Anlise HPLC simultnea de aminas biognicas, Amino cidos, e on amnio como derivados Aminoenone em Vinho e amostras de cerveja Um mtodo

foi desenvolvido para a anlise simultnea de aminas biognicas, aminocidos e o on amnio em vinho e cerveja. Aminoenones formado pela reao de aminocidos, biognicas aminas, e os ons de amnio com o reagente de derivatizao dietil ethoxymethylenemalonate so separados por HPLC. Reao ocorre em meio alcalino e de metanol por 30 min em um ultra-som banho. Aquecimento adicional a 70 C por 2 h produz uma completa degradao do reagente de derivatizao excesso e seus derivados. Comparao dos resultados de anlise de amnio e anlise enzimtica mostrou uma boa correlao (r) 0,953). O mtodo analtico proposto tem as seguintes vantagens: fcil derivatizao de vinhos e cervejas; quantificao de 24 aminocidos, nove aminas biognicas, e o on amnio em uma nica injeo, a utilizao do detector de arranjo de diodos, degradao completa de limites de deteco abaixo de 0,40 mg / L de; reagente de derivatizao excesso durante a preparao da amostra aminocidos e abaixo 0,06 mg / L de aminas biognicas. PALAVRAS-CHAVE: aminas biognicas, aminocidos, ons de amnio; ethoxymethylenemalonate etlico; vinho; cerveja; HPLC. INTRODUO Aminocidos e os ons de amnio so de crescimento essenciais fatores para a boa execuo e desenvolvimento de leveduras e ltico bactrias do cido durante o curso de bebidas alcolicas e malolctica fermentao, respectivamente (1, 2). Algumas aminas biognicas forma em quantidades variveis em vinhos pela descarboxilao de seu aminocidos precursores devido ao de leveduras durante a fermentao alcolica, bactrias do cido lctico durante malolctica fermentao, ou outros microorganismos contaminantes (3). Como em vinho, aminas biognicas esto presentes tambm em outros fermentados alimentos ou bebidas, como queijo e cerveja. Alguns destes aminas, como a histamina, tiramina e feniletilamina, so nocivos para a sade, causando indivduos sensveis a sofrer nuseas, dores de cabea e distrbios respiratrios, especialmente quando acompanhado de lcool e acetaldedo (4).

Por esta razo, apesar do fato de que nenhum mtodo oficial foi desenvolvido ainda para a sua anlise, alguns pases tm estabelecido legal ou limites recomendados para as concentraes de histamina em vinho. A concentrao final dos compostos no vinho anterior varia de acordo com uma srie de fatores, incluindo a variedade de uva e raiz de aes, nitrogenados fertilizante, temporada, maturao, e prticas enolgicas. Por exemplo, alguns autores tm utilizado composio de aminocidos e aminas biognicas ou a combinao de ambos com a composio de polifenis, cidos orgnicos, ou compostos volteis como um mtodo para diferenciar a uva variedades utilizadas para produzir o vinho (5-9), sua situao geogrfica origem (7-9), o vintage (7-8), ou a autenticidade de alguns vinhos licorosos elaborados a partir de uvas botritizados (6, 10). A anlise dessas duas importantes famlias de compostos da frao nitrogenada difcil devido s suas diferentes estruturas ea ausncia de um cromforo especficas e, portanto, eles so normalmente derivatizados usando diferentes compostos qumicos para melhorar os limites de deteco e para evitar interferncias da matriz. comum para analisar aminas biognicas e aminocidos separadamente por HPLC aps a pr-ou ps-coluna derivatizao: como derivados fluorescentes com o-phthaldialdehyde (OPA), embora o principal cido amino em vinho, prolina, no reage neste caso (6), ou com 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamato (AQC) (11), ou atravs da formao de forte absoro de UV-vis derivados com ninidrina (8) ou cloreto de dansyl (12). Alguns mtodos recentes tm sido publicados que permitem a articulao A anlise de aminocidos e aminas biognicas em vinho. No entanto, apesar de suas vantagens esperadas mais de anlise separada destes duas famlias de compostos, eles ainda tm algumas limitaes. Por exemplo, Lozanov et al. (13) desenvolveu um mtodo de HPLC capaz de separar e quantificar 20 aminocidos e quatro poliaminas aps derivatizao com N-(9-fluorenylmethoxycarbonyloxy) succinimide (Fmoc-Su), no entanto, o excesso reagente e seu produto de hidrlise (Fmoc-OH) ainda esto presentes como picos maioria no cromatograma, e o mtodo que no determinar a histamina aromticos e aminas biognicas tiramina, que so os mais importantes, dado os seus efeitos para sade do consumidor, ou C-aminobutrico (GABA), uma caracterstica aminocido nas uvas. Outra anlise simultnea com base na derivatizao OPA quantifica 20 aminocidos e 17 aminas, mas o reagente no serve para determinar prolina, quantitativamente o cido amino mais importantes na uva e do vinho (14). Um terceiro mtodo exige OPA simultnea dual / Fmoc derivatizao e tambm usa um detector de fluorescncia (15). O presente trabalho relata o desenvolvimento de um novo mtodo para a anlise simultnea de aminas biognicas, aminocidos e on amnio em vinhos e cervejas. baseado em um mtodo que foi inicialmente desenvolvido para a anlise de hidrolisados de protena (16, 17) e outras amostras biolgicas (18) e, posteriormente, utilizado para

analisar aminocidos livres em alimentos (19, 20), mas nunca tinha at ento sido utilizado para analisar aminas biognicas. Ele consiste em reversedphase separao por HPLC e UV-vis a deteco da aminoenones formado pela reao de aminocidos, biognicas aminas, e on amnio com o reagente de derivatizao dietil ethoxymethylenemalonate (DEEMM).

MATERIAIS E MTODOS Reagentes: Super-gradiente de acetonitrila grau HPLC e metanol foram obtidos a partir Labscan (Dublin, Irlanda) e gua ultrapura gerado pelo sistema Milli-Q Millipore (Bedford, MA) foi utilizado. L-Cistena, L-leucina, L-fenilalanina, L-lisina, cloreto de amnio, L-histidina sulfato, agmatina, cadaverina, L-arginina, a histamina, L-prolina, LR-alanina, espermidina, glicina, -alanina, L-cido asprtico, cido L-glutmico, L-tirosina, L-valina e L-serina eram de Fluka Chemie (Buchs, Sua); isoamylamine, diethylethoxymethylenemalonate (DEEMM), putrescina, L-glutamina, tiramina, e trans-4hidroxi-L-prolina foram de Aldrich Chemie (Steinhein, Alemanha); L-2-Aminoadpico, cido L-ornitina monocloridrato, L-triptofano, L-asparagina, L-treonina, cido -aminobutrico (GABA), L-isoleucina, L-metionina, feniletilamina, e azida de sdio eram da Sigma Chemie (Steinhein, Alemanha). Solues de aminocidos e biognicas aminas foram preparadas com HCl 0,1 N. Materiais: Vinte e oito vinhos tintos e 14 vinhos brancos a partir do 2005 colheita foram gentilmente fornecidos por 10 vincolas diferente do Regio espanhola de Castilla-La Mancha. Cerveja foi comprada em uma loja loja. Determinao enzimtica de on amnio: Amnia foi determinada com um kit enzimtico para determinao de uria e ons de amnio nos alimentos da Boehringer Mannhein / R-Biopharm (Darmstadt, Alemanha). Amostras de vinho foram previamente tratados com polivinilpolipirrolidona (PVPP) para evitar a interferncia dos taninos conforme especificado pelo fabricante. Reao de derivatizao: Aminoenone derivados foram obtidos pela reao de 1,75 mL de tampo borato 1 M (pH) 9), 750 de IL metanol, 1 mL de amostra-alvo, sem qualquer pr-tratamento, 20 de IL padro interno (L-2-Aminoadpico cido, 1 g / L), e 30 de IL DEEMM num tubo de ensaio com tampa de rosca mais de 30 min em banho de ultrasom. A amostra foi, ento, aquecido a 70 C por 2 horas para permitir que a degradao completa do DEEMM excesso e subprodutos reagente. Anlise de HPLC: As anlises foram realizadas em um ProStar Varian HPLC (Varian Inc., Walnut Creek, CA), compreendendo um ProStar 240 bomba ternria, um ProStar 410 amostrador automtico, e um conjunto ProStar 330

detector fotodiodo. Separao cromatogrfica foi realizada em um HPLC ACE coluna de tamanho de partculas (5 C18-HL) 5 im (250 mm? 4,6 mm) thermostatized a 16 C em um forno MFE-01 (Ana'lisis V'nicos, Tomelloso, Espanha), atravs do gradiente binrio mostrado na Tabela 1 (fase A, 25 mM pH tampo acetato) 5.8 com azida de sdio 0,02%; fase B, 80:20 mistura de acetonitrila e metanol) e uma taxa de fluxo de 0,9 mL / min. Para a deteco, um detector de arranjo de diodos monitorados em 280, 269,e 300 nm foi utilizado. Nas condies propostas, 34 foram compostos separados, identificados e quantificados em uma nica injeo: 24 amino cidos (mais o padro interno), o on amnio, e nove biognicas aminas. Os compostos alvo foram identificados de acordo com a reteno vezes e UV-vis caractersticas espectrais dos derivados do padres correspondentes e foram quantificados utilizando o padro interno mtodo. Limites de deteco foram calculados de acordo com o Oeno OIV 7 / 2000 (21) como mtodo de 3 vezes a linha de base de rudo. Anlise estatstica. Anlise estatstica foi realizada usando SPSS 12 software de estatstica (SPSS Inc., Chicago, IL).
Table 1. Eluent Gradient for HPLC Determination of Aminoenone

Derivatives of Amino Acids, Biogenic Amines, and Ammonium Ion

time (min) eluent A (%) eluent B (%) 0.0 20.0 30.5 90 90 83 10 10 17 33.5 65.0 73.0 78.0 82.0 85.0 83 60 28 18 0 0 17 40 72 82 100 100

RESULTADOS E DISCUSSO Desenvolvimento de mtodo: Com base em um mtodo original projetado para a anlise de apenas aminocidos livres (19, 20), que desenvolveu um novo mtodo que melhora a separao de aminocidos e nos permitiu estender a anlise a outros nitrogenados compostos. A asparagina e aminocidos serina, que coeluted no mtodo original, foram separadas com sucesso, e um novo composto, hidroxiprolina, tambm foi introduzido com os aminocidos analisados. Ao mesmo tempo, mais mudanas eram necessrios para separar os derivados aminoenone de nove aminas biognicas no cromatograma mesmo. Para fazer isso, foi necessrias para estender o tempo de execuo de 40 cromatogrfica a 85 min e tambm para mudar a composio do mvel fase B, que atua como um modificador orgnico, 100% acetonitrila a uma mistura de 80% acetonitrila e metanol 20%. Com o mtodo analtico desenvolvido cromatogrfica, corrigir separao de 24 aminocidos, nove aminas biognicas, e on amnio foi alcanado com sucesso (Figura 1). O comprimentos de onda mximo de absoro no UV do aminoenone derivados de aminocidos, aminas biognicas, e amnio ion foram encontrados entre 269 nm (aminoenone do amnio ion) e 292 nm (aminoenones de prolina e hidroxiprolina), e os comprimentos de onda de absoro mxima foram intermedirios 279-284 nm (aminoenones dos cidos amino primrio), 277 -

278 nm

nm (aminoenones de lisina e ornitina) e 278-280 (aminoenones das poliaminas ou aminas biognicas). Com base nestes dados, foram selecionados 280 nm como o comprimento de onda para quantificar todas as aminas biognicas ea maioria dos amino cidos, com exceo da asparagina, serina, e hidroxiprolina (Picos de 3, 4 e 5), como mostrado na Figura 1, esses apresentado uma melhor separao em 300 nm j que apenas hidroxiprolina apareceu como um ombro de serina no cromatograma registrado em 280 nm. O on amnio tambm poderia ter sido quantificados a 280 nm, mas decidiu-se usar a resposta de 269 nm para aumentar a intensidade do seu sinal. Este procedimento analtico tem vrias vantagens sobre o mtodos relatados na literatura para anlise simultnea de aminocidos e aminas biognicas (13-15). Uma caracterstica importante comum a todos esses outros mtodos o uso de fluorescentes derivatizing agentes, o que requer equipamento HPLC com este tipo de detector. No entanto, os derivados aminoenone formado pela reao com DEEMM pode ser detectado com um fotodiodo detector de arranjo e tambm com um detector ultravioleta, as duas mais detectores comuns em equipamento HPLC. Alguns ultravioleta detectores pode ser definida em deteco simultnea vrias ondas comprimentos, mas, se isso no for possvel, a quantificao pode ser realizada a 280 nm, bem como, embora, nesse caso, h uma probabilidade de erro considervel na quantificao de hidroxiprolina. Comparao com o procedimento analtico desenvolvido por Herbert et al. (15), o nosso mtodo resolveu o mesmo nmero de compostos em uma anlise em tempo muito mais curto (85 min em vez de 135 min) e tambm foi mais reprodutvel e preciso. No que respeita ao mtodo proposto por Kutla'n e Molna'r-Perl (14), o nosso mtodo nos permitiu quantificar prolina, o mais abundante aminocido livre na uva e do vinho, e tambm hidroxiprolina, que no reagiu com o agente derivatizing utilizados por eles. Quando comparado com o mtodo desenvolvido por Lozanov et al. (13), a vantagem do nosso mtodo que ele nos permitiu determinar histamina e tiramina, o mais importante aromticas aminas biognicas dado os seus efeitos sobre sade do consumidor, e C-aminobutrico, um aminocido caracterstica das uvas. A Tabela 2 mostra os comprimentos de onda de quantificao, a calibrao linear intervalo, os coeficientes de r2, coeficientes de variao obtidos em a anlise de 10 amostras consecutivas, e os limites de deteco. As curvas de calibrao com os padres comerciais foram plotados, cobrindo a faixa de concentraes normalmente presentes em produtos enolgicos. Estes produziram coeficientes de regresso (r2) acima 0,995 em quase todos os casos, com exceo de hidroxiprolina, prolina, metionina e cadaverina, indicando excelente linearidade da resposta dos derivados.

O teste de repetibilidade do mtodo consiste em consecutivos anlise de 10 rplicas de uma mistura padro e 10 rplicas de um vinho tinto produzido com uvas Cencibel. Todos os resultantes coeficientes de variao foram inferiores a 5% (ou seja, dentro normalmente limites aceitveis). Os limites de deteco para os aminocidos foram abaixo de 0,1 mg / L, com exceo de cido asprtico, asparagina, serina, histidina, hidroxiprolina e prolina, para que os limites foram abaixo de 0,4 mg / L. No caso do aminas biognicas analisados, os limites de deteco ficaram abaixo de 0,06 mg / L em todos os casos. Estes limites foram menores do que o exigido para as aplicaes propostas e, ao mesmo tempo semelhante, ou abaixo, aos relatados na literatura (13-15). Recuperao do mtodo analtico tambm foi estudada pela adio trs quantidades crescentes de cada composto alvo para um vinho tinto para cobrir o intervalo esperado de concentraes e, em seguida, analisar cada um em triplicata. Os resultados so apresentados na Tabela 3, o recuperaes mdias foram entre 95 e 103%, excepto nos casos de arginina e putrescina, que foram 94 e 90%, respectivamente. Para determinar se o mtodo desenvolvido neste estudo poderia ser aplicada a outros alimentos fermentados, decidimos realizao do estudo de recuperao em cerveja. Os dados da Tabela 3 mostram que o procedimento analtico pode ser aplicado cerveja desde o resultados foram to bons ou melhores do que os alcanados no vinho. As recuperaes no caso de cerveja variou de 95% dos metionina a 105% de lisina. No caso do on de amnio, os resultados do HPLC anlise de seus derivados aminoenone tambm foram comparados com os obtidos com um kit enzimtico. Para este fim, contedo de amnio em 28 vinhos tintos produzidos com Cencibel uvas foram analisados utilizando ambos os mtodos. A Figura 4 mostra o alta correlao (r) 0,9529, p <0,0001) entre os resultados alcanada com ambos os mtodos. Estudo da Estabilidade de Derivados Aminoenone. Para determinar a estabilidade dos derivados, a mesma amostra foi analisada em triplicado no momento da preparao, dias aps a 1, 2 e 4 e aps 1 e 4 semanas. A Figura 2 mostra as variaes na concentraes de trs aminocidos e duas aminas ao longo do tempo, a ttulo de exemplo. Como pode ser visto, na maioria dos casos, os compostos produzidos pela reao de derivatizao foram perfeitamente estvel, pelo menos durante a primeira semana. O observado diferenas entre a primeira ea ltima anlise no normalmente ser superior a 0,1 mg / L e foram abaixo de 0,2 mg / L no caso de histidina, glicina, arginina e putrescina. Os compostos apenas que no eram estveis ao longo do tempo nas condies de reao foram prolina e hidroxiprolina, da, para que estes possam ser quantificados, a anlise teria que ser realizada no prazo de 24 h da reao de derivatizao.

Os derivados aminoenone de prolina e hidroxiprolina eram menos estveis, devido natureza do grupo amino secundrio destes dois compostos. Formao do derivado aminoenone implica a substituio do grupo etoxi em DEEMM pela grupo amino (Figura 3a). Se o grupo amino envolvidos no reao primrio (R-NH2), como ocorre na maioria dos aminocidos e aminas biognicas, o aminoenone resultante particularmente estabilizado pela formao de uma ponte de hidrognio entre as hidrognio amino livres eo oxignio de um dos carbonila grupos do reagente derivatizing (Figura 3b). Este hidrognio ponte permite que o grupo aminoenone adotar uma planar arranjo que facilita o equilbrio de amino-imino tautomerismo, resultando em um vnculo mais forte no NC aminoenone uma vez que existe um certo grau de ligao dupla. No caso de prolina e hidroxiprolina, a ponte de hidrognio no pode ser formado no aminoenone resultantes, porque no h livre hidrognio ligado ao nitrognio. Consequentemente, a ligaes simples (NC e CC) do sistema aminoenone, sem a caractersticas das ligaes duplas, que pode girar livremente (Figura 3c). Desde que o sistema aminoenone nos casos de prolina e hidroxiprolina foi incapaz de adotar uma planar preferencial arranjo, a ligao N-C foi mais fraco. A falta de planaridade tambm significava que os coeficientes de absoro molar da prolina e aminoenones hidroxiprolina foram substancialmente mais baixos do que os correspondentes aminoenones derivados da produo primria aminas, que tambm explica o fato de que seus cromatogrfica picos foram proporcionalmente menos intenso do que o esperado de seus de concentrao. Anlise de amostras de vinho. Como uma aplicao especfica do mtodo proposto, 18 vinhos tintos produzidos com uvas Cencibel foram analisados aps a concluso da fermentao malolctica, e 14 vinhos brancos produzidos com uvas Aire'n foram analisadas como tambm. Todos os vinhos eram da safra 2005 e foram obtidos de vincolas na regio de Castilla-La Mancha (Espanha). A Tabela 4 mostra os resultados mdios para os vinhos tintos e brancos. O primeiro aspecto digno de nota foi a enorme variao entre os diferentes vinhos tintos e brancos, como revelado pela valores de desvio padro de aminocidos e aminas biognicas. O aminocido mais abundante em ambos os tipos de vinho foi prolina, com concentraes que variam de 1.100-1.800 mg / L e 590-1010 mg / L em vinhos tintos e brancos, respectivamente. Os cidos aminados prxima em ordem de abundncia foram R-alanina, arginina, GABA e cido glutmico, juntamente com ornitina em vinhos tintos e lisina nos vinhos brancos. Todos os outros aminocidos foram presentes em quantidades significa que no deve exceder 20 mg / L no caso dos vinhos tintos e 15 mg / L nos vinhos brancos. Tambm interessante notar que os vinhos tintos exibido maior mdia amino cido contedo. Esta diferena foi provavelmente devido a macerao com casca da uva durante a fermentao alcolica em

o caso dos vinhos tintos para extrair a sua cor caracterstica (22). Alm disso, as concentraes de aminas biognicas foram maiores em vermelho vinhos; esta diferena foi provavelmente devido ao malolctica fermentao de vinhos tintos seguintes fermentao alcolica (3). Conforme relatado na literatura (9, 23, 24), a principal amina biognica em ambos os tipos de vinho foi putrescina, seguido em termos de abundncia pela histamina, espermidina, cadaverina, tiramina e agmatina. As aminas biognicas minoria, presentes em concentraes perto de seus limites de deteco, foram triptamina, feniletilamina, e isoamylamine. No caso de histamina, o aminas biognicas principais do ponto de vista dos efeitos sobre sade humana, os valores mdios nos vinhos tintos foram abaixo o limite considerado para a produo de efeitos adversos (4) e apenas excedeu 10 mg / L em um dos vinhos. Vinhos brancos no a fermentao malolctica, e, portanto, as concentraes deste aminas biognicas foram muito inferiores, o mximo valor a ser 0,67 mg / L nos vinhos brancos estudaram aqui.