UNIDADE DE ENSINO SUPERIOR VALE DO IGUAU CURSO DE FARMCIA DISCIPLINA: TOXICOLOGIA CLNICA

APOSTILA DE ANLISES TOXICOLGICAS

PROFESSORA: Elaine Anton

APRESENTAO

O presente trabalho uma compilao de vrias tcnicas ministradas na disciplina de Toxicologia de outras Universidades, que tambm esto sendo usadas nos laboratrios de Emergncias Toxicolgicas dos Centros de Controle de Intoxicaes, bem como de algumas anlises realizadas em laboratrios da Polcia Tcnico-Cientfica, com a finalidade de sistematizar as aulas prticas da disciplina de Toxicologia.

Prof. Elaine Anton

SUMRIO
PROCEDIMENTOS GERAIS NO LABORATRIO .................................................... 2 ANLISES TOXICOLGICAS ................................................................................... 4 DIAGNSTICO DAS INTOXICAES AGUDAS ...................................................... 8 MODELO DE REQUISIO PARA ANLISE TOXICOLGICA ................................ 9 MODELO DE FICHA PARA ANLISE TOXICOLGICA ......................................... 10 MODELO DE LAUDO PARA ANLISE TOXICOLGICA ........................................ 11 TESTES COLORIMTRICOS RPIDOS PARA IDENTIFICAO DE AGENTES TXICOS TOXICOLOGIA DE MEDICAMENTOS ................................................. 13 TESTES RPIDO PARA TRIAGEM DE MEDICAMENTOS (IMUNOCROMATOPLACAS) ................................................................................... 17 MARCHA SISTEMTICA PARA EXTRAO DE MEDICAMENTOS DE MATERIAL BIOLGICO ............................................................................................................. 19 DETERMINAO DE PARACETAMOL EM ESPECTROFOTMETRO UV-Vis ..... 26 DETERMINAO DE SALICILATOS EM ESPECTROFOTMETRO UV-VIS (MTODO DE KAYE) ............................................................................................... 31 IDENTIFICAO DE AGENTES TXICOS ............................................................. 36 TESTE RPIDO PARA TRIAGEM DE DROGAS DE ABUSO IMUNOCROMATOPLACAS ..................................................................................... 39 IDENTIFICAO DE CANABINIDES EM ERVA IN NATURA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) ........................................... 42 IDENTIFICAO DE CANABINIDES EM URINA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA EFICINCIA (CCDAE / HPTLC) .......................... 44 IDENTIFICAO DE COCANA EM AMOSTRAS DE PRODUTO .......................... 47 TESTES COLORIMTRICOS RPIDOS PARA IDENTIFICAO DE AGENTES TXICOS ................................................................................................................. 51 IDENTIFICAO DE AGROTXICOS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) ..................................................................................................... 52 DETERMINAO DA ATIVIDADE DA COLINESTERASE PLASMTICA .............. 55 DETERMINAO DE METEMOGLOBINA .............................................................. 58 DETERMINAO DE CARBOXIEMOGLOBINA NO SANGUE ............................... 62

COMUNICAO

Pelo presente, estamos levando ao conhecimento dos alunos as seguintes informaes: A freqncia s aulas ser OBRIGATRIA, respeitando-se os horrios prdeterminados. Ser OBRIGATRIA a utilizao de guarda-p nas aulas prticas. No fumar, comer ou ingerir lquidos no laboratrio. Conserve as bancadas livres de materiais que no esto sendo usados. Recomenda-se muito cuidado na utilizao de substncias corrosivas e inflamveis. Solventes e lquidos fumegantes devero ser manipulados dentro das capelas. No torne a colocar no frasco de origem o reagente dele retirado ou nele introduzir objetos estranhos (pipetas, etc.), evite assim a contaminao do reagente e possibilitar a sua conservao por mais tempo. No deixar frascos de reativos abertos. Zelar pela conservao do material utilizado e pela ordem do laboratrio, deixando a vidraria usada nos locais indicados. Os alunos sero responsveis pelas suas amostras, durante o andamento das anlises. Atender s recomendaes para o despejo do material utilizado. Usar luvas e ps-pipetas para manuseio do material biolgico.

PROCEDIMENTOS GERAIS NO LABORATRIO

1. Rejeitos qumicos Para o recolhimento dos rejeitos qumicos devem ser utilizados recipientes de vidro ou de plstico resistentes, que estejam em perfeitas condies, principalmente com relao vedao dos mesmos. Evitar frascos com vazamentos. O recolhimento dos rejeitos qumicos no deve ultrapassar 2/3 da capacidade do recipiente. Frascos extremamente cheios criam riscos quando transportados. Antes do recolhimento dos rejeitos qumicos ativos, deve-se ter o devido cuidado no sentido da desativao destes. Lembrar que frascos contendo rejeitos qumicos ativos, sem nenhuma indicao no rtulo, expem os funcionrios do setor a srios riscos. Os frascos contendo rejeitos devero ser rotulados e perfeitamente identificados com o nome do laboratrio, material, responsvel e data. 1.1 Solventes orgnicos clorados (ex: clorofrmio, tetracloreto de carbono, diclorometano, dicloroetano, etc). Tendo em vista que esta classe de rejeitos qumicos no possibilita nenhum tipo de tratamento prvio dentro do laboratrio, devem ser armazenados em recipiente plstico resistente com tampa, para que posteriormente sejam recuperados ou eliminados. 1.2 Solventes no clorados (ex: lcoois, acetonas, teres, hexano, benzeno, tolueno, etc). O procedimento adotado para estes solventes, o mesmo adotado para solventes orgnicos clorados, citados no item 1.1. 1.3 Metais pesados, ctions, nions em meio aquoso (ex: chumbo, mercrio, cobre, zinco, etc). O tratamento dos rejeitos inorgnicos compreende as seguintes etapas: O material deve ser lanado em bombonas de plstico de 50 litros no final de cada experincia. Quando o volume de rejeitos atingir 50% do volume total da bombona sobre a mistura, adicionar excesso de soda custica e cal virgem. Deixar decantar o precipitado.

Por sifonagem, separar o precipitado do sobrenadante em novas bombonas. Testar se ainda ocorre precipitao com o sobrenadante. Repetir o procedimento at no mais formar nenhum precipitado. O sobrenadante final pode ser lanado na pia (estas etapas so realizadas por tcnicos da universidade). 1.4 cidos e bases Solues aquosas diludas de cidos e bases devero ser colocadas em recipiente tipo bquer e neutralizadas no final de cada experincia. Depois de neutralizado, o material poder ser lanado na pia, visto que sais do tipo cloretos, sulfatos, carbonatos, fosfatos, etc., na forma diluda no so prejudiciais ao meio.

2. Descarte materiais biolgicos

Urina: as amostras de urina devem ser descartadas em recipiente prprio contendo hipoclorito de sdio. Os frascos coletores devem ser descartados em saco plstico branco leitoso e encaminhados coleta de lixo hospitalar.

Sangue: as amostras de sangue devem ser descartadas em tubos ou frascos bem vedados e prova de vazamentos em recipientes de paredes rgidas, e devidamente identificados com o smbolo internacional de Risco Biolgico. O vasilhame deve ser lacrado, acondicionado em saco plstico branco leitoso e encaminhado para a coleta hospitalar.

3. Lavagem do material - A limpeza da vidraria deve ser feita com detergente neutro. - Enxaguar trs vezes com gua corrente, - A seguir enxaguar duas vezes com gua destilada ou deionizada. - Secar a temperatura ambiente. - Resduos de detergentes no material utilizado podem causar alteraes nos resultados e contaminar os reagentes. Certifique-se o material a ser utilizado est devidamente limpo e seco.

4. Bibliografia PORTARIA SMSA-SUS/BH N 017 de 03 de maro de 1999. Fiscalizao sanitria em laboratrios de anlises clnicas no municpio de Belo Horizonte. Disponvel em: http://www.pbh.gov.br/smsa/biblioteca/gevis/port_017_99.pdf. Acesso em 25/11/2009. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA. Boletim Oficial. Sistema de coleta de resduos qumicos. Disponvel em:notes.ufsc.br/aplic/boletim.nsf/0/121 c4ea357070a400325642c005de5aa?OpenDcument. Acesso em 26/04/2006.

ANLISES TOXICOLGICAS

Um laboratrio de anlises toxicolgicas tem grande importncia, tanto do ponto de vista das anlises que pode oferecer, quanto das informaes que seus profissionais podem fornecer. Com a larga utilizao das substncias qumicas na atualidade, um aumento no nmero de anlises tem sido registrado. Para atender, no entanto, s expectativas exigidas para a obteno de resultados confiveis, precisamos de profissionais treinados e capazes de lidar com diferentes instrumentos analticos, isto porque, as anlises toxicolgicas necessitam de metodologia variada, que atenda as suas caractersticas peculiares. Para entendermos melhor o que isto significa, podemos dividir a toxicologia em 5 reas principais: Toxicologia Ocupacional, Ambiental, de Alimentos, de Medicamento e Social. Em cada uma destas reas vamos encontrar necessidades diferentes. Por exemplo, na Toxicologia Ocupacional, pouco valor tem o fato de mencionarmos que este ou aquele agente txico foi identificado no sangue do trabalhador, uma vez que, na maioria das vezes, sabemos as condies de exposio; h necessidade, sim, de se quantificar tal substncia e se tentar correlacionar o valor obtido com o quadro txico exibido. Entretanto, isto no ocorre na rea de Toxicologia Social. Exemplo: um indivduo em controle de farmacodependncia anfetamina, se encontrarmos o frmaco inalterado ou seus produtos de biotransformao, no precisamos quantific-los, pois sua identificao j basta a esta finalidade. Assim sendo, a realizao de Anlises Toxicolgicas depender da finalidade destas, decorrendo da, questes como: natureza da substncia a ser pesquisada, amostra a ser utilizada, a concentrao esperada, o mtodo mais adequado etc. Quanto a Finalidade, esta poder ser: - Forense: toda anlise com propsitos legais. Ento, uma anlise do tipo forense poderia estar includa em quaisquer das reas da Toxicologia anteriormente citadas. - Controle teraputico: nvel sanguneo de frmacos, principalmente aqueles que possuem estreita margem de segurana. - Limite de Tolerncia e Limite Biolgico de exposio: controle do nvel de exposio e preveno no ambiente de trabalho. - Avaliao da qualidade dos Alimentos - Dose Diria Aceitvel. - Avaliao da qualidade do ar, da gua e dos solos. - Auxlio diagnstico nas emergncias toxicolgicas e outras. Dentro do exposto, poderemos abordar outros aspectos relacionados a cada sub-item mencionada qual seja:

Tipo de amostra: a finalidade da amostra est diretamente ligada finalidade da anlise e da substncia a ser pesquisada. Exemplos: na avaliao da exposio ocupacional aos compostos liberadores do on cianeto, no adiantaria colhermos a amostra e dizermos que h a presena deste on, mas sim dizermos o quanto h, de maneira exata, pois isto poderia definir o destino do trabalhador exposto. Neste caso, o sangue seria til na avaliao do on cianeto e tambm a urina, como exame suplementar dosando-se tiocianato urinrio. No controle teraputico a amostra biolgica ideal o sangue; em exames anti-dopping a urina, sangue e a saliva; na verificao de intoxicaes letais so as vceras (rins, fgado, bao, crebro, pulmes etc.), sangue, urina, contedo estomacal etc. Natureza da substncia: ou seja, suas propriedades fisico-qumicas e como se comporta, pois dependendo destes fatores, uma substncia dever ser pesquisada neste ou naquele local. Exemplos: os inseticidas organoclorados so muito lipossolveis e devero ser pesquisados preferencialmente no sangue e no tecido adiposo; para um gs irritante, de ao local e sem ao sistmica a melhor amostra seria o ar do ambiente geral ou do ambiente de trabalho. Concentrao esperada - disto resultar implicaes relativas sensibilidade das tcnicas empregadas: altamente sensveis, por exemplo, na determinao de resduos de inseticidas organoclorados (aqui necessitaramos de um cromatgrafo a gs acoplado a um detector de captura de eltrons); pouco sensveis, por exemplo, na identificao de fenobarbital em contedo estomacal proveniente de necrpsia de indivduo com histrico de uso excessivo desse frmaco (neste caso, poderamos, utilizar a cromatografia em camada delgada). Isso tudo, redundaria noutro fato, ou seja, a disponibilidade de equipamentos. Mtodo mais adequado - uma reviso bibliogrfica especializada seria necessria para avaliao dos mtodos utilizados, para escolha do mais indicado e que se enquadre dentro da realidade do laboratrio. Existem ainda outros fatores a serem considerados. Uma substncia poder ser amplamente biotransformada no organismo e se a pesquisa for efetuada na urina poderemos no encontr-la e sim, seus produtos de biotransformao. Se um indivduo est exposto a benzeno no seu ambiente de trabalho e recebemos urina para anlise, o que podemos dosar o fenol urinrio ou o cido trans-trans mucnico, pois o benzeno quase que completamente biotransformado e desta maneira excretado. A forma de distribuio da substncia no organismo tambm um importante fator a ser considerado. De que adiantaramos pesquisar chumbo no soro se esse agente se encontra em torno de 99 % ligado aos eritrcitos? De posse destes dados e de outros complementares relacionados a toxicocintica e a toxicodinmica, poderamos iniciar a anlise propriamente dita que, seja ela qual for, via de regra apresenta trs fases: 1 fase - Separao: eliminao dos componentes indesejveis onde se encontra a substncia objeto de anlise. 2 fase - Extrao: retirada do elemento do meio onde se encontra. 3 fase - Identificao e /ou quantificao

Entre uma fase e outra podemos incluir uma fase de purificao.

ANLISE DOS RESULTADOS

Aps execuo de uma Anlise toxicolgica, obtemos um resultado. Entretanto, isto no representa tudo. H que se analisar todo um conjunto de fatores envolvidos com este resultado. Vamos supor que aps determinao da digoxina srica, encontramos uma concentrao de 2 ng/ml (duas nanograma de digoxina por mililitro de soro). Essa concentrao est contida dentro da faixa considerada teraputica (1,0 - 2,0 ng / ml). Entretanto, este paciente foi enviado ao laboratrio para controle teraputico justamente por exibir sinais de intoxicao. Como proceder diante de uma situao destas? Vemos, ento, que h a necessidade de se pensar em outros fatores relacionados com o quadro apresentado. Esse indivduo no poderia apresentar uma massa cardaca sadia menor? Ou, ento, esse indivduo no estaria submetido a uma terapia associada que estivesse produzindo sinergismo? A partir da, percebemos que deve haver uma preocupao constante quanto aos fatores que envolvem cada caso em particular e que a obteno de um valor numrico, pura e simplesmente, no significa muito. O histrico do paciente de fundamental importncia para que uma anlise toxicolgica chegue a bom termo. Finalizando o Toxicologista Analtico deve ser, antes de qualquer coisa, um exmio analista, intimamente familiarizado com os modernos equipamentos e tcnicas que possam supri-lo com rapidez, sensibilidade preciso e exatido. Deve estar igualmente habilitado na aplicao dos princpios bsicos da Toxicologia, na interpretao de seus achados para formar suas concluses, quando estas se fizerem necessrias. TIPO DE AMOSTRAS 1 - AMOSTRAS BIOLGICAS: - vceras (estmago com seu contedo, fgado, rins, vescula biliar, crebro, intestinos, etc.); - sangue, soro, plasma; - urina; - saliva; - fezes; - pelo, unhas, cabelos; - leite materno; - ar expirado; - bile; - vmitos;

- gorduras; - lquido cfalo raquidiano; - lquidos provenientes de lavagem estomacal ou de dilise. 2 - AMOSTRAS NO BIOLGICAS: (vetor que serve de meio de transporte do agente). - Alimento; - Ar (do ambiente geral); - Ar (do ambiente de trabalho); - gua; 3 OUTRAS - Relacionadas com intoxicaes agudas e/ou letais: copos c/ lquidos, frascos com agrotxicos, frascos com produtos de limpeza, embalagem de medicamentos, seringas com lquidos, etc. - Relacionadas com a "Lei anti-txico": vegetais, ps, ampolas, seringas com lquidos, etc.

DIAGNSTICO DAS INTOXICAES AGUDAS

Banco de referncia

Amostras adicionadas

Amostras autnticas

Salicilatos Fenotiaznicos Imipramnicos

Escolha do mtodo de anlise Reaes diretas Extrao seletiva

Carbamatos Clorados Benzodiazepnicos

Escolha do mtodo de anlise Sulfas Metais Paraquat / Diquat Colinesterase Triagem Camada delgada Sistemas solventes Confirmao e quantificao HPLC Frmacos especiais Fase gasosa Col. A Col. B

Paracetamol S1 Volteis Agentes cromognicos S2 FID / EC / NPD

Resultados

MODELO DE REQUISIO PARA ANLISE TOXICOLGICA REQUISIO PARA ANLISE TOXICOLGICA

Data/hora da admisso:

Para: (preencher o nome do laboratrio, endereo e nmero do telefone) Data/hora da ingesto ou exposio:

Discutir sobre necessidades especiais ANTES de Medicamentos prescritos ou usados no enviar as amostras tratamento:

Mdico:

Telefone/beep:

Endereo do hospital para relatrio (informao):

Drogas/venenos reivindicados ou suspeitos:

Assinatura: Paciente:

Data: Outros nomes:

Idade/data de nascimento: Consultante:

Sexo: Responsvel:

Detalhes clnicos/investigao requisitada/prioridades:

Nmero do Protocolo:

Amostra Sangue (10 mL heparinizado) Urina (50 mL) Cateter: sim ( ) no( )

Data

Hora

Contedo estomacal (50 mL) Outros (fornecer detalhes)

Adaptado de OMS / IPCS. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO, 1995. p.35.

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MODELO DE FICHA PARA ANLISE TOXICOLGICA FICHA TOXICOLGICA

Paciente: Hospital: Teste requisitado: Amostra Laboratrio Mdico: Telefone / beep: Prioridade: Data Hora Anlise Qualitativa Laboratrio Testes Realizados

1. Salicilatos 2. Fenotiaznicos 3. Imipramnicos 4. Compostos triclorados 5. Paracetamol 6. Paraquat/diquat 7. Etanol 8. Clorados, etc. 9. Ferro 10. CCD drogas cidas + bsicas 11. 12 13. 14. 15. 16. 17.
Responsvel pela Anlise: Data / Hora:

Observaes:

Adaptado de OMS / IPCS. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO, 1995. p.39.

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MODELO DE LAUDO PARA ANLISE TOXICOLGICA

UNIDADE DE ENSINO SUPERIOR VALE DO IGUAU UNIGUAU LABORATRIO DE TOXICOLOGIA
Rua Padre Saporiti, 717 Rio d Areia CEP 84600-600 FONE: (42)3522-6192 e-mail: prof_elaineanton@uniguau.edu.br

Paciente: Hospital: Mdico (a): Protocolo: Suspeita

Unidade: Data Coleta: Data Entrada: Tipo de anlise

Hora: Hora: Resultado

Material: Mtodo: Observao:

Responsvel:

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TOXICOLOGIA DE MEDICAMENTOS

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TESTES COLORIMTRICOS RPIDOS PARA IDENTIFICAO DE AGENTES TXICOS TOXICOLOGIA DE MEDICAMENTOS

Os testes rpidos de colorao e/ou precipitao para identificao de agentes txicos tm seu valor como triagem. A partir dos resultados obtidos com tais testes, podemos direcionar um pouco mais o trabalho analtico. Para que seja possvel a comparao de colorao, so utilizados nestes testes controles positivo (adicionado de medicamentos) e negativo (isento de medicamentos), podendo-se ento comparar a colorao obtida com a amostra suspeita. 1. Salicilatos A presena de salicilatos pode ser identificada pela adio de soluo de cloreto frrico a urina do paciente. Os polifenis, quando em presena do elemento ferro, podem ter os oxignios de suas hidroxilas oxidados ou formar complexos com aquele elemento. Esses produtos apresentam uma colorao que varia do azul ao violeta, por terem maior nmero de ligas duplas conjugadas do que seu precursor. Como o cido acetilsaliclico no possui hidroxila fenlica disponvel, somente o cido saliclico capaz de formar complexos com sais de ferro. Procedimento: a) A 1 mL de urina adicionar 0,5 mL de cloreto frrico 1%. Esta reao no especfica; vale como triagem para todos os compostos fenlicos. Para concentraes maiores do que 150 mg/mL (nas intoxicaes agudas) a cor violeta inconfundvel. b) Ferver cerca de 2 mL de urina em tudo de ensaio sem tampa, por aproximadamente 2 min. Esfriar (temperatura ambiente) e adicionar cloreto frrico 10% gota a gota. Inicialmente forma-se um precipitado esbranquiado que aps ficar prpura (azul-violceo). Derivados fenlicos tambm do essa reao. O aquecimento elimina corpos cetnicos que podem estar interferindo na anlise. c) Em tubo de centrfuga, acidificar 5 mL de urina com cerca de 2 gotas de cido sulfrico 6N. Adicionar 2,5 mL de ter etlico e agitar por 1 minuto por inverso. Centrifugar por 5 minutos a 2000 rpm. Transferir o ter decantado para outro tudo e agitar com 2,5 mL de gua destilada e uma gota de cloreto frrico 10%. A camada aquosa ficar violcea. Reagentes: Cloreto frrico 1%: pesar 1 g de cloreto frrico e elevar o volume para 100 mL com gua destilada em balo volumtrico.

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Cloreto frrico 10%: pesar 10 g de cloreto frrico e elevar o volume para 100 mL com gua destilada em balo volumtrico. cido sulfrico 6N: diluir 16,7 mL de cido sulfrico concentrado em gua destilada e levar para 100 mL em balo volumtrico. 2. Paracetamol O paracetamol em sua maior parte metabolizado por conjugao com cido glicurnico previamente a excreo urinria. A hidrlise do conjugado glicurnico se d por tratamento com cido clordrico concentrado, resultando em paminofenol. Este se conjuga com soluo de fenol e hidrxido de amnio, resultando numa tintura fortemente colorida, assim dando um teste qualitativo sensvel. Cor azul desenvolvida em 10 min. indica a presena de fenacetina ou paracetamol. Procedimento: Em tubo de ensaio adicionar 1 mL de urina, 1 mL de HCl concentrado. Submeter ao banho de gua fervente por 20 minutos. Resfriar a temperatura ambiente (jamais resfriar na torneira). Retirar 0,2 mL da urina hidrolisada e adicionar 5 mL de fenol 1% e 3 mL de NH4OH 4M. Reagentes: Soluo aquosa de fenol 1%: colocar 1 g de fenol em balo volumtrico de 100 mL e completar o volume com gua destilada. Soluo de hidrxido de amnio 4M: colocar 10,4 mL de hidrxido de amnio em um balo volumtrico de 100 mL e completar o volume com gua destilada. 3. Clorpromazina e outros fenotiaznicos Fenotiazincos so extensamente metabolizados. Clorpromazina, por exemplo, possui mais de 50 metablitos em humanos. O teste descrito abaixo baseado na reao de muitos destes compostos com on frrico sob condies cidas. Prodecimento: a) Com reagente FPN A 1 mL de urina adicionar 1 mL do reagente FPN. Uma colorao rosa-vermelha indica a presena de fenotiaznicos (a colorao depende da quantidade presente). Interferentes: constituintes endgenos da urina, pigmentos biliares. A reao com FPN rpida (5 segundos); se a colorao aparecer aps alguns minutos provavelmente interferente; o cido saliclico no sendo estvel em meio fortemente cido no interfere nesta reao. Obs.: quando colocar o reagente FPN coloc-lo gota a gota pelas paredes do tubo. No agitar o tubo. Resultados positivos devem ser confirmados por CCD.

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b) Com cloreto de ouro A 1 gota de urina adicionar 1 gota de cloreto de ouro. Uma colorao vermelha indica clorpromazina e outros fenotiaznicos. Reagentes: FPN: misturar 5 mL de soluo aquosa de cloreto Frrico 50 g/L, 45 mL de soluo aquosa de cido Perclrico 20% (20 mL HClO4 em 100 mL H2O) e 50 mL de soluo aquosa de cido Ntrico 50% (50 mL HNO3 em 100 mLde H2O). Reagente Cloreto de ouro: misturar partes iguais de cido tricloroactico 20% e cloreto de ouro a 0,25%. 4. Antidepressivos tricclicos (imipramina e derivados) O antidepressivo tricclico imipramina usado extensamente, sendo metabolizada por desmetilao para desipramina, a qual tambm usada como antidepressivo. O teste descrito abaixo, (Teste de Forrest), baseado na reao destes compostos com soluo de dicromato de potssio acidificada. Procedimento: Em tubo de ensaio colocar 0,5 mL de amostra (urina ou contedo estomacal). Adicionar 1 mL do Reagente de Forrest e misturar por 5 segundos. Observar, imediatamente, o surgimento de colorao. Coloraes que variam do amareloesverdeado at verde escuro ou azul sugerem a presena dos antidepressivos tricclicos (imipramina e desipramina). Reagente de Forrest: 25 mL da soluo aquosa de dicromato de potssio 0,2%; 25 mL de soluo aquosa de cido sulfrico 30%; 25 mL de soluo aquosa de cido perclrico 20%; 25 mL de soluo aquosa de cido ntrico 50%. Obs: Misturar sempre volumes iguais (ideal para uma anlise 2 mL do reagente de Forrest 0,5 mL de cada reagente). Soluo estvel se mantida em refrigerao a 4oC. K2Cr2O7 0,2 % (0,2 g K2Cr2O7 H2O reagente q.s.p. 100 mL) H2SO4 30 % v/v (30 mL H2SO4 H2O reagente q.s.p. 100 mL) HClO4 20 % v/v (20 mL HClO4 H2O reagente q.s.p. 100 mL) HNO3 50 % v/v (50 mL H2O reagente q.s.p. 100 mL)

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6. Bibliografia: COSTA, A. F. Farmacognosia. Lisboa: Fundao Calouste Gulbenkian, 1972. v. III, Cap. 10. p. 640. DECKER, W.J. Spot Tests for rapid diagnosis of poisoning. Clin. Toxic., 4: 89-97, 1971. MEREK, S. B.; PIVA, R.; ITINOSE, A. M. Padronizao de spot testes para uso em laboratrios com atendimento em emergncia toxicolgicas. Rev. Bras. An. Clin. 36: 143-144, 2004. MOFFAT, A. C. (ed). Clarke's isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004. MORAES, R. L. F. Determinao da salicemia em crianas portadoras de artrite reumatide juvenil por colorimetria e espectrofluorimetria. Faculdade de Cincias Farmacuticas. Universidade de So Paulo. S.P. Dissertao de Mestrado, 1986. OMS/IPCS. Monographs: analytical and toxicological data. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO, 1995. p. 59-236.

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TESTES RPIDO PARA (IMUNOCROMATOPLACAS)

1. Fundamento analtico:

TRIAGEM

DE

MEDICAMENTOS

Estes testes fornecem somente um resultado preliminar. Um mtodo de teste alternativo deve ser usado a fim de obter um resultado analtico mais especfico. A cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG/MS) o mtodo confirmatrio preferido. Outros mtodos qumicos de confirmao esto disponveis. Os Quick Screen testes para medicamentos so testes competitivos rpidos de imuno-anlise qualitativa para deteco de medicamentos e seus metablitos na urina. um dispositivo absorvente cromatogrfico em que as drogas ou os metablitos da droga em uma amostra competem com o combinado de droga/protena retido em uma membrana porosa por um nmero limitado de locais obrigatrios que apresentam conjugados de anticorpos coloridos. O dispositivo do teste emprega uma combinao original de anticorpos monoclonal e policlonal para identificar seletivamente medicamentos e seus metablitos na urina com um elevado grau de confiana. Caso a urina adicionada ao dispositivo apresente nveis abaixo da sensibilidade de deteco do teste, o conjugado anticorpo/colorido ligado ao conjugado droga/protena fica na regio do teste (T) do dispositivo. Isto produz uma faixa colorida do teste que no obstante sua intensidade indica um resultado negativo. Caso a urina adicionada ao dispositivo apresente nveis acima da sensibilidade de deteco do teste, a droga livre na amostra liga-se ao conjugado anticorpo/colorido, impedindo que o conjugado anticorpo/colorido ligue-se ao conjugado de droga/protena retido na regio (T) do dispositivo. Isto impede o desenvolvimento de uma faixa colorida, indicando uma amostra potencialmente positiva. 2. Medicamentos: Benzodiazepnicos, opiides, barbitricos e antidepressivos tricclicos. 3. Limites de deteco: As concentraes de interrupes (cut-off) para cada classe de medicamentos no painel de Quick Screen teste so: BZD Benzodiazepnicos 200 ng/mL OPI Opiides 300 ng/mL BAR Barbitricos 300 ng/mL TCA Antidepressivos tricclicos 1000 ng/mL 4. Amostra: A urina deve ser coletada em um recipiente limpo de vidro ou plstico. Ela pode ser refrigerada (2-8C) por 2 dias ou congelada (-20C) por um longo perodo. A urina que for refrigerada deve alcanar a temperatura ambiente (15-25C) antes de ser testada. As amostras que forem congeladas devem ser descongeladas e misturadas antes do teste. Caso haja amostras com grande quantidade de partculas, estas urinas devem ser clareadas por centrifugao ou deixadas em repouso para sedimentar antes de serem testadas.

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5. Procedimento: - Abra a dobradura do cartucho no entalhe, remova o aparelho de teste. Tome cuidado para no tocar na membrana exposta. - Segure o conta-gotas verticalmente e pingue 05 gotas de urina dentro do reservatrio destinado para a amostra. - Aguarde 10 (dez) minutos. - Leia o resultado do teste imediatamente. Resultados lidos aps terem passados 15 (quinze) minutos no devem ser considerados. 6. Interpretao dos resultados: Positivo Um resultado positivo ser indicado quando uma (1) faixa colorida de cor lils aparecer apenas na regio de controle (C), mas no na regio de teste (T). Este resultado sugere que a amostra contenha medicamento em um nvel igual ou superior ao da concentrao cut-off para aquele medicamento. A intensidade da cor do controle positivo no deve ser usada como referncia. Negativo Um resultado negativo indicado quando duas (2) faixas coloridas de cor lils aparecem, uma na regio de controle (C) e outra na regio de teste (T). Este resultado sugere que a amostra contenha medicamento em um nvel abaixo ao da concentrao cut-off para aquele medicamento. Invlido Um teste deve ser considerado invlido se nenhuma faixa aparecer na regio de controle (C). A presena de uma faixa de controle necessria para confirmar o desempenho da anlise. 7. Controle de qualidade: Uma linha processual interna foi incorporada ao dispositivo do teste para ajudar a assegurar o desempenho e a confiabilidade ao Kit. Entretanto, o uso de controles externos recomendado. Os controles positivos e negativos dentro de 25% da concentrao cut-off devem produzir os resultados previstos. 8. Bibliografia: Quick Screen teste Barbitricos. San Diego: Pharmatech Inc. 2005. Bula de kit. Quick Screen teste Benzodiazepinas. San Diego: Pharmatech Inc. 2005. Bula de kit. Quick Screen teste Opides. San Diego: Pharmatech Inc. 2005. Bula de kit. Quick Screen teste Tricclico Antidepressivo. San Diego: Pharmatech Inc. 2005. Bula de kit.

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MARCHA SISTEMTICA PARA EXTRAO DE MEDICAMENTOS DE MATERIAL BIOLGICO

Esta metodologia de ordem qualitativa, aplicada em suspeitas de intoxicao por medicamentos e outras substncias e baseia-se na comparao da amostra com um padro do agente toxicante suspeito. Baseia-se em uma extrao lquido/lquido, os medicamentos e outras substncias so extrados de material biolgico com solventes orgnicos, em pH cido e bsico. Os extratos obtidos so concentrados, aplicados em placas cromatogrficas e eluidos em sistema solvente. 1. Amostras: Urina (coletada recentemente ou conservada a 4C), sangue total com anticoagulante, contedo estomacal, vsceras, medicamentos suspeitos, outros. 2. Extrao: Para identificao de medicamentos atravs de cromatografia em camada de delgada ou outros mtodos, devemos primeiramente extra-los do meio em que se encontram. Assim, extramos as substncias em meio cido, neutro e bsico e depois realizamos a sua identificao. 2.1 Substncias de carter cido e/ou neutro: Colocar 10 mL da amostra num bquer de 20 mL e ler o pH;

- Ajustar o pH entre 4,0 5,0 por meio de soluo de H2SO4 0,5 N (+/- 3gotas) e transferir a amostra para um funil de separao; - Extrair com 10 mL de clorofrmio : isopropanol (9:1) agitando vigorosamente por 2 minutos; - Deixar o funil em repouso ( 5 min) para separao das fases (orgnica/aquosa); - Filtrar a fase orgnica (inferior) em papel filtro contendo sulfato de sdio anidro (o equivalente a ponta de uma esptula pequena) e recolher o extrato em bquer de 50 mL (Rc); - Na fase remanescente (aquosa urina) repetir os itens acima recolhendo o filtrado no mesmo bquer. - Evaporar em temperatura ambiente. O bquer deve ser colocado a uma distncia de aproximadamente 0,5 cm da porta da capela, estando esta semifechada e ligada (abertura deve ser de 0,5 cm mais alta do que a altura do bquer). A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma, a evaporao acontece em 10 minutos. Pode haver formao de gua de condensao na parede do bquer e posteriormente no fundo. Confirmar se realmente gua da seguinte maneira: transferir o lquido do fundo do bquer para um eppendorf com auxlio de uma micropipeta. Adicionar 5 gotas de diclorometano, se

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haver formao de 2 fases, confirma-se a presena de gua de condensao. Podese desprez-la do bquer e proceder somente com o extrato. Reservar o extrato para cromatografar. 2.2 Substncias de carter bsico e/ou neutro: - Adicionar a camada aquosa remanescente no balo de separao, soluo de NH4OH a 10% at a obteno de pH 8 a 9 (+/- 8 gotas). - Extrair com 10 mL de clorofrmio : isopropanol (9:1) agitando vigorosamente por 2 minutos; - Deixar o funil em repouso ( 5 min) para separao das fases (orgnica/aquosa); - Filtrar a fase orgnica (inferior) em papel filtro contendo sulfato de sdio anidro e recolher o extrato em bquer de 50 mL (Ralc); - Na fase remanescente (aquosa urina) repetir os itens 3, 4 e 5 recolhendo o filtrado no mesmo bquer. Adicionar aproximadamente 2 gotas de cido clordrico:metanol (1:100 v/v); - Evaporar em temperatura ambiente. O bquer deve ser colocado a uma distncia de aproximadamente 0,5 cm da porta da capela, estando esta semifechada e ligada (abertura deve ser de 0,5 cm mais alta do que a altura do bquer). A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma, a evaporao acontece em 10 minutos. Pode haver formao de gua de condensao na parede do bquer e posteriormente no fundo. Confirmar se realmente gua da seguinte maneira: transferir o lquido do fundo do bquer para um eppendorf com auxlio de uma micropipeta. Adicionar 5 gotas de diclorometano, se haver formao de 2 fases, confirma-se a presena de gua de condensao. Podese despreza-la do bquer e proceder somente com o extrato. Reservar o extrato para cromatografar.

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3. Fluxograma simplificado da extrao de agentes txicos de material biolgico

Amostra 10mL
urina, lavado gstrico, e outros
Acidificar (pH 4-5 com H2SO4 0,5N) Extrair c/ 10mL clorofrmio:isopropanol 9:1

Fase orgnica Filtrar sobre Na2SO4 anidro

Fase aquosa Alcalinizar c/ NH4OH 30% at pH 8-9 extrair com 10mL clorofrmio-isopropanol 9:1

Extrato cido
no

Evaporar Fase aquosa (descartar) Resduo cido Fase orgnica Filtrar sobre Na2SO4 anidro Extrato Alcalino (Rac) Evaporar

Resduo Alcalino

Obs.: Colocar nos extratos alcalinos 1-2 gotas de HCl diludo em metanol (1 ml de HCl em 100 ml de metanol) para evitar perdas em relao aos derivados anfetamnicos

(Ralc)

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4. Identificao por cromatografia em camada delgada: Aps a evaporao dos resduos (Rcido e Ralcalino), ressuspend-los com 5 gotas da mistura de solvente orgnico clorofrmio-isopropanol (9:1). 4.1. Aplicao: Utilizando microcapilares, transferir 3 microgotas das amostras e 3 microgotas dos padres para as placas cromatogrficas ativadas a 110 C por 1 hora. 4.2. Eluio: Sistemas Eluentes: 1. Clorofrmio- acetona ( 9:1). 2. Metanol - amnio (100:1,5 ). Aps a aplicao, colocar as placas em cubas previamente saturadas contendo o sistema eluente adequado. Deixar correr at 12 cm, retirar as cromatoplacas e secar em temperatura ambiente at a evaporao total dos eluentes. 4.3. Revelao: A revelao deve ser realizada em trs etapas: 1)Observar as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm). 2) A seguir vaporizar com os agentes cromognicos especficos. 3) Observar novamente as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm).

5. Agentes cromognicos: - Soluo de cloreto frrico a 5 % (Salicilatos) - Soluo de nitrato mercuroso a 1 % (Barbitricos) - Reativo de Dragendorff Modificado (Alcalides e Geral) - Reativo cloroplatnico acidificado (Geral) - Reagente de Forrest (Imipramina) 5.1 Preparao dos agentes cromognicos: 5.1.1 Soluo de cloreto frrico 5%: Pesar 5 g de cloreto frrico (FeCl3) e dissolver em quantidade de gua destilada suficiente para completar 100 mL de soluo.

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5.1.2 Nitrato mercuroso 1%: Pesar 1 g de nitrato mercuroso (HgNO3) e dissolver em quantidade de gua destilada suficiente para completar 100 mL de soluo. 5.1.3 Reativo de Dragendorff Modificado: Adicionar 1,0 g de Iodo para cada 100 mL do Reativo de Dragendorff. Reativo de Dragendorff Soluo A: 2,0 g de subnitrato de bismuto 25 mL de cido actico 100 mL de gua destilada Soluo B: 40 g de Iodeto de potssio 100 mL de gua destilada Soluo de uso: 10 mL de A + 10 mL de B + 20 mL de cido actico + 100 mL de gua destilada. 5.1.4 Reativo Cloroplatnico Acidificado: Soluo cido cloroplatnico a 10%........................ 3,0 mL gua destilada ......................................................... 97 mL Soluo de iodeto de potssio a 6% ..................... 100 mL Para cada 100 mL de soluo adicionar 2 mL de cido clordrico concentrado. 5.1.5 Reagente de Forrest: 25 mL de soluo aquosa de dicromato de potssio 0,2%; 25 mL de soluo aquosa de cido sulfrico 30%; 25 mL de soluo aquosa de cido perclrico 20%; 25 mL de soluo aquosa de cido ntrico 50%. Obs: Misturar sempre volumes iguais (ideal para uma anlise 2 mL do reagente de Forrest 0,5 mL de cada reagente). Soluo estvel se mantida em refrigerao a 4oC. K2Cr2O7 0,2 % (0,2 g K2Cr2O7 H2O reagente q.s.p. 100 mL) H2SO4 30 % v/v (30 mL H2SO4 H2O reagente q.s.p. 100 mL) HClO4 20 % v/v (20 mL HClO4 H2O reagente q.s.p. 100 mL) HNO3 50 % v/v (50 mL H2O reagente q.s.p. 100 mL)

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6. Clculo do valor de Rf:

Rf = distncia percorrida pela substncia em cm distncia percorrida pelo solvente em cm

100

7. Fatores interferentes: A CCD uma tcnica que envolve muitas variveis, assim diversos fatores podem interferir no resultado da anlise, devendo estes ser bem controlados durante todo o procedimento analtico. Tais fatores podem ser: experincia do analista; extrao eficiente; intensidade da reao de cor quando na aplicao dos reativos cromognicos; alterao dos valores de Rf em funo da temperatura ambiente, saturao da cuba, natureza do adsorvente, dos solventes e das placas cromatogrficas utilizadas. 8. Validade do mtodo: Os principais parmetros envolvidos na identificao de uma substncia por CCD so a deteco e os valores de Rf. A deteco envolve a visualizao da substncia luz UV (em 254 ou 366 nm) ou ainda pela aplicao de determinado reagente ou combinao de reagentes (reativos cromognicos) proporcionando uma reao de cor caracterstica da substncia em anlise. A verificao dos valores de Rf se d atravs da utilizao de diferentes sistemas solventes. Assim a associao destes dois parmetros, juntamente com utilizao de padres de referncia em todas as anlises, faz com que se tenha controle do mtodo e segurana na identificao da substncia pesquisada. 9. Sensibilidade: Em sua dissertao de mestrado, Vieira (1979), relata boa sensibilidade para concentraes de 5mg/L.

10. Bibliografia: BRITO-FILHO, D. Toxicologia Humana e Geral. 2 ed. Rio de Janeiro: Atheneu. 1988. p. 676. FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO/USP. Anlises toxicolgicas de urgncia: apoio analtico aos centros de intoxicao. Ribeiro Preto: USP, 1984. 67p. MELLO, S.M.; MACHADO, R.G.P.; FERNANDES, M.D. Manual de Tcnicas Analticas. UNICAMP: Centro de Controle de Intoxicaes/Laboratrio de Toxicologia.

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MOFFAT, A. C. (ed). Clarke's isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004.

OMS/IPCS. Monographs: analytical and toxicological data. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO, 1995. p. 59-236.

VIEIRA, R.V. Identificao de frmacos em urina por cromatografia em camada delgada: Faculdade de Cincias Farmacuticas. Universidade de So Paulo. S.P. Dissertao de Mestrado, 1979.

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DETERMINAO DE PARACETAMOL EM ESPECTROFOTMETRO UV-Vis

1. Princpio do mtodo: Cerca de 25 a 30% do Paracetamol (Acetaminofeno) administrado no organismo se liga s protenas plasmticas sendo necessrio um pr-tratamento da amostra com cido tricloroactico para precipitao das protenas. O mtodo se baseia na reao do acetaminofeno (N-acetil p-aminofenol) com o cido nitroso formando assim o 2-nitro-4-acetaminofenol o qual assume uma colorao amarela em meio alcalino. A intensidade desta colorao proporcional concentrao de acetaminofeno e pode ser medida em espectrofotmetro UV-Visvel no comprimento de onda timo de 430 nm. 2. Amostra: Soro ou plasma (soro apresenta menor interferncia na metodologia). Coletar a partir da 4a hora da ingesto do paracetamol e registrar o horrio da coleta. Obs: No usar como anticoagulante heparina ou outras solues que contenham ocresol como preservativo. 3. Estabilidade: Armazenar em geladeira a 4C por no mximo uma semana. 4. Preparo das solues: 4.1 cido tricloroactico 3% Pesar 3 g de CCl3COOH (cido tricloroactico) e dissolver em cerca de 50 mL de gua destilada. Completar o volume para 100 mL em balo volumtrico. 4.2 Hidrxido de sdio 8 M Dissolver 32 g NaOH em 50 mL de gua destilada e completar o volume para 100 mL em balo volumtrico. 4.3 Nitrito de sdio 0,07 M Pesar 0,0241 g de nitrito de sdio e dissolver em 5 mL de gua destilada. Soluo instvel deve ser preparada na hora do uso. 4.4 Soluo estoque de paracetamol 1,0 mg/mL Dissolver 0,1000 g de paracetamol em pequena quantidade de etanol e transferir para um balo volumtrico de 100 mL. Completar o volume com gua destilada. Deve ser preparada sempre que uma nova curva for feita.

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5. Curva de calibrao: A partir da Soluo Estoque de paracetamol 1,0 mg/mL e soro (branco), preparar a curva de calibrao: P 25,0 mg/L: Pipetar 0,25 mL de soluo estoque de paracetamol em balo volumtrico de 10 mL e completar o volume com soro. P 50,0 mg/L: Pipetar 0,5 mL de soluo estoque de paracetamol em balo volumtrico de 10 mL e completar o volume com soro. P 75,0 mg/L: Pipetar 0,75 mL de soluo estoque de paracetamol em balo volumtrico de 10 mL e completar o volume com soro. P 100,0 mg/L: Pipetar 1,0 mL de soluo estoque de paracetamol em balo volumtrico de 10 mL e completar o volume com soro. P 150,0 mg/L: Pipetar 1,5 mL de soluo estoque de paracetamol em balo volumtrico de 10 mL e completar o volume com soro. 6. Procedimento: - Utilizando tubos Falcon de 15 mL, pipetar 500 L do branco (soro isento de paracetamol), de cada ponto da curva de calibrao, da amostra em duplicata e do soro controle. - Adicionar 3 mL da soluo de cido tricloroactico 3 % em cada tubo e agitar em vrtex durante 30. Centrifugar por 15 minutos a 2500 rpm. Transferir 2 mL do sobrenadante para um tubo de ensaio de 5 mL. Adicionar 0,5 mL de nitrito de sdio 0,07 M e homogeneizar. Colocar os tubos em banho-maria a 37C durante 10 minutos. Retirar do banho-maria e adicionar 2 gotas de NaOH 8M.

- Agitar em vrtex e efetuar a leitura da absorbncia em 430 nm dentro de no mximo 1 hora.

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7. Fluxograma analtico:

Branco da Amostra
500 uL de soro ou plasma (sem paracetamol)

Curva de calibrao e Soro Controle

500 uL de soro ou plasma

Amostras em Duplicata
500 uL de soro ou plasma

- 3 mL de cido tricloroactico 3 % - Vrtex por 30 segundos - Centrfuga, 2500 rpm por 15minutos

- 2 mL do sobrenadante - 0,5 mL de nitrito de sdio 0,07 M - Banho-maria a 37 por 10 minutos - 2 gotas de NaOH 8 M - Vrtex por 30 segundos

Realizar as leituras em espectrofotmetro = 430 nm

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8. Interpretao do resultado: A interpretao do resultado das anlises de paracetamol realizada atravs do NOMOGRAMA DE RUMACK (Figura 1) pela correlao entre a concentrao de paracetamol e o tempo de ingesta. Para tanto se deve fazer a coleta da amostra de sangue a partir de 4 horas aps a ingesta do frmaco, onde se tem o pico de absoro. A quantificao do paracetamol importante para avaliao do risco de dano heptico, em casos de intoxicao aguda.

Figura 1: Nomograma de RumacK 9. Interferentes: Os medicamentos: fenilbutazona, oxifenilbutazona, teofilina, 4-amino saliclico e levodopa; cido saliclico,

Uso de heparina como anticoagulante e solues que contenham o-cresol.

10. Bibliografia: BRITO-FILHO, D. Toxicologia Humana e Geral. 2 ed. Rio de Janeiro: Atheneu. 1988. p. 619. HALE, P.W.; POLKLIS, A. Evalution of a modified colorimetric assay for the determination of acetaminophen in serum. Journal Analytical Toxicology. 7: 249251. 1983.

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ITINOSE, A.M.; SZNELWAR, R.B. Determinao de paracetamol em soro por espectrofotometria na regio do visvel. Rev. Farm. Bioq. 18 (2): 164-176, 1987. MOFFAT, A. C. (ed). Clarke's isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004. MORAES, E.C.F.; SZNELWAR, R. B.; FERNICOLA, N.A.G.G. Manual de Toxicologia Analtica. So Paulo: Roca, 1991. p. 130-131. OLSON, K. (Ed.). Poisoning & drugs overdose. East Norwalk : Appleton e Lange, 1994. p. 61-63. OMS/IPCS. Monographs: analytical and toxicological data. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO, 1995. p. 59-236.

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DETERMINAO DE SALICILATOS EM ESPECTROFOTMETRO UVVIS (MTODO DE KAYE)

1. Princpio do Mtodo: Os salicilatos so hidrolisados com cido ntrico formando cido saliclico. Este ltimo, por possuir uma hidroxila aromtica, interage com nitrato frrico produzindo um composto colorido que medido em espectrofotmetro a 540 nm. 2. Amostra: Soro. Coletar a partir da 6a hora da ingesto e registrar o horrio da coleta. 3. Reagentes: 1. Soluo padro de salicilato 250 ug/mL: 25 mg de cido saliclico em q.s.p. de metanol e completar o volume para 100 mL com gua destilada em balo volumtrico . 2. Soluo de cido ntrico 0,07 N: diluir 4,7 mL de cido ntrico concentrado (d=1,42 g/ml e T=70,5%) em 1000 mL de gua destilada. 3. Soluo de nitrato frrico a 1% em cido ntrico 0,07 N: diluir 0,47 mL de cido ntrico concentrado em 100 mL de gua destilada. Em seguida, adicionar 1 g de de nitrato frrico. 4. Procedimento: Colocar em dois tubos de ensaio marcado A (Amostra) e BA (Branco da Amostra) alquotas de 0,2 mL de amostra. Em outros dois tubos marcados P (Padro) e BP (Branco do Padro) colocar alquotas de 0,2 mL da soluo padro de salicilatos. Adicionar 0,8 mL de gua destilada em todos os tubos. Adicionar 1 mL da soluo de nitrato frrico aos tubos A e P. Nos tubos BA e BP adicionar 1 mL da soluo de cido ntrico 0,07 N. Homogeneizar e aguardar 5 minutos. Efetuar as leituras das absorbncias em 540 nm usando o branco correspondente.

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5. Fluxograma analtico:

COLOCAR FLUXOGRAMA !!

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6. Clculo: Conc. Salic. Amostra (mg%) = Absorbncia Amostra Absorbncia Padro 7. Interpretao do resultado: A interpretao do resultado das anlises para determinao de Salicilatos feita atravs do NOMOGRAMA DE DONE. Para tanto se deve fazer a coleta da amostra de sangue a partir de 6 horas aps a ingesta do frmaco, onde se tem o pico de absoro. O Nomograma de Done (Figura 2) permite uma avaliao do prognstico do paciente atravs da correlao da concentrao plasmtica de salicilato e, o tempo de ingesta. x 25

Figura 2: Nomograma de Done

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8. Bibliografia: KAYE, S. Handbook of Emergency Toxicology, 3 ed. Illinois : Charles C. Thomas. 1963, p. 116-117. MORAES, R. L. F. Determinao da salicemia em crianas portadoras de artrite reumatide juvenil por colorimetria e espectrofluorimetria. Faculdade de Cincias Farmacuticas. Universidade de So Paulo. S.P. Dissertao de Mestrado, 1986.

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TOXICOLOGIA SOCIAL

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IDENTIFICAO DE AGENTES TXICOS

Os testes rpidos de colorao e/ou precipitao para identificao de agentes txicos tm seu valor como triagem. A partir dos resultados obtidos com tais testes, podemos direcionar um pouco mais o trabalho analtico. Para que seja possvel a comparao de colorao, so utilizados nestes testes controles positivo (amostra que contm o agente txico) e negativo (amostra que no contm o agente txico), podendo-se ento comparar a colorao obtida com a amostra suspeita. 1. Efedrina 1.1 Teste colorimtrico Colocar uma pequena poro do material em tubo de ensaio; adicionar 0,1 mL de sulfato de cobre 12,5% e 1 mL de hidrxido de sdio 45%. H o aparecimento de colorao violeta. Junte 1 mL de ter etlico e agite. A camada etrea deve tornar-se violcea, indicando presena de efedrina na amostra. Reagentes: Sulfato de cobre 12,5%: pesar 2,5 g de sulfato de cobre e elevar o volume para 20 mL com gua destilada. Hidrxido de sdio 45%: pesar 45 g de hidrxido de sdio e elevar o volume para 100 mL com gua destilada em balo volumtrico. 1.2 Espectrofotometria Equipamento: espectrofotmetro de varredura (190 nm 1100 nm). Diluir a amostra suspeita (p / drgea) em cido sulfrico 0,5 N, por se tratar de um agente txico com caractersticas bsicas. Para obteno da linha base, realizar a leitura somente com o veculo da diluio. Em seguida efetuar a leitura em espectrofotmetro de varredura no intervalo de comprimentos de onda de 200 a 400 nm. Interpretao do resultado: a efedrina apresenta picos de absorbncias em 251 nm, 257 nm e 263 nm.

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Figura 1: Picos de absorbncias da efedrina Reagentes: H2SO4 0,5 N: diluir 1,5 mL de cido sulfrico concentrado em gua destilada e elevar-se o volume para 100 mL em balo volumtrico. 2. Aminas secundrias (metanfetamina): 2.1 Teste colorimtrico Colocar uma gota de cada soluo do reativo de Feigel-angel sobre o material suspeito. H o aparecimento de colorao violeta intensa. Reagentes: Reativo de Feigel-angel Soluo de nitroprussiato de sdio 1%: pesar 0,2 g de nitroprussiato de sdio e elevar o volume para 20 mL com gua destilada. Soluo de acetaldedo 50%: pesar 50 g de acetaldedo e elevar o volume para 100 mL com gua destilada em balo volumtrico. Soluo de carbonato de sdio 15%: pesar 3 g de carbonato de sdio e elevar o volume para 20 mL com gua destilada. 3. Benzidamina 3.1 Teste colorimtrico Adicionar, em uma placa escavada de porcelana, uma gota do reativo de Mandelin amostra suspeita (p / drgea) e uma gota do reativo como branco da reao. Observar o desenvolvimento de colorao marron-esverdeada que indica a presena de cloridrato de benzidamina.

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Reagentes: Reativo de Mandelin: dissolver 1,0 g de vanadato de amnia em 1,5 mL de gua destilada e completar para 100 mL com cido sulfrico concentrado. 4. Bibliografia: DECKER, W.J. Spot Tests for rapid diagnosis of poisoning. Clin. Toxic., 4: 89-97, 1971. MOFFAT, A. C. (ed). Clarke's isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004.

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TESTE RPIDO PARA TRIAGEM DE DROGAS DE ABUSO IMUNOCROMATOPLACAS

1. Fundamento analtico:

Estes testes fornecem somente um resultado preliminar. Um mtodo de teste alternativo deve ser usado a fim de obter um resultado analtico mais especfico. A cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG/MS) o mtodo confirmatrio preferido. Outros mtodos qumicos de confirmao esto disponveis. A considerao clnica e o julgamento do profissional devem ser aplicados a qualquer resultado de teste de abuso de drogas, particularmente quando os resultados preliminares positivos so observados. Este teste um imunoensaio de ligao competitiva onde a droga ou os metablitos da droga em uma amostra de urina competem com os compostos da droga quimicamente marcados por um anticorpo restrito nos stios de ligao. Ao utilizar anticorpos que so especficos para as diferentes classes de drogas, o ensaio permite a deteco independente e simultnea de seis drogas em uma nica amostra. O tempo aproximado de 10 minutos. No procedimento de ensaio, a urina se mistura com o conjugado de coranticorpo marcado e migra pela membrana. Se a concentrao de uma certa droga for inferior ao limite de deteco do teste, o anticorpo marcado-conjugado de cor se liga ao antgeno conjugado imobilizado na membrana, desenvolvendo uma faixa de cor lils na rea teste (identificada de C e T) para aquela droga. Inversamente, se o nvel da droga for igual ou superior ao limite de deteco, o anticorpo-conjugado de cor se liga a droga livre, formando um complexo antgeno-anticorpo-corante. Este complexo compete com o antgeno conjugado sobre a membrana, impedindo o desenvolvimento da faixa de cor lils. Independente dos nveis da droga em uma amostra ocorre o aparecimento da faixa lils em cada rea controle (marcadas com C) devido a uma reao imunoqumica paralela. Estas faixas servem como um controle de qualidade interno e demonstram o reconhecimento do anticorpo, indicando que os reagentes esto quimicamente ativos e que o teste foi realizado de forma correta.

2. Substncias: Benzodiazepnicos, opiides. cocana, anfetaminas, metanfetamina, tetrahidrocanabinol,

3. Limites de deteco: As concentraes de interrupes (cut-off) para cada classe de drogas no painel de drogas de abuso so:

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THC OPI COC AMP BZD MET

Tetrahidrocanabinol Opiides Cocana Anfetaminas Benzodiazepnicos Metanfetamina

50 ng/mL* 300 ng/mL 300 ng/mL* 1000 ng/mL* 300 ng/mL 500 ng/mL

*Concentrao de interrupo (cut-off) de triagem recomendada pela Substance Abuse and Mental Health Services Administration.

4. Amostra: A urina deve ser coletada em um recipiente limpo de vidro ou plstico. Ela pode ser refrigerada (2-8C) por 2 dias ou congelada (-20C) por um longo perodo. A urina que for refrigerada deve alcanar a temperatura ambiente (15-25C) antes de ser testada. As amostras que forem congeladas devem ser descongeladas e misturadas antes do teste. Caso haja amostras com grande quantidade de partculas, estas urinas devem ser clareadas por centrifugao ou deixadas em repouso para sedimentar antes de serem testadas. 5. Procedimento: Deixar as amostras dos pacientes e os componentes do kit atingirem a temperatura ambiente. Remover um dispositivo do teste do envelope laminado e identificar a amostra. Mergulhar a extremidade do dispositivo na amostra da urina at a tarja onde se l: INSERT THIS END por mais de 10 segundos. Remover o dispositivo da amostra de urina e colocar em uma superfcie plana. Ler o resultado do teste entre 4 a 7 minutos aps a adio da amostra.

7. Interpretao dos resultados: Importante: So necessrias duas faixas do controle para validar os resultados do teste. Se no aparecer a faixa de cor lils em qualquer uma das reas (C), descartar o dispositivo e testar a amostra novamente com um novo dispositivo. Positivo Ausncia de uma faixa de cor lils em qualquer das seis tiras (AMP, BZD, COC, MET, OPI, THC) indica um resultado positivo para a droga correspondente. Negativo A presena de uma faixa de cor lils em qualquer tira indica que o nvel da droga correspondente ou seu metablito est abaixo do limite da sensibilidade.

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Invlido Se a linha na rea Controle (C) no aparecer num intervalo de 5 minutos, repetir o ensaio com um novo dispositivo.

8. Controle de qualidade: Uma linha processual interna foi incorporada ao dispositivo do teste para ajudar a assegurar o desempenho e a confiabilidade ao Kit. Entretanto, o uso de controles externos recomendado. Os controles positivos e negativos dentro de 25% da concentrao cut-off devem produzir os resultados previstos. 9. Bibliografia: Multi-Drogas One Step Teste. Diadema: Inlab Diagnstica Alamar Tecno Cientfica Ltda. 2002. Bula de Kit.

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IDENTIFICAO DE CANABINIDES EM ERVA IN NATURA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Os princpios ativos de plantas da espcie Cannabis sativa podem ser retirados da erva in natura atravs de extrao com solvente orgnico. Aps aplicao e eluio em cromatografia de camada delgada, esses agentes podem ser revelados pela adio de agentes cromognicos. 1. Amostra: erva in natura 2. Extrao de 9-THC (9-Tetra-HidroCanabinol) - Colocar aproximadamente 100 mg da amostra em um gral de porcelana. Adicionar cerca de 20 mL de ter de petrleo e macerar com o pistilo, deixar em repouso por 10 min, pode-se deixar macerando por 12 a 24 horas; - Aps macerao, adicionar uma ponta de esptula de carvo ativado, filtrar com papel filtro, sob um bquer com fundo afunilado; - Evaporar em temperatura ambiente. O bquer deve ser colocado a uma distncia de aproximadamente 0,5 cm da porta da capela, estando esta semifechada e ligada (abertura deve ser 0,5cm mais alta do que a altura do bquer). A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma, a evaporao acontece em 10 minutos. Pode haver formao de gua de condensao na parede do bquer e posteriormente no fundo. Confirmar se realmente gua da seguinte maneira: transferir o lquido do fundo do bquer para um eppendorf com auxlio de uma micropipeta. Adicionar 5 gotas de ter de petrleo, se haver formao de 2 fases, confirma-se a presena de gua de condensao. Pode-se desprez-la do bquer e proceder somente com o extrato.

3. Aplicao: - Ressuspender com 5 gotas de ter de petrleo e aplicar em placa de slica gel 60 com auxlio de um capilar. - Aplicar todo o volume em que foi feita a ressuspenso. Utilizando microcapilares, transferir microgotas das amostras e do padro para as placas cromatogrficas ativadas a 110 C por 1 hora.

4. Eluio: - Aps a aplicao, colocar as placas em cubas de vidro pr-saturadas, contendo o sistema eluente Clorofrmio / Tolueno (2:1). Para as cubas pequenas, prepara-se aproximadamente 30mL de eluente; - Colocar a placa na cuba de forma que o eluente no toque a linha de aplicao das amostras; - Deixar eluindo at a linha do solvente chegar a 0,5cm do fim da placa; - Deixar secar naturalmente.

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5. Revelao: A revelao deve ser realizada em trs etapas: 1) Observar as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm). 2) A seguir vaporizar com os agentes cromognicos especficos. 3) Observar novamente as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm). 5.1. Agente cromognico: Benzidina tetrazotada (B.T.A.) 5.2 Preparo do agente cromognico: Benzidina tetrazotada Soluo A: Benzidina ................................................................................ 5,0 g HCl concentrado ................................................................ 14,0 mL H2O destilada q.s.p. ................................................................... 1 L Guardar em frasco escuro Soluo B: Nitrito de sdio a 10 % Misturar volumes iguais das solues A e B no momento de usar. 6. Bibliografia: MOFFAT, A. C. (ed). Clarke's isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004.

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IDENTIFICAO DE CANABINIDES EM URINA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA EFICINCIA (CCDAE / HPTLC)
A CCDAE uma tcnica mais rpida, eficiente e sensvel que a CCD convencional, podendo ser dito que se trata de um aperfeioamento da mesma. A tabela I, apresenta uma comparao entre CCD e CCDAE.

Tabela I Comparao entre cromatografia em camada delgada e cromatografia em camada delgada de alta eficincia. Parmetro
Tamanho usual da placa Volume aplicado de cada amostra Nmero de amostras por placa Dimetro da mancha Tempo de corrida Limites de deteco por absoro de luz por fluorescncia

CCD
20 x 20 cm 1 5 L 7 - 10 3 6 mm 30 200 min ~ 5 ng

CCDAE
10 x 10 cm 0,1 0,2 L 10 - 20 1 mm 3 20 min ~ 0,5 ng

1. Amostra: A urina deve ser coletada em um recipiente limpo de vidro ou plstico. Ela pode ser refrigerada (2-8C) por 2 dias ou congelada (-20C) por um longo perodo. A urina que for refrigerada deve alcanar a temperatura ambiente (15-25C) antes de ser testada. As amostras que forem congeladas devem ser descongeladas e misturadas antes do teste. Caso haja amostras com grande quantidade de partculas, estas urinas devem ser clareadas por centrifugao ou deixadas em repouso para sedimentar antes de serem testadas. 2. Extrao: - Colocar aproximadamente 5mL da amostra em um tubo Falcon de 15mL. Adicionar 0,5mL de NaOH 1N e homogeneizar por inverso; - Colocar o tubo no banho-maria a (50 a 60C) durante 15 min para hidrlise; - Resfriar a temperatura ambiente, jamais utilizar gua para isso; - Acidificar com 1 mL de HCl 1N para conferir ao meio um pH entre 2-3; - Adicionar 5mL de n-hexano e colocar no agitador horizontal em baixa rotao por 25min. No colocar em vrtex, pois a formao de espuma prejudicial; - Centrifugar por 5 min a 2000rpm; - Retirar a fase orgnica (superior) com auxlio de uma pipeta Pasteur. - Evaporar em temperatura ambiente. O bquer deve ser colocado a uma distncia de aproximadamente 0,5cm da porta da capela, estando esta semi-fechada e ligada (abertura deve ser 0,5cm mais alta do que a altura do bquer). A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma, a evaporao acontece em aproximadamente 20 minutos. Pode haver formao de gua de condensao

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na parede do bquer e posteriormente no fundo. Confirmar se realmente gua da seguinte maneira: transferir o lquido do fundo do bquer para um eppendorf com auxlio de uma micropipeta. Adicionar 5 gotas de n-hexano, se haver formao de 2 fases, confirma-se a presena de gua de condensao. Pode-se desprez-la do bquer e proceder somente com o precipitado. 2.1 Preparo dos reagentes: - NaOH 1N: pesar 4 g de NaOH e dissolver em 100 mL de gua destilada. - HCl 1N: em proveta de 100 mL com tampa, colocar 80 mL de gua destilada, adicionar 8,3 mL de HCl concentrado e completar o volume com gua.

3. Aplicao: Ressuspender com 5 gotas de clorofrmio:metanol (3:1) e aplicar todo o volume em placa cromatogrfica de silicagel 60, 10 x 10 cm, para HPTLC (CCDAE) de cromatografia de alta eficincia com auxlio de um capilar; - Aplicar todo o volume em que foi feita a ressuspenso; - Usar padro de maconha com ter de petrleo. 4. Eluio: Aps a aplicao, colocar as placas em cubas de vidro pr-saturadas, contendo o sistema eluente n-heptano / n-butanol / cido actico ( 18:1,8:0,2 mL); Para as cubas pequenas, prepara-se aproximadamente 20mL de eluente; Colocar a placa na cuba de forma que o eluente no toque a linha de aplicao das amostras; Deixar eluindo at a linha do solvente chegar a 0,5cm do fim da placa; Deixar secar naturalmente. 5. Revelao: A revelao deve ser realizada em trs etapas: 1) Observar as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm). 2) A seguir vaporizar com os agentes cromognicos especficos. 3) Observar novamente as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm). -

5.1. Agente cromognico: Fast Blue Seqncia de revelao a. b. c. d. Nebulizar a placa com dietilamina; Secar a temperatura ambiente; Nebulizar com soluo de Fast Blue BB 0,1 % (preparar na hora); Aguardar 10 minutos e observar a placa;

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5.2 Preparo do agente cromognico: Fast Blue 0,1 % : dissolver 0,01 g de Fast Blue em 1 mL de metanol e adicionar 9 mL de gua.

6. Bibliografia: REINHARDT, V. E.; MDIO, A F. Reviso dos mtodos analticos para a deteco de canabinides em material biolgico. Rev. Bras. Tox. 8 (2): 29-40, 1995. SPINELLI, E.; SILVA, O. A. Identificao de usurios de cannabis por cromatografia em camada delgada de alta eficincia. Rev. Bras. Tox. 8 (2), 21-28, 1995.

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IDENTIFICAO DE COCANA EM AMOSTRAS DE PRODUTO

1. Amostra: P suspeito

2. Reao colorimtrica: Os testes rpidos de colorao e/ou precipitao para identificao de agentes txicos tm seu valor como triagem. A partir dos resultados obtidos com tais testes, podemos direcionar um pouco mais o trabalho analtico. Para que seja possvel a comparao de colorao, so utilizados nestes testes controles positivo (amostra que contm o agente txico) e negativo (amostra que no contm o agente txico), podendo-se ento comparar a colorao obtida com a amostra suspeita. Seqncia para identificao a) Reativo de Tiocianato de cobalto Colocar uma pequena quantidade (ponta de uma pequena esptula) do p suspeito em um eppendorf, ou placa escavada. Adicionar 2 gotas de tiocianato de cobalto glicerinado. Colorao azul indica indcios sugestivos da possvel presena de cocana. b) Reao de Scott Acrescentar 2 gotas de HCl 6N no eppendorf ou placa escavada que foram utilizados para a reao do tiocianato. Homogeneizar bem at ficar na cor rosa clara. Adicionar algumas gotas de clorofrmio P.A. Colorao azul indica indcios sugestivos da possvel presena de cocana. OBS: importante utilizar sempre as mesmas quantidades de tiocianato de cobalto glicerinado 2% e cido clordrico 6N. Reagentes: Reativo de Tiocianato de Cobalto: pesar 1 g de cloreto de cobalto, mais 1,5 g de tiocianato de sdio ou potssio e misturar em 90 mL de gua destilada. Adicionar glicerina na mesma proporo do reativo. Reativo de Scott: HCl 6N: mistura-se mesmo volume de cido clordrico concentrado com gua destilada.

3. Reao microqumica: Em um bquer colocar uma pequena amostra de cocana e adicionar 0,5 mL de HCl 0,1 N. Concentrar em lmina de microscpio umas gotas dessa mistura mais algumas

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gotas de cido cloroplatnico a 5%. Visualiza-se ao microscpio cristais em forma de folhas de palmeira. Reagentes: HCl 0,1N : diluem-se 1,7 mL de cido clordrico concentrado em at 20 mL de gua destilada. cido cloroplatnico 5%: pesar 5 g de cido cloroplatnico e dissolver em quantidade de gua destilada suficiente para completar 100 mL de soluo.

4. Cromatografia em camada delgada: 4.1 Solubilizao: Colocar uma pequena amostra do p suspeito em um bquer e adicionar 1mL etanol. Misturar e em seguida aplicar em placa de cromatografia recoberta com slica gel. 4.2 Aplicao: Utilizando microcapilares, transferir microgotas das amostras e do padro para as placas cromatogrficas ativadas a 110 C por 1 hora. 4.3 Eluio: Aps a aplicao, colocar as placas em cubas de vidro pr-saturada, contendo o sistema eluente metanol-amnia (100: 1,5). Deixar correr por 12 cm, retirar as cromatoplacas e secar em temperatura ambiente at a evaporao total do eluente. 4.4 Revelao: Vaporizar as cromatoplacas com um dos agentes cromognicos: - Reativo de Draggendorff - Reativo Cloroplatnico Acidificado 4.5 - Preparao dos agentes cromognicos 4.5.1 Reativo de Draggendorff: Soluo A: 2,0 g de subnitrato de bismuto 25 mL de cido actico 100 mL de gua destilada Soluo B: 40 g de Iodeto de potssio 100 mL de gua destilada Soluo de uso: 10 mL de A + 10 mL de B + 20 mL de cido actico + 100 mL de gua destilada.

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4.5.2 Reativo cloroplatnico acidificado Soluo cido cloroplatnico a 10% ............................................. ...........................3,0 mL gua destilada ......................................................................................................... 97 mL Soluo de iodeto de potssio a 6% ..................................................................... 100 mL Para cada 100 mL de soluo adicionar 2 mL de cido clordrico concentrado.

5. Bibliografia: CALABRESE, A.J.; ASTOLFI, E.A. Toxicologia. Buenos Aires : Kapelsuz, 1972. MOFFAT, A. C. (ed). Clarke's isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004. VIEIRA, R.V. Identificao de frmacos em urina por cromatografia em camada delgada: Faculdade de Cincias Farmacuticas. Universidade de So Paulo. S.P. Dissertao de Mestrado, 1979.

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TOXICOLOGIA OCUPACIONAL

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TESTES COLORIMTRICOS RPIDOS PARA IDENTIFICAO DE AGENTES TXICOS

Os testes rpidos de colorao e/ou precipitao para identificao de agentes txicos tm seu valor como triagem. A partir dos resultados obtidos com tais testes, podemos direcionar um pouco mais o trabalho analtico. Para que seja possvel a comparao de colorao, so utilizados nestes testes controles positivo (amostra que contm o agente txico), e negativo (amostra que no contm o agente txico), podendo-se ento comparar a colorao obtida com a amostra suspeita. 1. Paraquat e Diquat A urina ou lavado/contedo gstrico podem ser testados quanto a presena de paraquat usando o mtodo baseado na reduo do ction paraquat a um radical inico azul, na presena de um lcali e ditionito de sdio. A 1mL de urina (lavado/contedo gstrico) adicionar 20 mg de bicarbonato de sdio (equivalente ponta de esptula) e 20 mg de ditionito de sdio. Misturar. Aguardar a efervescncia desaparecer. Fazer leitura em fundo branco. 2. Bibliografia: ZENECA AGRCOLA. O tratamento por intoxicao por paraquat. So Paulo: Zeneca Agrcola. 1998.

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IDENTIFICAO DE AGROTXICOS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Os agentes inibidores da enzima acetilcolinesterase podem ser retirados da urina ou lavado gstrico atravs de extrao cida com solvente orgnico. Aps aplicao e eluio em cromatografia de camada delgada, esses agentes podem ser revelados pela adio de agentes cromognicos. 1. Amostra: Urina ou lavado gstrico, devidamente coletados, com data e hora da coleta, mantida sob congelamento ou refrigerao no caso da impossibilidade da anlise imediata. 2. Extrao: - Colocar 10 mL da amostra em um tubo Falcon de 50 mL e medir o pH. Acert-lo com H2SO4 0,5 N para conferir ao meio um pH 4,0; - Adicionar 10 mL de diclorometano, agitando primeiramente por 1 minuto no vrtex e depois por 30 minutos no agitador horizontal, realizando assim a extrao cida; - Centrifugar por 10 minutos na velocidade de 3000 rpm (no ultrapassar jamais); - Retirar a fase inorgnica (superior) atravs de aspirao com bomba de vcuo ou pipeta Pasteur. Se houver formao de camada de emulso, no aspir-la; - Filtrar os extratos sobre sulfato de sdio (Na2SO4) anidro, reunindo esses extratos em um bquer com fundo afunilado; - Evaporar em temperatura ambiente. O bquer deve ser colocado a uma distncia de aproximadamente 0,5cm da porta da capela, estando esta semi-fechada e ligada (abertura deve ser 0,5cm mais alta do que a altura do bquer). A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma, a evaporao acontece em 10 minutos. Pode haver formao de gua de condensao na parede do bquer e posteriormente no fundo. Confirmar se realmente gua da seguinte maneira: transferir o lquido do fundo do bquer para um eppendorf com auxlio de uma micropipeta. Adicionar 2 gotas de diclorometano, se haver formao de 2 fases, confirma-se a presena de gua de condensao. Pode-se desprez-la do bquer e proceder somente com o precipitado.

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3. Fluxograma para extrao de agrotxicos:

Amostra (10mL)
urina, lavado gstrico, etc
Acidificar (pH 4-5 com H2SO4 10%) Extrair com 10mL de diclorometano

Fase aquosa

(descartar)

Fase orgnica
Filtrar sobre Na2SO4 anidro

Extrato orgnico Evaporar

Resduo (Rcido) CCD

4. Aplicao: - Ressuspender com 5 gotas de diclorometano e aplicar em placa de slica gel 60 com auxlio de um capilar. Aplicar todo o volume em que foi feita a ressuspenso. Aplicar microgotas de padro de organofosforado e carbamato. 5. Eluio: - Aps a aplicao, colocar as placas em cubas de vidro pr-saturada, com sistema clorofrmio / acetona (9:1). Para as cubas pequenas, prepara-se aproximadamente 30mL de eluente (27 mL de clorofrmio : 3mL de acetona). - Colocar a placa na cuba de forma que o eluente no toque a linha de aplicao das amostras. Deixar eluindo at a linha do solvente chegar a 0,5cm do fim da placa. Deixar secar naturalmente.

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6. Revelao: Vaporizar as cromatoplacas conforme a sequncia de revelao descrita a seguir: - Organofosforados: Tampar a regio da placa destinada a revelao de carbamatos com uma placa de vidro. Borrifar a placa com cloreto de paldio a 0,5%. - Carbamatos: Tampar a regio da placa usada para a revelao de organofosforados. Misturar volumes iguais das solues A e B (2mL de cada) e borrifar a placa. Deixar secar em estufa 80C de 5 a 10 minutos. Misturar volumes iguais da soluo C com etanol absoluto (2mL de cada) e borrifar na placa. 6.1 Preparao dos reagentes para revelao: - Cloreto de paldio a 0,5%: o cloreto de paldio no dissolve diretamente em gua. Deve-se primeiro dissolver 0,5g em algumas gotas de HCl 20% aps, completar o volume para 100mL com gua destilada. - Soluo A: soluo de p-nitroanilina a 1% em HCL 2N. Pesar 1g de pnitroanilina e dissolver em 100mL de cido clordrico 2N. Conservar em geladeira; - Soluo B: soluo de nitrito de sdio 3%. Pesar 3g de nitrito de sdio e dissolver em 10mL de gua destilada. Estabilidade de 1 ms em geladeira; - Soluo C: soluo de hidrxido de sdio 80%. Pesar 80g de hidrxido e sdio e dissolver em 100mL de gua destilada.

7. Bibliografia: UNIVERSIDADE NACIONAL DE LA PLATA . Disponvel em: http://www.biol.unlp.edu.ar/toxicologia/seminarios/parte_2/bibliografia_sem_2.html. Acesso em: 30/08/2006.

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DETERMINAO DA ATIVIDADE DA COLINESTERASE PLASMTICA

1. Princpio do mtodo: A colinesterase catalisa a hidrlise do iodeto de butiriltiocolina com formao de tiocolina que em uma reao secundria com o cido 5,5-ditio bis-2-nitrobenzico (DTNB), forma o 5-mercaptano-2-nitrobenzico de colorao amarela (Figura 4). A intensidade da cor diretamente proporcional a atividade da colinesterase, a qual pode ser determinada em espectrofotmetro na regio do visvel a 405 nm.

Iodeto de 5-butiriltiocolina + H2O

colinesterase

Iodeto de tiocolina + Butirato

Iodeto de Tiocolina + cido 5,5-ditio bis-2-nitrobenzico

5-Mercaptano-2-nitrobenzico + 2-Nitrobenzico-5-mercaptanotiocolina

Figura 4: Reao de catlise da colinesterase 2. Amostra: Soro ou plasma 0,5 mL. O plasma pode ser utilizado desde que colhido com heparina ou EDTA. Os anticoagulantes a base de citrato, fluoreto ou oxalato produzem inibio enzimtica leve e por isso no devem ser utilizados. Estabilidade: a amostra deve ser preferencialmente fresca. Pode ser conservada at 07 dias sob refrigerao, sem conservantes. Se necessrio transportar a amostra recomenda-se o congelamento e analisar a amostra imediatamente aps o degelo. 3. Equipamento: - Espectrofotmetro UV-Vis. 4. Reagentes: Soluo de tampo fosfato pH 7,7 50 mmol/L Diluente 100 mL Estvel at data indicada no frasco, quando estocado a temperaturas entre 2 e 8C. Substrato 30x3 mL (Reagente de cor): Iodeto de butiriltiocolina 7 mmol/L; cido 5,5 ditiobis 2 nitrobenzico 0,25 mmol/L.

Estvel at a data indicada no frasco, quando estocado a temperaturas entre 2 e 8C.

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Cloreto de sdio a 0,9% (que no acompanha o Kit)

5. Preparo das solues: Soluo de Reao: adicionar 3 mL de tampo fosfato em um frasco de substrato. Tampar e agitar suavemente, por inverso, at dissoluo completa. Reconstituir somente no momento do uso. Estvel por 1 hora quando mantido a temperaturas entre 15 e 25C. 6. Mtodo: Zerar o espectrofotmetro com ar. Transferir 3,0 mL da soluo de reao para a cubeta de leitura (faces paralelas devido volume) e adicionar 20 L do soro (amostra). Misturar imediatamente e ler a absorbncia, disparando simultaneamente o cronmetro. Voltar a ler depois de 30, 60, 90 e 120 segundos. Determinar a diferena mdia da absorbncia a cada 30 segundos (A/30 seg) subtraindo cada leitura da anterior e fazendo a mdia dos valores. Utilizar a mdia para os clculos.

OBS: a 37C utilizar amostra diluda 1:2 com soluo de cloreto de sdio a 0,9% e continuar o procedimento conforme descrito acima. Multiplicar o resultado obtido por 2. 7. Parmetros: Temperatura dos reagentes: 25, 30 ou 37C; Comprimento de onda: 405 nm; Fenda: 1 cm; Temperatura de leitura (ambiente e reagentes): 25, 30 ou 37C.

OBS: Os valores de referncia devem ser interpretados em funo da temperatura de reao. 8. Clculo:

Atividade da enzima (U/L) = A/30seg x 22.710

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9. Valores de referncia: 25C 3200 9000 U/L 30C 3962 11142 U/L 37C 4970 13977 U/L

10. ndice Biolgico Mximo Permitido (IBMP) Depresso da atividade da colinesterase plasmtica em 50%, em relao medida realizada pr-ocupacionalmente, indica exposio excessiva, devendo o trabalhador ser afastado da exposio. Com a finalidade de realizao de monitorizao biolgica, o horrio da coleta no crtica, desde que realizada a avaliao procupacional. 11. Bibliografia: BRASIL, Secretaria de Segurana e Sade no Trabalho. Portaria n. 24 de 29 de dezembro de 1994, Braslia. Seo 1, p. 21278-21282 [ NR7 Programa de Controle Mdico de Sade Ocupacional]. Colinesterasa. Francisco A. Zaccara. Rosrio: Wiener Laboratrios S.A.I.C. 2000. Bula de kit.

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DETERMINAO DE METEMOGLOBINA

1. Princpio do teste:

O princpio considera a determinao de metemoglobina presente na amostra em relao hemoglobina total. A quantidade de metemoglobina na amostra medida no comprimento de onda de 632 nm (D1). Aps a adio de ferricianeto de potssio ocorre a oxidao do Fe+2 da hemoglobina a Fe+3 (com conseqente formao de metemoglobina), o que possibilita a leitura da hemoglobina total convertida, no comprimento de onda de 632 nm (D3). O on cianeto utilizado para produo de cianometahemoglobina (D2 e D4), complexo no mensurvel no comprimento de onda de 632 nm, sendo a leitura obtida considerada como a dos interferentes na amostra.

2. Amostra: Sangue total, devidamente coletado com anticoagulante EDTA ou Heparina, com data e hora da coleta, mantida sob refrigerao no caso da impossibilidade da anlise imediata. A determinao deve ser feita em no mximo 2 horas aps a coleta. Amostras hemolisadas devem ser desprezadas.

3. Padres, Controles, Reagentes e outros insumos:

- Tampo Fosfato pH 6,8 (Soluo A: dissolver 2,8g de fosfato dissdico 7H2O em 100mL de gua destilada e ajustar o pH em 6,8 com HCl ou NaOH diludos. Soluo B: dissolver 1,16g de fosfato monobsico de sdio anidro em 100mL de gua destilada. Soluo de uso: misturar 49,1mL da soluo A com 50,9mL da soluo B). - Cianeto de potssio 5%: colocar 5g de cianeto de potssio em um balo volumtrico de 100mL e completar o volume com gua destilada. - Ferrocianeto de potssio 5%: colocar 5g de ferrocianeto de potssio em um balo volumtrico de 100mL e completar o volume com gua destilada. - Triton X 100 1%: transferir 1mL de Triton X 100 para um balo volumtrico de 100mL e completar o volume com gua destilada.

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4. Procedimento detalhado:

- Pipetar 0,2 mL de sangue em um tubo de Falcon de 15mL contendo 4,0mL de tampo fosfato e 6,0mL de soluo detergente Triton X-100 1%. O lisado tamponado pode ser guardado por 24h a 4C sem alterao significante; - Pipetar 3mL dessa soluo em duas cubetas de espectrofotmetro (marcar como cubeta A e cubeta B); - Ler a absorbncia da cubeta A em 632nm (D1); - Adicionar 30L da soluo de KCN 5% a cubeta A, homogeneizar e medir novamente a absorbncia em 632nm (D2); - A cubeta B, adicionar 30L de K3FeCN6, esperar 5 minutos, e medir a absorbncia a 632nm (D3); - Adicionar 30L de KCN a cubeta B, homogeneizar e ler novamente no mesmo comprimento de onda (D4).

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5. Fluxograma analtico

Amostra (em duplicata)

0,2 mL de sangue + 4,0 mL de tampo fosfato + 6,0 mL de soluo Triton 1% Colocar 3 mL dessa soluo em cada cubeta

CUBETA A

CUBETA B

Leitura em = 632 nm

D1

30 L de K3FeCN6, esperar 5 min, homogeneizar

30 L de KCN 5% repouso de 1 min

Leitura em = 632 nm

D3

Leitura em = 632 nm

30 L de KCN 5% repouso de 1 min

D2

Leitura em = 632 nm

D4

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6. Clculos: % Metemoglobina = (D1 D2 / D3 D4) x 100

7. Controle da qualidade: Amostras controle para determinao de metemoglobina no podem ser encontradas comercialmente. Pode-se determinar, em paralelo, a concentrao de metemoglobina de uma amostra de recente de doador saudvel como controle normal.

8. Valores de referncia: Valores menores ou iguais a 2% so tidos como normais. OBS: Quando o comprimento de onda de D2 for maior do que D1 o resultado da determinao menor que 2%. 9. ndice Biolgico Mximo Permitido (IBMP) Valores de metemoglobinemia superiores a 5%, indicam exposio excessiva, devendo o trabalhador ser afastado da exposio. Com a finalidade de realizao de monitorizao biolgica, recomenda-se a coleta pr e ps jornada de trabalho.

10. Bibliografia:

BRASIL, Secretaria de Segurana e Sade no Trabalho. Portaria n. 24 de 29 de dezembro de 1994, Braslia. Seo 1, p. 21278-21282 [ NR7 Programa de Controle Mdico de Sade Ocupacional]. HEGESH, E.; GRENER, N.; COHEN, S.; BOCHKOUSKY, R.; SHUVAL H.I. A sensitive kicromethod for the determination of methemoglobin in blood. Clin.Chim.Acta. 30: 679-682, 1970. MORAES, E.C.F.; SZNELWAR, R. B.; FERNICOLA, N.A.G.G. Manual de Toxicologia Analtica. So Paulo: Roca, 1991.

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DETERMINAO DE CARBOXIEMOGLOBINA NO SANGUE

1. Princpio do mtodo: O princpio do mtodo compara os nveis de hemoglobina reduzida e carboxihemoglobina. A hemoglobina reduzida utilizando ditionito de sdio para se obter um sistema bicomponente, composto por Hbred e COHb, determinado atravs das absorbncias em 420nm e 432nm. As razes das absorbncias nestes comprimentos de onda so particularmente sensveis a quantidade de CoHb presente na amostra. A porcentagem de COHb calculada correlacionando-se as absorbncias das amostras com os coeficientes de absortividade molar da Hbred e da COHb nos comprimentos de onda apropriados. 2. Amostra: A amostra de sangue deve ser colhida no final da jornada de trabalho em vaccuntainer heparinizado e conservada a 4 C por no mximo uma semana. Para os fumantes devem ser colhidas duas amostras, antes e aps a jornada de trabalho. 3. Material: sol. tampo pH= 6,85: KH2PO4 /K2HPO2 0,1 M sol. hemolisante: dilluir o tampo com gua 1:10. Preparar semanalmente sol. diluente: dissolver 25 mg de ditionito de sdio em 20 mL de sol. tampo. Preparar antes do uso.

3. Tcnica: 1. Em tubo de ensaio com tampa, colocar 0,1 mL de sangue e 12 mL de sol. hemolisante. Agitar, deixar em repouso por 10 minutos; 2. Diluir 0,2 mL do hemolizado com 2,3 mL de sol. diluente. Tampar; 3. Deixar a temperatura ambiente por 10 minutos. Ler as absorbncias a 420 e 432 nm, usando como branco a sol. diluente. 5. Clculo da % da carboxiemoglobina: % COHb = Sendo: AR = Abs. 420 Abs. 432 F2 = Abs HbCO 432 = 0,4787 Abs Hb 420 F1 = Abs Hb 432 = 1,3330 Abs Hb 420 F3 = Abs HbCO 420 = 1,9939 Abs Hb 420 x 100 1 (AR. F1) AR (F2 F1) F3 + 1

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6. Valores de referncia: Valores menores ou iguais a 1% para no fumantes so tidos como normais. 7. ndice Biolgico Mximo Permitido (IBMP) Valores de carboxihemoglobinemia superiores a 3,5% para indivduos no fumantes indicam exposies excessivas, devendo o trabalhador ser afastado da exposio. Com a finalidade de realizao de monitorizao biolgica, recomenda-se a coleta pr e ps jornada de trabalho.

8. Bibliografia: BEUTLER, E. & WEST, C. Simplified determination of carboxihemoglobin. Clin. Chem., 30(6):871-4, 1984.

BRASIL, Secretaria de Segurana e Sade no Trabalho. Portaria n. 24 de 29 de dezembro de 1994, Braslia. Seo 1, p. 21278-21282 [ NR7 Programa de Controle Mdico de Sade Ocupacional].