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Cromatografia
LIQUIDO – SOLIDO
TECNICA IMPIEGATA
per SEPARARE MISCELE DI COMPOSTI
(organici e non)
si basa sul
FENOMENO DELL’ADSORBIMENTO
Maggiori sono le interazioni che un composto ha con la superficie del solido (maggiore affinità) e
maggiormente questo verrà trattenuto dalla fase stazionaria. Questi composti saranno anche in
grado di rimuovere dalla superficie molecole con affinità inferiori, e che si muoveranno quindi più
velocemente lungo la colonna cromatografica.
Caratteristiche dell’adsorbente
Perché si esplichi il fenomeno della separazione cromatografica, l’adsorbente deve essere in grado
di esercitare sui composti da separare interazioni più forti di quelle che questi hanno con la fase
mobile. Questo può essere ottenuto impiegando materiali con elevata ed operando con eluente con
bassa polarità o a polarità crescente. In questo caso si esaltano quelle interazioni fase stazionaria-
soluto di tipo dipolost - dipolosol, i ponti ad idrogeno e i dipolost - dipolo indottosol.
Alternativamente, impiegando adsorbenti poco polari (ex: il carbone attivo) si sarà in grado di
esaltare, utilizzando eluenti polari, le interazioni fase stazionaria-soluto di tipo Van Der Waals (tra
composti a bassa polarità).
Nella TLC di tipo analitico viene impiegata una granulometria minore di quella usata negli
adsorbenti per colonna; per le TLC si usano misure dai 5 ai 40 µm. Queste granulometrie
d ( A)
R fa
d (F )
solitamente garantiscono delle buone efficienze. La selettività è legata alla natura della fase mobile
ed alle caratteristiche dell’adsorbente. Questi è legato al supporto in vetro tramite un collante
(solfato di calcio) ed in genere contiene una sostanza fluorescente, solfuro di zinco, che assorbe a
251 nm (frequenza ultravioletta). Le lastre commercializzate garantiscono una buona omogeneità
della granulometria ed una buona densità di impaccamento. Questo consente di avere buone
efficienze e buone riproducibilità.
La selettività, nel caso TLC, viene valutata considerando il fattore di ritardo Rf. Questo parametro è
il rapporto tra la corsa effettuata dal solvente (che solitamente si lascia salire per capillarità sino ad
un centimetro dal bordo superiore della lastra) e quella dei componenti caricati sulla lastra stessa.
Difatti nella TLC l’eluente risale la fase stazionaria per capillarità, ed in questo movimento contro
la gravità trascina il soluto. In questo processo, chiamato sviluppo della lastra cromatografica, si
instaurano gli stessi equilibri visti per la cromatografia in colonna fra la fase stazionaria e quella
mobile.
Maggiore è la corsa o Rf, minore è la selettività dell’adsorbente per quel composto.
Rf dipende da: natura adsorbente, struttura dei pori delle particelle (la presenza di pori sulla
superficie aumenta l’area superficiale e quindi la selettività; la struttura dei pori viene individuata
nel diametro medio di questi, dal loro volume, dalla loro distribuzione e dalla loro superficie),
spessore dello strato, temperatura e grado di saturazione dell’ambiente di sviluppo della lastra.
In genere le lastre da sviluppare vengono introdotte in una camera di sviluppo nella quale viene
posto l’eluente. Il livello dell’eluente deve essere tale da non superare la linea di partenza (~1mm
sotto tale linea). La fase stazionaria, possedendo una elevata superficie, faciliterà l’evaporazione del
solvente che sale per capillarità. Questo fenomeno deve essere ridotto al minimo, per evitare che
quando si usino miscele di elementi si abbia evaporazione del solvente più volatile o meno polare e
quindi alterazione della polarità dell’eluente, ed è facilmente ottenuto usando camere di sviluppo
chiuse in cui la fase liquida ha raggiunto l’equilibrio con la fase vapore. In questo modo la
superficie della lastra è a contatto con un ambiente saturo di vapori dell’eluente, e questo riduce
l’evaporazione dell’eluente dalla superficie della lastra. Si raggiunge velocemente la saturazione
della camera introducendo strisce di carta da filtro nella camera di sviluppo. Queste, imbevendosi di
eluente ed aumentando la superficie a disposizione del liquido consentono una veloce saturazione
della camera.
La relazione tra la polarità dell’eluente e quella dell’adsorbente è evidenziata dalla struttura stessa
del silica gel. Questo composto viene preparato per reazione del silicato di sodio con acido solforico
per precipitazione di acido silicico. Condensando tramite eliminazione di acqua di ottiene il gel.
Se la miscela non è scioglibile nell’eluente è possibile farla adsorbire da una quantità 1:4 di silice
attraverso il solvente che meglio la scioglie, e poi si evapora il solvente fino a secchezza. Si
deposita infine la silice in testa alla colonna e si procede con il caricamento dell’eluente.
Mano a mano che l’eluizione procede i composti della miscela percolano e vengono raccolti in
frazioni di 20-30 ml al termine della colonna. Le diverse frazioni vengono poi analizzate tramite
TLC in modo da poter determinare quali frazioni contengano lo stesso componente della miscela.
Quando anche l’ultimo componente viene eluito le frazioni contenenti gli stessi composti vengono
riunite, ed il solvente evaporato per ottenere il composto puro.
Nel caso specifico le colonne R rappresentano i riferimenti che indicano la natura del composto
isolato nella frazione. La frazioni 5 e 6 devono essere scartate perché contengono sia composto A
che composto B.
Il confronto tra prodotto recuperato e prodotto caricato ci dice se del prodotto è andato perso nella
colonna a causa di degradazione o se un prodotto non è stato del tutto recuperato in quanto non
visibile all’ultravioletto o con i reagenti evidenzianti impiegati. I componenti puri vengono
successivamente sottoposti ad indagine analitica per determinarne la natura e le caratteristiche
fisiche e spettroscopiche. Dati, questi, che andranno riportati a supporto della struttura proposta ed
accertata.