Curado del plsmido en bacterias 1.

RESUMEN Los plsmidos son fragmentos extracromosmicos de ADN de doble cadena circular que tiene la capacidad de replicarse independientemente del cromosoma del husped, sin embargo, conviven con ella [1]. Hasta la fecha, muchas especies de bacterias aisladas de diversos hbitats se sabe que contienen ADN plsmido [2,3]. Algunos plsmidos son estables y pueden mantenerse a travs de sucesivas generaciones al ser partioned a cada clula hija durante la divisin celular. Esto permite que cada celular para recibir al menos una copia del plsmido. En los ltimos aos, los plsmidos se han observado en una amplia variedad de bacterias. En parte, esto se debe al desarrollo de nuevos procedimientos que permiten la deteccin, aislamiento y caracterizacin molecular del ADN del plsmido. Cuando se trabaja con algunas bacterias que contienen el plsmido, a menudo es deseable para obtener un derivado del plsmido curado. Esto permite una comparacin directa entre las clulas que contienen el plsmido y el plsmido curado. Algunos plsmidos someterse a la segregacin y eliminacin espontnea. Sin embargo, la mayora son extremadamente estables, y requieren el uso de agentes de curado u otros procedimientos (temperatura de crecimiento elevado, el hambre timina), para aumentar la frecuencia de la segregacin espontnea [4]. La utilidad de los agentes de curado es impredecible en muchas cepas bacterianas, ya que no existen protocolos estndar aplicable a todos los plsmidos. Sin embargo, existen algunos procedimientos que han dado buenos resultados con ciertas especies. Los objetivos de este manuscrito es un resumen y revisin plsmido agentes de curado y procedimientos. En vista de la importancia de los plsmidos en la especificacin de los antibiticos y la resistencia a metales; propiedades metablicas, patogenicidad, la especificidad del husped y la nodulacin (Rhizobium spp.), Las propiedades conyugales, y las propiedades de mantenimiento de la replicacin [2], los procedimientos reproducible para la obtencin de plsmido curado derivados son necesarios. 2. CURADO plsmido en bacterias Numerosas tcnicas utilizadas actualmente para curar el plsmido se resumen en la Tabla 1. Otros agentes de curado tambin sern discutidos en el texto de este manuscrito. Dado que muchos plsmidos no se puede curar (refractario), se debe mencionar que no subsanar un plsmido no implica que el rasgo no es codificada por plsmidos. Adems, la prdida del plsmido completo o un fragmento del plsmido puede ser demostrado por eleetrophoresis gel vertical u horizontal de agarosa de lisados celulares despejado, o cesio etidio cloruro de gradientes de bromuro. Para una descripcin de algunas tcnicas utilizadas para aislar los plsmidos, los artculos de Trevor [2], Kado y Liu [5], y Schleif Wensink [6], Maniatis et al. [7]; Meyers et al. [8], Bimboim y Doly [9], y Summerton et al. [10] se recomienda. Adems, Caro et al. [4] afirma que en ciertos organismos, incluso la prdida de un plsmido que puede no ser suficiente evidencia para concluir que el rasgo es codificada por plsmidos. Esto se debe a muchos plsmidos son capaces de integrarse en el cromosoma husped bacteriano. Si esto ocurre, el plsmido no se presente como una

circular cerrado covalentemente (CCC) molcula. Caro et al. [4] sugiere que los procedimientos sensibles, tales como transferencia de Southern de ADN total, seguido de hibridacin con una sonda especfica de plsmido, se utilizar para verificar la prdida fsica del plsmido. 2.1. Colorantes intercalantes Colorantes intercalantes como acriflavina, naranja de acridina, bromuro de etidio y quinacrina se han utilizado con xito en la curacin de las bacterias plasraids. Un procedimiento general ha sido esbozada por Caro et al. [4], y se presenta en la Tabla 2. Bsicamente, durante la noche (12 h) los cultivos se inoculan en caldo nutritivo (ajustado a pH 7,6) para dar 102 a 104 clulas / ml. Esterilizada por filtracin, naranja de acridina (u otro agente de curado adecuado), se aade en concentraciones de 1,0 a 100 ~ tg / ml. Las concentraciones depender del organismo y el agente de curado. El cultivo se incuba durante la noche en su temperatura ptima de crecimiento, y el frasco de cultivo o de tubo que contiene la mayor concentracin de agente de curado que todava permite el crecimiento bacteriano se utiliza como fuente de inculo para las clulas de revestimiento en placas de agar nutriente. Despus de crecimiento de las colonias, las colonias individuales son examinados para detectar la prdida del fenotipo bajo investigacin. En el caso de plsmidos codifican la resistencia a los antibiticos o de metal, esto se hace generalmente por la chapa de rplica o placas de parche colonias individuales de una placa de maestro a un agar selectivo y pruebas de sensibilidad a los antibiticos adecuados (s) o de metal (s) . Colonias sospechosas de la prdida de plsmido puede ser examinada por plsmidos usando la electroforesis en gel de agarosa. Carlton y Brown [11] inform de que la concentracin ms efectiva de un agente de curado en particular puede variar considerablemente, en el rango de 100 - a 1000 veces. Esto depende de la especie a tratar, la eficiencia de agente de curado, y el modo de ha utilizado con xito en la curacin de las bacterias plasraids. Un procedimiento general ha sido esbozada por Caro et al. [4], y se presenta en la Tabla. Esto depende de la especie a tratar, la eficacia del agente de curado, y el modo de la Tabla 2. Procedimiento generalizado de curado del plsmido (1) cultura de la noche, logartmica de crecimiento se utiliza para inocular una serie de frascos de cultivo o tubos de ensayo conteniendo caldo nutritivo o medio de crecimiento apropiado modificado con una gama de concentraciones de agente de curado. (2) Los cultivos se incuban durante la noche (o ms si es necesario) a la temperatura ptima de crecimiento o apropiado de otro modo para la cepa en particular se est investigando. (3) Cultura tubo o frasco mostrar turbidez observable y que contiene la mayor concentracin de agente de curado se utiliza para la placa de las diluciones en agar nutriente o medio similar. (4) Las colonias individuales pueden ser rplica chapada, o un parche chapado a un medio de agar selectivo para la deteccin de prdida de plsmidos codifican rasgos (por ejemplo, sensibilidad a los antibiticos o de metal) y / o colonias individuales pueden ser probados para la prdida del plsmido con un micro procedimiento de aislamiento del

plsmido [2]. la accin del agente de curado [11]. Por estas razones, es necesario utilizar un rango de concentraciones, especialmente cuando las bacterias aisladas son de origen ambiental y / o se sabe muy poco sobre el organismo de investigacin. Hohn y Korn [12] han utilizado con naranja de acridina para curar el plsmido F (F gala 'cI857) a partir de clulas de Escherichia coli. La prdida del fenotipo seguido cintica de primer orden, lo que sugiere que acridina produjo una inhibicin inmediata y completa de la replicacin del plsmido. Sin embargo, esto puede ser especie-dependiente y similares no se puede esperar con otros organismos. Salisbury et al. [13] tambin se utiliza para curar el naranja de acridina lac F 'a partir de E. coli K12. La eliminacin del factor F parece ser debido a la interferencia selectiva de la replicacin del plsmido, y se observa fcilmente en cultivos con crecimiento exponencial. Adems, el curado de acridina por lo general causa la prdida de todo el plsmido [13]. Acridina tambin ha sido utilizado con xito por otros investigadores para el curado del plsmido en E. coli [14-17]. Wechsler y Kline [15] tambin han identificado una regin del locus F-plsmido que determina la resistencia a la. naranja de acridina cura en ciertas bacterias. El bromuro de etidio se ha utilizado ampliamente para curar plsmidos en una amplia variedad de cepas bacterianas. En 1969, Bouanchaud et al. [18] se describe el uso de bromuro de etidio para eliminar plsmidos de enterobacterias resistentes a los antibiticos y los estafilococos. Curado por lo general se observ una alta frecuencia, y los resultados obtenidos fueron ms reproducible que con colorantes de acridina. Rubin y Rosenbaum [19] tambin curado con xito peni.cillinase plsmidos en cepas de Staphylococcus aureus con bromuro de etidio. Otros colorantes intercalantes de ADN, como acriflavina y quinacrina, tambin se han utilizado para la curacin de plsmido. Hahn y Ciak [16] han informado sobre el uso de la quinacrina como un agente de curado. Concentraciones subinhibitorias que van de 10 - 3 a 10 a 5 M eliminado lac F 'del plsmido de una cepa de E. coli. Hay situaciones donde el uso de tintes intercalantes, tales como la acridina y bromuro de etidio, no tienen xito. Por ejemplo, estos agentes no se cura plsmidos de gran tamao (> 250 MDa) se encuentran en Rhizobium y Agrobacterium spp. [20]. Adems, un 151 mercurio cepa resistente de Bacillus cereus [21] actualmente bajo investigacin en mi laboratorio no poda ser bromuro de etidio curado de sus plsmidos. 2.2. Coumermycin y novobiocina Ambos coumermycin y novobiocina son inhibidores de la girasa de ADN en las clulas intactas de E. coli [22]. ADN girasa cataliza negativo se convierte en superhelical de doble cadena de ADN cerrado, circular [21]. Caro et ai. [4] inform de que la curacin de ColE1 plsmidos de E. bobina K12C600 ocurri con las concentraciones coumermycin 1 a 7 / tg / ml, con un ptimo curado en 5 / ~ g / ml. Adems, estas concentraciones no reducir el nmero de clulas viables en un grado significativo. Novick [23] tambin ha informado sobre el uso de coumermycin en la curacin de algunos plsmidos S. aureus penicilinasa.

Las bajas concentraciones de coumermycin eliminado efectivamente los plsmidos; pBR 322, PMB9 y otros ColE1 plsmidos de E. coli K-12 cepas [24]. La accin de curado del antibitico parece involucrar a ms de inhibicin de la replicacin. Un lisado celular crudo de cloranfenicol tratados con las clulas que contienen el plsmido ColE1 se someti a electroforesis en gel de agarosa. La banda ColE1 plsmido que normalmente se encuentran en esta cepa no se ha encontrado si las clulas fueron tratadas con coumermycin. Parece como si coumermycin hace que el ADN plsmido que se resolviera simplemente causar una acumulacin de formas replicativas intermedias de ADN plsmido, que se degradan, y como resultado, la curacin [24]. 2.3. Rifampicina La rifampicina se une directamente a la molcula de ARN polimerasa, tanto en la bobina E. y S. aureus [25]. Este mecanismo de accin es muy diferente de los dos mecanismos de curado anteriormente. Johnston y Richmond [25] investig el aumento de la prdida de plsmidos de penicilinasa (COMI) de S. aureus en presencia de rifampicina. Este plsmido codifica la resistencia a la penicilina, los iones de cadmio y la eritromicina. La curacin ms eficaz se obtuvo cuando un inculo inicial de 105 organismos / ml fue empleado, y el agente de curado se utiliz en un 0,01 btg / ml. De las colonias negativas penicilinasa prueba, todos tenan tambin 152 perdieron su resistencia tanto a cadmio y eritromicina. Esto sugiere que la plasmidhad toda sido eliminado de la clula, en lugar de genes justthe penicilinasa. Los autores tambin sugirieron que debido a que la rifampicina ejerce un efecto diferencial sobre el crecimiento bacteriano y el mantenimiento del plsmido, una determinada molcula de ARN polimerasa o un grupo de molculas pueden estar implicados en la replicacin del plsmido y la segregacin a las clulas hijas en S. aureus [25]. Bazzicalupo y Tocchini Valentino [26] confirman que la rifampicina inhibe especficamente la ARN polimerasa mediante el uso de un mutante de E. coli que la RNA polimerasa resistente a este antibitico. Clulas que poseen esta resistencia no se curaron de plsmidos durante el tratamiento con rifampicina [26]. Observaciones similares fueron reportados por Riva et al. [27]. Adems, tambin encontraron que la curacin de las clulas que no contienen resistente a la ARN polimerasa, se produjo en condiciones muy similares a las requeridas para naranja de acridina curado (tamao de inculo de baja, 103 a 104 clulas / ml, medio de caldo de nutrientes, temperatura de incubacin no debe ser inferior 30 C). 2.4. La mitomicina C La mitomicina C debe su actividad inhibidora de la activacin metablica a travs de la reduccin a un hidroquinona correspondiente [28]. La hidroquinona sufre cambios y produce un intermediario reactivo que puede reaccionar con bases de purina [28]. Debido a este tipo de ataque nucleoflico, puede insertar alquilantes enlaces cruzados entre las dos hebras de ADN de doble cadena. Cualquier entrecruzamiento de ADN es suficiente para bloquear la transcripcin por la ARN polimerasa [28]. Rheinwald et al. [29] utilizado con xito la mitomicina C para curar plsmidos codifican genes que

especifican el alcanfor (CAM) de oxidacin en Pseudomonas putida. Concentraciones casi txica de mitomicina C en caldo L (triptona, extracto de levadura, y cloruro de sodio) se inocularon con aprox. 105 clulas / ml de un cultivo en fase estacionaria y se incubaron con agitacin durante 48 h. Cultureswere diluciones seriadas en solucin salina rplica, chapada en los medios de comunicacin completo, y luego colocadas en un medio mnimo o D-alcanfor placas de agar para seleccionar a las colonias individuales muestran la CAMphenotype [29]. 2.5. Dodecilsulfato de sodio Dodecil sulfato sdico (SDS) es capaz de curar ciertos plsmidos. Algunas clulas que contienen el plsmido se supone que son ms sensibles a la SDS por plsmidos especficos pili en su superficie celular [4]. Un mtodo para la curacin de la R (resistencia) y F (factor sexo) plsmidos en E. coli K-12 por el tratamiento SDS ha sido reportado por Tomoeda et al. [30]. Penassay caldo que contiene 10% de SDS se utiliza como medio de curacin. Hallazgos similares se han observado en S. aureus, con una concentracin de SDS relativamente bajo. S. aureus PC1 y 196E fueron cultivadas en un caldo de tripticasa de levadura-extracto de soja modificada con 0,002% de SDS, y mostr una 96,1 a 100% de prdida de la capacidad de producir penicilinasa ~. [31]. Al mismo tiempo, tanto el cadmio y el zinc se han perdido resistencia. Los autores sugirieron que el SDS fue un agente de curado ms eficaz que el crecimiento del cultivo a una temperatura elevada o el tratamiento con bromuro de etidio. 2.6. Temperatura de crecimiento elevado Elevada temperatura de incubacin (5-7 C por encima de la temperatura de crecimiento normal o ptima) puede ser empleado como un mtodo de curacin. Por ejemplo, las cepas que normalmente tienen una temperatura ptima de crecimiento de 37 C pueden ser incubadas a 43 C [11]. Un protocolo para el uso de esta tcnica de curacin se pueden encontrar en un captulo escrito por Carlton y Brown [11]. La cultura bajo investigacin se incuba a la temperatura elevada hasta llegar a la fase de registro tarde, momento en el que se diluye (1: 20) y reincuban a la temperatura elevada hasta finales de la fase de registro de crecimiento que se alcance de nuevo. Diluciones seriadas se preparan, y se colocaron para obtener colonias individuales que pueden ser probados individualmente por la prdida del rasgo plasmidencoded, y la ausencia fsica del plsmido mediante electroforesis en gel de agarosa [2]. Temperatura de crecimiento elevado se ha utilizado con xito para curar resistentes a la tetraciclina, penicilinasa-positivos cepas de S. aureus [32]. Las culturas se desarrollaron en 43-44 C para obtener clulas negativas tetraciclina sensibles y penicilinasa. Sin embargo, estas clulas no apareci hasta despus de varias generaciones de clulas a la temperatura elevada [32]. E. coli K-12 tambin ha sido curado de plsmidos F por un crecimiento elevado en 42-44 C. Esta temperatura tambin impidi el restablecimiento de los plsmidos en clulas de curarse si la cultura se le permiti llegar a miembros de la clula> 105/ml [331. 2. 7. Timina limitacin Limitacin de timina puede ser utilizado para curar la timina-que requieren auxtrofos. Caro et al. [4] inform de que se slo se ha empleado con E. coli, y ha resumido un

protocolo para su uso con este organismo. A medio mnimo que contena 50 # g / ml timina es inoculado con la cepa auxotrficos, y se incubaron durante la noche (12 h). Las clulas son aspticamente diluido en una serie de tubos que contienen el mismo medio y mnimo de las concentraciones de timidina entre 0-25 # g / ml. Despus de la incubacin durante la noche, diluciones en serie y la placa estn preparados DONTO timinacomplementado agar nutritivo [4]. Las colonias individuales pueden ser probados por la prdida del plsmido. Clowes et al. [34] y Pinney y Smith [35] han descrito curado timina hambre plsmido en E. coli K12. Este organismo contiene una 1818 R-Factor, que es refractaria a la cura de acridina y bromuro de etidio. Sin embargo, se cur con xito en los mutantes thymineless de este organismo en condiciones de hambre timina crecimiento [35]. Similares experimentos curado tambin se han descrito para los plsmidos Col en E. coli K12. 2.8. Formacin y regeneracin de protoplastos Se ha informado de que la eliminacin de ciertos plsmidos en el 80% de las clulas de S. aureus puede ocurrir durante la formacin y regeneracin de lysostaphin producidos protoplastos [36]. Se sugiri que la curacin de plsmido puede ocurrir durante las divisiones de protoplastos varios que tienen lugar antes de la regeneracin de las clulas de la pared. Curado se postula que se debe a una alteracin del mecanismo de fraccionamiento plsmido cuando la pared celular se ha eliminado. Este proceso de curado puede llegar a ser especialmente adecuado para bacterias Gram-positivas que son difciles de curar mediante otros procedimientos, sin embargo, son fciles de hacer en los protoplastos a travs de tratamiento de lisozima. 2. 9. Curado incompatibilidad plsmido Caro et al. [4] han comentado sobre el uso de la incompatibilidad de plsmido curado en su excelente captulo sobre el estudio de la replicacin del plsmido en vivo. El mtodo se basa en el hecho de que dos plsmidos similares no pueden existir de manera estable en la misma celda. Un incompatible plsmido se introduce en el organismo que est siendo curado, y la seleccin se mantiene para el nuevo plsmido durante el crecimiento del organismo. Las clulas que han perdido el primero (residente) plsmido se curan del plsmido introducido mediante la seleccin de las condiciones que conducen a su prdida. Esta tcnica requiere que los mutantes inestable o sensibles a la temperatura de los plsmidos estn disponibles que son similares a los residentes con el plsmido curado se [4]. Adems, el derivado del plsmido debe llevar un marcador selectivo que puede ser usado para distinguirlo del plsmido residente que est siendo curada. Otro requisito es que un procedimiento adecuado est disponible (conjugacin, transduccin, transformacin) para introducir el segundo plsmido en la clula. 3. Ejemplos especficos de plsmido agentes de curado Ejemplos especficos de agentes de curado del plsmido de las bacterias y las referencias correspondientes se presentan en la Tabla 3. A pesar de todos los agentes de curado del plsmido discutido en este manuscrito han sido "utilizados para aumentar la frecuencia de la prdida de plsmido, que slo son tiles contra algunos plsmidos. Por lo tanto, cuando inicialmente el trabajo con nuevos plsmidos y cepas bacterianas, una amplia variedad de mtodos de curacin puede tener que ser tratado antes de obtener un mtodo

satisfactorio. AGRADECIMIENTOS Esta investigacin fue financiada por una subvencin de funcionamiento de las Ciencias Naturales e Ingeniera de Investigacin de Canad. Sincero agradecimiento se expresa a B. McGavin para la preparacin del manuscrito y KM para Oddie por su ayuda en las bsquedas de la literatura. Tabla 2 Procedimiento generalizado de curado del plsmido (1) cultura de la noche, logartmica de crecimiento se utiliza para inocular una serie de frascos de cultivo o tubos de ensayo conteniendo caldo nutritivo o medio de crecimiento apropiado modificado con una gama de concentraciones de agente de curado. (2) Los cultivos se incuban durante la noche (o ms si es necesario) a la temperatura ptima de crecimiento o apropiado de otro modo para la cepa en particular se est investigando. (3) Cultura tubo o frasco mostrar turbidez observable y que contiene la mayor concentracin de agente de curado se utiliza a la placa de las diluciones en agar nutriente o medio similar. (4) Las colonias individuales pueden ser rplica chapada, o un parche chapado a un medio de agar selectivo para la deteccin de prdida de plsmidos codifican rasgos (por ejemplo, sensibilidad a los antibiticos o de metal) y / o colonias individuales pueden ser probados para la prdida del plsmido con un micro procedimiento de aislamiento del plsmido [2]. Disminucin de la resistencia a los antibiticos y la prdida del plsmido en el plsmido portador de cepas de Staphylococcus aureus tratado con cido ascrbico. Resumen El efecto del cido ascrbico en el plsmido con cdigo de resistencia a antibiticos en Staphylococcus aureus fue investigado. Varias cepas de S. aureus fueron cultivadas en presencia de ascorbato 1 mM durante 6 h. Este tratamiento indujo un aumento de la prdida de marcadores de resistencia en 4 de 6 cepas probadas, y geles de agarosa mostr esta desaparicin de ADN plsmido en ascorbato inducido por las colonias susceptibles. La presencia de ascorbato induce una disminucin del 50-75% en concentraciones mnimas inhibitorias de los diferentes antibiticos de cepas resistentes. Cuando se aade el ascorbato, las concentraciones antes subinhibitorias de la penicilina o tetraciclina tienen un mayor efecto inhibitorio sobre las cepas resistentes y llev incluso a la muerte del 25-93% de la poblacin inicial. Estos resultados sugieren que el ascorbato puede provocar la prdida de varios plsmidos de S. aureus, y que los niveles de resistencia a los antibiticos tambin se ven afectados por la presencia de este compuesto. L-cido ascrbico (vitamina C) se ha encontrado para ser capaz de modificar las propiedades del ADN (McCarty, 1945). El ascorbato puede inactivar los fagos varias induccin de roturas de cadena sencilla en su ADN (Murata y Kitagawa, 1973;. Murata et al, 1971, 1986), y puede inducir mltiples rupturas en los cromosomas de los mutantes deficientes en la reparacin de Escherichia coli (Van Sluys et al., 1986a). Este efecto se

atribuy inicialmente a la generacin de perxido de hidrgeno (H202) y / o radicales libres hidroxilo (HO -), pero esto no parece ser clara. E. coli xthA, un mutante H202hipersensibles (Demple et al., 1983), no es sensible al tratamiento con ascorbato (Van Sluys et al., 1986b). Una rotura sequencespecific despus del tratamiento con ascorbato, es poco probable que se generan aleatoriamente por los radicales de oxgeno, se ha observado en ADN del fago (Kobayashi et al., 1988). La mayora de las pruebas in vivo no detectan actividad mutagnica o cancergenos para el cido ascrbico (Douglas et al, 1984;. Norkus et al, 1983).. Parece que el ascorbato puede daar slo las molculas de ADN pequeos y sin proteccin, especialmente las formas covalentemente cerrado circular (ADNccc), que dependen para su replicacin y transcripcin eficiente en el mantenimiento de su estado superenrollado. Este laboratorio ha informado previamente a la eliminacin de plsmidos de penicilinasa de S. aureus despus de un tratamiento de 6 h con el ascorbato 1 mM (Amfibile-Cuevas, 1988). La posibilidad de que la eliminacin de los factores determinantes de la resistencia bacteriana puede ser de alguna ayuda en el control de la incidencia de resistencia a los medicamentos extracromosmico, como se ha sugerido (Bouanchaud y Chabbert, 1971; Hahn, 1976), nos ha inducido a examinar el alcance de esta prdida de la resistencia causada por el cido ascrbico. Hemos probado los efectos de este compuesto en varias plsmido portador de cepas resistentes de S. aureus, incluyendo cepas clnicas y cepas laboratoryconstructed, la resistencia a diferentes antibiticos, y en el caso de los plsmidos de penicilinasa, diferentes "familias" de los elementos extracromosmicos (Shalita et al., 1980). Creemos que un agente capaz de eliminar plsmidos de resistencia pueden ser tiles en el tratamiento de las enfermedades infecciosas con multi-resistentes a la etiologa, si se administra junto con un antibitico comn. Con el fin de determinar si un organismo resistente a los antibiticos puede ser inhibida por la presencia de cido ascrbico y un frmaco antimicrobiano, hemos expuesto estas cepas resistentes a la accin conjunta de ascorbato y los antibiticos. A pesar de ascorbato no se puede inducir la prdida de plsmidos en todas las cepas estudiadas, se encontr un aumento en la accin inhibitoria de los antibiticos en las cepas resistentes al ascorbato est presente. Material y mtodos Las cepas y los productos qumicos Las cepas de S. aureus utilizados se enumeran en la tabla 1. Cultivos lquidos se cultivaron en caldo infusin cerebro corazn (BHI) y los slidos en agar Muller-Hinton (ambos de Difco). L-cido ascrbico (Sigma) fue utilizado como la sal de sodio, el ajuste de 100 soluciones madre mM a un pH de 7,2 mediante la adicin de NaHCO3. Amikacina, penicilina, espectinomicina, tetraciclinas y tobramicina se obtuvieron de Laboratorios Bristol de M6xico, Lakeside Farmac6uticos, Upjohn, Rorer de M6xico, y Upjohn, respectivamente. Determinacin de la prdida del plsmido Tratamiento de ascorbato se realiz de la siguiente manera: inculos pequeos (106 clulas / ml) de cada cepa fueron cultivadas en BHI con o sin ascorbato 1 mM, durante 6 horas a 37 C con burbujeo de aire constante. Las muestras de estos cultivos fueron sembradas en placas de agar para obtener colonias aisladas. Los plsmidos fueron anotados por la presencia o ausencia de sus marcadores de resistencia, determinado por

toothpicking a los medios selectivos y no selectivos. Concentraciones selectiva fueron: 50 t ~ g / ml de amikacina, espectinomicina y tobramicina, usados por separado para las cepas DIM; 50 / ~ g / ml de tetraciclina, para la cepa RN2424, 0,1 # g / ml de penicilina de las cepas RN11 y RN794. Prdida del plsmido fue confirmada por electroforesis de agarosa al examen de ADN extracromosmico, realizado por el mtodo de Nahaie et al. (1984) con un 0,8% en geles de agarosa en una losa horizontal. Concentraciones inhibitorias mnimas Determinaciones de los PRM en la presencia o ausencia de cido ascrbico se realizaron mediante la tcnica de tubedilution, en BHI con o sin ascorbato 1 mM. Determinaciones preliminares fueron realizadas por diluciones de los antibiticos, y los rangos de la actividad se divide en 10 - # g aumenta. Las concentraciones ensayadas fueron: 40-100 # g / ml de tetraciclina y la penicilina ~ 40250 g / ml. Los tubos se incubaron a 37 C durante 12 h, y la inhibicin del crecimiento fue confirmada 'por la medida turbidimetra a 620 nm en un colormetro Corning 252. Culturas de los antibiticos y ~ o ascorbato El efecto del tratamiento simultneo con el ascorbato y concentraciones subinhibitorias de antibiticos se determin por el crecimiento de las clulas en BHI con 1 mM ascorbato y 50 # g / ml de tetraciclina para la cepa RN2424, de 40 # g / ml de penicilina para la cepa RN794, y 15 / / ~ ml de RNll cepa. Los cultivos se incubaron a 37 C con burbujeo de aire constante. Unidades formadoras de colonias (ufc / ml) se determin mediante la dilucin de las clulas adecuadamente, placas Resultados La prdida de plsmidos de resistencia debido a ascorbato ascorbato aumentado la incidencia de la prdida de resistencia en resistencia aminoglucsidos las cepas, y en una de las cepas resistentes a la penicilina, pi258 (pen r) y PT 181 (tet r) no se pueden eliminar mediante el tratamiento con 1 mM ascorbato. Una comparacin de la prdida espontnea e inducida ascorbato de marcadores de resistencia se muestra en la Tabla 2. La suma de los resultados de tres experimentos simultneos se muestra, estos valores son tpicos de 4 series de experimentos independientes. La desaparicin de ADN plsmido en la deteccin electrofortica de lisados crudos de las colonias de las drogas susceptibles ascorbateinduced confirma que la prdida de marcadores de resistencia es el resultado de la eliminacin de plsmidos de resistencia (Fig. 1). 10-20 colonias susceptibles de cada experimento y cada cepa fueron analizadas y todas las pantallas de la prdida de las bandas de plsmido. Reduccin de la CIM por la presencia de ascorbato La adicin de ascorbato 1 mM reduce la CIM de penicilina por 52 70 para la cepa RN11, y en un 75% de RN794. Tetraciclina MIC se redujo en un 50% de RN2424. Los valores en la Tabla 3 son de un experimento tpico, pero han sido reproducidos en al menos tres experimentos independientes. La inhibicin del crecimiento y muerte celular con antibiticos si se presenta una ascorbato mM ascorbato no se modifican el crecimiento de las cepas RNll, RN794, y RN2424. Sin embargo, la asociacin de las concentraciones de ascorbato y subinhibitorias de antibiticos puede inhibir el crecimiento de las poblaciones de bacterias,

e incluso provocar la muerte de 25, 93, y 89o70 del inculo inicial de RNll, RN794, y RN2424, respectivamente, mientras que los propios antibiticos slo inducen una tiempo de retraso (Fig. 2-4). Discusin L-cido ascrbico est involucrado en una amplia gama de actividades biolgicas, en especial contra los cidos nucleicos (Shamberger, 1984). Los presentes resultados sugieren que una variedad de plsmidos S. aureus son sensibles a la 'curar' efecto de ascorbato, el cual fue reportado previamente por el laboratorio (Amfibile-Cuevas, 1988). 4 de las 6 cepas estudiadas mostraron una prdida del fenotipo de resistencia cuando son tratados con el ascorbato que pueden atribuirse a la eliminacin de la codificacin del plsmido, como puede comprobarse por examen de electroforesis. En el caso de la RN2424, 1 mM ascorbato no induce la prdida de resistencia por parte de cualquier clula. Esta podra ser la consecuencia del nmero elevado de copias del plsmido pT181 (20-25), por lo que no se debe descartar la posibilidad de que el ascorbato podran inducir a la prdida de algunas de las copias, pero no de todos. El efecto bactericida de la asociacin de ascorbato y los antibiticos en las cepas resistentes, que pueden ser observados en las determinaciones de los PRM, as como en las curvas de crecimiento, podra ser la consecuencia de una variedad de eventos posibles: (a) la reduccin en el nmero de plsmidos dentro de la poblacin bacteriana, (b) la inhibicin de la expresin de determinantes de resistencia a la interferencia con la transcripcin del plsmido o por daos en el ADN del plsmido (por ejemplo, la conversin de ADNccc a ocDNA, previamente reportado como un efecto del ascorbato en el ADN circular ( Morgan et al, 1976));. o (c) un efecto sinrgico del ascorbato, que slo potencia la actividad antimicrobiana de los medicamentos. Creemos que la ltima posibilidad es poco probable, teniendo en cuenta que los dos antibiticos implicados, la penicilina y la tetraciclina, tienen objetivos muy diferentes celulares y mecanismos de accin. Adems, el efecto del ascorbato difieren en la magnitud en diferentes cepas de RN que slo se diferencian en su resistencia plsmidos. Por lo tanto, parece que el ascorbato acta a travs del plsmido, y no en la clula husped. Por otra parte, pases de ingresos medios para el anfitrin, sin plsmidos no ha cambiado debido a la presencia de ascorbato (no mostrado). Sin embargo, la prdida de plsmidos (Tabla 2) no parecen estar en correlacin con el efecto de la asociacin de ascorbato y los antibiticos, especialmente para la cepa RN2424. Ascorbato no elimin los plsmidos a partir de cualquier clula, pero redujo la CIM de tetraciclina a 50 7o y puede inducir la muerte de 89% de una poblacin original expuesto a una concentracin subinhibitorias del antibitico. Este podra ser el resultado de una reduccin en el nmero de copias del plsmido porque hay una dependencia de la dosis de genes de resistencia a este plsmido (Carleton et al, 1984;. Thomas, 1986). Aunque no hay evidencia de que la resistencia a la penicilina tiene el mismo comportamiento, los mecanismos de esta o similar puede ser propuesto, junto con una interferencia con la expresin de genes de plsmidos, como se mencion anteriormente. Ninguno de estos resultados dan ninguna indicacin sobre el mecanismo de accin del ascorbato en los plsmidos.

Pero parece poco probable que este podra ser el resultado de la generacin extracelular de radicales libres que entran en la clula y daar el ADN u otras structuresinvolved en la replicacin del plsmido o la estabilidad. Los radicales libres, en su caso, se debe generar muy cerca de ADN, tal vez incluso de un complejo de ADN-ascorbato, como se ha informado anteriormente (Jamaluddin et al., 1981). Dao del ADN inducido por el ascorbato parece haber dos intermediarios diferentes: (a) perxido de hidrgeno, producido durante la auto-oxidacin de ascorbato, el cual genera radicales hidroxilo, la especie radical ms reactivo que participan en el dao por el ascorbato de ADN del fago in vitro (Morgan et al,. 1976; Murata et al, 1986) y el cromosoma de E. coli en vivo (Van Sluys et al, 1986a),.., y (b) otros productos de la oxidacin de ascorbato, los radicales probablemente peroxi o alcoxilo de ascorbato, que pueden estar implicados en el secuencia especfica de dao de ADN del fago, a diferencia de la divisin uniforme causada por HO-(Kobayashi et al., 1988). Extracelular catalasa o tiourea impide la matanza de mutantes uvrArecA de E. coli por el ascorbato, lo que sugiere la participacin de H202 y HO " (Van Sluys et al., 1986a). Sin embargo, la concomitante ADN de cadena sencilla rotura inducida por el tratamiento con el ascorbato, el cual puede ser, al menos en parte, responsable de la muerte celular, no puede ser causada por H202 o sus productos, ya que el mutante xthA, que es hipersensible al perxido de hidrgeno, no es sensible al tratamiento de ascorbato / cobre (Van Sluys et al., 1986b). NGR-374 mutantes de S. aureus (Tam y Pattee, 1986), que tambin son hipersensibles a H202, no son sensibles a ascorbato (Am ~ ibile-Cuevas, resultados no publicados). Por otra parte, H202 s mismo no induce la prdida del plsmido en cualquiera de las cepas de S. aureus utilizada en este trabajo (Amfibile-Cuevas, resultados no publicados). Estos resultados sugieren que la H202 no est involucrado directamente como intermediario en el dao del ADN o en la prdida de plsmido por el cido ascrbico en el S. aureus. Tambin existe la posibilidad de que productos genotxicos de la peroxidacin lipdica de las componentes de la membrana puede actuar como intermediarios reactivos de la eliminacin del plsmido con el tratamiento ascorbato, como se ha propuesto para la mutagnesis radiacin (Petkau, 1980). El ascorbato puede promover la peroxidacin lipdica extensa en algunas preparaciones biolgicas, tales como los ensayos in vitro de enzimas de la membrana (Schaefer et al., 1975), o los ensayos de unin de los neurotransmisores a los receptores de membrana (Heikkila, 1984). Interaccin con las membranas de ascorbato tambin puede dar lugar a la distorsin de la arquitectura de la membrana, ya sea como consecuencia de la peroxidacin lipdica, o por otros mecanismos que no implican la generacin de radicales libres o la peroxidacin (Matsuda et al., 1990). Las membranas de otros compuestos que actan como SDS (Sonstein y Baldwin, 1972), y las fenotiazinas y la imipramina (Molnfir et al., 1982) tambin son capaces de eliminar los plsmidos bacterianos. Sin embargo, los plsmidos pi258 y pT181, que puede ser eliminado por la formacin de regeneracin de protoplastos (Novick et aI., 1980), no son susceptibles de ascotbate. La inestabilidad del plsmido durante la regeneracin de protoplastos se ha atribuido a la participacin de la envoltura celular en el mantenimiento del plsmido (Novick et al, 1980;. Gruss y Novick, 1986). Por lo tanto, cabra esperar

inicialmente estos plsmidos para ser eliminados por el tratamiento ascorbato, si el cido ascrbico altera la membrana celular, lo que no es el caso. Es necesario seguir trabajando para determinar el mecanismo por el cual el cido ascrbico acta. Agradecimientos Nos gustara expresar nuestra gratitud a Bruce Demple y Ludgar Mauricio por sus crticas y sus valiosos comentarios, RP Novick, PA Pattee, y B. Baca por su amable envo de cepas y de Isabel Niv6n por su excelente tcnica de asistencia. Movilizacin y transferencia de los cromosomas No todos los plsmidos son capaces de lograr esta transferencia a otra celda sin ayuda, los que pueden son conocidos como plsmidos conjugativos. En algunos casos, un plsmido conjugativo es capaz de promover la transferencia de (movilizar a) un segundo de lo contrario nonconjugative plsmido de la clula donante. Esto no sucede por casualidad y no todos los plsmidos no conjugativos pueden ser movilizados. A fin de comprender la movilizacin de los ColEI plsmido puede ser tomado como un ejemplo (ver Figura 5.3). Movilizacin involucra al gen multitud, que codifica una nucleasa especfica, y el sitio de bom ( oriT, el origen de la transferencia), donde la mafia nucleasa hace una muesca en el ADN. ColE1 tiene los genes necesarios para la transferencia de ADN, pero no lleva los genes necesarios para la formacin de apareamiento de pares. La presencia de otro (conjugacin) plsmido permite a los donantes para formar parejas de apareamiento con la clula receptora y ColE1 continuacin, puede utilizar su propia maquinaria para llevar a cabo la transferencia de ADN. Algunos plsmidos que pueden ser movilizados no tienen un gen multitud. La movilizacin de entonces depende de la capacidad de la mafia de la nucleasa plsmido conjugativo de reconocer el sitio naci en el plsmido que se moviliza. Esto slo funciona si los dos plsmidos estn estrechamente relacionados. Por otro lado, el sitio nacido es esencial para la movilizacin. Este es un factor importante en la modificacin gentica como la eliminacin del sitio naci de un vector plsmido se asegura de que los plsmidos modificados no pueden ser transferidos a otras cepas bacterianas (vase el captulo 8). En la mayora de los casos, el ADN que se transfiere desde el donante hasta el receptor consiste simplemente en una copia del plsmido. Sin embargo, algunos tipos de plsmidos pueden tambin promover la transferencia de ADN cromosmico. El primero de ellos por descubrir, y la ms conocida, es la F (fertilidad) del plsmido de E. coli, pero existen sistemas similares en otras especies, sobre todo por Pseudomonas aeruginosa. En algunos casos, como se describe ms adelante, esto implica la integracin del plsmido conjugativo en el cromosoma de los donantes (de modo que el cromosoma es, en efecto transferidos como parte del plsmido). Sin embargo, en muchos casos, la transferencia cromosmica se produce sin ningn tipo de asociacin estable con el plsmido, posiblemente por un mecanismo anlogo a la movilizacin de un plsmido no conjugativo. Cuando un plsmido se transfiere de una clula a otra por conjugacin, el plsmido completo se transfiere. Por el contrario, la transferencia de los cromosomas no se trata de

una copia completa del cromosoma intacto. Una razn para esto es el tiempo requerido para la transferencia. El proceso es menos eficiente que la replicacin normal del ADN y la transferencia del cromosoma entero tomara cerca de 100 min (en E. coli). La pareja de apareamiento muy rara vez se mantiene junto todo este tiempo. Por el contrario, un plsmido de decir 40 kb es equivalente al 1 por ciento de la longitud del cromosoma, - por lo tanto la transferencia del plsmido se espera que est terminado en 1 min. La transferencia incompleta del ADN cromosmico significa que no constituye un replicn intacto en la clula receptora. Para este fragmento para ser replicado y heredado debe recombinarse con el cromosoma del husped, por lo general reemplazar los genes receptores correspondientes en el proceso.