Material disponvel no site http://www.ufsm.

br/larp Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou Thin Layer Chromatography (TLC)

Prof. Renato Zanella (UFSM)

A cromatografia em camada delgada outra forma de cromatografia onde o material adsorvente fica sobre um vidro, alumnio ou filme plstico.

A separao pode ser convenientemente expressa como um fator de retardo ou fator de reteno (Rf), definido como:

Rf A = dA/dS e Rf B = dB/dS

0 Rf 1

- Rf difcil de reproduzir pois depende de: natureza e granulometria do adsorvente natureza do eluente, grau de ativao, tcnica do operador, T e quantidade amostra. - Cmaras de eluio (tanque, sandwich, HPTLC); Preparo das placas - Avaliao qualitativa, Avaliao semi-quantitativa O exemplo de cromatografia mais clssico a cromatografia em papel onde uma amostra lquida flui por uma tira de papel adsorvente vertical. O papel composto por molculas extremamente longas chamadas celulose. A celulose um polmero polar com muitas regies de altas e baixas densidades de eltrons. A cromatografia em papel uma das tcnicas mais simples e que requerem menos instrumentos para realizao, porm tambm apresenta as maiores restries para realizao em termos analticos.

Aplicao

ou Eluio Resultado

Exemplos de aplicao:

Cromatograma de 10 leos essenciais. Placa revelada com vanilina.

CCD de clorofila

Pigmentos utilizados em tinta de marcador preto (A), amarelo (B) e vermelho (D) so os mesmos. Vamos investigar se a tinta do marcador verde (C) um corante s ou uma combinao.

CCD Bidimensional (Eluio efetuada em duas direes com solventes diferentes)

Revelao empregando derivatizao ps-cromatogrfica Se as substncias na placa no forem ativas em UV, a absorbncia ou fluorescncia pode ser gerada pela imerso ou spray de reagentes adequados, chamados reveladores. Imerso para derivatizao indicada para: Aumentar a reprodutibilidade em determinaes quantitativas Aumentar a proteo ambiental/higiene industrial Evitar contaminao do ambiente de trabalho

Revelao

Contraceptivos

1 = cholesterol 2 = beta-estradiol 3 = estrone

4 = estriol

7* = contraceptive 2 10 = alpha norgestrel 11 = cortisol

5 = diethyl stilbestrol 8 = progesterone 6* = contraceptive 1 9 = norethindrone

Rf values contraceptive 1 0.36, 0.25, 0.03

contraceptive 2 0.92, 0.35, 0.2, 0.02 cholesterol beta-estradiol estrone estriol diethyl stilbestrol progesterone norethindrone alpha-norgestrel cortisol 0.75 0.25 0.5 0.05 0.24 0 0.4 0.6 0

Based on a comparison of Rf values and colorimetric identification, I deduce that both unknown contraceptives contain norethindrone and beta-estradiol. Unfortunately, the progesterone, estriol, and cortisol standards did not give very clear marks on the silica gel paper.

Cromatografia de aminocidos em papel Na cromatografia em papel, por exemplo, a resoluo de uma mistura de solutos sobre um papel de filtro pode depender de uma variedade de fenmenos, tais como adsoro superfcie do papel, troca inica ou na partio entre solventes. Os aminocidos podem ser separados por cromatografia em papel devido a sua solubilidade que os diferentes tipos desta substncia apresentam pela gua de hidratao ao redor das fibras de celulose e pela fase orgnica mvel que flui atravs destas fibras. A solubilidade relativa dos aminocidos nestas duas fases pode ser mudada por alteraes na polaridade do solvente, ou no pH da soluo, o qual ir alterar o estado inico dos aminocidos. Sob um conjunto adequado de condies, ento, cada molcula de uma mistura ir se deslocar a uma diferente velocidade sobre a fase estacionria e estar a uma distncia especfica de um do ponto de origem, quando cessar o fluxo de solvente. Os aminocidos no absorverem luz no comprimento de onda visvel, assim a reao de ninhidrina usada para este propsito por que reage com grupamentos amino livres produzindo um composto colorido (usualmente prpura). Diversos aminocidos, contudo, produzem diversas tonalidades de cores com a ninhindrina, o que pode ajudar em sua identificao. A reao da ninhindrina com prolina, por exemplo, gera um composto amarelo e a reao com a tirosina produz uma colorao azul metlica.

CROMATOGRAFIA de ADSORO ....fenmeno de superfcie que ocorre na interfase, implicando interaces dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, pontes de hidrognio, complexos p FE: Adsorvente FM: Eluente

Slica: silanol SiO2.xH2O; Alumina: Al3+, 02Influenciada por: Natureza da FE Solubilidade substncias FM Capacidade adsoro na FE para cada substncia FE Inorgnicas: Slica Alumina cida, bsica ou neutra Poliamidas Sephadex Florisil FE Orgnicas: Celulose

Poder adsorvente das fases estacionrias

Poder adsorvente da silica (maior afinidade = maior reteno = menor Rf)

Polaridade dos solventes

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Efeito de Bordo = Saturao da Cmara Deficiente ou Excesso de amostra

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography Instrumental TLC usada para descrever uma tcnica moderna, instrumental e de alta performance, onde a avaliao feita atravs de equipamentos e software

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Princpio do Mtodo Separao de misturas de compostos moleculares atravs da migrao diferencial dos mesmos entre duas fases: uma fixa (ou estacionria) e outra mvel, que desliza sobre a primeira. Ou tambm pode ser expresso como um procedimento de separao microanaltico no qual os componentes de uma mistura so transportados para diferentes distncias em uma placa recoberta com uma fina camada de material poroso. A espessura da camada pode variar de 100 a 250 mm. A placa que serve de suporte em geral de vidro, mas pode ser de plstico ou de alumnio. A camada que recobre a placa recebe o nome de fase estacionria e em geral constituda de slica gel. O mecanismo de transporte um solvente e conhecido como fase mvel. Primeiro a amostra dissolvida em um solvente adequado, ento, uma certa alquota desta soluo aplicada na regio de partida e o conjunto seco. A placa de TLC/HLTPC ento colocada em uma cmara de desenvolvimento ou cuba, o qual contm o solvente. Inicia-se o que chamamos de desenvolvimento cromatogrfico onde os componentes da amostra so influenciados pela ao de duas foras, opostas entre si: Capilaridade: a responsvel pelo avano do solvente ou fase mvel sobre a fase estacionria que contm a amostra. Interao: to logo se inicia a migrao da fase mvel, a amostra dissolvida e comea a ser arrastada pela fase mvel. Neste momento aparecem foras de interao entre os componentes da amostra e a fase estacionria. Estas foras de interao se opem fora de arraste da fase

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mvel (capilaridade) retardando o avano dos componentes da amostra. Este retardo no ocorre da mesma forma para os diversos constituintes presentes na amostra aplicada. Foras de interao como dipolo induzido, pontes de hidrognio, foras de Van der Waals tomam parte neste processo, fazendo ocorrer mecanismos de separao como adsoro, disperso e troca inica.

Diferenas entre Placas de TLC e HPTLC Placas comercialmente j preparadas so mais indicadas pois garantem boa reprodutibilidade, devido homogeneidade da aplicao da fase estacionria no suporte. Na tabela abaixo esto as diferenas entre as placas TLC e HPTLC TLC Tamanho mdio de partculas Distribuio de partculas Espessura da placa Nmero mximo de amostras Distncia de migrao Tempo de migrao Quantidade de solvente Limite de deteco 10 15 m Larga 250 m 12 100 150 mm 30 200 min 50 mL Abs 100 1000 ng Fluor 1 100 ng HPTLC 5 7 m Estreita 100, 200 m 36 72 30 50 mm 3 20 min 5 10 mL Abs 10 100 ng Fluor 0,1 10 ng