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Antonio Papagni

Appunti di Laboratorio di Chimica II:


La tecnica cromatografica

Cromatografia
LIQUIDO – SOLIDO

TECNICA IMPIEGATA
per SEPARARE MISCELE DI COMPOSTI
(organici e non)

si basa sul
FENOMENO DELL’ADSORBIMENTO

Assorbimento: formazione di legami stabili tra molecole e fase solida.


Adsorbimento: ritenzione superficiale da parte di un solido di molecole di varia natura.

Molecole trattenute per interazioni tra superficie del solido e molecole:


DIPOLO – DIPOLO
DIPOLO – DIPOLO INDOTTO
LEGAMI a IDROGENO
FORZE di VAN DER WAALS
Fenomeno della cromatografia

Fu introdotto nei primi del 900 dal botanico russo


Mikhail Tswett e usato nella separazione di pigmenti
di origine vegetale. Il fenomeno nasce dalle diverse
interazioni tra molecole diverse e la superficie solida,
e quindi dalla diversa
attitudine delle molecole
nel distribuirsi fra la fase
solida (o fase stazionaria) e
quella liquida (o fase
mobile). Anche la fase
mobile o il solvente di
trascinamento competeranno con il soluto per il processo di
adsorbimento. È possibile separare miscele di composti quando le
interazioni di questi ultimi con la superficie solida sono nettamente superiori a quelle tra solvente
trascinante e fase stazionaria.

Maggiori sono le interazioni che un composto ha con la superficie del solido (maggiore affinità) e
maggiormente questo verrà trattenuto dalla fase stazionaria. Questi composti saranno anche in
grado di rimuovere dalla superficie molecole con affinità inferiori, e che si muoveranno quindi più
velocemente lungo la colonna cromatografica.

In ultima analisi, dunque, ciò che regola il processo cromatografico è


la posizione dell’equilibrio che si instaura tra le molecole adsorbite
sulla fase stazionaria e l’eluente (la fase mobile).

Nell’immagine a lato, As ed Am indicano rispettivamente la


concentrazione della sostanza A nella fase stazionaria e nella fase
A
mobile. Possiamo definire il coefficiente di distribuzione K A  S :
AM
esso indica la costante d’equilibrio solido-liquido per il composto A.

Le affinità delle diverse


molecole con la fase
stazionaria e quella mobile hanno un ruolo fondamentale
nella determinazione di questi equilibri. Quando una
miscela di composti viene posta sulla parte alta della
colonna cromatografica (cioè un tubo di vetro riempito di
materiale adsorbente) e del solvente viene caricato e
lasciato percolare attraverso la fase stazionaria, questo
inizierà a trascinare le molecole costituenti la miscela
attraverso il materiale adsorbente. A seconda della forza
delle interazioni che questi composti hanno con la
superficie dell’adsorbente, essi verranno trascinati più o
meno dal solvente (eluente o fase mobile). La velocità con
cui il solvente (eluente) percola attraverso la fase
stazionaria deve essere sufficientemente lenta, affinché gli
equilibri liquido ↔ solido si instaurino in modo efficace
con i soluti. Si può quindi pensare alla cromatografia come ad un processo continuo di estrazione
selettiva, operato dalla fase stazionaria sulla fase mobile (elemento + soluto). Agli inizi della
cromatografia ciò consente alla fase stazionaria di trattenere maggiormente i componenti della
miscela più affini ad essa e quindi ne consente la separazione dalla miscela iniziale;
successivamente avremo l’estrazione dell’eluente dal soluto adsorbito (quando la separazione è già
avvenuta) e questo consente il recupero al termine della colonna di frazioni di eluente contenenti i
componenti la miscela separati. È quindi molto importante nella scelta dell’eluente che questo sia in
grado di estrarre le molecole adsorbite dalla fase stazionaria.

Caratteristiche dell’adsorbente
Perché si esplichi il fenomeno della separazione cromatografica, l’adsorbente deve essere in grado
di esercitare sui composti da separare interazioni più forti di quelle che questi hanno con la fase
mobile. Questo può essere ottenuto impiegando materiali con elevata ed operando con eluente con
bassa polarità o a polarità crescente. In questo caso si esaltano quelle interazioni fase stazionaria-
soluto di tipo dipolost - dipolosol, i ponti ad idrogeno e i dipolost - dipolo indottosol.
Alternativamente, impiegando adsorbenti poco polari (ex: il carbone attivo) si sarà in grado di
esaltare, utilizzando eluenti polari, le interazioni fase stazionaria-soluto di tipo Van Der Waals (tra
composti a bassa polarità).

Adsorbenti Adatti per separare


Allumina ed ossido di magnesio Steroli, coloranti alimentari, vitamine, esteri
alcaloidi, composti inorganici
Alluminio silicato Steroli, glucosidi
Amido Enzimi
Calcio carbonato Carotenoidi, xantofille
Calcio idrato Carotenoidi
Calcio fosfato Enzimi, proteine, polinucleotidi
Carbone attivo Peptidi, carboidrati, amminoacidi
Gel di silice Steroli, amminoacidi, gliceridi, cere
Magnesio carbonato Porfirine
Magnesio silicato Steroli, esteri, gliceridi, alcaloidi
Poliammide Fenoli, nitrocomposti aromatici
Zucchero Clorofille, xantofille

La scelta di un adsorbente rispetto ad un altro è


molto legata alla natura della sostanza da separare.
Se queste sono poco polari sarà abbastanza
complicato riuscire ad esercitare su di esse delle
differenze di interazione tali da permetterne la
separazione, attraverso un supporto polare. In
questo caso sarebbe infatti più efficace un
adsorbente poco polare che ha una maggiore
affinità con i composti poco polari. L’affinità di un
adsorbente per una certa classe di composti rientra
nelle caratteristiche di selettività della tecnica
cromatografica.
Selettività ed efficienza
La selettività è la possibilità di ottenere bande ben distanziate tra i componenti di una miscela. È
correlata con le interazioni soluto-adsorbente: difatti essa è in relazione alla temperatura, ma a
temperatura costante è in stretta correlazione alle caratteristiche della fase mobile, come la polarità.
La selettività diminuisce aumentando la
temperatura, con tutti gli adsorbenti. In
quelli polari può diminuire ulteriormente
aumentandone la polarità; viceversa in
quelli apolari. Un ulteriore parametro
che caratterizza un adsorbente è la sua
efficienza, cioè la capacità di un
materiale di formare bande compatte
(poco diffuse lungo la colonna) e
dipende essenzialmente dalla
dimensione delle particelle
(granulometria). Le dimensioni delle
particelle influenzano infatti il passaggio
della fase mobile. Più piccole sono le
particelle e minore è il volume interstiziale fra di esse, ed allo stesso modo saranno ridotti i cammini
preferenziali che la fase mobile può incontrare, maggiore sarà la superficie di contatto fra la fase
mobile e quella stazionaria, e quindi maggiori saranno le interazioni
soluto-fase stazionaria e migliore sarà la selettività (vengono difatti
esaltate le interazioni soluto-superficie della fase stazionaria).
La granulometria influenza enormemente il passaggio della fase
mobile e quindi per avere flussi di fase mobile adeguati non si
possono usare particelle troppo piccole, in quanto ostacolerebbero
troppo il normale percolamento della fase mobile. In genere non si
usano adsorbenti con diametro delle particelle inferiore a 230 - 300
mesh (o 50-60 µm) per le cromatografie su
colonna. Solitamente per le cromatografie
gravitazionali (dove l’eluente percola sotto il
solo effetto della gravità) si usano
granulometrie tra i 63 ed i 200 µm. Con
granulometrie inferiori (fino a 50 µm) è
possibile effettuare cromatografie sotto pressione. In questo caso si usano
colonne in vetro rinforzato o in acciaio. Più è ristretto il range della
granulometria (particelle di volume regolare) e migliore è l’efficienza.
Altro fattore su cui poter agire sono le dimensioni della colonna. In genere
colonne con sezioni più grosse consentono di avere una superficie di
contatto fase mobile - fase stazionaria più ampia e a parità di volume la stessa quantità di
adsorbente è contenuto in altezze minori di colonna. Questo consente di
Allumina
ottenere, a parità di caricamento, bande più strette.
Attività % Acqua Silica gel
I 0
Difatti all’aumentare dell’ampiezza della colonna e
mantenendo costanti la selettività e la granulometria Attività % Acqua
II 3 I 0
III 6
dell’adsorbente, l’efficienza aumenta perché la quantità
di adsorbente trattiene il soluto in una banda più stretta. II 12
IV 8 III 15
V 10 Quindi può essere più conveniente utilizzare colonne
corte ma larghe in sezione rispetto a colonne lunghe e strette. Può capitare in
alcuni casi che possano essere necessari volumi elevati di eluente puro per ottenere la eluizione del
soluto. Può quindi risultare comodo disattivare l’adsorbente per aggiunte pesate di H2O.
Sulla selettività dell’adsorbente ha una diretta influenza l’attività dell’adsorbente stesso.
L’attività dell’adsorbente è direttamente legata al numero di siti attivi presenti per unità di
superficie a quanti di questi siti sono accessibili sia alla fase mobile che al soluto. Inoltre ha un peso
determinante sull’attività quanti di questi siti attivi risultano effettivamente attivati o meno. In
adsorbenti molto polari una delle cause principali di deattivazione è la quantità di acqua adsorbita.
L’acqua, come liquido con la più alta costante dielettrica, interagisce fortemente con substrati polari
e, nel caso di sostanze adsorbenti, interagirà fortemente con i siti attivi di questa e può essere
rimossa da tali centri solo da composti ancora più polari (ad esempio composti ionici). Più acqua è
presente meno selettivo è l’adsorbente e questo
Serie eleutrope
può in certi casi condurre a pessime separazioni
Benzene 1:1
tra soluti, quando questi non sono in grado di
Benzene / Cloroformio --
competere con H2O a livello dei siti attivi. D’altra
Cloroformio 8:2
parte un adsorbente particolarmente attivo può
Cicloesano / Acetato d'etile 95:5
legare fortemente le particelle di soluto, tanto da
Cloroformio / Acetone 9:1
renderne problematica la rimozione da parte
Benzene / Acetone 8:2
dell’eluente. (Manca la pagina 13) …con una
Benzene / Acetato d'etile 9:1
velocità che risulterà dipendente dalla forza di
Cloroformio / Etere etilico 9:1
queste interazioni solido-soluto e quelle soluto-
Benzene / Metanolo 95:5
fase mobile e solido-fase mobile. Questi equilibri
Benzene / Etere Etilico 6:4 sono anche regolati dalle diverse masse degli
Cicloesano / Acetato d'etile 1:1 elementi da un punto di vista squisitamente
Cloroformio / Etere etilico 8:2 quantitativo. Agendo sulla polarità dell’eluente si
Benzene / Acetone 8:2 agisce sulle interazioni soluto-fase mobile e
Cloroformio / Metanolo 99:1 solido-fase mobile, e cioè su quei fattori che
Benzene / Metanolo 9:1 portano al deadsorbimento del soluto dalla fase
Cloroformio / Acetone 85:15 stazionaria. La polarità di un sorbente può essere
Benzene / Etere Etilico 4:6 in prima analisi associata alla costante dielettrica
Benzene / Acetato d'etile 1:1 del solvente, anche se interazioni forti acido –
Cloroformio / Etere etilico 6:4 base tra solvente e fase stazionaria possono
Cicloesano / Acetato d'etile 2:8 stravolgere questo ordine (ad esempio l’acido
Acetato di butile -- acetico interagisce meglio con silice che con
Cloroformio / Metanolo 95:5 H2O, anche se ε acido acetico < ε H2O). La
Cloroformio / Acetone 7:3 cromatografia può essere condotta anche con
Benzene / Acetato d'etile 3:7 miscele di solventi purché questi formino miscele
Acetato di butile / Metanolo 99:1 stabili in quasi tutti i rapporti. Questo consente di
Benzene / Etere Etilico 1:9 modulare la polarità di un solvente con quella di
Etere etilico / Metanolo 99:1 un altro e quindi ottenere un gradiente continuo di
Etere etilico --
Etere etilico / Dimetilformammide 99:1
Acetato d'etile --
Acetato d'etile / Metanolo 99:1
Benzene / Acetone 1:1
Cloroformio / Metanolo 9:1
Diossano --
Acetone --
Metanolo --
Diossano / Acqua 9:1
polarità dal solvente meno polare a quello più polare.
Varie liste di solventi o eluenti vengono riportate sui
vari testi. Tutte si basano su questo concetto. Queste
liste vengono indicate come serie eleutrope. Dato che
nella cromatografia sono coinvolti processi di equilibrio tra due fasi e la superficie di contatto fra
queste rappresenta uno dei fattori cruciali, la cromatografia viene trattata da un punto di vista
teorico come una colonna di distillazione a piatti ed è quindi valutabile in questo caso il numero di
piatti teorici per una colonna cromatografica (sono 104).

Cromatografia su strato sottile (TLC)


La thin layer cromatography opera con gli stessi parametri visti per la cromatografia su colonna. In
questo caso la fase stazionaria è supportata su di un supporto solido inerte con uno spessore che
varia a seconda dell’utilizzo di questa tecnica.
 Analitico : spessore 0.25 - 0.5 mm, carico fra i 5 ed i 10 µg di miscela.
 Preparativo (recupero di prodotti): spessore 2 - 5 mm, carico fino a 250 mg di sostanza.

Nella TLC di tipo analitico viene impiegata una granulometria minore di quella usata negli
adsorbenti per colonna; per le TLC si usano misure dai 5 ai 40 µm. Queste granulometrie

d ( A)
R fa 
d (F )
solitamente garantiscono delle buone efficienze. La selettività è legata alla natura della fase mobile
ed alle caratteristiche dell’adsorbente. Questi è legato al supporto in vetro tramite un collante
(solfato di calcio) ed in genere contiene una sostanza fluorescente, solfuro di zinco, che assorbe a
251 nm (frequenza ultravioletta). Le lastre commercializzate garantiscono una buona omogeneità
della granulometria ed una buona densità di impaccamento. Questo consente di avere buone
efficienze e buone riproducibilità.
La selettività, nel caso TLC, viene valutata considerando il fattore di ritardo Rf. Questo parametro è
il rapporto tra la corsa effettuata dal solvente (che solitamente si lascia salire per capillarità sino ad
un centimetro dal bordo superiore della lastra) e quella dei componenti caricati sulla lastra stessa.
Difatti nella TLC l’eluente risale la fase stazionaria per capillarità, ed in questo movimento contro
la gravità trascina il soluto. In questo processo, chiamato sviluppo della lastra cromatografica, si
instaurano gli stessi equilibri visti per la cromatografia in colonna fra la fase stazionaria e quella
mobile.
Maggiore è la corsa o Rf, minore è la selettività dell’adsorbente per quel composto.

Rf dipende da: natura adsorbente, struttura dei pori delle particelle (la presenza di pori sulla
superficie aumenta l’area superficiale e quindi la selettività; la struttura dei pori viene individuata
nel diametro medio di questi, dal loro volume, dalla loro distribuzione e dalla loro superficie),
spessore dello strato, temperatura e grado di saturazione dell’ambiente di sviluppo della lastra.
In genere le lastre da sviluppare vengono introdotte in una camera di sviluppo nella quale viene
posto l’eluente. Il livello dell’eluente deve essere tale da non superare la linea di partenza (~1mm
sotto tale linea). La fase stazionaria, possedendo una elevata superficie, faciliterà l’evaporazione del
solvente che sale per capillarità. Questo fenomeno deve essere ridotto al minimo, per evitare che
quando si usino miscele di elementi si abbia evaporazione del solvente più volatile o meno polare e
quindi alterazione della polarità dell’eluente, ed è facilmente ottenuto usando camere di sviluppo
chiuse in cui la fase liquida ha raggiunto l’equilibrio con la fase vapore. In questo modo la
superficie della lastra è a contatto con un ambiente saturo di vapori dell’eluente, e questo riduce
l’evaporazione dell’eluente dalla superficie della lastra. Si raggiunge velocemente la saturazione
della camera introducendo strisce di carta da filtro nella camera di sviluppo. Queste, imbevendosi di
eluente ed aumentando la superficie a disposizione del liquido consentono una veloce saturazione
della camera.

Caricamento della TLC analitica


Si impegano capillari di vetro nei quali viene fatto salire per capillarità il soluto disciolto nel
solvente più opportuno. Come solvente si deve scegliere quello con il migliore potere solvente sul
composto o miscela da analizzare e che possegga una relativamente bassa polarità coniugata con
una alta volatilità (etere etilico, cloruro di metilene). Si discioglie una piccola quantità di miscela o
del composto da analizzare in questi solventi (in genere una punta di spatola in 2 – 3 ml di
solvente). Si carica il capillare immergendolo nella soluzione, facendo salire il solvente per 1 – 1.5
cm e non oltre (l’effetto del peso dell’eluente può causare la formazione di una goccia all’estremo
del capillare che provocherebbe un deposito non controllato) e questo viene appoggiato sulla linea
di base, avendo cura di non disturbare lo strato di fase stazionaria. Si cerca in questa fase di non far
diffondere troppo il solvente nella zona di caricamento in modo da evitare che il soluto venga
caricato su un’aria molto ampia (quella raggiungibile dall’eluente). Se si fanno piccoli depositi di
miscela (solvente – soluto), soffiando fra un deposito e l’altro sull’area di deposizione per agevolare
l’evaporazione del solvente, si riesce a contenere il soluto in un’area molto ristretta della linea di
deposizione; questo garantisce buona omogeneità del deposito e quindi un buono sviluppo.
Cose da evitare in questa fase: usare soluzioni troppo
concentrate o addirittura composti liquidi puri. Questo
provocherebbe la saturazione dei siti attivi della fase
stazionaria lungo tutto il percorso di sviluppo con perdita di
selettività. Evitare di procurare danneggiamenti alla fase
stazionaria, toccandola con le dita o staccandola dal supporto.
Questo causa irregolarità nella salita dell’eluente con perdita di
efficienza. Evitare di fare caricamenti troppo vicini ai bordi
laterali (la distanza minima deve essere intorno al mezzo
centimetro). Difatti lungo i bordi l’eluente non sale
omogeneamente e potrebbe falsare Rf. È possibile fare anche
caricamenti multipli sulla medesima lastrina: l’importante è che
essi siano distanziati di almeno mezzo centimetro l’uno
dall’altro, perché la capillarità tende a far salire l’eluente lungo
una fascia che va ampliandosi mano a mano che la distanza percorsa aumenta. Se i caricamenti sono
troppo vicini si rischia una sovrapposizione di bande che falserebbe lo sviluppo.

Analisi di uno strato sottile sviluppato


In genere le lastre commerciali sono fornite di un indicatore a fluorescenza che emette luce a 254
nm. Tutte le sostanze organiche che presentano assorbimenti a lunghezza d’onda maggiori
assorbono la radiazione al posto di ZnS e danno come risultato una lastra verde chiaro (ZnS in
fluorescenza) punteggiato con macchie blu scuro (l’analita). Assorbono radiazione a 254 nm tutte
quelle sostanze che presentano cromofori insaturi (da dieni, composti carbonilici da α o β insaturi in
su, derivati aromatici). È sufficiente porre la lastra sotto una lampada UV. Sostanze che non
assorbono a 254 nm o che presentano assorbimenti a lunghezze d’onda minori (composti saturi, o
con una sola insaturazione – alcheni, composti carbonilici, ecc.) non possono essere rilevate
esponendo la lastra a lampada UV. In questo caso la lastra viene sottoposta all’azione di vari agenti
specifici per la rilevazione delle macchie. Il più usato è esporre la lastra ai vapori di I2 (I2 sublima
facilmente dando vapori viola). I vapori vengono assorbiti dalla lastra ed in genere in
corrispondenza delle zone dove è presente della sostanza organica si formano aree di colore
marrone più scuro rispetto al colore assunto dal fondo. Il colore deriva dalla parziale reazione di I2
con la sostanza organica o per adsorbimento preferenziale di I2 nel composto organico rispetto alla
fase stazionaria. Quando si fa una vera reazione tra comparso organico (ad esempio olefina) e I2,
può verificarsi il fenomeno opposto: zone più chiare su fondo scuro. Tempo esposizione: da pochi
minuti a ore.

Uso della TLC Analitica


La TLC analitica può essere utilizzata per i seguenti scopi:
 Individuare l’adsorbente ottimale per una data sostanza. In genere vengono usati SiO2 e
Al2O3 per cui questo utilizzo è caduto in disuso.
 Scelta della migliore miscela o solvente eluente. Analisi della sostanza pura, si cerca un
eluente che fornisca un Rf non superiore a 0.5. La polarità dell’eluente influenza la
selettività della fase stazionaria per cui questa va selezionata in modo da avere questo valore
di Rf. Nel caso di miscele la scelta dell’eluente è molto importante. L’eluente ottimale è
quello che consente di separare tutti i componenti della miscela. Questa scelta fornisce
anche informazioni su quale l’eluente migliore per operare una separazione cromatografica
su colonna per la stessa miscela di composti. Difatti in genere l’eluente ottimale per la TLC
è anche quello ottimale per la separazione cromatografia in colonna.
 Monitoraggio dell’andamento delle reazioni chimiche. Una volta trovato l’eluente idoneo
per evidenziare i reagenti impiegati in una reazione chimica (uno di questi va posto con Rf =
0.5 ca), l’analisi per strato sottile evidenzia la scomparsa di un reagente o la comparsa di
altre macchie relative ai prodotti.
 Monitoraggio dell’andamento della separazione di una miscela con colonna cromatografica.

Criterio di scelta per la migliore miscela eluente


 Analisi delle funzionalità presenti: la presenza di gruppi polari nella molecola perchè
interagiscono più fortemente con il supporto polare e
quindi i relativi composti verranno maggiormente
trattenuti. Questo a parità di polarità della fase mobile.
Più gruppi polari sono presenti in una struttura e
maggiore deve essere la polarità dell’eluente per ottenere
ritenzioni di circa 0.5.
 Criterio pratico: su di un deposito eseguito cercando di
mantenere l’area di caricamento il più ridotta possibile si
fa adsorbire con un capillare la miscela eluente da testare.
Si lascia che l’eluente diffonda fino a raggiungere la
massima distanza dal deposito e si segna a matita il limite
raggiunto. Si valuta successivamente il fronte del soluto:
se questo è circa a metà della distanza percorsa Rs
 0.5
dall’eluente, allora questi è idoneo. Se questo non accade R el
si deve lavorare sulla polarità dell’eluente, aumentandola
o diminuendola, per cercare di avvicinare il più possibile l’Rf a 0.5. In particolare se il
rapporto è minore di 0.5 si deve aumentare la polarità dell’eluente, viceversa se maggiore.
Se la miscela di sostanze da analizzare è solubile negli eluenti da testare questa miscela può
essere utilizzata direttamente sia per la deposizione che per lo sviluppo locale. In questo
caso si ottengono risultati ancora migliori.

La relazione tra la polarità dell’eluente e quella dell’adsorbente è evidenziata dalla struttura stessa
del silica gel. Questo composto viene preparato per reazione del silicato di sodio con acido solforico
per precipitazione di acido silicico. Condensando tramite eliminazione di acqua di ottiene il gel.

Na4SiO4 + H2SO4 H4SiO4 + Na2SO4 H4SiO4 SiO2

Analizzando la struttura fine del gel di silice è possibile


identificare i siti attivi che ne garantiscono
l’adsorbimento. La reattività dell’adsorbente è quindi
localizzata sui legami polari Si - O in superficie, e sui
gruppi OH che si estendono verso l’esterno del
composto. Nel percorso cromatografico saranno le
interazioni tra le funzioni OH- (dipolo - dipolo e ponte
ad idrogeno) e le interazioni acido-base tra il gruppo
idrossido e/o i legami polari tra silicio ed ossigeno con
le molecole di soluto e solvente a creare la selettività
mostrata da questo adsorbente. È su queste interazioni
che si deve quindi operare per poter condurre con
successo una separazione cromatografica.

Preparazione di una colonna cromatografica


Una volta determinati il miglior eluente e l’adsorbente più adatto alla separazione cromatografica
che ci si appresta a condurre, è necessario comprendere quanto di questo adsorbente deve essere
caricato all’interno della colonna. Nel caso si stia usando Silica gel esiste una relazione matematica
in grado di correlare l’altezza della colonna riempita al peso della silice da usare ed al diametro
della colonna. Solitamente la silice deve avere un peso compreso fra le 25 e le 50 volte quello della
miscela da separare. La quantità da utilizzare è collegata alla selettività mostrata dalla silice verso i
componenti della miscela da separare. Minori sono le differenze di selettività (nel caso di TLC si
parla di minore ΔRf tra le due componenti della miscela) e maggiore deve essere la quantità di silice
da impiegare. Quindi quando il ΔRf è fra gli 0.1 e gli 0.2, la quantità di silice sarà massima. Una
volta determinata la quantità di silice la relazione che lega le dimensioni della colonna è
6  mSiO2
l
d2
dove l è la lunghezza della colonna e d il suo diametro. In generale un rapporto diametro -
lunghezza di 1:10 o 1:15 rappresenta un valore ottimale.

Rimpimento della colonna


Il gel di silice viene dapprima imbevuto di miscela eluente in un bicchiere, in modo che l’aria
contenuta nella silice venga spostata e che la colonna risulti ben impaccata. Questo fenomeno di
adsorbimento è esotermico perché il legame tra la silice ed il solvente è più energetico di quello con
l’aria (gli elettroni del solvente perdono gradi di libertà, quantificabili in energia). Questo può
portare specialmente con solventi polari ad un riscaldamento della silice ed alla conseguente
evaporazione dell’eluente. Questo può essere un problema soprattutto se la miscela eluente è
composta da solventi con elevate tensioni di vapore. L’evaporazione preferenziale di uno dei
componenti della miscela ne altera la composizione e la polarità. Al termine dell’aggiunta
dell’eluente (che deve bagnare tutta la silice e sovrastarla di almeno 1 o 2 cm) si agita la
sospensione e la si introduce sotto agitazione nella colonna cercando di far depositare meno silice
possibile nel bicchiere. Nella parte bassa della colonna viene introdotto del cotone inumidito di
eluente dal quale si è fatta fuoriuscire l’aria inglobata con l’uso di una bacchetta di vetro.
L’introduzione della silice umida va fatto inizialmente tenendo fermo il cotone con la bacchetta di
vetro e successivamente questa va tolta non appena si è ottenuto uno strato di alcuni cm di silice
depositata sul cotone. Dal fondo della colonna si recupera l’eluente e lo si riutilizza fino ad
introdurre tutta la silice pesata. Si completa l’impaccamento facendo percolare l’eluente e
picchiettando la colonna delicatamente con un tubo di gomma. In tutte queste operazioni la parte
alta della silice deve rimanere coperta dall’eluente per evitarne l’ossidazione all’aria e l’eventuale
intrusione della stessa nella colonna cromatografica. Se la colonna si asciuga il procedimento
dell’impaccamento deve essere ripetuto da capo. L’eluente va fatto percolare fino a 1 - 2 mm dalla
superficie libera della silice, che deve essere più piatta possibile. A questo punto si passa al
caricamento della miscela da separare. Questo viene fatto sciogliendo la miscela nella minore
quantità possibile di eluente e depositandola sulla superficie della silice con una pipetta, facendo
attenzione a non disturbarne eccessivamente la superficie.

Se la miscela non è scioglibile nell’eluente è possibile farla adsorbire da una quantità 1:4 di silice
attraverso il solvente che meglio la scioglie, e poi si evapora il solvente fino a secchezza. Si
deposita infine la silice in testa alla colonna e si procede con il caricamento dell’eluente.
Mano a mano che l’eluizione procede i composti della miscela percolano e vengono raccolti in
frazioni di 20-30 ml al termine della colonna. Le diverse frazioni vengono poi analizzate tramite
TLC in modo da poter determinare quali frazioni contengano lo stesso componente della miscela.
Quando anche l’ultimo componente viene eluito le frazioni contenenti gli stessi composti vengono
riunite, ed il solvente evaporato per ottenere il composto puro.
Nel caso specifico le colonne R rappresentano i riferimenti che indicano la natura del composto
isolato nella frazione. La frazioni 5 e 6 devono essere scartate perché contengono sia composto A
che composto B.

Resoconto della cromatografia

Frazioni riunite Contenuto Eluente impiegato Grammi


1-4 Composto A puro Etere petrolio/ Acetato d'etile (7:3) 0,8
5-6 A+B " 0,2
7 - 10 Composto B puro " 0,6
11 - 14 Composto C puro Etere petrolio/ Acetato d'etile (1:1) 0,6

Caricati 2.3 g Recuperati 2.2 g, cioè il 96% del prodotto.

Il confronto tra prodotto recuperato e prodotto caricato ci dice se del prodotto è andato perso nella
colonna a causa di degradazione o se un prodotto non è stato del tutto recuperato in quanto non
visibile all’ultravioletto o con i reagenti evidenzianti impiegati. I componenti puri vengono
successivamente sottoposti ad indagine analitica per determinarne la natura e le caratteristiche
fisiche e spettroscopiche. Dati, questi, che andranno riportati a supporto della struttura proposta ed
accertata.