperceptible < 13 mm --> Resistente La Escherichia coli es sensible al antibitico ya que no le permite crecer. Se pudo ver que en el disco que tiene la menor concentracin (Disco 1) de la solucin antibitica tiene el mayor radio de todos, significa que en ese disco las bacterias E. coli tuvieron un mayor efecto de resistencia a la solucin antibitica. El disco 5 tambien tena esa misma concentracin, pero el dimetro salio insignificante esto significa que no llego el hisopo con necesarias bacterias a la hora de la inoculacin.

Por lo tanto el tubo que tenia concentracin (1:16) cuya solucin se gote en el disco 1 es el tubo que mostr la CMI (Concentracin mnima inhibitoria) Esta nos indica que esta concentracin es la menor concentracin de nuestras diluciones de antibitico que provoca una inhibicin visible de la bacteria, dicho de otra manera, este tubo fue el que tuvo la menor concentracin diluida de antibitico en el que no se presentaba una turbidez presente en los tubos anteriores a l, lo que significa que no hubo crecimiento bacteriano visible. Corroboramos con la literatura de que el mtodo de dilucin en caldo nos da a conocer la CMI y la CMB (la menor concentracin de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana dada), ya que nuestra concentracin mnima inhibitoria fue de (1:16) del disco 4 y (1:4) del disco 3 y la CMB no la llegamos a conocer ya que este microorganismo es resistente a este antibitico al grado de no poder acabar con l.

Apareci un pequeo halo en el disco 5 aun siendo resistente, esto se debe a la alta concentracin (1:8) de antibitico en el medio inmediato al disco. Puede aparecer alguna colonia dentro de los

halos, esto se debe a mutaciones espontneas que hacen a algunas bacterias resistentes. Todo lo analizado es dentro de las 24 horas.
7.-CONCLUSIONES: Gracias a esta prctica aprendimos a realizar todo el procedimiento para conocer la sensibilidad de un microorganismo a algn medicamento determinado, realizando los procedimientos para encontrar la CMI y la CMB mediante los mtodos de dilucin en caldo y de difusin en agar. Tambin supimos que al utilizar el mtodo de dilucin en caldo encontramos tanto la CMI y la CMB y mediante la utilizacin de multidiscos solo sabemos a qu tipo de medicamentos es susceptible el microorganismo. Las placas deben colocarse invertidas en la incubadora de modo que la humedad o condensacin que se acumule en la placa no caiga sobre la superficie de agar tratada 8.-CUESTIONARIO: 8.1 Cul es la utilidad del antibiograma? En la instauracin de un tratamiento antibitico correcto al paciente. Es necesario conocer si el microorganismo responsable de la infeccin posee mecanismos que le confieran inmunidad frente a algn antibitico para no incluirlo como terapia. 8.2 Qu es la concentracin inhibitoria mnima (CIM)? Es la menor concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana dada. Qu significa la CIM para el mdico? Simplemente que debe lograr esa concentracin de antibitico en el sitio de la infeccin para que el desarrollo bacteriano sea potencialmente inhibido. Para esto ser necesaria la administracin de una mayor dosis, dado que otros factores como la unin del antibitico a protenas sricas, la presencia de inhibidores tisulares, etc.; pueden reducir la accin antimicrobiana.

8.3 Defina: bacteriostato y bacterisida. Bacteriostato: Es un Efecto que aunque no produce la muerte a una bacteria, impide su reproduccin; la bacteria envejece y muere sin dejar descendencia.. Estas sustancias son secretadas por los organismos como medios defensivos contra las bacterias. Bactericida: Es un efecto el cual produce la muerte de una bacteria . Estas sustancias son secretadas por los organismos como medios defensivos contra las bacterias. antimicrobianos de efecto lsico o ltico (Lisis) en las bacterias, provocan una reduccin en la poblacin bacteriana en el husped o en el uso de sensibilidad microbiana.

B.4 Qu es el radio de inhibicin? Es la zona alrededor de un disco de antibitico en un antibiograma en el que no se produce crecimiento bacteriano en una placa de agar inoculada con la bacteria. Es una medida de la potencia del antibitico frente a la bacteria.