163 Malaria

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE MALARIA
Serie de Normas Tcnicas N 39 Lima - 2003
Serie de Normas Tcnicas N 39 Lima - 2003
MINISTERIO DE SALUD Ministro Dr. lvaro Vidal Rivadeneyra Viceministro Econ. Carlos Rodrguez Cervantes
Subcomit Editor
Presidente Dra. Ada Palacios Ramrez
Secretario tcnico Dr. Csar Cabezas Snchez INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jefe Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga Subjefe Dra. Ada Cecilia Palacios Ramrez Centro Nacional de Salud Pblica Dra. Susana Zurita Macalup Directora General Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin Dr. Napolen Chvez Villanueva Director General Centro Nacional de Control de Calidad Dra. Rosa Guevara Ormeo Directora General Centro Nacional de Productos Biolgicos Q.F. Ricardo Valera Snchez Director General
Miembros Q.F. Zulema Arvalo Chong Dr. Jorge Barnaby Rodrguez Dr. Zuo Burstein Alva Lic. Ivn Gmez-Snchez Prieto Dr. Alfredo Guilln Oneeglio Dr. Csar Nquira Velarde Q.F Rosa Mendoza Yanavilca Dra. Frine Samalvides Cuba Dr. Vctor Surez Moreno
Editor Dr. Leonid Lecca Garca
Asistente Editorial Lic. Daniel Crdenas Rojas
Centro Nacional de Salud Intercultural Dr. Carlos del guila Campos Director General
Secretaria Srta. Roco Sols Agurto
Centro Nacional de Salud Ocupacional y Proteccin del Ambiente Para la Salud Dr. Enrique P. Swayne Daz Director General
Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica Volumen 19 Nmero 4 octubre diciembre 2002 La Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica es una publicacin trimestral del Instituto Nacional de Salud que estimula la divulgacin de trabajos tericos o aportes prcticos desarrollados por tcnicos y cientficos, promueve el avance y la aplicacin de la investigacin y experiencia cientfica en salud Los artculos firmados no expresan necesariamente la opinin de la revista, siendo los autores responsables de los criterios por ellos emitidos. Todos lo derechos quedan reservados por el Instituto Nacional de Salud. Cualquier publicacin, difusin y/o distribucin de la informacin presentada queda autorizada siempre que se cite la fuente de origen. Copyright octubre diciembre 2002 INS-PER Cartula: Frontis del local central del Instituto Nacional de Salud 1726-4634 Versin impresa Direccin: Instituto Nacional de Salud Cpac Yupanqui 1400. Lima 11, Per. Telf.: (051-1)471-9920 Anexo 162 E-mail: revmedex@ins.gob.pe Pgina web: www.ins.gob.pe Editor: Dr. Leonid Lecca Garca E-mail: llecca@ins.gob.pe Depsito Legal 2000-2856
ARTES & DISEOS LASER S.R.LTDA. Calle Las Turquesas 263-265-269 - Balconcillo - Lima 13 Telfono: 265-8320 Telefax: 266-0075 e-mail: artesydisenoslaser@hotmail.com
MPR-CNSP-017
Instituto Nacional de Salud
Manual de Procedimientos de Laboratorio para el Diagnstico de Malaria
ELABORACIN: Blga. Sonia C. Gutierrez Gonzles Blga. Nancy Arrspide Velasco Laboratorio de Malaria Divisin de Parasitologa Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud Lima - Per
MPR - CNSP - 017
CONSULTORES: Dr. Wilmer Marquio Quesada Laboratorio de Malaria Instituto Nacional de Salud Dr. Trenton K. Ruebush II Centro de Control de Enfermedades Infecciosas: CDC - Atlanta-USA
AGRADECIMIENTO: Lic. T.M. Maritza N. Puray Chvez Tc. Lab. Luz Mendizbal Alvarez Laboratorio de Malaria Instituto Nacional de Salud DEDICATORIA: A la memoria de nuestra compaera de trabajo T.M. Blanca Pardav Lugo.
Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin del INS

Gutierrez Gonzles, Sonia C. y Arrspide Velasco, Nancy Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnstico de malaria / Elaborado por Sonia C. Gutierrez Gonzles y Nancy Arrspide Velasco. Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2003. 100 p. : 30 cm. (Serie de Normas Tcnicas; 39)
1. MALARIA /diagnstico 2. MALARIA /inmunologa 3. MALARIA /parasitologa 4. PLASMODIUM FALCIPARUM /aislamiento y purificacin 5. TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO I. Gutierrez Gonzles, Sonia C. II. Arrspide Velasco, Nancy III. Instituto Nacional de Salud (Per) IV. Per. Ministerio de Salud
ISBN 9972 857 26 3 (O.C.) ISBN 9972 857 37 9 (N39) ISSN 1607 4904 Hecho el Depsito Legal N 1501152003-4204 Ministerio de Salud, 2003 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per Telf.: 431-0410 Instituto Nacional de Salud, 2003 Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, Per Telf.: 471-9920 Fax 471-0179 e-mail: postmaster@ins.gob.pe Pgina Web: www.ins.gob.pe Publicacin aprobada con R.J. No 461-2003-J-OPD/INS Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.
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II
INTRODUCCIN
CONTENIDO
VII
Malaria
Ciclo biolgico del Plasmodium Sntomas de la enfermedad Diagnstico de la enfermedad Diagnstico clnico Diagnstico de laboratorio
SECCIN 1: 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6
GENERALIDADES Objetivo Campo de aplicacin Responsabilidades Documentos de referencia Definiciones y abreviaturas Condiciones generales para la obtencin y manejo de muestras
SECCIN 2: 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6
BIOSEGURIDAD Medidas de bioseguridad Medidas de proteccin Descontaminacin Limpieza Desinfeccin Esterilizacin
SECCIN 3: 3.1 3.2 3.3
OBTENCIN DE MUESTRA HEMTICA Limpieza y almacenaje de lminas portaobjeto Registro Procedimiento para la obtencin de Ia muestra
SECCIN 4: 4.1 4.2 4.3 4.4
DESCRIPCIN DE GOTA GRUESA Y FROTIS Gota gruesa Frotis Secado de las muestras hemticas Errores comunes en la preparacin de muestras hemticas
SECCIN 5:
COLORACIN DE LA MUESTRA HEMTICA PARA EL DIAGNSTICO PARASITOLGICO DE MALARIA Uso del colorante giemsa Recomendaciones para una buena coloracin Coloracin de las muestras

5.1 5.2 5.3
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III
15 15 15 16 12 12 12 13 13 9 9 9 9 4 4 4 4 4 4 5 1 1 2 2 3 1 7 7 7 8 8 8 8
8.2.
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IV
SECCIN 11: 11.1 11.2 11.3 11.4
DIAGNSTICO INMUNOLGICO DE MALARIA Generalidades Tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Pruebas rpidas para diagnstico de malaria Kits existentes en el mercado para su aplicabilidad
10.6 10.7 10.8
SECCIN 10: 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5
CULTIVO in vitro DE Plasmodium falciparum Equipos Reactivos Materiales Preparacin de medios y otros Procedimiento para el aislamiento de parsitos en pacientes infectados por Plasmodium falciparum Cambio del medio de cultivo Criopreservacin o congelamiento de los parsitos Determinacin del porcentaje de parasitemia en frotis sanguneo
SECCIN 9: 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7
CONTROL DE CALIDAD EN EL DIAGNSTICO DE MALARIA Actividades del laboratorio de referencia nacional Actividades del laboratorio de referencia regional Actividades del nivel local e intermedio Recomendaciones generales para el envo de lminas e informe de resultados Criterios de evaluacin de la calidad tcnica de la lmina de gota gruesa Supervisin directa a los laboratorios Tipos de supervisin
SECCIN 8: 8.1
RESISTENCIA FARMACOLGICA Evaluacin de la resistencia de P. falciparum a los medicamentos antimalricos mediante el seguimiento in vivo Evaluacin de la resistencia de P. falciparum a los medicamentos antimalricos en un sistema in vitro mediante la prueba de la microplaca

SECCIN 7: 7.1 7.2 7.3
DETERMINACIN DE LA DENSIDAD PARASITARIA Consideraciones generales Mtodos de determinacin de la densidad parasitaria Reporte de la densidad parasitaria en caso de malaria por P. falciparum
SECCIN 6: 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6
OBSERVACIN MICROSCPICA DE MALARIA Recomendaciones Reconocimiento de los plasmodia Aspectos del parsito de malaria en sus diferentes estadios Morfologa de las especies de Plasmodium en el frotis de sangre Apariencia de los parsitos en gota gruesa y frotis Examen de rutina de la gota gruesa y frotis
19 19 19 19 20 21 21 30 30 30 32 33 33 37 42 42 42 43 44 44 46 47 48 48 48 48 49 50 51 51 53 54 54 54 59 62
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Limpieza y almacenamiento de lminas portaobjeto Formato: Solicitud de gota gruesa Precoloracin de la gota gruesa Preparacin de colorantes y soluciones Evaluacin de excresin urinaria de cloroquina y sulfamidas Formatos de control de calidad Preparacin de antgenos Titulacin de conjugado

ANEXOS Anexo A Anexo B Anexo C Anexo D Anexo E Anexo F Anexo G Anexo H
74 75 75 76 78 81 83 98 100
BIBLIOGRAFA
71
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VI
INTRODUCCIN
La malaria es una enfermedad parasitaria y transmisible que por siglos ha representado una amenaza para la salud del hombre y la economa de los pases endmicos. La Organizacin Mundial de la Salud estima que anualmente ocurren ms de 300 millones de infecciones de malaria y que, 1,5 a 2,5 millones de personas fallecen como consecuencia de esta enfermedad. Esto supone una amenaza para 200 millones de personas, dado que deteriora la salud y bienestar de la poblacin econmicamente activa, mermando los escasos recursos de muchos pases en vas de desarrollo. En nuestro pas, la poblacin residente en riesgo de enfermar es de aproximadamente 19 millones de habitantes, con un patrn de comportamiento temporal y estacional asociado geogrfica y ecolgicamente a zonas tropicales y desrticas irrigadas de la costa norte, selva montaosa, selva central y suroriental y la Cuenca Amaznica oriental del pas. El comportamiento y tendencia de la enfermedad malrica tiene un patrn en las reas fronterizas y en el nororiente del Per, con diseminacin a valles interandinos. Esta poblacin en riesgo ha sido clasificada en reas definidas de alto, mediano y bajo riesgo de transmisin, presentando el mayor nmero de casos los departamentos de Loreto, Piura, Tumbes, San Martn, Junn y Madre de Dios. El presente manual de procedimientos de laboratorio para el diagnstico y control de calidad de malaria tiene como propsito contribuir a que el personal profesional de los Laboratorios de la Red Nacional en Salud Pblica, cuente con procedimientos estandarizados para el diagnstico de malaria y su respectivo control de calidad. Incluye fundamentos, procedimientos y anlisis de los resultados obtenidos, todos ellos factibles de realizar en los diferentes niveles intermedios de la red. En el futuro estos mtodos pueden ser mejorados o reemplazados por otros de mayor sensibilidad y especificidad.
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VII
MALARIA CICLO BIOLGICO DEL Plasmodium
El agente etiolgico de la malaria es un protozoario del gnero Plasmodium y es transmitido por un vector (mosquito) del gnero Anopheles. Existen cuatro especies de Plasmodium capaces de infectar al hombre: Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale; en el Per se han descrito las tres primeras. El ciclo biolgico del Plasmodium comprende tres fases (Figura No1): CICLO SEXUAL O ESPOROGNICO: la transmisin natural de la enfermedad se produce cuando un mosquito hembra del gnero Anopheles pica a un husped infectado de malaria (ser humano), adquiere los gametocitos del Plasmodium (macho y hembra), los que ingresan al tubo digestivo del mosquito y luego de la fecundacin se reproducen en la pared de ste hasta adquirir la forma infectante denominada esporozoito, los cuales miden de 12 a 15 m aproximadamente. Estos esporozoitos son fusiformes, poseen un ncleo alargado y estn desprovistos de pigmento malrico. Los esporozoitos pasan por todas partes del mosquito y algunos llegan a las glndulas salivales, para ser transmitidos a otro husped sano, en el momento de la picadura. La forma infectante del Plasmodium (esporozoito) ingresa a la va sangunea del husped, en donde permanecen aproximadamente media hora antes de penetrar clulas hepticas. Esta fase dura de 14 a 20 das, dependiendo de factores ambientales. CICLO EXOERITROCTICO: Esta fase se inicia en los hepatocitos, donde los esporozoitos se reproducen en grandes cantidades hasta asumir la forma capaz de invadir los glbulos rojos. En un segundo da de esta fase, en el interior de los hepatocitos se encuentran esquizontes tisulares que aumentan de volumen y se dividen para formar millares de minsculos merozoitos. Esta fase tiene una duracin promedio de 12 das. CICLO ERITROCTICO: Ocurre cuando los merozoitos se liberan del hgado, pasan en grandes cantidades a la sangre e invaden los glbulos rojos produciendo su destruccin. Ello ocurre en 48 horas en P. vivax, P. falciparum y P. ovale, y 72 horas en P. malariae. Esto quiere decir que cada 48 72 horas se reinicia un nuevo ciclo eritroctico (trofozoito - esquizonte - trofozoito). SNTOMAS DE LA ENFERMEDAD El perodo de incubacin es el tiempo que transcurre desde la picadura del mosquito infectante hasta la aparicin de los sntomas de la enfermedad. En el caso de la malaria dura de 10 a 28 das segn la especie de Plasmodium. Luego de este perodo, los sntomas se presentan bruscamente con escalofros intensos, fiebre y sudoracin profusa; estos se presentan como accesos intermitentes cada 48 72 horas que corresponden a la ruptura de los esquizontes, aunque tambin se pueden presentar todos los das sin intermitencia. En el caso de P. falciparum los sntomas no son tan caractersticos durante los primeros das, pudiendo confundirse con una infeccin viral con febrcula, escalofros, dolor de huesos y dolor de cabeza.
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Figura No 1. Ciclo biolgico del Plasmodium
DIAGNSTICO DE LA ENFERMEDAD El diagnstico de la malaria se realiza considerando las manifestaciones clnicas y la confirmacin laboratorial de la gota gruesa u otra prueba de laboratorio que demuestre la presencia del parsito. Diagnstico clnico Las formas clnicas de la malaria se pueden dividir en: Leve: Frecuente en individuos parcialmente inmunes, quienes ya han tenido ataques de malaria, o en personas con buena respuesta inmediata del sistema inmune. En estos pacientes la fiebre no es muy alta y los sntomas, si los hay, son discretos. La parasitemia es baja, generalmente por debajo de 0,1% de glbulos rojos infectados. Moderada: Es tpica en individuos no inmunes, quienes presentan el caracterstico paroxismo febril con perodos de fro, calor y sudor, la temperatura es alta, con aumentos en la crisis. Los sntomas generales son ms intensos, con fuerte cefalea; adems, presentan anemia moderada y una parasitemia que varia de 0,1% a 0,5%.
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Grave y de urgencia: Casi siempre se observan en las infecciones producidas por P. falciparum. Este tipo de malaria se presenta en individuos no inmunes, mujeres embarazadas y nios. El paciente mantiene una fiebre persistente, la cefalea es fuerte, el vmito es frecuente y puede presentarse delirio. Adems, la anemia es intensa y pueden estar parasitados 2% a ms de los eritrocitos. Diagnstico de laboratorio Diagnstico parasitolgico Consiste en el examen microscpico de la muestra de sangre para demostrar la presencia del parsito para lo cual se usa la tcnica de coloracin de giemsa, con la cual podemos observar la gota gruesa y el frotis. Gota gruesa: Es una tcnica de rutina y consiste en una muestra de una gota de sangre conformada por numerosas capas en su mayora de glbulos rojos, los que son deshemoglobinizados durante la coloracin con giemsa. Esta concentracin de glbulos rojos facilita la deteccin de los parsitos que pudieran estar presentes en su interior en densidades bajas. Frotis: Es una capa delgada, nica de clulas sanguneas, fijadas con metanol y coloreadas con giemsa, que facilitan la observacin de las caractersticas morfolgicas de los parsitos presentes en los glbulos rojos. El examen en ambos casos (gota gruesa y frotis) se realiza con aumento de 1000x con aceite de inmersin. Diagnstico inmunolgico Abarca mtodos inmunoserolgicos que evalan la inmunidad humoral y celular del husped. La metodologa es suficientemente sensible y especfica para detectar las infecciones cuando la parasitemia es baja, adems de ayudar a diferenciar infecciones pasadas de la actual. Entre las tcnicas que se encuentran para el inmunodiagnstico de malaria tenemos: inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA, pruebas inmunocromatogrficas (Dipstick), hemaglutinacin, radioinmunoensayo, etc. La prueba de ELISA no es de mucha utilidad en el diagnstico clnico de un paciente, su mayor aplicacin es en estudios epidemiolgicos. El Instituto Nacional de Salud (Lima-Per) tiene estandarizada la tcnica IFI y tcnicas inmunocromatogrficas.
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SECCIN I GENERALIDADES 1.1 OBJETIVO Establecer los procedimientos para realizar el diagnstico de malaria. 1.2 CAMPO DE APLICACIN Se aplica en los laboratorios regionales referenciales y de establecimientos de salud del Sistema de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pblica. 1.3 1.3.1 RESPONSABILIDADES El Centro Nacional de Salud Pblica es responsable de autorizar la elaboracin, revisin y actualizacin del presente manual, de acuerdo a los procedimientos aprobados por el Instituto Nacional de Salud. Los directores de los establecimientos de salud son responsables de autorizar y proporcionar los recursos necesarios para designar al personal que aplicar las disposiciones contenidas en el presente manual. Los jefes o responsable de los laboratorios, deben asegurar el control interno de la calidad, la idoneidad del personal, equipos, materiales, reactivos e instalaciones. El personal mdico, tcnico y operativo, es responsable de seguir las especificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientos especficos indicados. DOCUMENTOS DE REFERENCIA Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para la obtencin y envo de muestras (I). 2a ed. Lima: INS; 1997. Serie de Normas Tcnicas No 15. Instituto Nacional de Salud. Normas de bioseguridad. 2a ed. Lima: INS; 2002. Serie de Normas Tcnicas No 18. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS anopheles: gnero de dpteros culcideo que comprende mosquitos caracterizados por poseer palpos largos y finos, casi tan largos como la trompa. Algunas especies transmiten el Plasmodium, agente de la malaria. anticuerpo: protenas pertenecientes al grupo de las gammaglobulinas o inmunoglobulinas, constituidas por la asociacin de cuatro cadenas polipeptdicas unidas entre s mediante puentes disulfuro, dos cadenas se denominan pesadas y las otras dos ligeras. A su vez, cada una de las cadenas ligeras y pesadas, incluye una regin variable (cuya secuencia de aminocidos es peculiar de cada anticuerpo) y una regin constante (con la misma secuencia en todos los anticuerpos). antgeno: generador de lo contrario. Sustancia que da lugar a reacciones inmunitarias como los anticuerpos.
4 Instituto Nacional de Salud
1.3.2
1.3.3 1.3.4 1.4 1.4.1 1.4.2 1.5 1.5.1
1.5.2
1.5.3
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1.5.4
bioseguridad: conjunto de medidas preventivas para proteger la salud, seguridad humana y del medio ambiente frente a los diferentes riesgos producidos por agentes biolgicos, fsicos, qumicos o mecnicos. desinfeccin: proceso que busca eliminar la mayora de microorganismos que causan enfermedades como hongos, virus, bacterias, etc. desinfectante: agente qumico utilizado para el proceso de desinfeccin. incubacin: mantenimiento de microorganismos en condiciones favorables para su crecimiento y reproduccin. infeccin: invasin y multiplicacin de microorganismos en un husped, pudiendo progresar hacia una enfermedad. limpieza: remocin de toda materia extraa con la finalidad de disminuir el nmero de microorganismos, pero sin asegurar la eliminacin de ellos. malaria: paludismo. paludismo: enfermedad infecciosa, febril, producida por protozoarios del gnero Plasmodium, que es transmitida por la picadura de mosquitos infectados del gnero Anopheles. La enfermedad se caracteriza por ataques de escalofros, fiebre y sudoracin. plasmodia: plural de Plasmodium. plasmodium: gnero de protozoarios plsmidos que comprende numerosas especies de parsitos de los glbulos rojos del hombre y de diversos vertebrados. Tienen un alto grado de especializacin parasitaria y su ciclo evolutivo es muy complejo. Son los agentes etiolgicos del paludismo. parsito: todo organismo que vive a expensas de otro, causndole dao. registro: documento que provee evidencias objetivas de las actividades efectuadas o de los resultados obtenidos. sincronizacin: procedimiento por el cual es posible obtener un solo estadio de Plasmodium falciparum luego de haberlo cultivado in vitro. CONDICIONES GENERALES PARA LA OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS Elegir el lugar correcto a partir del cual se obtendr la muestra empleando la tcnica apropiada. Esta debe obtenerse del pulpejo del dedo de la mano, de preferencia los dedos medio o anular por ser los menos usados. Obtener una muestra adecuada para asegurar la calidad tcnica. La muestra debe ser obtenida de preferencia antes de que el paciente haya recibido tratamiento antimalrico.
1.5.5 1.5.6 1.5.7 1.5.8 1.5.9 1.5.10 1.5.11
1.5.12 1.5.13
1.5.14 1.5.15 1.5.16 1.6 1.6.1
1.6.2 1.6.3
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1.6.4 1.6.5 16.6
Enviar las muestras de gota gruesa al establecimiento de salud ms cercano para obtener el diagnstico. Si fuera una muestra de suero mantenerla a 4oC si se procesar inmediatamente, o a -20oC si el proceso se va a ejecutar despus de un tiempo. En el caso de sangre para cultivo, stas se enviarn inmediatamente dentro de las 24 horas y a temperatura de refrigeracin ( 2oC - 8oC). En caso contrario, se debe criopreservar y guardar a -70oC o nitrgeno lquido. Las muestras deben ser colocadas para su envo en un recipiente apropiado para su transporte al laboratorio con la finalidad de evitar cualquier derrame o rotura .
1.6.7
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SECCIN II BIOSEGURIDAD 2.1 2.1.1 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Trabajar en un laboratorio aumenta el riesgo de enfermar por la exposicin a los agentes biolgicos, sea a travs de accidentes con agujas o materiales cortopunzantes contaminados, aerosoles, manejo de material contaminado o por falta de vacunacin. El personal involucrado en los diferentes procesos para el diagnstico de malaria debe aplicar las medidas de bioseguridad establecidas en las Normas de Bioseguridad (Serie Normas Tcnicas No 18). Se deben controlar las medias necesarias aplicables a: El personal. La vestimenta. Los ambientes. La obtencin de muestras. El envo de muestras al laboratorio. Los casos de accidentes. El laboratorio. MEDIDAS DE PROTECCIN Lavarse las manos cada vez que sea necesario. Los objetos afilados y punzantes deben manejarse con sumo cuidado. Desinfectar, esterilizar o descartar adecuadamente los instrumentos despus de usarlos. Usar guantes cada vez que maneje sangre o productos de sangre as como mascarilla, bata de proteccin, anteojos de proteccin, segn los requerimientos de cada procedimiento. Cubrir cualquier corte o abrasin de las manos con adhesivos. Cuidar de punzarse con cualquier instrumento agudo que haya estado en contacto con sangre. Nunca utilizar lancetas o agujas ms de una vez. Cualquier material contaminado con sangre, deber ser colocado en un envase con cloro o hipoclorito de sodio al 1%, y luego para mayor seguridad disponer su entierro o incineracin.
2.1.2 2.1.3 2.1.3.1 2.1.3.2 2.1.3.3 2.1.3.4 2.1.3.5 2.1.3.6 2.1.3.7 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 . 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.9 2.2.10
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2.3
DESCONTAMINACIN La descontaminacin es un pretratamiento necesario para la proteccin cuando se manipular materiales potencialmente infectados. Se pueden emplear soluciones de hipoclorito de sodio al 0,5%, fenol al 5%, perxido de hidrgeno al 6%, glutaraldehdo, formaldehdo, etc.
2.4
LIMPIEZA Consiste en la eliminacin fsica de sangre, fluidos corporales o cualquier material extrao visible, que pueda encontrarse en la piel o en los objetos inanimados.
2.5
DESINFECCIN Desinfeccin de alto nivel. Significa eliminar la mayora de microorganismos que causan enfermedades como hongos, virus, bacterias, etc. Esta puede obtenerse por ebullicin y por agentes qumicos.
2.6
ESTERILIZACIN Permite eliminar completamente de los objetos todo microorganismo (bacterias, virus, hongos, parsitos, etc., incluido endosporas bacterianas). Es el mtodo ms seguro para procesar los instrumentos que entran en contacto con material contaminado. La esterilizacin puede lograrse por medios fsicos o qumicos (Tabla No 1).
Tabla No 1. Tipos de esterilizacin
MTODOS FSICOS QUMICOS
MEDIO CALOR HMEDO CALOR SECO LQUIDO GAS
TIPOS AUTOCLAVE HORNO GLUTARALDEHDO AL 2% CIDO PARACTICO XIDO DE ETILENO FORMALDEHIDO PEROXIDO DE HIDRGENO
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SECCIN III OBTENCIN DE MUESTRA HEMTICA 3.1 3.1.1 LIMPIEZA Y ALMACENAJE DE LMINAS PORTAOBJETO Las lminas portaobjeto para uso de toma de muestra hemtica en gota gruesa debern ser procesadas antes de su uso, (lavadas, secadas y almacenadas correctamente). Las lminas nuevas son lavadas con detergente neutro y agua limpia. Despus de estar remojadas en agua con detergente por 30 minutos a 1 hora, enjuagar con agua continua o cambiada varias veces. Cada lmina deber ser pulida individualmente con esponja para luego secarlas con un trozo de tela de algodn. Las lminas ms limpias debern cogerse slo por los bordes para evitar dejar grasa sobre su superficie. Es preferible descartar lminas portaobjeto cuando: - Tengan coloracin iridiscente u opaca. - Presenten rajaduras o superficies irregulares. - No estn limpias. Las lminas portaobjetos limpias podrn ser envueltas en papel delgado (papel copia) en grupos de 10. Los paquetes as seleccionados para uso de toma de muestra sern almacenados en cajas de cartn y en lugares secos (evitando polvo y humedad) para uso posterior, y separando simultneamente las de uso diario. Es necesario tomar medidas de proteccin cuando se manipula sangre para evitar la contaminacin con agentes de transmisin sangunea (hepatitis viral B, C, G, VIH, etc.) cuya manipulacin representa un riesgo potencial. El riesgo es que la sangre de un paciente infectado con una de estas enfermedades, puede contaminar accidentalmente a otro paciente o trabajador. Sin embargo, el riesgo de infeccin de estas enfermedades se reduce tomando en cuenta las medidas de bioseguridad. 3.2 3.2.1 REGISTRO Para asegurar la fcil localizacin de los pacientes es importante Ilenar la informacin requerida en una ficha de toma de muestra diseadas por el Ministerio de Salud (MINSA) (Anexo B). No olvidar que equivocarse en el Ilenado correcto de estos formatos de registro, puede ser lo mismo que equivocarse en la lectura de la gota gruesa. PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIN DE LA MUESTRA En malaria, la muestra de sangre perifrica se obtiene para preparar dos clases de pelculas, una gruesa y una delgada (gota gruesa y frotis, respectivamente), para su examen por microscopa directa. La gota gruesa est conformada por numerosas capas de clulas sanguneas, en su mayora glbulos rojos, los que son deshemoglobinizados durante la coloracin con giemsa. Esta concentracin de glbulos rojos facilita la deteccin de los parsitos que pudieran estar presentes en el interior de alguno de ellos cuando la densidad es baja (Figura No 2).
3.1.2
3.1.3
3.3 3.3.1
3.3.2
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3.3.3
El frotis consiste en una capa delgada, nica de clulas sanguneas. Esto facilita la observacin de las caractersticas morfolgicas de los parsitos presentes en los glbulos rojos, sobre todo para la identificacin de la especie del parsito, cuando este no ha podido ser identificado por gota gruesa. Adems, el frotis debe ser utilizado siempre para rotular e identificar al paciente.
Figura No 2. Materiales necesarios para diagnstico de gota gruesa.
3.3.4 3.3.4.1 3.3.4.2 3.3.4.3 3.3.4.4
Despus que los datos del paciente han sido registrados en forma apropiada, las muestras de sangre se procesan de la siguiente manera: Sostener la mano izquierda del paciente, con la palma hacia abajo seleccionar el tercer dedo a partir del pulgar o el dedo ndice (EI dedo gordo del pie puede ser utilizado en nios). Limpiar el dedo con una pieza o torunda de algodn ligeramente humedecido en alcohol, utilizando golpes firmes para retirar suciedad y grasa de la yema del dedo. Secar el dedo con un algodn limpio y seco, utilizando golpes firmes para estimular la circulacin de la sangre. Sostener el dedo del paciente con la mano izquierda, tomndolo por sus lados y manteniendo una suave presin sobre ellos para favorecer la salida de sangre (Figura No 3).
Figura No 3. Presionar el dedo antes de la puncin.
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10
3.3.4.5
Punzar el borde de la yema del dedo con una lanceta estril y un movimiento rpido, presionar suavemente el dedo para extraer la primera gota de sangre y limpiar con una torunda de algodn seco. Asegrese que ninguna hilacha de algodn, que pueda mezclarse posteriormente con la sangre, permanezca en el dedo (Figuras No 4 y No 5).
Figura No4. Puncin digital.
Figura No 5. Limpiar con algodn la primera gota de sangre.
3.3.4.6 a.
Trabajando rpidamente y manipulando lminas completamente limpias, colectar la sangre de la siguiente forma: Aplique suave presin al dedo para extraer una gota de sangre y colocarla inmediatamente en contacto con el primer tercio externo de la superficie de la lmina. El tamao de esta gota se aproxima al tamao de una cabeza de fsforo. Presionar nuevamente el dedo y colectar una segunda gota de sangre ms pequea que la primera, en el centro de la lmina, para realizar el frotis. Limpiar la sangre restante del dedo con una torunda de algodn humedecido en alcohol e indicar al paciente que presione esta torunda contra el lugar de la puncin por 5 minutos.
b. c.
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SECCIN IV DESCRIPCIN DE GOTA GRUESA Y FROTIS 4.1 GOTA GRUESA Una vez obtenida la muestra, realizar la gota gruesa de la siguiente manera: utilizando uno de los ngulos de una segunda lmina (lmina auxiliar) esparcir rpidamente la gota de sangre y extenderla uniformemente hasta formar una gota gruesa de 1 cm de lado o de dimetro. La sangre no debe ser excesivamente revuelta, es suficiente con 3 a 6 movimientos. De preferencia, realizar el homogeneizado de la muestra en una sola direccin, en forma concntrica (de adentro hacia fuera o viceversa). 4.2 4.2.1 FROTIS Utilizando la misma lmina auxiliar, ponerla en contacto con la superficie de la lmina que contiene la gota central y hacerla correr firmemente a lo largo de su borde en un ngulo de 45. Asegrese de que ocurra un contacto parejo con la superficie de la lmina todo el tiempo que la sangre est siendo esparcida, de tal manera que el frotis sea homogneo y fino. Siempre manipular las lminas por los bordes o por una esquina para realizar el frotis, como se muestra en la Figura No 6:
Figura No 6. Ejecucin del frotis en ngulo de 45C.
4.2.2
Luego de haber secado el frotis, rotular con lpiz de carbn suave, escribiendo en la parte ms gruesa el cdigo, nmero y fecha de la muestra. No utilizar bolgrafo para etiquetar la lmina. Dejar secar la lmina con la gota gruesa en una superficie plana y protegida de polvo, calor e insectos.
Figura No 7. Rotular las muestras con lpiz.
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4.2.3
Si no existiera centro de diagnstico, envuelva la lmina seca en el formato de registro del paciente y enviar al Laboratorio de Referencia tan pronto como sea posible. La segunda lmina utilizada para esparcir la sangre puede ahora ser utilizado para el siguiente paciente y una segunda lmina limpia del paquete ser usado como lmina extensora. El frotis se usa como herramienta auxiliar para discriminar entre las diferentes especies. SECADO DE LAS MUESTRAS HEMTICAS Las lminas con las muestras de sangre deben permanecer horizontalmente, lo que va a permitir que la gota gruesa est en un mismo nivel y seque uniformemente. Proteger las muestras con la ayuda de pequeos mosquiteros para alejarlas de dpteros y otros insectos, as como del polvo. En climas hmedos y clidos, la autofijacin de las muestras ocurre muy rpidamente, por lo tanto deben ser coloreadas cuanto antes, a ms tardar en un plazo no mayor de tres das luego de su coleccin. Cuando un largo almacenamiento es inevitable, deben ser precoloreadas dentro de las siguientes 24 horas por el mtodo de Walker (Anexo C) para evitar la fijacin y contaminacin por hongos. ERRORES COMUNES EN LA PREPARACIN DE MUESTRAS HEMTICAS La preparacin incorrecta de la muestra hemtica puede afectar el etiquetado, la coloracin o el examen y, a veces, ms de uno de estos. Las fallas ms comunes que deben evitar cometerse son:
4.2.4
4.2.5 4.3 4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.3.4
4.4
4.4.1
Mala posicin de las muestras de sangre Las pelculas de sangre debern estar situadas correctamente en la lmina. Si no es as, puede dificultar el examen de gota gruesa; incluso porciones de la muestra pueden ser lavadas durante el proceso de coloracin.
4.4.2
Mucha sangre Si se obtiene demasiada sangre al colectar la gota gruesa, entonces la coloracin puede quedar muy bsica (azul), significando que se observarn muchas clulas blancas por campo pudiendo estas oscurecer o cubrir algunos parsitos de malaria que pueden estar presentes. Si el extendido es demasiado grueso, los glbulos rojos pueden estar unos encima de otros imposibilitando el examen adecuado despus de la fijacin.
4.4.3
Poca sangre Si se emplea poca sangre en la preparacin de las muestras, no habrn suficientes clulas blancas por campo y no se examinar suficiente cantidad de sangre como lo establece la norma.
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4.4.4
Lmina con grasa En una lmina sin desengrasar, la sangre se esparcir irregularmente, lo que har difcil el examen; por otro lado, parte de la gota gruesa en algunos casos puede desprenderse durante el proceso de coloracin.
4.4.5
Si el borde de la lmina extensora es irregular Cuando el borde de la lmina empleada como extensora est astillada, el frotis es esparcido irregularmente, afectndose la calidad del frotis.
4.4.6
El frotis demasiado grande y la gota gruesa mal ubicada Si el frotis es demasiado grande, la gota gruesa estar fuera de lugar, cerca al borde de la lmina, entonces no podr ser visto fcilmente a travs del microscopio. Durante el proceso de coloracin o secado porciones de la gota gruesa probablemente pueden ser desprendidas.
M= Mala calidad
B= Buena calidad
Figura No 8. Muestras de diferente calidad de gota gruesa
4.4.7 4.4.7.1 4.4.7.2 4.4.7.3 4.4.7.4
Otros errores comunes Dejar las lminas expuestas a moscas, cucarachas, hormigas y otros insectos que se alimentan de sangre seca y daan las muestras de sangre. Realizar gotas y frotices en muestras de sangre en lminas mal seleccionadas o rayadas. Secado irregular de la gota gruesa. Permitir la auto fijacin de la gota gruesa que ocurre con el transcurrir del tiempo o a travs de la exposicin al calor, por lo que la coloracin se hace difcil e insatisfactoria.
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SECCIN V COLORACIN DE LA MUESTRA HEMTICA PARA EL DIAGNSTICO PARASITOLGICO DE MALARIA
5.1
USO DEL COLORANTE GIEMSA El constituyente bsico del colorante giemsa consiste en cierto tipo de eosinato de azul de metileno, disuelto ya sea en alcohol metlico puro o glicerina pura. La solucin alcohlica constituye una forma conveniente en la preparacin de la solucin acuosa que tie simultneamente en rojo, azul y violeta. Los elementos disueltos permanecen en solucin y al cabo de un tiempo todos los elementos activos de coloracin se precipitan.
5.2 5.2.1 5.2.2
RECOMENDACIONES PARA UNA BUENA COLORACIN Asegrese que la gota gruesa y el frotis estn secos antes de iniciar el proceso de tincin. Puede acelerarse el secado empleando calor suave, por ejemplo, exponindolos al calor generado por una lmpara. Evite utilizar demasiado calor ya que esto puede dificultar la deshemoglobinizacin. Mantenga el envase (vidrio mbar u oscuro) que contiene la solucin madre giemsa, cerrado y en lugar seco, fresco y protegido de luz solar directa. As evitar la volatizacin del solvente y la oxidacin del colorante prolongando la duracin de la solucin. Nunca aada agua a la solucin madre del colorante o deje entrar una pipeta mojada. Esto puede provocar deterioro de la solucin de modo que esta no coloree adecuadamente. No agite la botella de colorante antes de utilizarla. Se suspenderan pequeos cristales de colorante que no han sido disueltos, los cuales pueden visualizarse en las muestras de sangre durante el proceso de coloracin y dificultaran el examen bajo microscopio. Nunca regrese el colorante diluido no utilizado al envase que contiene la solucin madre. El material de vidrio usado para guardar colorante giemsa debe ser lavado en agua limpia inmediatamente despus de ser utilizado para retirar los restos del colorante. El material usado debe remojarse por algn tiempo, preferiblemente toda la noche, en una solucin de detergente y posteriormente, debe ser enjuagado totalmente en agua limpia. Los residuos de detergente en el material de vidrio pueden alterar el pH de su contenido y estropear el colorante. La solucin madre constituye el colorante stock (giemsa concentrado), el cual se diluye con buffer o agua destilada para obtener la solucin de trabajo o de uso diario.
5.2.3
5.2.4
5.2.5
5.2.6 5.2.7
5.2.8
5.2.9
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5.3 5.3.1
COLORACIN DE LAS MUESTRAS Antes de proceder a la coloracin de la gota gruesa, fije el frotis sumergindolo en metanol, por tres segundos y djelo secar (Figura No 9).
Figura No 9. Fijar el frotis en metanol.
5.3.2 5.3.3 5.3.3.1
Asegrese de preparar el volumen de colorante diluido en cantidad suficiente para las lminas que debe colorear (Anexo D). Mtodo rpido o coloracin en varilla Este mtodo se usa generalmente para colorear entre 1 a 10 lminas. Debe tenerse en cuenta que la gota de sangre tiene que estar seca antes de ser coloreada, debindose evitar secar las muestras con demasiado calor. Procedimiento Coloque las varillas de vidrio sobre un lavatorio o recipiente de tal forma que facilite la eliminacin de los lquidos que se usarn en la coloracin y coloque las lminas que debe colorear sobre las varillas, espacindola de tal forma que pueda manipularlas con seguridad (Figura No 10).
5.3.3.2 a.
Figura No 10. Lminas listas para colorear
b.
Vierta colorante diluido sobre la gota gruesa cubrindola por completo. Haga esto suavemente, a una distancia corta de la lmina y deje actuar el colorante por 10 minutos. La experiencia le puede indicar la necesidad de modificar este tiempo de espera.
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Figura No 11. Coloracin de lmina en varilla.
c.
Descarte el exceso de colorante diluido y lave la lmina con agua corriente, usando una pista, hasta que el agua no desprenda colorante (Figura No 12).
Figura N 12. Lavado de lmina de gota gruesa.
d.
Acomode las lminas en una gradilla de madera, de modo que queden inclinadas y con la gota gruesa hacia abajo. Deje secar las lminas en esta posicin. En caso de no poder dilucidar las especies en la gota gruesa, colorear el frotis de la misma forma anterior (Figura No 13).
Figura No 13. Secado de muestras hemticas de gota gruesa.
5.3.4 5.3.4.1
Mtodo de lmina invertida Este mtodo de coloracin se usa para colorear la gota gruesa y frotis de varias lminas a la vez en una bandeja especial de coloracin hecha de material acrlico, la inversin de las lminas disminuye la probabilidad de precipitado del colorante.
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5.3.4.2
Procedimiento Coloque la bandeja de coloracin sobre una superficie plana (mesa de trabajo) cerca del lavatorio o recipiente, de tal forma que facilite la eliminacin de los lquidos que se usarn en la coloracin. Acomode las lminas que desea colorear en forma invertida (con la muestra hacia abajo), espacindolas entre ellas de tal manera que pueda agregarse el colorante lmina por lmina (dejar fluir el colorante por el borde de la lmina (Figura No14).
Figura No 14. Coloracin de lmina invertida.
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SECCIN VI OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS PARSITOS DE MALARIA 6.1 RECOMENDACIONES Se necesita un microscopio compuesto con fuente de luz propia o con sistema de espejos para recibir luz natural o artificial. Si se usa como fuente externa de luz una bombilla incandescente (foco de 100W y pavonado), la luz se debe hacer pasar por un filtro azul (que se puede preparar con la solucin azul cielo) (pg. 76), esto facilita la visualizacin de los parsitos. 6.2 6.2.1 6.2.2 RECONOCIMIENTO DE LOS PLASMODIA Los parsitos de malaria toman con la coloracin de giemsa un aspecto determinado en la gota gruesa y el frotis que permite el reconocimiento del tamao y la forma del parsito. El ncleo del parsito (cromatina) es generalmente redondo y se colorea de un rojo intenso (rojo grosella), el citoplasma toma diferente formas, desde una forma de anillo a una totalmente irregular y se colorea siempre de azul, aunque la tonalidad pueden variar ligeramente. ASPECTOS DEL PARSITO DE MALARIA EN SUS DIFERENTES ESTADIOS Las caractersticas en los diferentes estadios de los plasmodia que se observan en la gota gruesa y frotis se muestran en las Tablas No 1, 2 y 3. Para el reconocimiento de la especie y del estadio de los plasmodios, el frotis permite observar mejor las caractersticas del parsito. 6.3.1 6.3.1.1 Etapa de trofozoito joven Esta etapa es la que se observa con mayor frecuencia en las diferentes especies, a veces puede tomar la forma de coma o anillo como en el caso de Plasmodium falciparum, o formas ameboideas, como en el caso de P. vivax. (Figura No 15)
Ncleo
6.3
Citoplasma Trofozoito joven de P. falciparum

Figura No 15. Trofozoito joven
Trofozoito joven de P.vivax
6.3.2 6.3.2.1
Etapa de trofozoito mediano y adulto El trofozoito es una etapa del desarrollo del parsito dentro del glbulo rojo, puede variar en tamao desde pequeo a grande. En el trofozoito se visualiza, en la mayora de las veces, el pigmento malrico el cual aparece a medida que el parsito crece. Este pigmento denominado tambien hemozona es un producto del metabolismo celular del parsito y proviene de la descomposicin de la hemoglobina en hem y globina. La hemozona no se colorea, porque adopta un color propio, que puede variar de amarillo plido a castao oscuro o negro.
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6.3.2.2
El trofozoito mediano se caracteriza porque morfolgicamente es grande, de citoplasma fragmentado y con presencia de vacuola, pudiendo ser la cromatina o ncleo del parsito de posicin central o excntrica. El trofozoito adulto es de menor tamao, de citoplasma compacto, la cromatina se ubica por lo general excntricamente y es ms pequea que la de los gametocitos (Figura No 16).
Trofozoitos medianos
Trofozoitos adultos
Figura No 16. Trofozoito medianos y adultos.
6.3.3 6.3.3.1
Etapa de esquizonte En la etapa de esquizonte el parsito de malaria comienza a reproducirse. Esta reproduccin es conocida como asexual debido a que se reproducen por simple divisin binaria. El parsito presenta ncleos con cromatina y citoplasma definido. Cuando este estadio est presente el nmero de ncleos observados son de utilidad para determinar la especie (Figura No 17).
P. malariae
Figura N 17. Esquizontes.
o
P. vivax
6.3.4 6.3.4.1
Etapa de gametocito El gametocito es el estadio sexual en el cual el parsito llega a ser masculino o femenino, ste proceso de maduracin se completa en el estmago del anofelino hembra. La morfologa de los gametocitos depende de la especie. El gametocito masculino es llamado microgametocito y el gametocito femenino macrogametocito (Figura No 18).
P. falciparum
P. vivax
Figura No 18. Gametocitos.
P. malariae
En malaria por P. falciparum se pueden ver en sangre perifrica gametocitos y anillos a diferencia de vivax en el que se visualiza todos los estadios parasitarios. 6.4 6.4.1 MORFOLOGA DE LAS ESPECIES DE Plasmodium EN EL FROTIS DE SANGRE Una simple manera de distinguir entre las cuatro especies de malaria es observar los cambios morfolgicos que provoca el parsito al infectar los glbulos rojos. Los caracteres distintivos son: el tamao del glbulo rojo (si est o no agrandado) y si se han coloreado o no las granulaciones de Schuffner dentro de la clula.
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6.4.2
En las preparaciones sanguneas de pelcula fina o frotis, las plaquetas adheridas a los eritrocitos pueden confundirse con plasmodios, as como otros contaminantes como bacterias, esporas, hongos, microalgas, precipitado de colorante, etc. APARIENCIA DE LOS PARSITOS EN GOTA GRUESA Y FROTIS La morfologa de los glbulos rojos y de los leucocitos cambian en el frotis y en la gota gruesa, lo mismo sucede con la morfologa de los parsitos. Los parsitos de malaria pueden ser vistos semejantes a los glbulos blancos en la gota gruesa, pero aparentan ser ms pequeos que en el frotis. Se necesita observarlos muy cuidadosamente antes de identificarlos, enfocando y usando el micromtrico cada vez que mueva un campo microscpico, esto le permitir examinar la gota gruesa en profundidad. El citoplasma de los anillos finos de los trofozoitos pueden aparecer incompletos o rotos. Esta apariencia es normal en muestras de sangre de gota gruesa. Similarmente, la ausencia de glbulos rojos puede dificultar la visin de las granulaciones de Schffner; por tanto, en partes de la muestra no puede ser posible ver el punteado. Observar el parsito en diferentes etapas de desarrollo le ayudar para hacer el diagnstico. Recordar que las granulaciones de Maurer de Plasmodium falciparum no pueden ser vistos en gota gruesa.
6.5 6.5.1
Grnulos de Shuffner en frotis
Grnulos de Shuffner gota gruesa
Figura No 19. Grnulos de Shffner de P. vivax.
6.5.2
En el estado de trofozoito, los Plasmodium presentan tres caractersticas indispensables, presentes tanto en la gota gruesa como en el frotis: citoplasma azul violceo o azul cielo, ncleo rojo intenso o rojo grosella, y pigmento amarillo plido o castao oscuro o negro (dependiendo de la especie y de las formas maduras del parsito). En las preparaciones sanguneas las siguientes estructuras pueden confundirse con parsitos de malaria: plaquetas adheridas a los eritrocitos en las extensiones sanguneas, conglomerados de plaquetas, fragmentos de leucocitos en las preparaciones de gota gruesa, colorante precipitado, restos de piel del paciente, polvo, bacterias, levaduras, esporas y otros microorganismos que caen en la preparacin (si no se tienen protegidos) mientras se est secando, y algas u otros organismos que pueden estar contaminando el colorante. EXAMEN DE RUTINA DE LA GOTA GRUESA Y DEL FROTIS El examen de la gota gruesa es recomendable para detectar la presencia de los parsitos de malaria, mientras que el frotis sirve como herramienta auxiliar para determinar la especie de Plasmodium en caso de que no sea posible hacerlo en la gota gruesa. El cdigo del paciente es rotulado en la cabeza del frotis.
6.5.3
6.6
6.6.1 6.6.1.1
Examen de la gota gruesa El examen de rutina de la gota gruesa requiere observar 100 campos microscpicos ptimos a un aumento final de 1000x, con lente de inmersin.
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6.6.1.2
Una lmina puede declararse como negativa, slo despus de observar 100 campos microscpicos sin haber encontrado parsitos. Si se encuentran parsitos, deben examinarse tambin los 100 campos microscpicos; esto asegura detectar la posibilidad de infeccin mixta (ms de una especie presente en una muestra de sangre). En lo posible, debe identificarse la(s) especie(s) a la(s) que pertenecen los parsitos. Procedimiento Verificar la clave de la lmina que va examinar en la hoja de registro de datos. Colocar la lmina entre los soportes de la platina mecnica y verificar que est sostenida firmemente al momento de mover el carro, de lo contrario se pueden perder de vista objetos sospechosos antes de que puedan ser ubicados. Examinar la gota gruesa completa con el objetivo de 10X, hasta localizar una zona conveniente para la bsqueda de los plasmodia (que se observen leucocitos numerosos y bien coloreados). Colocar aceite de inmersin sobre la zona seleccionada de la gota gruesa y girar el objetivo de 100X hasta ponerlo en posicin sobre ella. Bajar el objetivo hasta ponerlo en contacto con el aceite de inmersin. Verificar que la parte seleccionada de la lmina sea ptima (leucocitos de 10 a 20 por campo microscpico). Examinar 100 campos. Desplazar la lmina que contiene la muestra de sangre siguiendo el patrn mostrado (Figura No 20). Recuerde usar el ajuste fino para enfocar, accionando el tornillo micromtrico hacia delante y atrs, con el fin de observar el mayor nmero posible de capas sanguneas. Anotar el nmero de parsitos observados y la especie a la que pertenecen (si le fue posible identificarla).
6.6.1.3 6.6.1.4 a. b.
c.
d.
e. f.
g.
h.
FROTIS
Figura No 20. Recorrido de la gota gruesa durante la observacin microscpica.
6.6.2 6.6.2.1
Examen del frotis de sangre Este examen requiere mayor tiempo de observacin en comparacin con la gota gruesa, debido a que la concentracin de los elementos sanguneos es mucho menor.
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6.6.2.2 a. b. 6.6.2.3 a. b. c. d. 6.6.2.4
Se debe realizar en las siguientes circunstancias: Cuando no es posible examinar la gota gruesa por alguna razn (Ejemplo: por ser muy pequea). Cuando no es posible identificar en la gota gruesa la(s) especie(s) de Plasmodium. El aspecto que debe presentar esta preparacin al microscopio debe ser: Fondo limpio y libre de residuos los eritrocitos deben estar teidos de color rosa plido. El ncleo de los leucocitos, de color morado oscuro y grnulos bien definidos. Los grnulos de Schffner deben verse como un moteado en los eritrocitos que contienen P. vivax. La cromatina de los plasmodia se tie de color rojo grosella intenso y el citoplasma de azul violceo o azul cielo. Procedimiento Colocar la lmina sobre la platina mecnica entre los soportes de esta. Enfocar con el objetivo de 10X el extremo menos denso del frotis, donde los glbulos rojos estn dispuestos en una sola capa. Bajar el objetivo de inmersin hasta poner en contacto con el aceite de inmersin. Enfocar y examinar la pelcula de sangre siguiendo el patrn mostrado (Figura No 21). Examinar el mayor nmero de campos microscpicos (300) para determinar si la muestra de sangre es positiva o negativa para malaria. Si el diagnstico es dudoso deber examinar de 400 a 500 campos microscpicos (Figura No 22).
Figura No 21. Recorrido del frotis durante la observacin microscpica
Figura No 22. Observacin microcpica de P. falciparum en frotis
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Tabla No 1. Caractersticas diferenciales entre plasmodios vistos en frotis de sangre humana
Caracterstica Glbulo rojo Aspecto general Trofozoito joven (anillos)
P. vivax - Tamao aumentado. - Grnulos de Schuffner presentes. - Pequeo a grande, generalmente un anillo por eritrocito.
P. falciparum - Tamao normal
P. malarie - Tamao normal o menor - Generalmente uno a dos anillos por eritrocito.
- Pequeo y delicado, a menudo dos puntos de cromatina y dos o ms anillos por eritrocito - La infeccin mltiple es rara. - Raro en sangre perifrica. Si existe, es de tamao moderado. - Pigmento en forma de grnulos. - Raro en sangre perifrica.
Trofozoito mediano
- Grande, ameboide. - Pigmento en forma de bastones finos.
- Pequeo y compacto, a menudo en forma de banda. - Pigmento granulado.
Trofozoito maduro o adulto Esquizonte
- Tamao mediano, con citoplasma compacto. - Pigmento fino. - Grande, con numerosos merozoitos (12-24). Promedio: 16. - Pigmento concentrado en 1 2 masas.
- Mediano, con numerosos merozoitos (12 - 32). - Pigmento en una masa nica - Su presencia es rara en sangre perifrica.
- Pequeo, con pocos merozoitos grandes dispuestos en roseta (6 a 12), Promedio: 8. - Pigmento granuloso, ubicado generalmente en la parte central. - Parecido al P. vivax pero ms pequeo y menos numeroso en el frotis.
Gametocito
- Esfricos, compactos y de ncleo nico.
- Forma de banana o salchicha y de ncleo nico central.
- Pigmento difuso y fino.
Nota: Ocasionalmente se puede encontrar dificultades para establecer diferencias entre trofozoitos maduros y gametocitos de Plasmodium vivax y entre trofozoitos maduros de Plasmodium malariae y gametocitos redondeados de Plasmodium falciparum. Tampoco es posible distinguir entre trofozoitos en estadios avanzados y gametocitos de Plasmodium malariae en muestras de gota gruesa, aunque si estn presentes los gametocitos de Plasmodium falciparum es relativamente fcil de realizar el diagnstico.
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Tabla No 2. Algoritmo para el diagnstico parasitolgico de malaria en gota gruesa.
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Tabla No 3. Aspecto de las diferentes especies y estadios de los plasmodia en la gota gruesa.
Estadio caracterstica P. vivax P. falciparum P. malarie
Trofozoito
Tamao Nmero Citoplasma Cromatina Formas pequeo a grande moderado Fragmentado, de forma irregular nica, a veces dos Jvenes: anillos, comas, sin pigmento mediano: citoplasma ameboideo, fragmentado, con pigmento. maduro o adulto: compacto. Fino, desperdigado pequeo a mediano por lo general abundante uniforme, fino a menudo dos ncleos Frecuentemente anulares y comas. Las formas maduras (compactas) slo presentes en casos graves Pocos grnulos o en masa pequeo a grande escaso a moderado regular, denso nica grande Jvenes: anulares Adultos: redondos, compactos
Pigmento Esquizonte Tamao No en sangre N de rnerozoitos Forma
Abundante, generalmente rodeando el citoplasma pequeo escaso 6 a 12, generalmente 8 merozoitos en conglomerado laxo, de forma madura, algunos aparentemente sin citoplasma concentrado Difciles de distinguir de trofozoitos maduros redondeadas, compactas, algunas veces tambin difcil de distinguir de los Trofozotos maduros bien definida menor tamao Desperdigado, rugoso, Puede estar distribuido en la periferie solo con cromatina y pigmento
grande escaso a moderado 12 a 24, generalmente 16 en conglomerado irregular formas maduras
pequeo, compacto poco frecuente, solo en forma, graves 12 a 30, mas aglomerados y compactos
Pigmento Gametocito Formas inmaduras Formas maduras
dispuesto en masa suelta difciles de distinguir de trofozoitos maduros redondas, grandes
masa nica y oscura inmaduras: puntiagudas en forma de banana o redondeadas
Cromatina Pigmento
grande y nica, bien definida desperdigado fino
bien definida de menor tamao desperdigado, grueso
Formas erosionadas
con citoplasma oscuro o ausente, y solo con cromatina y pigmento
a veces se observa rgano de extrusin de color rosa
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ESTADIOS PARASITARIOS DE P. vivax EN FROTIS (IZQ) Y GOTA GRUESA (DER.)
Plasmodium vivax c
TROPHOZOITES
SCHIZONTS
Thin film
GAMETOCYTES
Thick film
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ESTADIOS PARASITARIOS DE P. falciparum EN FROTIS (IZQ) Y GOTA GRUESA (DER.)
Plasmodium falciparum
TROPHOZOITES
SCHIZONTS
Thin film
GAMETOCYTES
Thick film
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ESTADIOS PARASITARIOS DE P. malariae EN FROTIS (IZQ) Y GOTA GRUESA (DER.)
Plasmodium malarie
TROPHOZOITES
SCHIZONTS
Thin film
GAMETOCYTES
Thick film
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SECCIN VII DETERMINACIN DE LA DENSIDAD PARASITARIA 7.1 7.1.1 7.1.1.1 7.1.1.2 7.1.1.3 CONSIDERACIONES GENERALES La determinacin de la densidad parasitaria es til para: Evaluar la severidad de la infeccin malrica. Evaluar la eficacia del tratamiento antiparasitario, monitoreando la densidad parasitaria durante el tratamiento. Si el tratamiento es eficaz, la densidad parasitaria disminuir progresivamente. La determinacin de la densidad parasitaria es especialmente importante en la infeccin por P. falciparum, la cual se asocia a enfermedad severa y potencialmente fatal, por lo que es necesario el seguimiento de la evolucin parasitolgica en respuesta al tratamiento instaurado. MTODOS DE DETERMINACIN DE LA DENSIDAD PARASITARIA Los mtodos ms usados para establecer la densidad parasitaria son dos: 7.2.1 7.2.1.1 Mtodo 1: Sistema de cruces (+) o mtodo simple (semicuantitativo)
7.2
Sistema indirecto, simple, usado rutinariamente que permite determinar el nmero de parsitos presentes por microlitro de sangre mediante la suma del total de parsitos observados en 100 campos. El resultado se deber informar de la siguiente manera: Cualquier numero inferior a 40 parsitos en 100 campos debe escribirse el nmero de parsitos encontrados en la lectura. Si observ ms de 40 parsitos, use la siguiente escala: +/2 De 40 a 60 parsitos en 100 campos + Un parsito por campo en 100 campos ++ De 2 a 20 parsito por campo en 100 campos +++ De 21 a 200 parsitos por campo en 100 campos ++++ Ms de 200 parsitos por campo en 100 campos Con un aumento de 750X, 100 campos microscpicos de inmersin, una muestra de gota gruesa bien preparada corresponde aproximadamente a 0,2 mL de sangre.
7.2.1.2
7.2.2 7.2.2.1
Mtodo 2: Clculo del nmero de parsito por microlitro de sangre Mtodo prctico, razonable y de precisin aceptable. El nmero de parsitos por microlitro de sangre se mide comparando el nmero de parsitos asexuados con el nmero de leucocitos en la gota gruesa en base a un recuento medio estimado en cerca de 6000 leucocitos por microlitro de sangre. Aunque existen variaciones este nmero nos permite comparaciones razonables, particularmente cuando se comparan densidades de muestras obtenidas sucesivamente del mismo paciente. Para poner en prctica este mtodo se necesitan dos contadores: uno para contar los parsitos y otro para los leucocitos.
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7.2.2.2 a. b.
Aplicar los siguientes criterios, segn se presente el caso: Si despus de contar 200 leucocitos, 10 ms parsitos han sido identificados y contados, anotar los resultados en los formatos de registro en trminos de nmero de parsitos por 200 leucocitos. Si despus de contar 200 leucocitos, menos de 10 parsitos han sido identificados y contados, continuar el recuento de leucocitos hasta Ilegar a 500 leucocitos, para luego anotar los resultados en los formatos de registro en trminos de nmero de parsitos por 500 leucocitos. En caso de parasitemia alta, realizar el recuento en funcin del nmero de parsitos, registrando su recuento hasta 500 y reemplazar su valor en la frmula con la cantidad de leucocitos encontrados. En cada caso, el nmero relativo de parsitos al nmero de leucocitos contados puede ser convertido a parsitos por microlitro de sangre usando la siguiente frmula: N de parsitos x 6000 = Parsitos / L N de leucocitos Donde: N de parsitos = Nmero de parsitos contados. N de leucocitos = Nmero de leucocitos contados. L= microlitro Ejemplos: Si se cuentan 205 leucocitos y 50 parsitos, al aplicar la frmula se tendr: Parsitos/ L = 50 x 6000 = 1463 205
c. 7.2.2.3
Si se cuentan 508 leucocitos y 7 parsitos, al aplicar la frmula se tendr: Parsitos/ L = 7 x 6000 = 83 508
Si se cuentan 501 parsitos y slo 95 leucocitos, al aplicar la formula se tendr: 501 x 6000 = 31 642 95 Como podemos observar las cantidades de 200 y 500 no siempre son exactas en la prctica del conteo. Parsitos/ L =
7.2.2.4
Si al finalizar los clculos, se obtienen cifras decimales redondear a nmeros enteros. Ejemplo: Parsitos / L = 68 x 6000 = 1990,24 esto es: 1990 p / L 205
7.2.2.5
En el caso de P. falciparum, el recuento se realiza de manera independiente para los estadios de trofozoito y gametocito. Para el recuento de P. vivax, todos los estadios ingresan al recuento sin independencia alguna.
MPR - CNSP - 017
7.3 7.3.1
REPORTE DE LA DENSIDAD PARASITARIA EN CASO DE MALARIA POR P. falciparum Si la infeccin malrica es por P. falciparum, adems de la densidad parasitaria, se debe registrar las fases de desarrollo de la siguiente manera: F F y Fg Fg = = = anillos nicamente anillos y gametocitos gametocitos nicamente
7.3.2
Cuando se detecta un caso positivo de malaria por P. falciparum, se debe reportar inmediatamente al jefe inmediato y realizar un seguimiento o control tomando muestras durante los das D3, D7 y D14. En caso de realizar la evaluacin de alguna droga antimalrica, el seguimiento de los pacientes se realizar los das D1, D2, D3, D7, D14, D21 y D28. Para garantizar el diagnstico en el seguimiento de un caso por P. falciparum, se debe observar como mnimo 300 campos microscpicos con la finalidad de detectar la ocurrencia de resistencia a la(s) droga(s) antimalrica(s) o recrudescencia de la infeccin. En caso de seguimiento a P. falciparum, se identificar la muestra con la clave original (primera muestra) en todas las lminas a tomarse, adicionando un nmero correlativo para cada una de ellas. Ejemplo: Clave original (201) 15 Claves de seguimiento (201) 15/1, (201) 15/2, (201) 15/3, etc.
7.3.3
7.3.4
7.3.5
El control de casos de malaria por P.vivax se realiza de la misma forma que para P. falciparum; esto es, determinando la densidad parasitaria los das D3, D7 y D14, a no ser que se est realizando alguna evaluacin de droga antimalrica para P. vivax.
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32
SECCIN VIII RESISTENCIA FARMACOLGICA
8.1
EVALUACIN DE LA RESISTENCIA DE P. falciparum A LOS MEDICAMENTOS ANTIMALRICOS MEDIANTE EL SEGUIMIENTO in vivo Para la evaluacin de la resistencia de P. falciparum a los antimalricos es necesario hacer un seguimiento del paciente, que consiste en la evaluacin de la densidad parasitaria (nmero de parsitos por microlitro de sangre) mediante el examen de la gota gruesa durante los das sealados denominados como das de control. El incremento o disminucin de la densidad parasitaria como respuesta a un antimalrico es considerado como respuesta parasitolgica. Un parsito es resistente a una droga cuando sobrevive a una concentracin de droga que anteriormente lo eliminaba. La vigilancia sistemtica de los fracasos del tratamiento en lugares donde se puede efectuar el diagnstico microscpico puede actuar como sistema de alerta acerca de los problemas de eficacia del tratamiento. Las pruebas in vivo e in vitro recomendadas por la OMS son dirigidas esencialmente a determinar el efecto de un medicamento sobre los parsitos y sirven para la adopcin de decisiones en el cambio de la poltica nacional de medicamentos antimalricos. Criterios de inclusin Personas enfermas con diagnstico parasitolgico a malaria por P. falciparum. Adems, la densidad parasitaria debe ser de 500 a 100,000 parsitos asexuados determinados por examen microscpico de gota gruesa. Edad > 2 aos. Fiebre, corroborada por temperatura axilar > de 37,5 C o antecedente de fiebre de 48 horas previas a la captacin. Monoinfeccin a P. falciparum. Malaria no complicada. Acceso geogrfico y disponibilidad del paciente para asistir regularmente al seguimiento. Hemoglobina > 5gr/dL o hematocrito > 15,0%. Consentimiento informado y autorizado con firma del paciente. En caso de nios, adems del asentimiento del menor, se deber contar con la autorizacin del padre, madre o tutor, en caso de imposibilidad de firmar, se tomar huella digital.
33
8.1.1
8.1.2
8.1.3
8.1.4 8.1.4.1 8.1.4.2
8.1.4.3 8.1.4.4
8.1.4.5 8.1.4.6 8.1.4.7 8.1.4.8 8.1.4.9
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8.1.5 8.1.5.1 8.1.5.2 8.1.5.3 8.1.5.4 8.1.5.5 8.1.5.6 8.1.6 8.1.6.1 8.1.6.2 8.1.6.3 8.1.6.4 8.1.6.5 8.1.7
Criterios de exclusin Mujeres embarazadas. Presencia de otras causas de fiebre o condiciones mdicas agudas o crnicas. Infecciones mixtas o de otras especies distintas de P. falciparum. Presencia de signos de alarma o malaria grave complicada. Antecedentes de hipersensibilidad a alguna de las drogas antimalricas en estudio. Contraindicaciones especficas del medicamento a ser utilizado. Procedimiento La identificacin del parsito, preparacin y examen de lminas y el conteo de parsitos se realizarn de acuerdo a los procedimientos correspondientes desarrollados en los Anexos A, C y D. Una vez enrolado el paciente es necesario que este regrese los das que le son sealados como das de control. El da del enrolamiento del paciente es considerado como da 0 de seguimiento. Todos los pacientes regresarn para sus controles los das 1, 2, 3, 7 y 14, pudiendo extenderse a los das 21 y 28, segn el nmero de das de seguimiento fijado. En cada da de control se realizar una evaluacin clnica del paciente, un examen de gota gruesa (para determinacin de densidad parasitaria) y evaluacin de temperatura axilar. Respuesta parasitolgica Esta se clasifica de la siguiente manera:
8.1.7.1
Resistencia tipo III (RIll): Si la densidad parasitaria del da 2 es del 100% del da 0. Si la densidad parasitaria del da 3 es < del 25% del da 0.
8.1.7.2
Resistencia tipo II (RII): Si la densidad parasitaria del da 3 es < del 25% del da 0, pero reaparece el da 7.
8.1.7.3
Resistencia tipo I (RI) temprana: Si la densidad parasitaria del da 3 es negativa, pero reaparece entre el da 4 y da 28 inclusive, o si la densidad parasitaria del da 3 es < 25% del da 0, el da 7 es negativa, pero reaparece despus del da 7.
8.1.7.4
Resistencia tipo I (RI) tarda: Considerando los criterios anteriores, pero la parasitemia aparece despus del da 14.
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34
8.1.7.5
Sensible Cuando la densidad parasitaria del da 3 es negativa < del 25% del da 0, y negativa entre el da 7 y da 28 inclusive.
Figura No 23. Respuesta parasitolgica al tratamiento antimalrico
8.1.8
Respuesta teraputica La respuesta teraputica se clasifica en tres categoras:
8.1.8.1
Fracaso precoz del tratamiento (FPT) Si el paciente presenta una de las siguientes situaciones durante los 3 primeros das de seguimiento:
a. b. 8.1.8.2
Presencia de signos de peligro o signos de malaria grave con presencia de parasitemia el da 1, 2 3. Si la densidad parasitaria del da 3 es > al 25% del da 0. Fracaso tardo del tratamiento (FTT) Si el paciente presenta una de las siguientes situaciones entre los das 4 y 28 de seguimiento, sin haber tenido anteriormente ninguno de los requisitos que lo calificaran como FPT:
a. b. c. 8.1.8.3
Presencia de signos de peligro o de malaria grave despus del da 3, con parasitemia de la misma especie que el da 0. Regreso no programado del paciente debido a deterioro clnico en presencia de parasitemia. Presencia de parasitemia entre el da 7 y el da 28. Respuesta Clnica Adecuada (RCA). Si el paciente no presenta ninguno de los criterios de FPT ni FTT y se confirma la desaparicin del parsito durante el perodo de seguimiento.
8.1.9 8.1.9.1 a.
Medicamentos estudiados Cloroquina Droga antimalrica de marcada y rpida accin esquizonticida sangunea contra todas las infecciones por P. malariae y P. ovale y contra las infecciones por P. falciparum y P. vivax sensibles a cloroquina.
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Ejerce tambin accin gametocitocida contra P. vivax, P. malariae y P. ovale, as como contra los gametocitos inmaduros de P. falciparum. No es activa contra las formas intrahepticas. b. Presenta una composicin qumica de 7-cloro (4-dietilamino-metilbutalamina) quinolena. Sus nombres comerciales son Aralen, Avovlar, Resoqun y Nivaquina. Se presenta en comprimidos de 50 mg 100 mg y 150 mg de base (como difosfato o sulfato), y en jarabe que contiene 50 mg de base (como difosfato o sulfato) por cada 5 mL (Anexo E). Sulfadoxina / pirimetamina Droga antimalrica de accin esquizonticida sangunea. Presenta una composicin qumica de N 5,6 dimetoxi-4-pirimidil sulfanolamida y de 2,4- diaminoclorefenil-6-etilpirimidina. Su nombre comercial es Fansidar. Su presentacin es en frascos de comprimidos. Cada comprimido contiene 500 mg de sulfadoxina con 25 mg de pirimetamina. Los resultados de las pruebas in vivo e in vitro realizadas para esta droga se registran en formularios recomendados por la OMS (Anexo E). Mefloquina Es un 4 quinolino-metanol qumicamente relacionada con la quinina. Es un potente esquizonticida sanguneo de accin prolongada contra P. falciparum. Es tambin sumamente activo contra P. vivax y P. malariae, y probablemente tambin contra P. ovale. No tiene una accin gametociticida ni contra las etapas tisulares de los plasmodia. Debido a su larga vida media de eliminacin y a la consiguiente concentracin subteraputica prolongada en la sangre, cabe preveer la aparicin de resistencia, especialmente en lugares con alta transmisin. La mefloquina se fija en gran medida a las protenas (98% en el plasma) y tiene una larga vida media de eliminacin que oscila entre 10 y 40 das en los adultos pero que tiende a ser ms corto en los nios y mujeres embarazadas (II y III trimestre). El metabolito principal, la carboximefloquina, aparece de dos a cuatro horas despus de la ingestin del medicamento de origen (quinolina metanol). La mefloquina puede usarse con fines teraputicos como quimioprofilctico. El principal problema de la mefloquina es la posibilidad de reacciones adversas neuropsiquitricas, adems de otros efectos colaterales como mareos, vmitos, diarreas, dolor abdominal as como la probabilidad de un mayor riesgo de estos eventos durante el embarazo y en personas que toman medicamentos cardioactivos. Artesunato El principio activo del artesunato es la artemisinina (compuesto de origen), aislado de la Artemisia annua. Es una lactona de sesquiterpeno con un puente de perxido; la fijacin de este perxido parece ser responsable de su accin antimalrica.
8.1.9.2 a. b.
c.
8.1.9.3 a. b.
c.
d. e.
8.1.9.4 a.
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b. c.
Esta droga antimalrica es un esquizonticida sanguneo de accin rpida. Puede ser administrado en terapia combinada , ya sea con sulfadoxina/pirimetamina o con mefloquina. De acuerdo a estudios clnicos realizados, la razn por la cual se administra mefloquina el segundo da de iniciado el tratamiento con artesunato es por que hay menos riesgos de vmitos, debido a que la afeccin clnica ha mejorado. Quinina La quinina es eficaz contra infecciones por P. falciparum resistentes a sulfadoxina/pirimetamina o a la combinacin de sulfadoxina /pirimetamina + artesunato o sulfadoxina /pirimetamina + mefloquina. En algunos lugares de Asia suroriental, donde la quinina se ha usado mucho para el tratamiento de la malaria, se ha detectado una disminucin de la sensibilidad a esta droga, especialmente en casos en que se administr tratamiento en un entorno no supervisado y en pacientes ambulatorios en un rgimen de ms de tres das. Aunque pesar de esto la quinina sigue siendo el medicamento de eleccin para tratar la malaria por P. falciparum grave y complicada. Las sales de quinina vienen en muchas formas diferentes, tanto en comprimidos como inyectables. Las ms comunes son clorhidrato de quinina y sulfato de quinina que contienen 82% y 82,6% de base de quinina, respectivamente. La presentacin en forma de bisulfato de quinina (con 59,2%) es la menos comn. EVALUACIN DE LA RESISTENCIA in vitro DE P. falciparum A LAS DROGAS ANTIMALARIAS Los estudios in vitro comparan las reacciones de los parsitos a los antimalricos bajo condiciones libres de interferencia de factores derivados del sistema inmunolgico humano. Al mismo tiempo son estudios complementarios de los estudios in vivo. Criterios de inclusin Personas enfermas con diagnstico parasitolgico positivo a P. falciparum nicamente. Densidad parasitaria > 1000 y < 80 000 parsitos asexuados / L. Malaria no complicada. Criterios de Exclusin Pacientes que hayan recibido tratamiento antimalrico con 4-aminoquinoleinas los ltimos 14 das o sulfadoxina/ pirimetamina en los ltimos 28 das. Pacientes muy enfermos o con vmitos, con antecedentes recientes de convulsiones, conciencia afectada, no poder sentarse o estar de pie. Pacientes positivos a la prueba de Dill-Glazko (evaluacin de excrecin de metabolitos antimalricos) Infecciones mixtas o de otras especies distintas de P. falciparum.
8.1.9.5 a.
b.
8.2 8.2.1
8.2.2 8.2.2.1 8.2.2.2 8.2.2.3 8.2.3 8.2.3.1 8.2.3.2 8.2.3.3 8.2.3.4
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8.2.4 8.2.4.1
Procedimiento Se emplear el estuche de microprueba in vitro (MARK II) que consiste en placas de ELISA para varias determinaciones con pozos que contienen drogas antimalricas en diferente concentracin. Estas placas son utilizadas para la evaluacin de la respuesta del P. falciparum a la cloroquina, sulfadoxina/ pirimetamina y otras drogas recomendadas por la OMS (1987)(Figura No 24). Pipetear 0,9 mL de medio RPMI completo en varios tubos Falcon de tapa de presin de 5 mL. Rotular adecuadamente los tubos y colocarlos en posicin vertical en la gradilla.
8.2.4.2 8.2.4.3
RPMI
Tubos con medio RPMI
Placas con droga impregnada Figura N 24. Materiales utilizados para la evaluacin de resistencia in vitro
8.2.4.4
Realizar puncin capilar o venosa y tomar 100L de sangre para transferirla rpidamente al tubo Falcon de 5 mL que contiene 0,9 mL de medio. De este modo estaremos preparando una solucin de 1/10 de la muestra obtenida (Figura No 25). El volumen final de la solucin 1/10 depender del nmero de drogas a evaluar. Presionar la tapa firmemente y agitar suavemente eI tubo para mezclar la sangre.
8.2.4.5 8.2.4.6
Figura N 25. Extraccin de 0,1 mL de sangre parasitada para diluir en 0,9 mL de medio.
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8.2.4.7
La mezcla sangre/medio (1/10) se mantendr estable varias horas y los tubos podrn transportarse con cuidado en el bolsillo del pecho o del pantaln, para mantener el contenido a una temperatura aproximada a la corporal. Si el tiempo de transporte es mayor a 4 horas, se mantendr conservado en hielo hmedo. Realizar las extensiones y preparaciones en gota gruesa previas al cultivo. Retira las tiras del precintado que cubren los pocillos de la placa (viene en el estuche de la microprueba)(Figura No 26).
8.2.4.8 8.2.4.9
Figura No 26. Retiro del precintado de la muestra.
8.2.4.10
Todos los pocillos de la fila apropiada (una fila por cada paciente analizado) se dosifican con 50 L de la mezcla sangre/medio (1:9) usando la pipeta eppendorf de 50 L y una punta estril desechable suministrada con el estuche. La dosificacin se efectuar empezando por el pocillo testigo (A) y se seguir por orden creciente de concentracin hasta el pocillo H (Figura No 27).
8.2.4.11
Figura No 27. Siembra de las muestras.
8.2.4.12
Agitar de vez en cuando la mezcla sangre/medio en el tubo de 5 mL para asegurar que la sangre se mantenga en suspensin y se distribuya por igual a todos los pocillos. Luego, quitar y descartar la punta desechable estril. Adaptar una nueva punta desechable estril a una pipeta eppendorf e instalar la prxima fila exactamente del mismo modo y as sucesivamente hasta que todas las muestras queden repartidas en partes alcuotas sobre la placa. Colocar la cubierta sobre la microplaca y con un lpiz graso escribir todos los detalles de cada paciente analizado sobre la fila correspondiente de la placa.
8.2.4.13
8.2.4.14
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8.2.4.15
Agitar la placa suavemente para tener la seguridad de que el frmaco depositado en los pocillos ha quedado completamente disuelto (Figura No 28).
Figura No 28. Agitar la placa luego de sembrar las muestras
8.2.4.16
Tomar el tarro de velas de la incubadora regulada para asegurar una temperatura interna de 37C en el tarro; es sumamente necesario precalentar el tarro durante una horas como mnimo y cargar con las placas que van a incubarse. Cuando la segunda vela est a punto de apagarse cerrar el grifo de evacuacin. Incubar el contenido a 37 C durante 24-30 horas (segn la fase de desarrollo de los trofozoitos en el frotis previo al cultivo)(Figura No 29).
8.2.4.17 8.2.4.18
Figura No 29. Incubacin de las muestras en estufa de C02.
8.2.4.19
Tras la incubacin, cosechar el contenido de los pocillos, quitando el lquido sobrenadante con tubos capilares de 50 L y traspasar los glbulos rojos depositados en el fondo plano de los pocillos a una lmina portaobjetos limpio, para formar una serie de gotas gruesas dispuestas en serie (Figura No 30).
Figura No 30. Cosecha de muestras luego de incubacin.
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40
8.2.4.20
Antes de teirlas, secar cuidadosamente las preparaciones en gota gruesa resultantes, pues de otro modo se desprendern espontneamente del portaobjetos. Normalmente se necesita 24 horas para secarlas al aire, pero este plazo puede acortarse secndolas en una estufa a 37C (30 minutos). Las preparaciones en gota gruesa se tien durante 30 minutos con giemsa diluido al 1% (v/v) en agua de pH 7,2 (Figura No 31).
8.2.4.21
Figura No 31. Coloracin de las gotas gruesas con giemsa.
8.2.4.22
Realizar la lectura de la gota gruesa para el recuento de esquizontes. Para que la prueba sea aceptable se tendr en cuenta que la poblacin de esquizontes maduros debe ser del 10% ms (es decir, 20 esquizontes con tres o ms ncleos por 200 parsitos asexuados). Para el caso de las preparaciones en gota gruesa con sulfadoxina/piremetamina (SP), se tendr en cuenta: presencia de trofozoitos, presencia de esquizontes con 3 a 7 ncleos, esquizontes anormales y esquizontes normales con 8 ncleos o ms. Asimismo, se tendr en cuenta el porcentaje de esquizontes maduros y el porcentaje de esquizontes inhibidos. Los resultados de las pruebas inmediatamente despus de conocerse se anotarn en las fichas adecuadas. Interpretacin de los resultados
Tabla No 4. Interpretacin de los resultados de evaluacin formolgica
8.2.4.23
8.2.4.24 8.2.4.5
DROGA
RESPUESTA SATISFACTORIA (inhibicin completa de esquizontes)
RESISTENCIA (crecimiento de esquizontes)
Cloroquina Mefloquina Quinina Amodiaquina Fansidar
4 pmol (*)
8 pmol 64 pmol 256 pmol 4 pmol > CI 90%
128 pmol
2 pmol
= CI 50%
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= CI 50%
SECCIN IX CONTROL DE CALIDAD EN EL DIAGNSTICO DE MALARIA 9.1 9.1.1 ACTIVIDADES DEL LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL Recepcin de lminas Recepciona el 100% de lminas positivas y 10% de lminas negativas de la produccin de muestras hemticas de los laboratorios de referencia regional y realiza la evaluacin de control de calidad en cuanto a reproductibilidad diagnstica y calidad tcnica de las lminas enviadas por el nivel regional. 9.1.2 Revisin Para la revisin de lminas se debe tener en cuenta los siguientes criterios: 9.1.2.1 Criterios de seleccin Revisa 10% de lminas negativas y selecciona las lminas positivas de acuerdo a los siguientes porcentajes: 10% de laminas positivas (+) 10% de lminas positivas (++) 10% de laminas positivas (+++) 100% de lminas positivas menores de +/2. 9.1.2.2 Criterios de evaluacin Realiza el control de calidad para evaluar: 9.1.3 Calidad de reproducibilidad diagnstica: 10 % de lminas negativas y todas las lminas positivas segn criterio de seleccin. Calidad tcnica de la muestra en gota y frotis: Revisa 10 % de lminas recibidas y registra los resultados en el formato CCM-2 .
Consolidado Consolida los resultados de reproducibilidad diagnstica y calidad tcnica de la muestra en el formato CCM-5.
9.1.4
Emisin de resultados Emite los resultados de control de calidad en el formato CCM-5, en un perodo no mayor de 3 semanas despus de recibir las lminas. Califica, de acuerdo a escalas, la reproducibilidad diagnstica y calidad tcnica de la muestra.
9.2 9.2.1
ACTIVIDADES DEL LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL, Y LABORATORIOS INTERMEDIOS Recepcin de lminas Recepciona la produccin de muestras hemticas de sus respectivos laboratorios intermedios y locales al 100 % de lminas positivas y negativas.
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9.2.2 9.2.2.1 a.
Revisin Criterios de seleccin Revisa 10% de lminas negativas y 10% de lminas positivas de cada una de las siguientes densidades parasitarias: +, ++, +++ y 100% de lminas positivas cuyas densidades son menores de +/2. Para la revisin de lminas utiliza el formato CCM-2 El personal recin capacitado y aquellos que tengan discordancias mayores al 2%, debern realizar la revisin de lminas, de acuerdo al siguiente porcentaje: 1ER. 2DO. 3ER. 4TO. Trimestre Trimestre Trimestre Trimestre 100 % de positivas y 100 % negativas 100 % de positivas y 50 % negativas 100 % de positivas y 25 % negativas 100 % de positivas y 10 % negativas
b.
Este esquema debe ser considerado, hasta que el personal evaluado logre superar los porcentajes de discordancias. 9.2.2.2 Criterios de evaluacin El nivel regional realiza el control de calidad tcnica para evaluar la calidad de muestra y la calidad de coloracin al 10 % de lminas recibidas, registrando los resultados en el formato CCM - 2, lo cual le permite tener un sistema de vigilancia permanente en la calidad diagnstica de la muestra pudiendo tomar decisiones de realizar supervisiones al nivel local e intermedio, si fuera el caso. 9.2.3 Consolidado Registra y consolida los resultados de produccin y control de calidad de las lminas de cada laboratorio evaluado en la fichas CCM-3. 9.2.4 Emisin de resultados Remite en forma trimestral al Laboratorio de Referencia Nacional de Malaria el informe de produccin y reproducibilidad diagnstica, en el formato CCM-3. Asimismo, remitir de manera inmediata los resultados de la calidad tcnica de gota gruesa y frotis, as como los de reproducibilidad diagnstica, a los niveles locales e intermedios de su jurisdiccin. Envia en el formato CCM-4 al nivel de referencia nacional la relacin del total de lminas. Cuando existan laboratorios intermedios, estos recibirn, revisarn y consolidarn la informacin con los mismos criterios del regional. El envo de informacin a su nivel superior lo har mensualmente. 9.3 9.3.1 ACTIVIDADES DEL NIVEL LOCAL Envo de lminas Todos los laboratorios locales que realicen diagnstico de malaria enviarn 100 % de positivas y
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100% de negativas, separando por grupos de lminas positivas y negativas, acompaado de su informe semanal, en el formato CCM-1. 9.4 RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL ENVIO DE LMINAS E INFORME DE RESULTADOS Del envo de lminas Las lminas al momento del envo deben estar limpias. Para ello, eliminar todo residuo de aceite de inmersin. El embalaje se har con cartn corrugado y asegurado con pabilo, a fin de evitar su deterioro o rotura. Es aceptable el envo de lminas hacia el nivel inmediato superior con un retraso de hasta una semana para el nivel local e intermedio y de un mes para el nivel de referencia regional . De la emisin de resultados El nivel de referencia regional emitir su resultado de control de calidad a los niveles intermedios de su jurisdiccin en un tiempo no mayor de quince das despus de recibir las lminas. El nivel intermedio emitir sus resultados en un tiempo de una semana. El nivel de referencia nacional emitir su resultado de control de calidad al nivel de referencia regional en un tiempo no mayor de 3 semanas despus de recibir las lminas. CRITERIOS DE EVALUACIN DE LA CALIDAD TCNICA DE LA LMINA DE GOTA GRUESA Calidad ptima de la toma de muestra De la gota gruesa - Ubicacin - Tamao - Calidad 9.5.1.2 Del frotis Tamao Ubicacin Extendido Identificacin : : : : 3 cm Del centro al borde externo de la lmina Fino, con cabeza cuerpo y cola Legible (fecha y nmero). : : : 1 a 1,5 cm. del tercio externo de la lmina 1 cm de lado 1 cm de dimetro 10 a 20 leucocitos por campo
9.4.1 9.4.1.1
9.4.1.2
9.4.1.3
9.4.2 9.4.2.1
9.4.2.2 9.4.2.3
9.5 9.5.1 9.5.1.1
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9.5.2
Calidad ptima de la coloracin

Tabla No 5. Caractersticas de la lmina de gota gruesa
DESHEMOGLOBINIZACIN TONALIDAD
Fondo libre de glbulos rojos. Coloracin del parsito: Ncleo: rojo grosella Citoplasma: azul cielo. Pigmento: amarillo sin brillo. Coloracin de leucocitos: Linfocitos: Citoplasma basfilo azul cielo Ncleo: azul oscuro. Grnulos inespecficos: rojo o azul. Monocitos: Citoplasma gris. Ncleo: azul tenue Neutrofilo: Citoplasma rosado. Ncleo: prpura. Eosinfilos: Citoplasma rosado. Granulos gruesos, rojo salmn. Basfilos: citoplasma y ncleo color azul . Granulaciones burdas.(grueso) Ausencia de precipitado de colorante
PRECIPITADO 9.5.3 9.5.3.1 9.5.3.2 Calidad del diagnstico
La reproducibilidad diagnstica se determinar revisando y confrontando el diagnstico emitido por el laboratorio a ser evaluado. Se considera error diagnstico la lmina que siendo positiva o negativa en el nivel evaluado, resulte negativa o positiva en el nivel evaluador (Tabla N 6).
Tabla No 6. Ejemplos de errores diagnsticos a la lectura de la lmina.
DIAGNSTICO Positivo Negativo 9.5.3.3 9.5.3.4
CONTROL DE CALIDAD Negativo Positivo
ERROR N x P (falso positivo) P x N (falso negativo)
Se considera error de especie cuando no presenta concordancia con el diagnstico positivo de especie reportado por el laboratorio que est siendo evaluado. La observacin microscpica de la revisin estar en relacin directa con la calidad y coloracin de la muestra, teniendo que observar como mnimo 100 campos microscpicos en una muestra bien preparada (10 a 20 leucocitos por campo). Si esto no se cumple, se emplear un factor de correccin (FC) cuyo resultado nos indicar el nmero de campos microscpicos a observar antes de considerar un error de diagnstico: FC = 6,000 x 0,2 X leucocitos en 10 campos
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9.5.4
Informe de resultados Los laboratorios del nivel local e intermedio elevarn sus resultados de diagnstico al nivel inmediato superior en el formato CCM-1. Este a su vez lo realizar utilizando el formato CCM-3 y CCM-4. Adjunto a este informe, se remitirn las lminas para su respectivo control de calidad separando las lminas positivas, negativas y discordantes. Asimismo, enviarn el total de lminas positivas a P. malarie y P. falciparum (en zonas de baja transmisin de esta especie).
9.5.5 9.5.5.1
Evaluacin El porcentaje mximo tolerable de discordancia es de 2%; cuando sea mayor, deber realizarse una supervisin directa para detectar las causas de la discordancia y corregirlo, dando sugerencias y pautas para ello. Escala de calificacin: a. Reproducibilidad : 98 % - 100 % 97 % - 95 % menos de 95 % 80 % - 100 % 70% - 79% menos de 70 % Bueno Regular Deficiente Bueno Regular Deficiente
b.
Tcnica:
9.5.5.2
Para la reproducibilidad y concordancia diagnstica, se determinar la concordancia y discordancia del total de lminas evaluadas expresado en porcentaje. Puntaje obtenido x 100 Puntaje total posible
Calificacin por evaluacin =
El porcentaje mximo de discordancia aceptable es 2%. Cuando sea mayor deber realizarse una supervisin directa para detectar las causas de la discordancia y corregirlo, dando sugerencias y pautas para ello. 9.6 9.6.1 SUPERVISIN DIRECTA A LOS LABORATORIOS El laboratorio de referencia regional realizar supervisiones peridicas a los laboratorios intermedios y locales de su jurisdiccin que realicen diagnstico parasitolgico de malaria; para evaluar el rendimiento del personal y mantenimiento de microscopios e insumos. La supervisin es necesaria por las siguientes razones: Confirmar si el trabajo que se est realizando est bien hecho y si el personal ha sido entrenado para ello. Facilitar y corregir errores en el procesamiento.
9.6.2 9.6.2.1 9.6.2.2
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9.6.2.3 9.6.2.4 9.6.3
Indicar la necesidad de readiestramiento. Proveer de una buena oportunidad de conversar con el supervisor de alguna dificultad en el trabajo. Las supervisiones podrn ser semestrales o cuando se requiera, segn el resultado de evaluaciones indirectas de control de calidad de muestras hemticas utilizando el formato de evaluacin y supervisin del laboratorio de malaria. El laboratorio evaluador preparar lminas con gran rigurosidad tcnica, confirmadas en cuanto a su positividad y negatividad, la que se aplicarn durante la supervisin a los laboratorios. TIPOS DE SUPERVISIN Supervisin directa En la supervisin directa se entrar en contacto con el encargado del control de calidad del diagnstico parasitolgico de malaria a travs de una visita por un perodo prolongado. El supervisor observar su trabajo y analizar las dificultades que tiene; adems, se tendr la oportunidad de discutir aspectos importantes de la ejecucin de los procesos, promoviendo soluciones que podran facilitar la labor del microscopista.
9.6.4
9.7 9.7.1
9.7.2
Supervisin indirecta En la supervisin indirecta se conoce el trabajo del personal a travs de las lminas enviadas peridicamente a un laboratorio de referencia para la evaluacin tcnica de la muestra, coloracin y reproducibilidad en el resultado de diagnstico, proceso que se conoce como control de calidad de gota gruesa.
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47
SECCIN X CULTIVO in vitro DE Plasmodium falciparum Los plasmodia pueden desarrollar y ser mantenidos en el laboratorio en su ciclo asexual en cultivos continuos in vitro. La tcnica est orientada a la obtencin de antgenos para estudios serolgicos, sensibilidad de los plasmodia a las drogas antimalricas y estudios de biologa molecular. El mantenimiento y cultivo de plasmodia se realiza en medio RPMI 1640 suplementada con HEPES y enriquecido con suero humano a una temperatura de 37C y una atmsfera de 5% de bixido de carbono y 5% de oxgeno. Los cultivos sern realizados segn la tcnica descrita por Trager y Jensen (1976) modificado por ellos en 1997. 10.1 10.1.1 10.1.2 10.1.3 10.1.4 10.1.5 10.1.6 10.1.7 10.1.8 10.1.9 10.1.10 10.1.11 10.2 10.2.1 10.2.2 10.2.3 10.2.4 10.2.5 10.2.6 10.2.7 EQUIPOS Cabina de flujo laminar Incubadora de C02 / 02 Refrigeradora 4C Congeladora de -20C Congeladora de -80C Centrfuga refrigerada Microscopio compuesto Autoclave Horno de 30C-300C Grid (accesorio de ocular para recuento de clulas) Dos contadores manuales para recuento de clulas REACTIVOS Medio RPMI 1640 HEPES Bicarbonato de sodio (Na HC02) Glutamine : N2 NCO (CH) (NH2) COOH Cloruro de sodio (NaCl) Gentamicina Agua bidestilada
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10.3 10.3.1 10.3.2 10.3.3 10.3.4 10.3.5 10.3.6 10.3.7 10.3.8 10.4 10.4.1
MATERIALES Frascos para cultivo celular o placas Petri Pipeteador mecnico. Filtros de 0,22 m, para botella con adaptador N 33 sistema de filtro completo de 250 mLy 500 mL de capacidad. Botellas de vidrio graduadas de 250, 500 y 1000 mL de capacidad. Beaker graduados de vidrio o polyacrilamida (de preferencia) de 100, 250, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 y 5000 mL de capacidad. Lminas portaobjetos con borde esmerilado pavonado. Pipetas graduadas de vidrio o descartables estriles de 1, 2, 5, 10 y 25 mL de capacidad. Pipetas pasteur estriles de punta larga. PREPARACIN DE MEDIO Y OTROS RPMI 1640 (Medio incompleto): RPMI 1640 c/s glutamine HEPES Bicarbonato de sodio Glutamine Agua bidestilada Gentamicina (10 mg / mL) 10, 5, 2, 0, 950, 2, 1 Litro 20 g 95 g 00 g 30 g 00 mL 5 mL
Ajustar el pH a 7,36, con hidrxido de sodio (NaOH) 1 N. Completar a 1L teniendo en cuenta el hidrxido de sodio (NaOH) empleado, para descontar al final. Esterilizar por filtracin al vaco. 10.4.2 10.4.2.1 10.4.2.2 10.4.2.3 10.4.3 10.4.3.1 Eritrocitos humanos del grupo "O" (Stock) Procedente de donantes. Colectar aspticamente con heparina, centrifugar a 2200 r.p.m. y separar el plasma. Transferir en frascos de 200 mL, mezclar con igual volumen de medio y guardar a 4C debidamente rotulado. Esto puede durar de 2 a 3 semanas en ptimas condiciones. SUERO HUMANO GRUPO "O" Colectar dentro de bolsas de sangre sin anticoagulante sangre de donantes que no hayan tenido infeccin de malaria por P. falciparum.
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10.4.3.2
Mantener a temperatura ambiente por un perodo de 3 a 5 horas para retraer el cogulo y centrifugar a 2500 r.p.m. por 10 minutos. Colectar en tubos para centrfuga de 50 mL en cantidades de 25 a 30 mL y guardar a -20oC hasta su uso. RPMI medio completo Descongelar el suero. Aadir suero al 10%. Guardar en refrigeracin a 4C. Lavado de glbulos rojos Desde el stock de glbulos rojos (frasco de 200 mL) tomar 25 mL y colocarlo en tubo de centrfuga de 50 mL. Centrifugar a 2200 r.p.m. por 5 minutos. Descartar el sobrenadante con una pipeta. Agregar medio incompleto, mezclar cuidadosamente y centrifugar a 2200 r.p.m. por 5 minutos. Descartar el sobrenadante y repetir el paso anterior 2 veces ms. Resuspender los glbulos rojos con medio completo al 50% para evitar su deterioro. Guardar en la refrigeradora. Recomendaciones Todos los procedimientos deben realizarse dentro de la cabina de flujo laminar. Los frascos o placas deben ser previamente rotulados con el nombre o nmero de la muestra, la fecha de inoculacin de los glbulos rojos parasitados, as como la lmina portaobjetos empleada para el recuento parasitario. PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE PARSITOS DE PACIENTES INFECTADOS POR Plasmodium falciparum Extraer sangre venosa en tubos al vaco heparinizados o con EDTA de 10 mL de capacidad. Tambin se puede extraer la sangre con una jeringa de 10 mL conteniendo heparina (200 UI) o ACA (1 mL por 10 mL de sangre). Transferir la sangre a un tubo cnico graduado de 50 mL y centrifugar a 1500 r.p.m. por 5 minutos.
10.4.3.3
10.4.4 10.4.4.1 10.4.4.2 10.4.4.3 10.4.5 10.4.5.1
10.4.5.2 10.4.5.3 10.4.5.4 10.4.5.5 10.4.5.6 10.4.5.7 10.4.6 10.4.6.1 10.4.6.2
10.5
10.5.1
10.5.2
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10.5.3
Separar el plasma y guardar en tubos para criopreservacin (crioviales) de 1,5 - 2 mL a temperatura de congelacin de -70 C. Lavar el sedimento (glbulos rojos) con medio RPMI incompleto por 3 veces, centrifugando a 1500 r.p.m. por 5 minutos cada vez. Despus de cada lavado retire cuidadosamente la capa de glbulos blancos por aspiracin con una pipeta pasteur. Resuspender los eritrocitos con medio completo hasta obtener un hematocrito final de 5 a 10 %. Esta operacin debe realizarse en el material donde se van a cultivar los parsitos, que puede ser en placas petri de 35X10 mm (1,5 mL), 60X15 mm (4 mL) 100X15 mm (8 mL). Asimismo, se puede cultivar haciendo uso de los frascos para cultivo celular con cuello inclinado de 25 cm2 75 cm2 (es lo ms recomendable para cultivo en masa). Incubar a 37 C en una atmsfera de 5% de CO2 y 5% de O2 en una estufa de CO2/O2. Estas condiciones tambin podran conseguirse haciendo uso de una campana de anaerobiosis o un desecador colocando una vela prendida en su interior, cerrar la campana o desecador, y luego la vela se apagar generando un ambiente de CO2. Cambiar el medio cada 24 horas y realizar dos frotices del sedimento (a partir del tercer da de siembra), fijar y teir para evaluar el porcentaje de parasitemia. AI segundo da de haber realizado el cultivo, agregue eritrocitos humanos grupo "O" no infectados. Cuando la parasitemia Ilegue al 6% u 8% los cultivos tambin debern ser diluidos con eritrocitos no infectados. Los porcentajes de parasitemias mayores de 8% son perjudiciales para el desenvolvimiento normal de los parsitos debido al acmulo de ellos y a la produccin de variaciones de pH en el medio por efectos de su metabolismo. CAMBIO DEL MEDIO DE CULTIVO Inclinar el frasco o placa suavemente y extraer el sobrenadante con una pipeta Pasteur. Del sedimento preparar dos lminas con frotis, para evaluar el porcentaje de parasitemia. Aadir medio completo (a temperatura ambiente), el mismo volumen que extrajo del frasco o placa, agitar suavemente para homogeneizar e incubar. AI momento de tapar los frascos estos no debern ser sellados hermticamente, sino que la tapa quedara ligeramente floja, para que ingrese CO2 / O2. Las lminas preparadas debern fijarse y colorearse para ser observadas en microscopio comn y con objetivo de inmersin, para evaluar la parasitemia. CRIOPRESERVACIN O CONGELAMIENTO DE LOS PARSITOS Las cepas de Plasmodium falciparum sern criopreservadas con porcentajes de parasitemias de 2% a 3% y con predominio de formas anulares.
10.5.4
10.5.5
10.5.6
10.5.7
10.5.8 10.5.9
10.5.10
10.6 10.6.1 10.6.2 10.6.3
10.6.4
10.7
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51
10.7.1 10.7.1.1 10.7.1.2 10.7.1.3 10.7.1.4 10.7.1.5
Reactivo de Criopreservacin (Para 200 mL): Glicerol Solucin de lactato de sodio Cloruro de potasio (KCI) Fosfato monobsico de sodio dihidratado NaH2P04 2H2O Agua bidestilada 114,20 g 4,40 g 0,07 g 0,15 g 100 mL
Mezclar bien y ajustar el pH a 6,8 con hidrxido de sodio 1 N. Ajustar el volumen a 200 mL y esterilizar por filtracin con filtro de 0,22 m. 10.7.2 10.7.2.1 10.7.2.2 10.7.2.3 10.7.2.4 10.7.2.5 10.7.2.6 10.7.2.7 10.7.3 10.7.3.1 10.7.3.2 10.7.3.3 10.7.3.4 10.7.3.5 10.7.3.6 10.7.3.7 Procedimiento Centrifugar el material de cultivo a 1500 r.p.m por 5 minutos. Descartar el sobrenadante y medir el volumen del sedimento. Aadir 0,4 volmenes de la solucin criopreservante gota a gota, por cada volumen del sedimento. Equilibrar a temperatura ambiente por 5 minutos. Agregar 1,2 volmenes de la solucin criopreservante gota a gota y mezclar cuidadosamente. Transferir con una pipeta estril en tubos para criopreservacin rotulados correctamente con el cdigo de la muestra, procedencia y la fecha de criopreservacin. Guardar los tubos dentro de una caja o bolsa con ranura y guardar a -70C, por un periodo de 48 horas, luego colocarlos en cajas portacrioviales y seguir guardando a -70C o en nitrgeno lquido. Descongelamiento de las cepas Introducir la muestra en bao Maria a 37 C. Medir el volumen de la muestra y colocar en un tubo de centrfuga de 15 mL. Agregar gota a gota. 0,9 mL de cloruro de sodio al 12 % (por cada mL de la muestra), mezclar suavemente y equilibrar a temperatura ambiente por 5 minutos. Agregar gota a gota, 6,2 mL de cloruro de sodio al 1,6% (por cada mL de la muestra) y mezclar suavemente. Centrifugar a 1500 r.p.m. por 5 minutos. Descartar el sobrenadante con una pipeta estril. Lavar nuevamente el sedimento con cloruro de sodio al 1,6% de la misma manera descrita anteriormente.
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10.7.3.8 10.7.3.9 10.7.3.10 10.8 10.8.1 10.8.2
Descartar el sobrenadante con una pipeta estril. Agregar medio completo y centrifugar a 1500 r.p.m. durante 5 minutos y descartar el sobrenadante. Resuspender los eritrocitos con medio completo para continuar con el cultivo de los parsitos. DETERMINACIN DEL PORCENTAJE DE PARASITEMIA EN FROTIS SANGUNEO Los frotices fijados y coloreados con giemsa se examinan con el objetivo de inmersin y empleando dos contadores manuales de clulas. La parasitemia se determina contando el nmero de eritrocitos infectados en un grupo de 1000 eritrocitos como mnimo. Si la parasitemia es muy baja (menor de 5%) se contar de 5 000 a 10 000 eritrocitos. Ejemplo: Eritrocitos contados 1 000 10 000 Eritrocitos infectados 80 80 Porcentaje de parasitemia 8,0% 0,8%
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SECCIN XI DIAGNSTICO INMUNOLGICO DE MALARIA 11.1 GENERALIDADES El inmunodiagnstico de malaria abarca mtodos que evalan la inmunidad humoral y celular del husped. Las metodologas son suficientemente sensibles y especficas para detectar las infecciones en las que la parasitemia es baja, diferenciar infecciones pasadas de la actual, la primoinfeccin de las recrudescencias y las reinfecciones. 11.1.2 11.1.2.1 Existen mtodos de diagnstico inmunolgico directo e indirecto: Los mtodos de diagnstico inmunolgico directo, como su nombre lo indica, detectan directamente la presencia del parsito mediante la captura de antgenos del parsito durante la infeccin, estas fracciones antignicas representan fracciones especficas de la molcula antignica. Entre las pruebas que tienen este fundamento podemos mencionar las pruebas inmunocromatogrficas (Parasight F, OptiMAL, ICT , PATH) y pruebas de ELISA directo. Los mtodos de diagnstico indirecto, detectan fundamentalmente anticuerpos (tambin inmunoglobulinas) que se producen en respuesta al estmulo antignico durante la infeccin del Plasmodium y su desarrollo biolgico en el husped vertebrado. Esta respuesta inmune hace posible el inmunodiagnstico. La inmunofluorescencia, la prueba de ELISA indirecta, el radioinmunoensayo (RIA) y la fitohemaglutinacin indirecta son mtodos serolgicos que se basan en este fundamento. En este manual se describirn las siguientes tcnicas: De inmunodiagnstico indirecto Prueba serolgica de "Inmunofluorescencia Indirecta" (IFI). De inmunodiagnstico directo Pruebas inmunocromatogrficas, Ilamadas tambin pruebas de diagnstico rpido o dipstick: - Parasight F - OptiMAL - ICT 11.2 11.2.1 TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) Esta prueba se considera de referencia en el serodiagnstico y seroepidemiologa de malaria, sirve para detectar anticuerpos en los sueros, determinar los ttulos de stos y seguir el curso de su produccin. Los antgenos se obtienen de cultivos continuos o sangre de personas que tienen una infeccin primaria activa, los cuales son fijados en lminas portaobjetos sobre las que se agrega el suero del paciente, que contienen anticuerpos contra el agente etiolgico (anticuerpo primario) y que se unirn al antgeno. Esta unin se podr visualizar mediante un microscopio de fluorescencia utilizando una antinmunoglobulina humana marcada con fluorescena (anticuerpo secundario). Es til en zonas endmicas de malaria para medir el grado de la endemicidad, verificar la presencia o ausencia de infecciones malricas, delimitar zonas malricas, detectar cambios estacionales de transmisin y evaluar actividades antimalricas. Asimismo, en zonas no endmicas de malaria puede ser utilizada para seleccionar donantes de sangre.
11.1.2.2
11.1.3
11.2.2
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11.2.3
Es importante mencionar que los antgenos homlogos detectan ttulos de anticuerpos en niveles ms elevados que los antgenos heterlogos y adems proveen informacin retrospectiva sobre la poblacin. Requisitos para lograr una prueba de IFI ptima Fuente de antgeno (proporcin de esquizonte). Preparacin y conservacin de antgenos en lminas. Diluyente de los sueros. Calidad de microscopio y fuente de iluminacin UV. Ventajas y desventajas El antgeno obtenido en cultivos es de superior calidad al obtenido en huspedes infectados. La probabilidad de tener reacciones cruzadas es menor al de otros ensayos como ELISA. Su sensibilidad es de 80 % y su especificidad de 99 %. El ttulo de cohorte es 1/16. Las lminas de inmunofluorescencia que contienen la suspensin antignica se pueden preservar con un agente desecador y por tiempos prolongados a temperatura ambiente, sin prdida de la actividad inmunolgica. Una limitacin para la ejecucin del ensayo es la disponibilidad de equipos especializados como microscopios de epifluorescencia, incubadora de CO2 para cultivo de cepas de P. falciparum con objeto de produccin de antgeno parasitario para preparacin de lminas. Materiales Frascos de vidrio de 1 L de capacidad. Lminas portaobjetos para IFI (12 excavaciones). Laminillas cubreobjetos. Micropipetas graduadas de: 1 - 10 L ; 10 - 100 L ; 100 - 1000 L. Micropipeta multicanal (8 canales). 10 - 100 L ; 100 - 1000 L. Tips. Microplacas de 96 hoyos. Pizetas.
11.2.4 11.2.4.1 11.2.4.2 11.2.4.3 11.2.4.4 11.2.5 11.2.5.1 11.2.5.2 11.2.5.3 11.2.5.4 11.2.5.5
11.2.5.6
11.2.6 11.2.6.1 11.2.6.2 11.2.6.3 11.2.6.4 11.2.6.5 11.2.6.6 11.2.6.7 11.2.6.8
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11.2.6.9 11.2.6.10 11.2.6.11
Papel aluminio. Bombillas de jebe. Bandejas Coplin.
Figura N 32. Materiales utilizados en la tcnica de inmunofluorescencia.
11.2.7 11.2.7.1 a. b. 11.2.7.2 a. b. 11.2.7.3 a. b. 11.2.7.4 a.
Reactivos Antgeno De Plasmodium vivax / Plasmodium falciparum y P. malariae, obtenidos a partir de sangre de individuos con infeccin primaria reciente (de preferencia) o a partir de cultivos continuos in vitro. La preparacin de lminas impregnadas con los antgenos correspondientes se describen en el Anexo G. Sueros Suero problema. Suero control positivo y negativo. Conjugados fluorescentes Conjugados fluorescentes: Anti IgG, anti IgM, anti Ig totales, marcados con isotiocianato de fluorescena (debidamente titulado). Para cada lote de conjugado que inicie se recomienda determinar el titulo ptimo de uso (Anexo H). Soluciones Solucin salina amortiguadora (PBS). Cloruro de sodio (NaCI) Fosfato disdico (NaHP04) Fosfato monosdico hidratado (NaH2P04.2H20) Agua destilada pH de la solucin: 7,6 8,500 g 1,280 g 0,156 g 1000 mL
b.
Solucin bloqueadora (albmina bovina al 1 % en PBS)

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c. d.
Glicerina al 10% en PBS Azul de evans al 1 % (opcional) Azul de Evans (Evans Blue) PBS pH 7,6 Equipos Estufa de 37C. Refrigeradora. Balanza. Potencimetro o cinta para medir el pH de soluciones. Bandeja para cmara hmeda. Agitador manual o elctrico. Microscopio de inmunofluorescencia. Reloj. Procedimiento Retirar las lminas con antgeno de la congeladora (-70C) y dejar secar a temperatura ambiente (Anexo E). Cubrir los antgenos con 15 L de solucin bloqueadora (con la finalidad de inactivar reacciones inespecficas), utilizando una micropipeta graduada y colocarlos en cmara hmeda a temperatura ambiente por 30 minutos. Paralelamente a la incubacin, realizar las diluciones de los sueros empleando las microplacas ELISA de acuerdo al siguiente esquema: Colocar 75 L de solucin bloqueadora en cada uno de los hoyos y 25 L de los sueros (controles positivo, negativos y sueros a ensayar) slo en el primer hoyo, mezclar y pasar 25 L de la mezcla al segundo hoyo, mezclar y pasar 25 L al tercer hoyo, y as sucesivamente. Lavar las lminas con PBS en una bandeja y sobre un vibrador elctrico durante 5 a 10 minutos por 3 veces. Retirar las lminas y secar cuidadosamente el exceso de PBS con un papel absorbente. Tomar 15 L de cada una de las diluciones (sueros positivos, negativos y muestras a ensayar) con una micropipeta y colocar uno a uno empezando por la concentracin ms baja. Siga el esquema adjunto (Tabla No7). Incubar las lminas en cmara hmeda a 37C por 30 minutos. Lavar las lminas de acuerdo al tem 11.2.8.4
0,500 g 50,00 mL
11.2.7.5 a. b. c. d. e. f. g. h. 11.2.8 11.2.8.1 11.2.8.2
11.2.8.3
11.2.8.4 11.2.8.5 11.2.8.6
11.2.8.7 11.2.8.8
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11.2.8.9
Agregar el conjugado marcado con isotiocianato de fluorescena previamente titulado conteniendo Azul de Evans (1:1000) diluido en solucin bloqueadora utilizando una micropipeta y colocar en cada hoyo 15 L de la solucin. Incubar las lminas de acuerdo al tem 11.2.8.4 en cmara hmeda a 37C por 30 minutos. Lavar las lminas de acuerdo al tem 11.2.8.4. Colocar el glicerol al 10% en PBS sobre la lmina y cubrir con la laminilla cubreobjetos. Examinar al microscopio de fluorescencia con objetivo 40X, ocular 10X y filtro de excitacin de 450- 520 nm.
Tabla No 7. Esquema de diluciones
11.2.8.10 11.2.8.11 11.2.8.12 11.2.8.13
DILUCION SUEROS Soluc. Bloq. Control Post. Mezclar y transf. Soluc. Bloq. Control Neg. Mezclar y transf. Soluc. Bloq. Muestra problema Mezclar y transf. (L) (L) (L) (L) (L) (L) (L) (L) (L)
1:4 (1) 75 25
1:16 (2) 75 25 (1) 75 25 (1) 75 25 (1)
1:64 (3) 75 25 (2) 75 25 (2) 75 25 (2)
1:256 (4) 75 25 (3) 75 25 (3) 75 25 (3)
1:1024 (5) 75 25 (4) 75 25 (4) 75 25 (4)
1:4096 (6) 75 25 (5) 75 25 (5) 75 25 (5)
75 25 25 75 25
11.2.9 11.2.9.1 a. b. c. d. e. 11.2.9.2 a. b.
Fallas comunes durante el procesamiento Falsos positivos Conjugados mal titulados. Reacciones cruzadas entre diferentes especies de plasmodios. Presencia de anticuerpos. Mezcla de distintos sueros en las lminas por confluencia. Presencia de factor reumatoide. Falsos negativos Iluminacin deficiente del microscopio. Conjugados mal titulados.
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c. d.
Sueros controles sin actividad inmunolgica. Conservacin inadecuada de los reactivos.
Figura N 33. Observacin microscpica por inmunofluorescencia de una reaccin positiva a anticuerpos contra P. falciparum.
11.2.10 11.2.10.1
Observacin microscpica Rutinariamente las lminas procesadas para observacin fluorescente deben ser examinadas al trmino de la ejecucin de la tcnica. Si esta ha sido aplicada como se recomend, la reaccin fluorescente debe observarse slo en el suero control positivo en presencia del antgeno y en los sueros a ensayar que tambin resulten positivos. Como ttulo del suero se considerar la mayor dilucin que presente fluorescencia. El suero es negativo cuando no hay fluorescencia. Para facilitar la observacin microscpica deber utilizarse una ficha de registro de resultados para prueba IFI, donde se anotarn reacciones positivas como presencia de fluorescencia y reacciones negativas como no fluorescentes, en sus respectivas diluciones de sueros y conjugados. Si la observacin no pudiera hacerse al trmino del procesamiento, se pueden guardar las lminas en oscuridad y refrigeracin 4C, hasta realizar la lectura al da siguiente. Considere que con el tiempo la fluorescencia disminuye. PRUEBAS RPIDAS PARA EL DIAGNSTICO DE MALARIA Las pruebas rpidas para el diagnstico malaria denominadas tambin pruebas inmunocromatogrficas o "dipstick", se basan en la deteccin de antgenos presentes en los parsitos del gnero Plasmodium, mediante reacciones antgeno - anticuerpo que se producen sobre tiras de nitrocelulosa (inmunocromatografa). Estas pruebas consisten en una tira de papel revestida por una membrana de nitrocelulosa, en la cual se han impregnado anticuerpos monoclonales o policlonales especficos para ciertos antgenos de las cuatro especies del gnero Plasmodium que parasitan al hombre. La reaccin ant59 Instituto Nacional de Salud
11.2.10.2
11.2.10.3
11.2.10.4
11.3 11.3.1
11.3.2
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geno- anticuerpo, en presencia del conjugado, expresa la formacin de una banda de color que es posible ser visualizada macroscpicamente. 11.3.3 11.3.4 Estas pruebas han sido validadas en diferentes partes del mundo alcanzando niveles de sensibilidad (S) y especificidad (E) ptimos mayores al 90% con relacin a la gota gruesa. La ventaja de esta prueba es fundamentalmente que los procedimientos se pueden ejecutar en un tiempo promedio de 15 a 20 minutos. Antgenos detectados mediante el uso de pruebas rpidas Protena II rica en Histidina ( PfHRP-II) Es una molcula soluble en agua, secretada por los estadios de trofozoitos y gametocitos jvenes del Plasmodium falciparum. Para la reaccin antgeno - anticuerpo utiliza un conjugado que contiene sulfonaminas (PATH, parasight) y oro coloidal (ICT), ligadas a un colorante para fijar la reaccin. Este antgeno puede seguir circulando en la sangre de la persona hasta por 72 horas despus de negativizarse la gota gruesa, fenmeno conocido como antigenemia. En el mercado existen varios kits que utilizan PfHRP-II como fuente de antgeno, entre ellos tenemos: Parasight f, PATH, ICT Pf, ICT Pf/Pv, etc. Lactato deshidrogenasa (pLDH) Es una isoenzima glicoltica producida y expresada en altos niveles durante el estadio eritroctico del parsito, por tanto es producida nicamente por parsitos vivos de las diferentes especies de Plasmodium. Esta prueba tambin utiliza tiras de nitrocelulosa, las cuales contienen un "pool" de anticuerpos de carcter monoclonal dirigidos especficamente hacia una eptope de la pLDH. Esta reaccin antgeno - anticuerpo es fijada por la presencia de anti-anticuerpos policlonales contenidos en la solucin de conjugado en soportes de liposomas ligados a un colorante que permite la visualizacin de los resultados. En el mercado existen kits que pueden detectar las 4 especies de este gnero que parasitan al hombre, pero slo pueden diferenciar P. falciparum de los no falciparum, ms no distingue entre P. vivax, P.malariae y P. ovale. Existen tambien otros antgenos que estn presentes en las cuatro especies de Plasmodium, que son utilizados en combinacin a la deteccin de la PfHRP II de P. falciparum. Estos se denominan "antgenos pan malricos". Limitaciones de las pruebas rpidas En el caso de las que detectan HRP-II, son especficas para P. falciparum.
11.3.5 11.3.5.1 a. b. c. d. 11.3.5.2 a.
b.
c.
11.3.5.3
11.3.6 11.3.6.1
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11.3.6.2 11.3.6.3
No permiten la cuantificacin parasitaria. Presenta fenmeno de antigenemia (presencia de HRP-II circulante hasta 72 horas despus de que el paciente es gota gruesa negativo a la infeccin por P. falciparum). Detecta parasitemias por encima de 100 parsitos / L sangre. El umbral de deteccin de estas pruebas disminuyen en parasitemias bajas. Presenta reaccin cruzada con el factor reumatoideo en el caso de HRP-II, y leishmaniasis en el caso de LDH. Detecta antgenos producidos por gametocitos inmaduros, que pueden persistir posteriormente al tratamiento, lo cual puede llevar a una falsa interpretacin del resultado. El costo vara de $ 1,50 - 3,00. No es posible diferenciar especies entre P. vivax, P. malariae y P. ovale. No detecta infecciones mixtas.
11.3.6.4 11.3.6.5 11.3.6.6
11.3.6.7
11.3.6.8 11.3.6.9 11.3.6.10
11.3.7 11.3.7.1 11.3.7.2 11.3.7.3 11.3.7.4
Ventajas de las pruebas rpidas Emplea poco tiempo de proceso (entre 10 a 20 minutos). Tiene buen porcentaje de especificidad y sensibilidad. Muy til en comunidades rurales donde no se cuenta con microscopio ptico. Puede ser usado como prueba confirmatoria de gota gruesa en caso de dudas por falta de entrenamiento del microscopista. Son de fcil uso e interpretacin y no requieren microscopios ni personal especializado. Pueden detectar una infeccin cuando los parsitos se encuentran secuestrados en los vasos (pLDH).
11.3.7.5 11.3.7.6
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Tabla No 8. Investigaciones de pruebas rpidas realizadas por el Instituto Nacional de Salud

AO 1998 PRUEBA RPIDA Sensibilidad Especificidad ESPECIE Path OptiMAL FLOW (1era Generacin) 1999 OptiMAL FLOW (1era Generacin) 97,1 % 97,8 % 89,4 % 88,5 % 97,2 % 93,2 % 99,4 % 90,1 % P.f P.f P.v Pf/Pv
PUBLICACIN
Stanies GM, MarquioW, Paradve B, Roper M, Cabezas C, Noriega V, et al. Assessment of two immunochromatographic strip test for the rapid diagnossis of P. falciparum and P. vivax en Iquitos-Per. Am J Trop Med Hyg 1998; 59 (Suppl ): 112 -3. Marquio W, Cabezas C, Arrspide N, Gutirrez S, Calampa C, Naupay R. et al. Evaluation of the use of an immunocromatographic rapid test for malaria diagnosis by village health promotors in rural areas of the peruvian amazon. Am J Trop Med Hyg 2000; 62 (Suppl): 278-9. Gutirrez S, Arrspide N, Pardave B. Sensitivity and specificity of rapid immunochromatographic test (OptiMAL) for diagnossis of malaria peruvian coast region. Am J Trop Med Hyg 2001; 65 (Suppl): 319. Arrspide N, Gutierrez S, Ylquimiche L, Hermeregildo Y, Palacios A, Alva V, et al. Assessment of an immunocrhomatografic assay (ICT malaria P. falciparum / P. vivax) for diagnosing malaria by health technical personel in three sites in the norhten region of Per. Am J Trop Med Hyg 2001; 65 (Suppl): 319. Arrspide N, Puray M, Guzmn E, Verano M, Medina del Rosario X, Mendizbal L, et al. Uso de pruebas rpidas para la deteccin de Plasmodium falciparum en donantes de sangre en Per. Rev Peru Med Exp Salud Publica 2002; 19(Supl). S11. Arrspide N, Puray M, Guzmn E, Verano M, Medina del Rosario X, Mendizbal L, et al. Estudio multicntrico de DIAMED Optimal para el diagnstico de P.falciparum y P.vivax en reas endmicas del Per-2001. Rev Peru Med Exp Salud Publica 2002; 19(Supl). S11.
1999
OptiMAL FLOW (1era Generacin) ICT Pf/Pv
87,3 % 100,0 % 94,0 % 75,8 %
99,0 % 99,6 % 98,5 % 97,8 %
P.f P.v P.f P.v
2000
2001
OptiMAL Diamed
100,0 %
98,0 %
P.f
2001
OptiMAL Diamed
90,5 % 92,0 %
97,3 % 99,0 %
Pf P.v
11.4 11.4.1 11.4.1.1
PRUEBAS EXISTENTES EN EL MERCADO Prueba que detecta HRPII ( ICT AMRAD Pf/Pv ) El ICT AMRAD Pf/Pv para el diagnstico de malaria es una prueba rpida de inmunodiagnstico in vitro para la deteccin de antgenos de Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax en sangre entera (Figuras No34 y No35).
Figura N 34. ICT AMRAD Pf/Pv Presentacin comercial de la tira ICT AMRAD Pf/Pv
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Buffer
Membrana de nitrocelulosa
Figura No35. Partes de la tira de ICT
11.4.1.2
Esta prueba utiliza dos anticuerpos que han sido inmovilizados formando lneas separadas a travs de una lmina de test. Un anticuerpo (rea de prueba 1) es especfico para el antgeno de P. falciparum de protena II, rica en histidina (P.f.HRPII). El otro anticuerpo (rea de test 2) es especfico para un antgeno de malaria que es comn tanto para la especie de P. falciparum y P. vivax. El procedimiento consiste en aplicar sangre entera (15L) a una almohadilla de muestra impregnada con anticuerpos agregados a oro coloidal que apuntan a los dos antgenos de malaria (Figura No 36).
Figura No36. Procedimientos para realizar la prueba utilizando ICT AMRAD Pf/Pv (8 pasos)
c.
1
Abrir la tarjeta y colocarla sobre la mesa. Obtener sangre del dedo con un capilar.
3
Aplicar la sangre sobre la almohadilla color lila.
4
Aplicar una gota del reactivo A por encima de la muestra.
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63
5
Aplicar 2 gotas del reactivo A por debajo de la muestra.
6
Dejar que la sangre ascienda a lo largo de toda la columna hasta que llegue a la base de la almohadilla (1 minuto). Para ello invierta la tarjeta.
7
Aplicar 4 gotas del reactivo A en la almohadilla de la contratapa de la tarjeta.
8
Retirar la cinta adhesiva y cerrar la tarjeta. Espere la visualizacin de las bandas y anote los resultados.
d.
Cuando se aplica una muestra positiva, los antgenos de malaria se juntan a los anticuerpos adheridos al oro coloidal en la almohadilla, y los complejos inmunes que se forman emigran a lo largo de la lmina de la prueba donde son capturados por los anticuerpos inmovilizados. Una vez que ocurre la captura, se forma una lnea rosada en el rea 1 y/o 2 de la ventana del test. Estas lneas no se forman cuando se aplica una muestra negativa. Si el test ha sido ejecutado correctamente, en el rea C de la ventana del test asomar una lnea de procedimiento de control (Figura No 37).
Figura N 37. Interpretacin
NEGATIVO
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POSITIVO: P. vivax
POSITIVO: P. falciparum
POSITIVO: P. falciparum
e.
Este kit diagnstico no necesita refrigeracin, sus componentes pueden ser conservados a temperatura medio ambiente. Entre las limitaciones de la prueba podemos mencionar la incapacidad para especificar infecciones mixtas y el hecho de que puede ser positiva siendo el paciente gota gruesa negativo, esto por el fenmeno de antigenemia propia de la protena de P.f.HRP2 como en el caso del PATH y Parasight. Prueba que detecta LDH (OptiMAL) Es otra prueba inmunolgica en estudio basada en la deteccin de la isoenzima lactato-deshidrogenasa (LDH) del parsito vivo y que puede diferenciar la especie del parsito, P. falciparum y P. vivax. (Figuras No 38, No 39 y No 40).
f.
11.4.2
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65
Figura N 38. Procedimientos para realizar la prueba utilizando OptiMAL (10 pasos)
Coloque un microtubo con conjugado y un microtubo para lavado en porta-tubos.
Dispense una gota del buffer en el microtubo de conjugado y cuatro gotas en el microtubo de lavado y espere un minuto.
Limpie aspticamente la superficie de la piel y pinche el dedo utilizando siempre una nueva lanceta. Deposite la sangre en la pipeta plstica.
Dispense una gota de sangre en el microtubo con conjugado.
Mezcle suavemente con el extremo sellado de la pipeta y espere un minuto.
Coloque la tira verticalmente en el microtubo con conjugado.
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Deje la tira de 10 a quince 15 minutos
Transfiera la tira del microtubo del conjugado al microtubo para lavado
Deje la tira en el microtubo de lavado hasta que el campo de reaccin se aclare (5 - 10 m).
Lea los resultados
P.v
P.f
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Figura No39. Procedimientos para realizar la prueba utilizando la presentacin individual OptiMAL (11 pasos)
Escribir aqu
1
Con un lpiz escribir el cdigo del paciente y la fecha de obtencin de muestra
Destapar los pocillos y agregar una gota del buffer, dentro del pocillo con fondo violeta, que contiene el conjugado.
Agregar 4 gotas del buffer dentro del segundo pocillo con fondo transparente
4
Limpiar aspticamente la superficie de la yema del dedo y colectar la sangre, para ello presionar el capilar y aspirar hasta que la sangre suba a la altura de 1 cm.
5
Presionar el capilar para dejar caer la sangre en el pocillo de fondo violeta que contiene el buffer.
6
Utilizando el extremo del capilar (forma de paleta), mezclar la sangre con el buffer. Esto demora aproximadamente 1 minuto.
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7
Retirar la tira del estuche.
8
Introduzca la tira dentro del pocillo que contiene la sangre.
9
Esperar 10 minutos hasta que la sangre haya migrado por la tira.
10
Transferir la tira al pocillo que contiene el reactivo o buffer del lavado.
QUEBRAR AQU
11
Tapar los pocillos y eliminarlos, quebrando el estuche por las marcas sealadas.
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69
Figura No 40. Interpretacin de bandas en OptiMAL
NEGATIVO
P.vivax
P. falciparum
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70
BIBLIOGRAFA 1. Arrspide N, Gutierrez S, Ylquimiche L, Hermeregildo Y, Palacios A, Alva V, et al. Assessment of an immunocrhomatografic assay (ICT malaria P. falciparum / P. vivax) for diagnosing malaria by health technical personel in three sites in the northen region of Peru. Am J Trop Med Hyg 1998; 65 (Suppl): 319. Arrspide N, Puray M, Guzmn E, Verano M, Medina Del Rosario X, Mendizbal L, et al. Uso de pruebas rpidas para la deteccin de Plasmodium falciparum en donantes de sangre en Per. Rev Peru Med Exp Salud Publica 2002; 19(Supl): 11. Arrspide N, Puray M, Guzmn E, Verano M, Medina Del Rosario X, Mendizbal L, et al. Estudio multicntrico de DIAMED Optimal para el diagnstico de P. falciparum y P. vivax en reas endmicas del Per-2001. Rev Peru Med Exp Salud Publica 2002; 19(supl): 11. Almeida-Filho J. Prueba sencillas para determinar sulfonamidas en orina. Boletn de la Oficina Sanitaria Panamericana 1983; 10: 378-9. Ambroise-Thomas, P. L'inmunofluorescence dans la serologie du palidisme. Ginebra: WHO/ MAL; 1981;81.953:1-6. Beadle C, Long GW, Weiss WR. Diagnosis of malaria by detection of Plasmodium falciparum HRPII antigen with a rapid dipstick antigen capture assay. Lancet 1994; 343: 564-8. Fajfar JO, Collins WE, Ristec M. In vitro and in vivo adaptation of the Geneve/SGE-1 strain of Plasmodium falciparum to growth in a squirrel monkey (Saimiri Sciureus) model. Am J Trop Med Hyg 1987; 36(2): 221-227. Garca J, Ngirabega JD, Soldevila M, Navarro R, Bada JL. Evolution of resistence of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs in Rwanda 1985-1987. Tran R Soc Trop Med Hyg 1989; 83: 490. Gutierrz S, Arrspide N, Pardav B. Sensitivity and specificity of rapid immunochromatographic test (OptiMAL) for diagnossis of malaria peruvian coast region. Am J Trop Med Hyg 2001; 65 (Suppl): 319. Hall CI, Haynes JD. Cultured Plasmodium falciparum used as in a malaria indirect fluorescent antibody test. Am J Trop Med Hyg 1978; 27: 849-52. Jensen B. In vitro cultivation of malaria parasites. In: W H Mc. Gregor Sir I (eds): Malaria principles and practics of malariology.Vol. I. Wernsdorfer. London: Churchill Livingstone. p. 307-29. Jelinek T, Grobush MP, Schwenke S, Steildl S, Von Sonnenburg F, Nothdurft HD, et al. Sensitivity and specificity of dipstick tests for rapid diagnosis of malaria in nonimmune travelers. J Clin Microbiol 1999; 37: 721-3.
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3.
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15. 16. 17. 18. 19. 20.
21.
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29. 30.
31. 32. 33. 34.
35. 36. 37. 38. 39.
40. 41. 42.
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73
ANEXOS ANEXO A LIMPIEZA Y ALMACENAJE DE LAMINAS PORTAOBJETO A.1 A.1.1 Recomendaciones Las lminas portaobjeto a utilizarse en la toma de muestra hemticas para el diagnstico de malaria mediante el examen de gota gruesa y el frotis deben ser secadas correctamente antes de ser usadas o almacenadas. No poner muchas lminas en el recipiente o lavadero, ya que esto favorece que unas rayen a otras. Las lminas limpias deben ser recogidas solamente por los bordes, para evitar dejar sobre su superficie grasa o suciedad de los dedos. Es mejor descartar las lminas portaobjetos cuando: tengan coloracin iridiscente, estn opacas, presentan rayaduras, rajaduras u otras alteraciones de la superficie. LIMPIEZA DE LMINAS NUEVAS Lavar las lminas con detergente (remojndolas durante 30 minutos en agua con detergente). Enjugarlas con agua a "chorro continuo", o cambiando el agua varias veces si se enjuagan en un recipiente. Utilizar una esponja para lavar cada lmina en forma individual, secarla luego con un trozo de tela de algodn limpia. LIMPIEZA DE LMINAS USADAS Sumergir las lminas por 60 minutos en una solucin de hipoclorito de sodio (leja) antes de lavarlas. Lavarlas, una por una, con agua jabonosa caliente y frotar ambas caras con un cepillo. Limpiar, uno por uno, con una gasa o torunda de algodn. Squelas con un pao limpio de algodn. Los portaobjetos ligeramente rayados, inservibles para las extensiones sanguneas, pueden aprovecharse en otros laboratorios. A.4 ALMACENAMIENTO Para su almacenamiento se pueden envolver en papel delgado, en conjunto de 10 ms lminas limpias. Los paquetes as formados se deben guardar en lugares secos (evitando la exposicin al polvo y humedad), de donde se tomarn cuando sean necesarias.
MPR - CNSP - 017 74 Instituto Nacional de Salud
A.1.2 A.1.3 A.1.4 A.2 A.2.1 A.2.2 A.2.3 A.3 A.3.1 A.3.2 A.3.3 A.3.4
SOLICITUD DE GOTA GRUESA MALARIA

Localidad.....................................................................................................

Nombre del paciente...................................................................................

Procedencia................................................ Edad................ Sexo..............

Direccin actual ..........................................................................................

Diagnstico................................... Control .............. Da de tto...................

Tratamiento y N de pastillas.......................................................................

Nombre del solicitante..................................................................................

Laboratorio........................................
Microscopista ............................
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SOLICITUD DE GOTA GRUESA MALARIA

No................................ Localidad..................................................................................................... Nombre del paciente................................................................................... Procedencia................................................ Edad................ Sexo.............. Direccin actual .......................................................................................... Diagnstico................................... Control .............. Da de tto................... Fecha de toma........................................... Tratamiento y N de pastillas....................................................................... Nombre del solicitante.................................................................................. Fecha de examen ................................... Resultado.................................. Laboratorio........................................ Microscopista ............................
No................................
ANEXO B
FORMATO: SOLICITUD DE GOTA GRUESA
75
Fecha de toma...........................................
Fecha de examen ................................... Resultado..................................
ANEXO C PRECOLORACION DE LA GOTA GRUESA La precoloracin es el tratamiento de la gota gruesa con azul de metileno fosfatado, que se realiza en el campo antes de someterla al proceso completo de coloracin. Tiene por objeto procurar una mejor coloracin y por ende, facilitar el diagnstico; adems, evita que las lminas que se demoran en el campo se contaminen con hongos, la precoloracin debe hacerse no antes de 2 horas ni despus de 24 horas de tomada la muestra. Si se hace antes de las dos horas la gota se desprende y se pierde la muestra. Si se hace despus de 24 horas la sangre se reseca, la deshemoglobinizacin se dificulta o la gota se contamina con hongos. C.1 C.1.1 TCNICAS DE LA PRECOLORACIN Preparar la solucin de azul de metileno fosfatado siguiendo las indicaciones del sobre (diluir un gramo en 1/4 de litro de agua destilada). Preparar tambin el agua amortiguada siguiendo las indicaciones del sobre. Las soluciones as preparadas se guardarn cada una en un frasco diferente. La solucin azul de metileno podr ser usada hasta que se observen precipitaciones, de acuerdo al volumen de muestras deshemoglobinizadas, al cabo de las cuales, se desecha y se prepara nuevamente. En un vaso verter la solucin de azul de metileno en cantidad suficiente de manera que en una lmina en posicin vertical sea cubierta la gota gruesa por la solucin. Contar "uno", "dos" "tres", (tres segundos), sacarla inmediatamente y hacerla escurrir verticalmente sobre una esponja de plstico o papel absorbente. Tener la precaucin de no dejar el "extendido" del lado en que se encuentra la identificacin de la muestra; porque si se mojara esta se perdera. En un vaso que contenga agua tamponada, hacer el primer enjuague, introduciendo la lmina hasta que el agua cubra la gota. Mantenerla introducida mientras se cuenta "uno", "dos". Sacarla inmediatamente despus y hacerla escurrir nuevamente sobre la esponja de plstico o el papel absorbente. En otro vaso que contenga agua tamponada, hacer el segundo enjuague, introduciendo la lmina hasta que cubra nicamente la gota, sucesiva y rpidamente de 5 a 10 veces, inmediatamente despus hacerla escurrir, por tercera vez, en la esponja. Dejar que seque la gota, colocndola verticalmente en un soporte de madera . MTODO DE WALKER Sumergir la lmina en solucin de azul de metileno por dos segundos. Eliminar el exceso de colorante enjuagando en agua amortiguadora hasta que los bordes de la muestra se tornen ligeramente gris azulado. El lavado contina hasta que se elimine el color rojo. Secar las lminas en calor suave y envolverlas con su ficha para ser remitida al centro de diagnstico para la coloracin con giemsa.
C.1.2
C.1.3
C.1.4
C.1.5
C.1.6 C.2 C.2.1 C.2.2 C.2.3
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Azul de metileno fosfatado - Cloruro de azul de metileno (medicinal) - Ortofosfato disdico anhidro - Ortofosfato monopotsico 1,0 g 3,0 g 1,0 g
Mezclar completamente en un mortero seco; disolver un gramo de la mezcla en 300 mL de agua destilada y filtrar en papel filtro No 4. Embalaje y envio Despus de la precoloracin, cada lmina o grupo de lminas deben envolverse en el formulario correspondiente de solicitud de diagnstico de malaria, proporcionado por el Ministerio de Salud. Para enviar las muestras al laboratorio correspondiente, se har un paquete cuidadosamente protegido con cartn y marcando la direccin correspondiente, indicando: Nombre del destinatario. Nombre del remitente. Cantidad de lminas remitidas.
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77
ANEXO D PREPARACIN DE COLORANTES Y SOLUCIONES
D.1 D.1.1
PREPARACIN DE LA SOLUCIN GIEMSA (STOCK) Frmula Colorante giemsa en polvo, certificado Alcohol metlico puro (sin acetona) Glicerina pura * Cantidades para 100 mL de solucin "madre". 0,75 g 65,00 mL 35,00 mL
D.1.2
Procedimiento Mezclar el giemsa en polvo con el alcohol metlico puro y la glicerina en un baln con perlas de vidrio y agitarlo en crculos fuertemente para conseguir una buena disolucin del colorante. Filtrar pequeas cantidades y experimentar con muestras hemticas, si los elementos se colorean adecuadamente el colorante esta listo para ser filtrado en el papel filtro N 4 en un embudo hacia un frasco color caramelo.
D.1.3
Recomendaciones El colorante es un elemento de suma importancia para el diagnstico parasitolgico, por lo tanto, debe ser preparado y almacenado con mucho cuidado. Para ello se deben tomar en cuenta las siguientes indicaciones:
D.1.3.1 D.1.3.2 D.1.3.3 D.1.3.4 D.1.3.5
El material de vidrio empleado en su preparacin debe estar limpio, seco y sin residuos de detergente. El material de vidrio para almacenar la solucin "madre" debe igualmente estar limpio y seco. Nunca se debe aadir agua a la solucin "madre" del colorante porque produce su completo deterioro. El frasco de almacenamiento no se debe nunca agitar antes de usar porque suspendera cristales que pudieran encontrarse en el fondo, perjudicando la coloracin. Nunca regrese el colorante no utilizado a las botellas que contengan la solucin "madre" por ello es mejor medir las cantidades de acuerdo a la cantidad de muestras. PREPARACIN DE LA SOLUCIN: AGUA AMORTIGUADORA Frmula Ortofosfato disdico anhidro (Na2HPO4) Ortofosfato monopotsico (KH2PO4) 4g 5g
D.2 D.2.1
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D.2.2
Procedimiento Tomar 1 g de la mezcla de las sales y disolver en 1 litro de agua destilada, agitar y ajustar a pH 7,2
D.2.3
Recomendaciones Las sustancias amortiguadoras actan como un elemento qumico inactivador de cantidades variables de cido o lcali. En trminos generales la reaccin de los diluyentes que haban dado mejores resultados se acercaba al punto de neutralidad (pH 7,0). En la prctica, la escala oscila generalmente entre un pH 6,6 - 7,4 que es por coincidencia, la escala del indicador rojo de fenol. El ortofosfato disdico y el ortofosfato monopotsico son las sales amortiguadoras que se usan con ms frecuencia. En la prctica, se puede preparar rpidamente soluciones amortiguadoras eficaces agregando 1 g de mezcla de sales de sodio y de potasio por cada litro de agua destilada en la proporcin de 4:5 en cualquier otra proporcin que haya resultado satisfactoria. Se mezclan perfectamente dichas sales en las proporciones seleccionadas, se pesa el polvo homogneo en lotes de un gramo y se puede envolver en papel glasine o bien disolver en pequeas cantidades de agua. Actualmente existen buffers en tabletas para diluir como el BUFFER GURR DE GIBCO.
D.2.4 D.2.4.1
Preparacin de colorante diluido Procedimiento Utilizar una probeta de vidrio para diluir el colorante. Preparar la solucin de trabajo diluyendo la solucin "madre" 1/10, con agua destilada o solucin amortiguadora de pH 7,2 (puede ser reemplazada por agua de Iluvia o agua hervida fra). Solucin "madre" giemsa Agua destilada 0,100 mL 0,900 mL
Una forma sencilla de preparar la dilucin es agregando 2 gotas de solucin "madre" por mililitro de agua destilada o solucin amortiguadora. D.2.5 Preparacin de solucin: luz azul cielo Para el diagnstico parasitolgico de malaria no se puede utilizar luz solar directa debido al principio fsico de reflexin de la luz, por esta misma razn se deben descartar focos de vidrio transparente reemplazndolos por los de vidrio esmerilado. Es indispensable el uso de un filtro azul con el objeto de obtener el fondo blanco necesario para la observacin de elementos celulares y parsitos. Quiz una de las mejores adaptaciones es el uso de un baln conteniendo la solucin luz azul cielo que hace las veces de filtro. D.2.6 Frmula Agua destilada Amoniaco Solucin de sulfato de cobre al 20 %
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c.s.p.
250 mL 40 mL 8-10 gotas

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D.2.7
Procedimiento AI mezclar los componentes tener la precaucin de usar bulbo de jebe para extraer el amoniaco, agitar suavemente y tapar.
D.2.8
Recomendaciones El exceso de azul es peor que su escasez porque reduce en gran medida la cantidad de luz. Se puede cambiar esta solucin conforme a las necesidades. Con frecuencia se puede aclarar una ligera turbidez agregando algunas gotas de cido actico glacial o amoniaco.
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ANEXO E EVALUACIN DE LA EXCRECIN URINARIA DE CLOROQUINA Y SULFAMIDAS E.1 E.1.1 EVALUACIN DE LA EXCRECIN URINARIA DE CLOROQUINA (PRUEBA DE DILL Y GLASKO) Reactivos Eosina (amarillenta) Cloroformo cido clorhdrico 1 N 50 mg 100 mL 1mL
Pesar 50 mg de eosina (amarillenta) y depositarlo en un pequeo embudo por separado con tapn de vidrio. Aadir 100 mL de cloroformo (con calidad de reactivo) y 1 mL de cido clorhdrico 1 N y agitar la mezcla manualmente durante unos minutos, hasta que el cloroformo tome un color amarillo claro por dilucin de la eosina. Dejar en reposo hasta que se separe la capa de cloroformo que puede pasarse a un frasco color pardo con tapn de vidrio para su conservacin. Procedimiento Verter 10 gotas de reactivo Dill-Glasco en un pequeo tubo de ensayo de 2 mL de orina y mezclar agitando, enrgicamente, unos minutos. El cambio de color amarillo a rojo- violeta en la capa de cloroformo precipitado indica la presencia de amodiaquina o cloroquina en la orina. Los resultados obtenidos en esta prueba de coloracin son totalmente fiables durante el periodo de 48 horas despus del tratamiento. E.2 E.2.1 E.2.1.1 EVALUACIN DE LA EXCRECIN URINARIA DE SULFAMIDAS (PRUEBA DE BRATTONMARSHALL MODIFICADA) Reactivos Reactivo 1: Solucin de nitrito de sodio, 0,03 mmol/ L 0,2 mg/ L 0,2% (p/v) en agua destilada. E.2.1.2 Reactivo 2: cido clorhdrico (concentrado). E.2.1.3 Reactivo 3: Solucin de Bratton-Marshall: disulvanse 20 mg de clorhidrato de N-(1-naptil)etileno diamina en 20 mL de agua destilada, agregando 2 gotas de cido clorhdrico concentrado. Los reactivos 1 y 2 son estables a temperatura ambiente. El reactivo 3 es estable durante un mnimo de dos meses si se mantiene a 5oC-10oC en un frasco oscuro.
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E.2.2 E.2.2.1 E.2.2.2 E.2.2.3 E.2.3 E.2.3.1 E.2.3.2
Procedimiento Con una pipeta se coloca 1 mL de orina en un tubo de ensayo. Se agrega una gota de solucin de nitrito sdico (reactivo 1) y 2 gotas de cido clorhdrico concentrado, y se mezcla con cuidado. Se deja reposar durante un minuto. Se agregan 3 gotas de Bratton-Marshall (reactivo 3) y se mezcla. La evaluacin de la prueba Es positiva para sulfadoxina libre y para otras arilaminas diazotizables cuando la solucin adopta un color prpura persistente. Es negativa si la solucin no adopta el color prpura o si este color desaparece rpidamente y se transforma en un tono verduzco o marrn.
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ANEXO F FORMATOS DE CONTROL DE CALIDAD

MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO NACIONAL DE SALUD PBLICA LABORATORIO REFERENCIAL DE MALARIA
INFORME SEMANAL DEL DIAGNSTICO PARASITOLGICO DE MALARIA

CCM-1 (EE-7) Establecimiento de salud: Semana: Del: De: Al: Microscopista: De: Del Clave:
FECHA
ACTIV.
INGRESADAS PARA DIAGNSTICO TOMADA EN PASIV. TOTAL LAB.
LMINAS EXAMINADAS P.v. P.f. CASOS P.m. Mx. P.v. P.f. CONTROLES P.m. N N TOTAL
TOTAL
RELACIN DEL TOTAL DE LMINAS

CDIGO DE LMINA DIAGNSTICO Lab. local Lab. revisor CDIGO DE LMINA DIAGNSTICO Lab. local Lab. revisor CDIGO DE LMINA DIAGNSTICO Lab. local Lab. revisor CDIGO DE LMINA DIAGNSTICO Lab. local Lab. revisor CDIGO DE LMINA DIAGNSTICO Lab. local Lab. revisor
OBSERVACIONES: .
FIRMA DEL REVISOR
LAB: LABORATORIO
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REGISTRO DE LA CALIDAD TCNICA DE GOTA GRUESA Y FROTIS DE LOS LABORATORIOS

CCM-2 Laboratorio revisor: Doc. referencia: Trimestre: Microscopista: Fecha de ingreso: Fecha de emisin:
FECHA DE EVALUAC.
CDIGO DE LAB. EVAL.
CDIGO DE LAM. EVAL. Tam
DE LA GOTA GRUESA MUESTRA Ubic. Calid. COLORACIN Desh. Ton. PP Tam
DEL FROTIS
LABORAT. EMISOR RESULTADO
LABORATORIO REVISOR RESULTADO CONCORD. P N P/N DISCORDANCIA N/P Sp.
Ubic.
Exten. N
Tam: Ubic: Calid: Desh:
Tamao Ubicacin Calidad Deshemoglobinizacin
Ton: Tonalidad PP: Precipitado Exten: Extendido
N: Negativo P: Positivo Sp: Especie
Concord: Concordancia Lab. eval: Laboratorio evaluado Lam. eval: Lmina evaluada
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INFORME TRIMESTRAL DE PRODUCCIN Y CONTROL DE CALIDAD EN EL DIAGNSTICO PARASITLOGICO DE MALARIA CCM-3

Laboratorio revisor: Dpto. Clave: Microscopista: Trimestre Fecha:
CDIGO DE LAB. EVAL. N Pv
MUESTRA HEMTICA INFORMADAS

POSITIVAS Pf Pm Mx TOTAL N Pv Pf
RESULTADO DE EVALUACIN REVISADAS

POSITIVAS
RECIBIDAS
POSITIVAS Pm Mx TOTAL %
CONCORD.DISCORD.
TOTAL %
ERRORES N/P P/N V F M Mx
Pv
Pf
Pm
Mx
P.v: Plamodium vivax P.f: Plasmodium falciparum P.m: Plasmodium malariae
Mx: Mixta P: Positivo N: Negativo
%: Porcentaje N/P: Negativo por positivo ( Falso positivo) P/N: Positivo por negativo (Falso negativo)
CONCORD: Concordancia DISCORD: Discordancia
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MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS EN SALUD PBLICA LABORATORIO REFERENCIAL DE MALARIA
FORMATO DE RELACIN TOTAL DE LMINAS

CCM-4 Laboratorio revisor: Microscopista: N ORDEN CDIGO DE LAB. EVAL. CDIGO DE LMINA RESULTADO
LAB. LOC. O INTERMEDIO
POSITIVO NEGATIVO
Trimestre:
RESULTADO
LAB. REF.REGIONAL
POSITIVO NEGATIVO
LAB. EVAL: Laboratorio evaluado LAB. LOC: Laboratorio local LAB. REF: Laboratorio referencial
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MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS EN SALUD PBLICA LABORATORIO REFERENCIAL DE MALARIA
RESULTADO DE CONTROL DE CALIDAD DEL DIAGNSTICO PARASITOLGICO DE MALARIA
CCM-5
DOC. REFERENCIA:
P.v.
LMINAS RECIBIDAS POSITIVAS P.f. P.m.
Mx.
TOTAL
P.v.
LMINAS REVISADAS POSITIVAS P.f. P.m. Mx.
TOTAL
% REV.
N/P
RESULTADO ERRORES P/N Sp.
% Error
P.v: Plamodium vivax P.f: Plasmodium falciparum P.m: Plasmodium malariae Mx: Mixta
P: Positivo N: Negativo N/P: Negativo por positivo ( Falso positivo) P/N: Positivo por negativo (Falso negativo)
% REV: Porcentaje de revisadas. Sp: Especie Porcentaje aceptable de discordancia: 2 %
CALIDAD TCNICA DE LA MUESTRA A) DE LA OBTENCIN DE MUESTRA ( Gota gruesa) Tamao: Ubicacin: Calidad: B) DE LA COLORACIN Deshemoglobinizacin: Tonalidad: Precipitado: C) DEL FROTIS: Tamao: Ubicacin Extendido:
ESCALA DE CALIFICACIN A) DE LA REPRODUCIBILIDAD DIAGNSTICA Bueno: Regular: Deficiente: 100 - 98% concordancia 97 - 95 % concordancia < 95% concordancia
B) DE LA CALIDAD TCNICA Bueno: Regular: Deficiente: 100 - 80% 79 - 70 % < 70%
Revisor: Fecha:
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MINISTERIO DE SALUD DEL PER INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Centro Nacional de Salud Pblica Divisin de Parasitologa FORMATO DE SUPERVISIN DEL DIAGNSTICO PARASITOLGICO DE MALARIA DEL NIVEL LOCAL I. DE LA IDENTIFICACIN
Nombre del establecimiento de salud..................................................................................................................................................... Regin de salud ................................... Localidad ............................................................................................................................... . Jefe del establecimiento de salud......................................................................................................................................... .................. Responsable de diagnstico parasitolgico de malaria ......................................................................................................................... N de supervisin .......................................................... II. DE LOS ASPECTOS TCNICOS Lugar: ......................................................
Del personal responsable de diagnstico Capacitado: SI ( ) NO ( ) Fecha:.................... Sobre medidas de bioseguridad Infraestructura
INFRAESTRUCTURA rea construida en m2 :.................. rea del terreno en m2 :................. Iluminaciny ventilacin: Adecuada [ ] Inadecuada [ ] Abastecimiento de agua: Adecuada [ ] Inadecuada [ ] Desage: Luz elctrica: Material del techo Material del piso: Regular Regular Noble Noble [ [ [ [ [ ] ] ] ] ] ] Irregular Irregular [ [ ] ] ] ] ]
OBSERVACIONES
Otro ........... [ Otro ........... [ Otro........... [ Inadecuada[ ]
Material de las paredes: Noble
Instalaciones de gas: Adecuada [ Usa balones de gas........ [ ] Mobiliario de laboratorio: Adecuada [ En implentacin [ ]
Ubicacin de laboratorio: Extrahospitalario [ ]
] Intrahospitalario [ Inadecuada[ ]
En la lista de supervisin los nmeros tienen el siguiente significado: 0= No observado o ausente. 1= Inadecuado. 2= Adecuado. Actividades que se ejecutan en el espacio asignado: ..................................................................................................... ........................................................................................... .................................................................................................................................................................... ............................ ................................................................................................................................................................................................ ......................................................................................................................................................................... OBSERVACIONES .......................................................................................................... ...................................................................................... ......................................................................................................................................................................... ....................... ................................................................................................................................................................................................
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I. ! ! ! ! ! ! ! !
DEL MANEJO DE MUESTRAS CRITERIO Cuenta con ambiente apropiado para obtencin de muestras Se utiliza mtodos de puncin digital recomendadas. Se observa medidas de bioseguridad en la obtencin y mani pulacin de las muestras. Los tcnicos tienen actitudes adecuadas para atender a los pacientes. Las lminas son rotuladas correctamente. Las lminas de gota gruesa son almacenadas bajo condiciones recomendadas para su posterior envo a control de calidad. Maneja los cuadernos de registro de muestras otorgado por el programa. Utiliza numeracin correlativa. EVALUACIN 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
Ha brindado capacitacin en cuanto a obtencin de muestras a los promotores o colaborad ores voluntarios de salud...............................S ( ) NO ( ) Persona (s) capacitada(s) del establecimiento en obtencin de muestras: S ( ) NO ( ) Cuantas..................................... 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Criterios de bioseguridad ! Se toman medidas de bioseguridad en el caso que el personal tenga heridas en la piel. ! El personal de laboratorio utiliza tcnicas apropiadas de lavado de manos. ! ! ! ! ! ! ! ! ! Se observa que el personal use mandil de laboratorio en el rea de trabajo. Se observar que no se ingiera alimentos, no se fume, ni se beba dentro del laboratorio. Se observar que se utilicen campos descartables sobre la superficie de trabajo. Existen afiches de bioseguridad en le laboratorio. Se restringe la entrada al laboratorio slo al personal autorizado. Los desechos y el material empleado en los ensayos de eliminan correctamente. Cuenta con vacuna para hepatitis B. Cuenta con vacuna para fiebre amarilla. Existen espacios administrativos.
Del control del funcionamiento y mantenimiento de las instalaciones: INSTALACIONES ! Las instalaciones elctricas funcionan correctamente. ! Cuentan con estabilizador. ! El nivel de iluminacin dentro del laboratoro es satisfactorio. i ! Hay adecuada ventilacin en el laboratorio. ! ! ! ! II. Tiene La temperatura dentro del laboratorio es 30C. Los lavaderos y desages funcionan. Los grifos funcionan correctamente. Hay abastecimiento adecuado de agua. DEL MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS S ( ) NO ( )
2 2 2 2 2 2 2 2
1 1 1 1 1 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0 0
Cul (es)? ............................................................................................... Lo utiliza S ( ) NO ( ) .......................................................................................... Lo utiliza S ( ) NO ( )
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De los formatos que utiliza Tiene S ( ) NO ( ) Lo utiliza S ( ) I.
NO ( )
Tipos de formatos ........................................................................
DEL ABASTECIMIENTO DE INSUMOS INSUMOS Giemsa Aceite de inmersin Lminas Papel lente Agua para dilucin de giemsa Formatos de diagnstico Formatos CCM-1 Otros ABASTECIMIENTOS DE INSUMOS Malaria (DISA Laboratorio intermedio o MINSA) o regional Otros
Observaciones:.......................................................................................................... ..................................... De las soluciones y colorante: Conserva adecuadamente la solucin stock del colorante giemsa S ( ) NO ( ) .................................................................... Prepara soluciones o co lorantes S ( ) NO ( ) Cuales....................................................................... . Utiliza buffers o agua para dilucin?................................................................. Utiliza las varillas de coloracin S ( ) NO ( ) Utiliza probeta de dilucin S( ) NO ( ) .......................................................................................................................... REGISTRO DE LAS MUESTRAS DEL LABORATOR IO LOCAL POR SEMANA EPIDEMIOLGICA Semana Semana 01 01 02 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 P.f. P.f. P.v. P.v. P.m. P.m. Neg Neg Ctr. Ctr. Total Total Semana Semana 28 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 P.f. P.f. P.v. P.v. P.m. P.m. Neg Neg Ctr Ctr Total Total
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Especies Total hasta la fecha
P. f.
CONSOLIDADO P. v P.m.
Neg
Total
Del informe de resultados Remite lminas de gota gruesa par el control de calidad al nivel de referencia intermedio o regional S ( ) NO ( ) a Frecuencia................................. Existe documentacin al respecto S ( ) NO ( ) Enva al nivel de referencia regional o Intermedio la relacin de lminas con sus resultados en su respectivo formato SI ( ) NO( ) Otros formatos que se utilizan................................................................................................................... Supervisa peridicamente a los puestos de salud de su microred S ( ) NO ( ) Cules?...................................................................................................................................................... Frecuencia..................................................................
Referente a equipo: Microscopio Operativo: S ( ) NO ( ) Marca S ( ) NO ( ) Cdigo.................... Condiciones de: Oculares:................................. Objetivos:................................ Carril:...................................... Micromtrico:......................... Macromtrico:........................ Fuente de luz:........................ Mantenimiento, conservacin y proteccin ....... Cuenta con programacin para su mantenimiento S ( ) NO ( ) Frecuencia ..................... Fecha ltima de mantenimiento..........................
Referente a equipo: Microscopio Operativo: S ( ) NO ( ) Marca S ( ) NO ( ) Cdigo.................... Condiciones de: Oculares:................................. Objetivos:................................ Carril:...................................... Micromtrico:......................... Macromtrico:........................ Mantenimiento, conservacin y proteccin ....... Cuen ta con programacin para su mantenimiento S ( ) NO ( ) Frecuencia .................... Fecha ltima de mantenimiento...................
Tipo de aceite de inmersin que utiliza...............................................Viscosidad.......................................... OTROS EQUIPOS ................................................................................................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................................................................................................ . ..................................................................................................... . CONTROL DE CALIDAD DEL DIAGNSTICO DEL LABORATORIO LOCAL Muestras de diagnstico supervisadas ............. DEL DIAGNSTICO: LAMINAS REVISADAS P. f. P.m. M.x. RESULTADO ERROR P/N Especie
P.v.
TOTAL N/P
% ERROR
Calificacin: ............. P.v. Plasmodium vivax P.f. Plasmodium falciparum P.m. Plasmodium malariae N: Negativo INS: Instituto Nacional de Salud Mx. Mixta
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DE LA CALIDAD TCNICA: A) De la obtencin de muestra Tamao:............................... Ubicacin:............................ Calidad................................ De la coloracin Deshemoglobinizacin......... Tonalidad............................. Precipitado............................ Escala de calificacin: De la reproducibilidad diagnstica: Bueno: 100% 98% Regular: 97% -95 % Deficiente: < 95% De la calidad tcnica Bueno: 100% 80% Regular: 79% 70% Deficiente: <70%
B)
C) Del frotis Tamao Ubicacin Extendido DE LOS PROBLEMAS ................................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................................ RECOMENDACIONES Readiestramiento en el diagnstico parasitolgico de malaria Obtencin de muestras ( ) Coloracin ( ) Diagnstico del Plasmodium ( ) Diferenciacin de especies ( ) Utilizacin de formatos ( ) Canalizacin de informacin ( ) Sobre microscopio Mantenimiento Limpieza Reparacion ( ) ( ) ( )
Fecha:.....................................
Hora........................................
............................................... Firma del supervisor Nombre
................................................... Firma del supervisado Nombre
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MINISTERIO DE SALUD DEL PER INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Centro Nacional de Salud Pblica Divisin de Parasitologa FORMATO DE SUPERVISIN DEL DIAGNSTICO Y CONTROL DE CALIDAD DE MALARIA DEL NIVEL REGIONAL I. DE LA IDENTIFICACIN
Nombre del establecimiento de salud............................................................................................... .......................................... Regin de salud.................................. Localidad ...................................................................................................................... . Jefe del laboratorio regional : .................................................................................................................................................... Responsable de diagnstico parasitolgico de malaria:............................................................................................................ . N de Supervisin .................... II. DE LOS ASPECTOS TCNICOS
Del personal responsable de diagnstico Capacitado: S ( ) NO ( ) Fecha:............................. Sobre medidas de bioseguridad Infraestructura INFRAESTRUCTURA rea construida :.............................. m2 . rea del terreno :................................m2. Iluminaciny ventilacin: Adecuada [ ] Inadecuada [ ] Abastecimiento de agua: Adecuada [ ] Inadecuada [ ] Desage: Luz elctrica: Material del techo Material del piso: Regular Regular Noble Noble [ [ ] ] Irregular Irregular [ ] [ ] ] ] ] ] ] [ ] [ ] [ ] OBSERVACIONES
Otro ........... [ Otro ........... [ Otro........... [ Inadecuada[
Material de las paredes: Noble
Instalaciones de gas: Adecuada [ ] Usa balones de gas........ [ ] Mobiliario de laboratorio: Adecuada [ En implementacin [ ] ]
Ubicacin de laboratorio: Extrahospitalario [ ] Intrahospitalario [ Inadecuada[ ]
En la lista de supervisin los nmeros tienen el siguiente significado: 0= No observado o ausente. 1= Inadecuado. 2= Adecuado. Actividades que se ejecutan en el espacio asignado: .................................................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................................................... OBSERVACIONES: .................................................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................................................................
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I. ! ! ! ! ! ! ! !
DEL MANEJO DE MUESTRAS CRITERIO Cuenta con ambiente para laobtencin de muestras Se utilizan mtodos de puncin digital recomendadas. Se observan medidas de bioseguridad en la obtencin y manipulacin de las muestras. Los tcnicos tienen actitudes adecuadas para atender a los pacientes. Las lminas son rotuladas correctamente. Las lminas de gota gruesa son almacenadas bajo condicione s recomendadas para su posterior envo a control de calidad. Maneja los cuadernos de registro de muestras otorgado por el programa. Utiliza numeracin correlativa. EVALUACIN 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
Ha brindado capacitacin en cuanto a obtencin de muestras a los promotores o colaboradores voluntarios de salud.........................S ( ) NO ( ) Persona (s) capacitada(s)del lab. regional en obtencin de muestras....... S ( ) NO ( ) Cuntas............ 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Criterios de bioseguridad ! Se toman medidas de bioseguridad en el caso que el personal tenga heridas en la piel. ! El personal de laboratorio utiliza tcnicas apropiadas de lavado de manos. ! ! ! ! ! ! ! ! ! Se observa que el personal use mandil de laboratorio en el rea de trabajo. Se observar que no se ingiera alimentos, no se fume, ni se beba dentro del laboratorio. Se observar que se utilicen campos descartables sobre la superficie de trabajo. Existen afiches de bioseguridad en le laboratorio. Se restringe la entrada al laboratorio slo al personal autorizado. Los desechos y el material empleado en los ensayos de eliminan correctamente. Cuenta con vacuna para hepatitis B. Cuenta con vacuna para fiebre amarilla. Existen espacios administrativos.
Del control del funcionamiento y mantenimiento de las instalaciones: INSTALACIONES ! Las instalaciones elctricas funcionan correctamente. ! Cuentan con estabilizador. El nivel de iluminacin dentro del laboratorio es satisfactorio. ! lHay adecuada ventilacin en el laboratorio. ! ! ! ! ! La temperatura dentro del laboratorio es 30 C. Los lavaderos y desages funcionan. Los grifos funcionan correctamente. Hay abastecimiento adecuado de agua.
2 2 2 2 2 2 2 2
1 1 1 1 1 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0 0
II. Tiene
DEL MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS S ( ) NO ( ) Cul?.......................................... Lo utiliza S ( ) NO ( )
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De los formatos que utiliza Tiene S ( ) NO ( ) Lo utiliza S ( ) NO ( ) I. DEL ABASTECIMIENTO DE INSUMOS INSUMOS Giemsa Aceite de inmersin Lminas Papel lente Papel higinico Agua para dilucin de Giemsa Formatos de diagnstico Formatos CCM-1 Otros
Tipos de formatos ................................................................................... .
ABASTECIMIETOS DE INSUMOS Malaria (DISA Laboratorio intermedio o MINSA) o regional
Otros
Observaciones: ................................................................................................................................................................................................................................................ .......................................................................................................................................................................................... De las soluciones y colorantes: Conserva adecuadamente la solucin stockdel colorante Giemsa S ( ) NO ( ) Prepara soluciones o colorantes ........................................... ....... S ( ) NO ( ) Cuales....................................................... . Utiliza Buffers o agua para dilucin?............................................................................ Utiliza las varillas de coloracin S ( ) NO ( ) Utiliza probeta para dilucin del colorante S ( ) NO ( ) N DE MUESTRAS TOMADAS EN EL LABORATORIO REGIONAL PARA DIAGNSTICO MUESTRAS Positivas Negativas Total VI. E F M A M J J A S O N D TOTAL
SOBRE EL CONTROL DE CALIDAD
N de personas que ejecutan el control de calidad: ....................... LAM. EVALUADAS POR EL LAB. REGIONAL Lminas positivas Lminas negativas Lminas discordantes Total I TRIMESTRE 2002 II TRIMESTRE 2002 III TRIMESTRE 2002 IV TRIMESTRE 2002
De las normas tcnicas para el control de calidad de malaria Tiene SI ( ) NO ( ) Cul?................................................................................... Lo utiliza S ( ) NO ( ) .
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N DE MUESTRAS EVALUADAS EN LA SUPERVISIN LMINAS REVISADAS POR LAB. REGIONAL N P.v. P. f. P.m. M.x. TOTAL N LMINAS REVISADAS POR INS P.v. P. f. P.m. M.x. TOTAL RESULTADO ERROR N/P P/N Especie % Error
Pv. P.f. P.m.
Plasmodium vivax Plasmodium falciparum Plasmodium malariae
Mx. Mixta LRRCusco: Laboratorio de Referencia Regional del Cusco INS: Instituto Nacional de Salud ESCALA DE CALIFICACIN A) DE LA REPRODUCIBILIDAD DIAGNSTICA Bueno: Regular: Deficiente: B) 100 98% concordancia 97 95% concordancia < 95% concordancia
CALIDAD TCNICA DE LA MUESTRA A) DE LA OBTENCIN DE MUESTRA (Gota gruesa) Tamao: Ubicacin Calidad: B) DE LA COLORACIN Deshemoglobinizacin: Tonalidad: Precipitado: DEL FROTIS Tamao: Ubicacin: Extendido:
DE LA CALIDAD TCNICA Bueno: 100 80% Regular: 79 70% Deficiente: < 70%
C)
Del informe de resultados Remite lminas de gota gruesa para el control de calidad al nivel de referencia nacional S ( ) Existe documentacin al respecto S ( ) NO ( ) NO ( ) Frecuencia.................................
Enva relacin de lminas con resultados de control de calidad a sus niveles inferiores en su respectivo formato S ( ) NO( ) Frecuencia de entrega de resultados a su nivel inmediato inferior (intermedios o locales): ......................... Otros formatos que se utilizan................................................................................................................... Supervisa peridicamente a los establecimientos de salud de su jurisdiccin S ( ) NO ( ) Cules?...................................................................................................................................................... Frecuencia.................................................................. Referente a equipo Microscopio operativo: S ( ) NO ( ) Marca S ( ) NO ( ) Cdigo.................... Condiciones de: Oculares:................................ . Objetivos:................................ Carril:...................................... Micromtrico:......................... Macromtrico:........................ Fuente de luz:....................... . Mantenimiento, conservacin y proteccin ....... Cuenta con programacin para su mantenimiento S ( ) NO ( ) Frecuencia ..................... Fecha ltima de mantenimiento.......................... Referente a equipo: Microscopio operativo: S ( ) NO ( ) Marca S ( ) NO ( ) Cdigo.................... Condiciones de: Oculares:................................. Objetivos:................................ Carril:..................................... . Micromtrico:......................... Macromtrico:........................ Mantenimiento, conservacin y proteccin ....... Cuenta con programacin para su mantenimiento S ( ) NO ( ) Frecuencia ....................... Fecha ltima de mantenimiento...............................
Tipo de aceite de inmersin que utiliza...............................................Viscosidad..........................................
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OTROS EQUIPOS: ............................................................................ .................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ..................... ................................................................................................................................................................................ ......................................................... ....................................................................................................................... ........................................................................................................................................ ........................................ ................................................................................................................................................................................ ...................................... .......................................................................................................................................... DE LOS PROBLEMAS ............................................................................ .................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ..................... ................................................................................................................................................................................ ......................................................... ....................................................................................................................... ........................................................................................................................................ ........................................ ................................................................................................................................................................................ ...................................... .......................................................................................................................................... RECOMENDACIONES Readiestramiento en el diagnstico parasitolgico de malaria Obtencin de muestras ( ) Coloracin ( ) Diagnostico del Plasmodium ( ) Diferenciacin de especies ( ) Utilizacin de formatos ( ) Canalizacin de informacin ( ) Sobre microscopio Mantenimiento Limpieza Reparacin ( ) ( ) ( )
Fecha:.....................................
Hora........................................
............................................... Firma del supervisor Nombre
...... ............................................. Firma del supervisado Nombre
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ANEXO G PREPARACIN DE LOS ANTGENOS Se obtienen buenos resultados cuando se utiliza sangre con parasitemia mnima del 1% y predominio de esquizontes. G.1 G.1.1 G.1.2 G.2 G.2.1 G.2.2 G.2.3 G.2.4 OBTENCIN DE ANTGENOS DE P. falciparum y P. vivax DE SANGRE HUMANA PARASITADA Preparar un extendido de sangre completa y teir con coloracin giemsa para contar el nmero de hemates parasitados por campo. Recoger la sangre con anticoagulante (heparina 200 UI para 10 mL 1 mL de ACD para 10 mL). PREPARACIN DE ANTGENOS DE P. vivax Despus de colectar la sangre, se centrifuga a 1500 rpm por 5 minutos. Se separa el plasma y la capa de leucocitos. Esta operacin se debe realizar cuidadosamente dado que los glbulos rojos parasitados estn inmediatamente por debajo de la capa de leucocitos. Lavar los glbulos rojos 3 veces por centrifugacin a 1500 r.p.m. 5 minutos en volmenes de PBS 10 veces mayores que el volumen de sedimento de hemates. Resuspender las clulas en PBS a su volumen original, colocar varias gotas de la suspensin en dos lminas con una micropipeta, secar y colorear por el mtodo giemsa para determinar el N de esquizontes por campo (Se recomienda 20 - 30 para determinar esquizontes por campo con objetivo de 40). Lo ideal 2000 parsitos/hoyo. Cuando el nmero de esquizontes es muy alto se diluyen las clulas con PBS y si el nmero de esquizontes es muy bajo, concentrar por centrifugacin y retirar el exceso de PBS. Depositar 5 L de la suspensin obtenida en cada hoyo de la lmina. Secar las lminas a temperatura ambiente o con una secadora de cabello fro, en la opcin de aire fro. Guardar las lminas a - 70C en un ambiente libre de humedad, despus de envolver individualmente con papel absorbente y luego en grupos de diez lminas con papel aluminio o en bolsas de plstico sellado conteniendo silica gel. PREPARACIN DE ANTGENOS DE P. falciparum DE CULTIVO in vitro Se obtienen buenos resultados con cultivos en medio RPMI 1640, sincronizados y con alta densidad de esquizontes cuyo procedimiento se detalla en captulo "CULTIVOS". Se emplea el mismo proceso para la preparacin de antgeno de P. vivax con sangre humana parasitada. G.4 SINCRONIZACIN Este procedimiento es empleado para obtener esquizontes (mtodo en masa) para la preparacin de antgenos utilizados en las pruebas serolgicas.
G.2.5 G.2.6 G.2.7
G.3
G.5 G.5.1 G.5.1.1
REACTIVOS Solucin de gelatina RPM1 1640 HEPES Agua destilada 10,2 g 5,9 g 1000,0 mL
G.5.1.2
Tomar 192 mL de solucin (paso 1) disolver 2,0 gr de gelatina en una botella de vidrio en bao Mara con agitador a 60C. Estabilizar a temperatura ambiente y esterilizar por filtracin con filtro 0,22 m (micropore). Agregar 8 mL de NaHC03 al 5% para completar a 200 mL. PROCEDIMIENTO Centrifugar el material de cultivo en tubo de centrfuga de 50 mL a 1500 r.p.m por 10 minutos. Descartar el sobrenadante. Medir el volumen del sedimento con una pipeta y hacer una suspensin al 20 % con medio completo, mezclar cuidadosamente. Agregar el mismo volumen de la solucin de gelatina (Ej. Si la suspensin es de 15 mL, entonces agregar 15 mL de solucin de gelatina, mezclar y distribuir a tubos de centrifuga a 15 mL: 5 mL en cada tubo, colocar la tapa rosca y girar la tapa sin cerrar completamente. Incubar a 37C por 30 minutos. Colectar cuidadosamente el sobrenadante en tubos de centrfuga de 50 mL y centrifugar a 1500 r.p.m. por 10 minutos. Descartar cuidadosamente el sobrenadante, preparar con el sedimento dos extendidos fijar y secar para colorear con giemsa y observar a 100X la presencia de esquizontes. Lavar las clulas (sedimento) con PBS a 1500 r.p.m. por 10 minutos. Descartar el sobrenadante y resuspender las clulas en 10 mL de PBS. Preparar dos lminas con 3 gotas de 50 L de la suspensin cada una, secar, colorear con giemsa y observar con objetivo de 40 para ver la concentracin de esquizontes. La concentracin ideal es de 20-30 esquizontes por campo. Si la concentracin es alta se diluye con PBS y si es baja se concentra centrifugando y separando el sobrenadante.
G.5.1.3 G.5.1.4 G.6 G.6.1 G.6.2 G.6.3
G.6.4
G.6.5 G.6.6
G.6.7
G.6.8 G.6.9 G.6.10
G.6.11
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ANEXO H TITULACIN DEL CONJUGADO Cada vez que utilice un nuevo lote de antgeno y conjugado tendr que ensayar o estandarizar los parmetros de cada reactivo. La titulacin se realiza en bloque utilizando diluciones crecientes del conjugado contra diluciones crecientes de sueros positivos y negativos conocidos. Como ttulo del conjugado se considerar la dilucin que proporcione la mxima sensibilidad y especificidad. H.1 H.1.1 H.1.2 H.1.3 PROCEDIMIENTO Seguir los pasos del procedimiento de la tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), hasta paso 9. Diluir el conjugado a evaluar en solucin bloqueadora conteniendo 0,01 mgr % del azul de Evans en 2 diluciones inferiores y 2 superiores a la dilucin del conjugado que indica el fabricante. Diluir el suero positivo hasta dilucin N12 en solucin bloqueadora en proporcin doble y depositar para la reaccin en forma alternada. Igualmente diluir sueros negativos hasta la dilucin N3, depositar en forma consecutiva. Preparar las lminas con antgenos para cada dilucin de conjugado a ensayar. (Paso 2:5 lminas). Seguir el mismo proceso de incubacin descrito en el procedimiento de la tcnica IFI (paso 2) y lavados (paso 4). Efectuar la lectura anotando intensidad de fluorescencia en cada reaccin. Como ttulo de la prueba se considerar la mayor dilucin que presente fluorescencia ntida en toda la superficie del parsito. En las reacciones negativas los plasmodia no presentan fluorescencia. DILUCIN DEL CONJUGADO Nro. Tubo Sol. bloqueadora Conjugado Evans blue Transferencia Dilucin H.3 1 350 l 25 l 40 l 1/16 2 180 l 20 l 200 l 1/32 3 180 l 20 l 200 l 1/64 4 180 l 20 l 200 l 1/128 5 180 l 20 l 200 l 1/256
H.1.4 H.1.5 H.1.6 H.1.7 H.2
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Se considerara el ttulo ptimo aquel donde se observe fluorescencia fuerte y ntida en toda la superficie del parsito. Al momento de titular se debe tener en cuenta: Lote conjugado. Fecha de expiracin Fecha de titulacin.
ARTES Y DISEOS LASER S.R.Ltda. Calle Las Turquesas 269-265,263 Balconcillo Lima 13 - Per Telf.: 265-8320 Telefax: 266-0075 Tiraje: 3000 ejemplares Setiembre de 2003
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD SEDE CENTRAL Cpac Yupanqui N 1400, Jess Mara Lima 11, Apartado N 451 Telf.: (51-1) 471 9920 - Fax: (51-1) 471 0179 E-mail: postmaster@ins.gob.pe Pgina Web: www.ins.gob.pe

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE MALARIA

Serie de Normas Tcnicas N 39 Lima - 2003

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE MALARIA

Serie de Normas Tcnicas N 39 Lima - 2003

Presidente Dra. Ada Palacios Ramrez

Editor Dr. Leonid Lecca Garca

Asistente Editorial Lic. Daniel Crdenas Rojas

Secretaria Srta. Roco Sols Agurto

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Manual de Procedimientos de Laboratorio para el Diagnstico de Malaria

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE MALARIA

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Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin del INS

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SECCIN 1: 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6

SECCIN 2: 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6

BIOSEGURIDAD Medidas de bioseguridad Medidas de proteccin Descontaminacin Limpieza Desinfeccin Esterilizacin

SECCIN 3: 3.1 3.2 3.3

SECCIN 4: 4.1 4.2 4.3 4.4

5.1 5.2 5.3

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SECCIN 11: 11.1 11.2 11.3 11.4

10.6 10.7 10.8

SECCIN 10: 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5

SECCIN 9: 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7

SECCIN 7: 7.1 7.2 7.3

SECCIN 6: 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6

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ANEXOS Anexo A Anexo B Anexo C Anexo D Anexo E Anexo F Anexo G Anexo H

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MALARIA CICLO BIOLGICO DEL Plasmodium

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Figura No 1. Ciclo biolgico del Plasmodium

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1.3.3 1.3.4 1.4 1.4.1 1.4.2 1.5 1.5.1

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1.5.5 1.5.6 1.5.7 1.5.8 1.5.9 1.5.10 1.5.11

1.5.14 1.5.15 1.5.16 1.6 1.6.1

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