Efeito do NaCl sobre a actividade killer em leveduras isoladas de salmoura de azeitona.

Objectivo: Determinao da actividade killer da levedura Rhodotorula glutinis avaliando o poder inibidor do NaCl a diferentes concentraes (0%, 3% e 6%), tendo usado como estirpes sensveis a Pichia fermentans, a Saccharomyces cerevisae e a Cryptococcus laurentii. Introduo: As caractersticas killer de
leveduras isoladas de salmouras de azeitona (gua das azeitonas) foram observadas na presena e ausncia de cloreto de sdio em concentraes de 0% at 6%. Verificou-se um aumento significativo da aco da actividade killer com o aumento da concentrao de NaCl assim como, foram observadas alteraes no espectro de actividade contra estirpes alvo seleccionadas. Culturas filtradas da estirpe Killer cresceram em diferentes concentraes de sal, e foram cultivadas contra leveduras sensveis sob as mesmas circunstncias. Levantou-se ento a questo se a actividade foi maior devido ao aumento da produo de toxina killer para o aumento da sensibilidade das estirpes afectadas ou por uma combinao de ambos. Derivado ao facto a sensibilidade da estirpe alvo ser muito maior na presena de NaCl nenhum efeito significativo se observou na produo de toxinas.

Materiais:
Pipeta de 10mL 3 Tubos Balana analtica Centrifugadora Tubos de centrifugao Pipetas Pontas para pipetas 9 Placas de petri Zaragatoas Frasco Schott esterilizados Discos Whatman Micropipeta Seringa

Mtodos: A estirpe killer, no nosso caso a Rhodotorula glutinis, foi inoculada a 30C em YMB em banho-maria com agitao lenta. Dividiram-se 150ml por trs tubos de ensaio, 50 ml por cada, contendo um YMB a 0%, outro a 3% e o terceiro a 6%. De seguida os tubos so pesados tendo-se registado um peso de 6,40g e foi realizada a centrifugao a 3000xg durante 10 minutos, a uma temperatura de 4C, para a aquisio de clulas de levedura e substncia killer (sobrenadante). Este sobrenadante foi retirado atravs de uma seringa em que a membrana filtrante de 0,22m (poro), sendo colocado previamente num frasco esterilizado. Posteriormente foi levado chama do bico de Bunsen obtendo-se assim o sobrenadante filtrado (estril). Na fase seguinte foram inoculadas as culturas de leveduras que iriam ser testadas como estirpes sensveis, sendo estas a Pichia fermentans, a Saccharomyces cerevisae e a Cryptococcus laurentii, em nove placas de petri, trs para cada uma das estirpes, contendo YMA (5g de extracto de levedura, 10g de peptona e 20g de glicose) a diferentes concentraes de NaCl (0%, 3% e 6%). Depois de correctamente inoculados, foram colocados na superfcie de cada meio trs discos Whatman (6mm cada) com a ajuda de uma pina, sendo devidamente identificadas as concentraes que iriam ser testadas em cada um. Foram ento pipetados 10 do filtrado de crescimento obtido anteriormente em cada um dos discos. Aps todo este procedimento os meios foram inoculados a uma temperatura de 30C durante 48 horas, para que seja feita ento a avaliao da actividade killer atravs da largura e com o aumento da inibio em volta dos discos Clculos:
YMB (Meio Liquido): 1000ml de YMB---3g de extracto de levedura 450ml----x= 1,35g 1000ml de YMB---5g de peptona 450ml---x= 2,25g 1000ml de YMB---3g de extracto de malte 450ml---x= 1,35g 1000ml de YMB---10g de glicose 450ml---x= 4,5g

Reagente:
Peptona, Malte, Glicose, Levedura Estirpe killer Meio YMA NaCl gua destilada Estirpes Sensveis (Pichia fermentans, a Saccharomyces cerevisae e a Cryptococcus laurentii)

Quantidade de NaCl colocada em cada tubo: 3g --100ml X---150ml x= 4,5g de NaCl 3% 6g---100ml X----150ml x= 9g de NaCl 6%

Aps o segundo ensaio feito sob condies diferentes e pelos resultados obtidos na tabela 2 verificamos que houve crescimento do halo de inibio numa das estirpes testadas como sensveis.

Resultados e discusso:

Tabela 1: Inibio de crescimento de Rhodotorula glutinis a 30C. % NaCl no meio slido YMA % 0% 3% 6% NaCl YMB PF SC CL PF SC CL PF SC CL 0% - sc sc 3% - sc sc (1) 6% - sc sc (1)

RG "killer"

Figura 1: Crescimento de halo de inibio de 8mm a 6%, numa concentrao de 0% de NaCl, na estirpe da Pichia fermentans.

Legenda: -: sem halo de inibio (mm) sc: sem crescimento (1): verifica-se crescimento no confluente PF: Pichia fermentans SC: Saccharomyces cerevisae CL: Cryptococcus laurentii

Como se pode verificar atravs da tabela 1 nos resultados no houve qualquer crescimento de halo de inibio, por isso foi realizado um novo ensaio a uma temperatura entre 22,5C e 25C, sendo depois incubado durante 22 horas. Verificaram-se ento os seguintes resultados:

Figura 2: Crescimento de halo de inibio de 9mm a 3% e 6%, numa concentrao de 3% de NaCl, na estirpe da Pichia fermentans.

Tabela 2: Inibio de crescimento da Rhodotorula glutinis entre 22,5C e 25C. % NaCl YMB RG "killer" 0% 3% 6% % NaCl no meio slido YMA 0% 8 9 9 3% SC SC SC 6% SC SC SC SC SC SC SC SC SC PF SC CL PF SC CL PF SC CL

Concluso:

Legenda: 8: crescimento de halo com cerca de 8mm. 9: crescimento de halo com cerca de 9 mm.

Ao realizar este trabalho laboratorial podemos concluir que se verificou actividade killer contra Pichia fermentans, logo a nica cultura testada sensvel actividade killer da Rhodotorula glutinis. Contudo, este crescimento s foi observado a uma concentrao de 0% de NaCl e 3% de NaCl, ou seja, a actividade killer aumenta conforme a concentrao salina, uma vez que 0% existe apenas um halo de 8mm a uma concentrao de 6% de Rhodotorula glutinis e a 3% existe um halo de 9mm para as concentraes de 3% e 6% da levedura killer. Verificamos ento como referimos no objectivo deste trabalho laboratorial que h um efeito da concentrao do NaCl na produo da toxina killer.

Referncias bibliogrficas: Applied and Environmental Microbiology, Mar.1997,p.1165-1167