Laboratorio

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Enzimas
Objetivos
Al finalizar este laboratorio el estudiante podr: 1. Explicar qu es una enzima y cmo stas actan en reacciones intracelulares. 2. Identificar factores que afectan la actividad enzimtica. 3. Distinguir entre inhibicin competitiva e inhibicin no-competitiva.

INTRODUCCIN
as clulas llevan a cabo simultneamente una gran cantidad de reacciones qumicas necesarias para la vida. Muchos de los productos de esas reacciones se necesitan inmediatamente, y si no fuera por la participacin de las enzimas, algunas reacciones no se produciran tan rpido. Las enzimas, en su mayora protenas o RNA (riboenzimas), son catalizadores qumicos que agilizan una reaccin que envuelve la formacin o rompimiento de enlaces qumicos. Las enzimas no se consumen en las reacciones, ni tampoco se alteran, razn por lo cual no se necesitan en grandes cantidades. Las enzimas actan sobre los sustratos formando un complejo enzimasustrato; esto ocurre en un lugar en especfico conocido como el sitio activo de la enzima. Las enzimas son muy selectivas porque pocas molculas pueden interactuar bien con este sitio (Figura 5.1).

Sustratos

Sitio activo

Complejo Enzima-Sustrato

Producto

Enzima

Figura

5.1

Reaccin con participacin de una enzima. Se forma el complejo Enzima-Sustrato al unirse la enzima a los sustratos en lugares especficos de la enzima donde encajan los sustratos. Se forma el producto y la enzima no se altera en el proceso; quedando libre para otra reaccin.

Las enzimas reducen la energa de activacin necesaria para llevar a cabo una reaccin; es decir, reducen la barrera de energa que hay que sobrepasar para que la reaccin se lleve a cabo (Figura 5.2).

Energa de activacin

Sin enzima Con enzima

Curso de la reaccin
Figura 5.2

Energa de activacin necesaria para iniciar la reaccin.

Las enzimas trabajan ptimamente bajo condiciones especficas y ciertos cambios pueden alterar el funcionamiento de la enzima, desactivarla o hasta destruirla. Algunas enzimas necesitan activadores para cambiar su conformacin de modo que pueda formarse el complejo enzimasustrato. Estos
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activadores se conocen como cofactores y pueden ser tan simples como iones metlicos. Los cofactores orgnicos se conocen como coenzimas. Las enzimas pueden afectarse negativamente por inhibidores que impidan la actividad enzimtica. Estos inhibidores pueden afectar el sitio activo de dos maneras: competitivamente, al bloquear el sitio activo, o no competitivamente, al pegarse en otro lugar de la enzima y alterar indirectamente la forma del sitio activo.

EJERCICIO 5.1
FUNCIONAMIENTO DE LA CATALASA EN VARIOS ORGANISMOS

A. Factores que afectan el funcionamiento de la catalasa

En los ejercicios siguientes se estudiar el funcionamiento de la catalasa. Esta enzima est presente en casi todas las clulas aerbicas y acta descomponiendo perxido de hidrgeno (agua oxigenada) en agua y oxgeno, segn la siguiente reaccin:

catalasa

2H2O2

2H2O + O2

A.1. Funcionamiento de la enzima catalasa en varios organismos

M A T E R I A L E S

Por laboratorio: Perxido de hidrgeno Papa Hgado Setas Espinaca Gasa (cheesecloth) Placas de porcelana Goteros Morteros o licuadora

P R O C E D I M I E N T O

En este ejercicio se prepararn varios homogenados para obtener partculas pequeas y uniformes al mezclarlas con el agua. 1. Para preparar los homogenados, corte en pedazos por separado las muestras de papa, hgado, setas y espinaca. 2. Usando una licuadora o mortero, muela el material con un poco de agua hasta diluir parte de la muestra; no muela excesivamente para que no queden pedazos muy pequeos del material. 3. De ser necesario, filtre el macerado con una gasa (cheesecloth).
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4. Coloque cada homogenado en un tubo de ensayo. 5. Usando un gotero, coloque cinco gotas de cada homogenado en las fosas de la placa de porcelana y aada tres gotas de perxido de hidrgeno (Pelcula 2). Para observar algunas reacciones, vea las siguientes pelculas cortas: PELCULA1 PELCULA2 4. Observe y anote los resultados en la Tabla 5.1: Tabla 5.1 Resultados homogenado con perxido de hidrgeno Homogenado Reaccin al aadir gotas de perxido Agua Papas Setas Hgado Espinaca

5. Qu ocurri al aadir el perxido?

6. Ocurri lo mismo en todas las muestras?

7. Por qu se forman burbujas?

8. Qu otros organismos podran usarse para esta prueba?

9. Por qu se prepararon los homogenados? Por qu no se aadi el perxido directamente a los tejidos sin macerarlos?

10. Explique por qu la gran mayora de las especies de plantas y de animales producen la enzima catalasa.
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A.2. Se comporta la catalasa de igual manera en todos los organismos?

M A T E R I A L E S

Por laboratorio: Homogenado de hgado, papa, setas y espinaca Tubos de ensayo grandes Perxido de hidrgeno Goteros

P R O C E D I M I E N T O

1. Rotule cinco tubos de ensayo con las letras A a la E. 2. Ponga 3 mL de cada homogenado en los tubos como sigue: A - Hgado B - Papa C - Setas D - Espinaca E - Agua 3. Marque el nivel hasta donde llega cada homogenado. 4. Ponga 3 mL de perxido de hidrgeno en cada tubo de ensayo. 5. Observe la reaccin que sucede en cada tubo y marque el cambio en el nivel del lquido. 6. Tabule los resultados en la Tabla 5.2.

Tabla 5.2 Tubo A B C D E

Resultados produccin de catalasa en varios organismos Cantidad de burbujas Cantidad de homogenado consumido

7. Fue igual la produccin de catalasa en todas las muestras?

8. Qu indican los resultados sobre la fisiologa de estos organismos?

A.3. Efecto de la temperatura sobre el funcionamiento de las enzimas

M A T E R I A L E S

Homogenado de hgado Bao de agua Termmetro Agarradera de tubo Hielo Congelador

P R O C E D I M I E N T O

1. Rotule cinco tubos de ensayo del 1 al 5 y caliente un bao de agua hasta 37 C y otro hasta 80C. 2. Aada 5 mL de hgado homogenado a cada tubo. 3. Mantenga los tubos a las siguientes temperaturas: Tubo 1 = 80 C por 15 minutos Tubo 2 = 37 C por 15 minutos Tubo 3 = Temperatura ambiental Tubo 4 = Hielo por 30 minutos Tubo 5 = Congelador a 4 C por 30 minutos 4. Aada 2 mL de perxido de hidrgeno al tubo 1. 5. Mida el tiempo transcurrido desde que se aadi el perxido hasta que se comienzan a producir burbujas, y antelo en la Tabla 5.3. 6. Repita con los dems tubos. 7. Compare sus resultados en trmino de tiempo de reaccin vs. temperatura.

Tabla 5.3 Tubo 1 2 3 4 5

Resultados del efecto de temperatura Tiempo que tard en Temperatura comenzar reaccin 80 C 37 C Ambiente Hielo Congelador (4C)

Observaciones

8. Cmo se relacionan la temperatura y la actividad enzimtica?

9. Qu le sucede a las enzimas cuando se exponen a temperaturas extremas (muy fras o muy calientes?

A.4. El efecto del pH sobre el funcionamiento de las enzimas

P R O C E D I M I E N T O

1. Rotule tres tubos de ensayo A, B y C 2. Aada 3 mL de homogenado de hgado a cada tubo. 3. Aada soluciones 3M de HCl y 3M de NaOH a los tubos como sigue, y agite suavemente hasta mezclar: Tubo A 3 ml de 3M HCl Tubo B 3 ml de 3M NaOH Tubo C control (sin cido ni base) 4. Aada 3 mL de perxido de hidrgeno a cada tubo. 5. Observe y anote las reacciones en la Tabla 5.4.

Tabla 5.4 Tubo A B C

Resultados del efecto del pH sobre la actividad enzimtica Tiempo que toma la reaccin en completarse Descripcin comparativa de las reacciones

6. Cmo se relacionan el pH y la actividad enzimtica?

7.

Las enzimas del estmago funcionan ptimamente a un pH de 2. Cmo se afectara la digestin si el pH aumenta a 4?

8. De qu otras maneras se podra explorar el funcionamiento de las enzimas estudiadas en el laboratorio?

9. Puede mencionar otras enzimas que actan en nuestro cuerpo?

10. Qu efecto podra tener una fiebre alta prolongada sobre el funcionamiento de las enzimas?

11. Conoce alguna condicin mdica que se deba al mal funcionamiento de una enzima?

INFORMACIN ADICIONAL La catalasa: se encuentra en casi todas las clulas aerbicas, donde acelera el rompimiento de perxido de hidrgeno (producto txico de las clulas). A veces, la reduccin de oxigeno al agua es incompleta y se produce superxido, una sustancia sumamente txica. Una enzima rompe el superxido y forma agua y perxido de hidrgeno, que es menos txico. La catalasa entonces rompe el perxido de hidrgeno para producir agua y oxgeno. Recursos del tema se pueden encontrar en: Solomon, Berg & Martin (2004). Biology, 7th Ed. Brooks Cole Publ. http://www.mhhe.com/physsci/chemistry/chang Denniston, Topping and Caret (2004). General, Organic, and Biochemistry , 4ta Ed. Mc Graw Hill. New York. USA Boyer, B (1999). Concepts in Biochemistry, Brooks/Cole Publishing. http://www.seps.org/cvoracle/faq/catalase.html www.worthington-biochem.com/introdBiochem/introEnzymes.html

LABORATORIO 5: ENZIMAS
PLAN DE ENSEANZA PARA LOS INSTRUCTORES

Destrezas que el estudiante adquirir a partir de este laboratorio:

1. 2. 3. 4. Trabajo individual y grupal. Se enfatiza la divisin ptima de tiempo para tareas en grupos. Se aprendern tcnicas de laboratorio. Se practicarn destrezas de comunicacin escrita y se reforzarn los conceptos de investigacin cientfica.

Manejo del laboratorio:

El instructor debe introducir los trminos generales brevemente, dejando para la discusin final los trminos ms especficos. Asegrese de explicar bien el procedimiento a seguirse, recalcando el uso eficiente del tiempo. Debe discutirse qu se espera del informe escrito y debe repasarse el mtodo cientfico. Vocabulario que los estudiantes deben conocer al finalizar el laboratorio: Enzima, catalizador, sustrato, producto, sitio activo, complejo enzima-sustrato, activadores, cofactores, coenzimas, inhibidores competitivos, inhibidores no-competitivos y energa de activacin Recordarles a los estudiantes que vengan preparados para el prximo laboratorio y anunciarles la prueba corta de la semana (si va a ofrecerse).

Manejo del tiempo:

1. Presentacin de objetivos e introduccin ........................10 minutos 2. Visita al invernadero para tomar datos (Laboratorio 2) ...10 minutos 3. Ejercicio 5.1 A.1: Enzima catalasa en varios organismos30 minutos A.2: Se comportan los organismos iguales?...............30 minutos A.3: Efecto de la temperatura sobre las enzimas ..30 minutos A.4: Efecto del pH sobre las enzimas 30 minutos 4. Discusin y repaso de objetivos ...15 minutos 5. Prueba corta ......10 minutos 5. Discutir asignacin de informe corto: Preparar introduccin 10 minutos 6. Recoger el laboratorio 5 minutos