Tcnicas de PCR: Aplicaes e Padronizao de Reaes

BSc. Daniel Perez Vieira

(Protozoologia-IMTSP/ Laboratrio de Biologia Molecular-IPEN) Aula 1 - PCR: Princpios e tipos de Reao
Breve Histrico Desenvolvida por Saiki, et al. (1985) e principalmente por Mullis, et al. (1987). Kary Mullis, que percebeu que possua uma importante ferramenta em mos, tentou publicar seus experimentos nas duas revistas cientficas mais importantes do mundo, a Science, americana, que prontamente lhe negou a publicao, e a Nature, britnica, que procedeu da mesma forma. Mullis, resignado, conseguiu publicar ento seu artigo sobre amplificao do gene da -globina humana na Methods in Enzymology, de impacto infinitamente menor. Apesar dos fracassos iniciais, a Perkin-Elmer Cetus, uma reconhecida empresa de insumos para pesquisa comprou-lhe a patente, o que lhe rendeu bons lucros, no antes de ser agraciado com o prmio Nobel de Qumica em 1993. Hoje a Perkin-Elmer repassou os direitos Roche Molecular Systems (valor da compra: US$ 300.000.000,00), que possui todas as patentes envolvidas no processo de PCR, inclusive as relacionadas aos termocicladores convencionais. Porm, a tecnologia tornou-se to difundida que o custo de pagamento da patente tornou-se acessvel s suas concorrentes, e a variedade de reagentes e aparelhos atualmente no mercado grande.

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Fig. 1: Kary Mullis, inventor da PCR, em foto de 1994 ( Nobel Academy)

Na verdade, Saiki j havia descrito a tcnica, mas Mullis inovou: Conseguiu especificidade na cpia de apenas segmentos especficos, introduzindo o conceito de primer de PCR, e na utilizao de uma DNA polimerase termoestvel. At ento, a precursora da PCR demandava grandes quantidades de enzima, adicionadas a cada ciclo de amplificao. Alm disso, desenvolveu-se vrios equipamentos para a automatizao da adio da enzima aps cada ciclo, todos de custo elevadssimo (os primeiros termocicladores). Mullis utilizou a ento recm descrita Taq, DNA polimerase termoestvel isolada da bactria de fontes termais Thermus aquaticus. Esta enzima se mantm estvel em temperaturas de at 117C, com temperatura tima de 72C. Estes dois passos tornaram a tcnica muito mais fcil de se realizar. Porm, a realizao manual dos ciclos de temperatura, banhando-se um rack de tubos em vrios banhos-maria de temperaturas diferentes, ainda constitua um fator dificultante do processo. Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador automtico. At hoje, a maioria dos termocicladores automticos funciona com o mesmo princpio: aquecimento por resistncias eltricas e refrigerao com ventoinhas e tubulaes em serpentina preenchidas por etileno glicol. Aperfeioou-se os sistemas de contagem de tempo, para aumentar a confiabilidade das reaes. Em meados dos anos 90 surge o padro Peltier, cujo bloco de aquecimento composto por uma liga metlica que aquece ou resfria de acordo com o sentido da corrente eltrica aplicada.

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Fig. 2: Termociclador atual. Observa-se a presena do bloco de ensaio.

A repercusso da inveno da PCR foi to grande, que o mdico Michael Crichton, escritor de Parque dos Dinossauros, afirmou que teve a idia de escrever este roteiro ao ler a descrio da tcnica, fato que refora a idia da versatilidade do processo. Ainda sobre a repercusso da tcnica, hoje existem grandes empresas e grupos de pesquisa tentando descobrir alternativas PCR, sem grande expresso devido ao sucesso da criao do qumico norte-americano Kary Mullis. Fundamentos e Objetivos Multiplicar um trecho especfico do DNA (gene ou parte dele, regies supervariveis, Junk DNA, etc.) utilizando desoxinucleotdeos como monmeros at um ponto em que sua concentrao em dada soluo seja to alta que possa ser facilmente detectvel por mtodos simples e clssicos de separao e identificao de substncias. Portanto, Kary Mullis na verdade props uma tcnica que consegue resolver um grande problema da anlise de cidos nuclicos: sua baixa quantidade na maioria dos tecidos vivos. A multiplicao destes trechos especficos se d alternando-se a temperatura de ensaio entre: a) Denaturao das cadeias do DNA genmico; b) anelamento (annealinng) dos primers, usados para delimitar a seqncia a ser amplificada; c) temperatura tima especfica da enzima: 72C; d) reincio do ciclo. www.etall.hpg.com.br 3

Fig. 3: Esquema dos processos realizados numa reao de PCR. Aps a denaturao das fitasmolde, ocorre o pareamento dos primers. A enzima, representada em verde, adiciona os desoxinucleotdeos complementarmente s fitas-me.

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Fig. 4: Passos finais de uma reao de PCR. A figura mostra as duas fitas-me, pareadas com as suas fitas-filha complementares, sintetizadas a partir da adio dos desoxinucleotdeos pela DNA polimerase.

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A quantidade de DNA final segue uma funo exponencial, onde:

N = N0 . 2n
N = Nmero final de cadeias de DNA N0 = Nmero inicial de DNA molde (template) n = Nmero de repeties do ciclo

Portanto, a concentrao final do DNA molde na soluo muito maior (da ordem de 235 ) do que a inicial, possibilitando a sua identificao. Reagentes Necessrios para a Reao A reao SEMPRE parte de um DNA molde, extrado convenientemente da amostra, ou de uma amostra de RNA, convertida para cDNA (DNA complementar). O ideal que o cido nuclico esteja livre de impurezas (protenas, lipdeos, outro cido nuclico, reagentes de extrao, etc.) e numa concentrao mnima de 5g/mL, apesar de quantidades bem menores poderem ser utilizadas (em medicina forense, chegou-se a utilizar quantidades de at 10-12 mol de DNA). A DNA polimerase: A mais utilizada ainda a Taq, numa concentrao que varia de 1 a 4U por microlitro de soluo. Normalmente, a maioria das DNA polimerases disponveis no mercado so fornecidas conjuntamente com uma soluo-tampo especfica, cuja composio varia de acordo com o fabricante. Basicamente, estas solues contm ons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) que otimizam as condies de reao. Alguns tampes contm ainda detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a formao de dmeros das cadeias enzimticas, protenas estabilizantes (BSA = Bovine Serum Albumin = Albumina Srica Bovina) e algumas substncias que agem na denaturao da cadeia molde

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de DNA (DTT = Dithiothreitol, -mercaptanoethanol), quebrando as pontes de hidrognio entre as bases. Um reagente de importncia crtica o MgCl2 , doador muito estvel de ons Mg2+, que so cofatores indispensveis para atividade da enzima. Algumas enzimas utilizam outros ons metlicos como cofatores. Um desses casos, e talvez o mais interessante a enzima Tth (Thermus thermophillus) Polimerase. Esta enzima possui atividade DNA polimersica em presena de ons Mg2=; porm, na presena de Mn2+ esta mesma enzima apresenta atividade de uma transcriptase reversa, ou seja, sintetiza DNA a partir de uma cadeia de RNA. Os desoxinucleotdeos so a matria-prima propriamente dita para a sntese das fitas-filhas. So compostos por nucleotdeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados no carbono 5 da desoxirribose. So adicionados pela polimerase complementarmente fita-me. Adiciona-se uma mistura de todos os dNTPs em concentraes iguais reao. Os dNTPs so ligados fita-me pela polimerase numa rea delimitada pelos primers, que so pequenas seqncias de DNA (12 a 35 bases) complementares s bordas Tipos de reao de PCR mais comuns RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): Esta reao composta de 2 partes: a transcrio reversa e a amplificao propriamente dita. Seu principal diferencial que na verdade esta reao no parte de um molde de DNA diretamente extrado da amostra; a amostra fornece o RNA, que convertido em cDNA (DNA complementar). Ferramenta til em estudos de expresso gnica, pois avaliando o mRNA, podemos detectar quais protenas esto sendo efetivamente expressas. No entanto, o estudo direto do RNA (principalmente o mRNA) invivel, devido sua alta sensibilidade a vrios fatores e a altas temperaturas. O primeiro passo da reao consiste na sntese de uma fita de DNA

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utilizando como template uma fita de RNA numa reao catalisada por uma transcriptase reversa. Usualmente, so utilizadas duas enzimas desta classe, extradas de vrus: a AMV (Avian Mieloblastosis Vrus) e a M-MuLV (Moloney Murine Laeukemia Vrus). Alm disso, tambm so utilizados primers, mas inespecficos e nunca em pares. So oligonucleotdeos compostos por vrias timinas consecutivas (6 a 35), que so anelados s regies Poly-A (ou A-Rich) do RNA, ricas em adeninas. Aps este ciclo, obtm-se o cDNA que ser utilizado na PCR. importante ressaltar que o round de transcrio reversa no altera o nmero de fitas de RNA ou DNA. Multiplex PCR: Mais de um segmento genmico amplificado numa nica reao, cada um com seu par de primers especfico. Esta vantagem pode simplificar alguns experimentos, como a investigao de paternidade, onde vrios marcadores genmicos devem ser analisados. Tambm til para a introduo de um controle de reao (a ser discutido posteriormente). Nested PCR: Para melhorar a especificidade e a eficincia da reao, o segmento genmico amplificado primeiro de forma abrangente, copiando at mesmo seqncias localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificao da real seqncia-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reaes separadamente, caracterizando o Semi-Nested PCR.

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Fig. 5: Esquema de uma reao de Nested PCR. O produto da amplificao do 1 Round utilizado com template no 2 round. No final das duas etapas, obtm-se um produto menor que o da primeira amplificao. Este tipo de reao tem como vantagem o ganho em especificidade e eficincia, uma vez que o DNA-molde do 2 round est em concentraes altssimas, e os primers da segunda etapa tm menos chances de anelamento em seqncias inespecficas, dada a reduo do tamanho do molde. PCR Competitiva: Alm do DNA molde, adicionado reao um outro trecho de DNA, de seqncia, tamanho e concentrao conhecidos (controle), cujas extremidades so complementares tambm aos primers que iro amplificar a seqncia-alvo. O resultado a amplificao de dois trechos de DNA: a de interesse e a controle. Esta ltima, levando-se em conta a quantidade inicial e dados sobre a eficcia da reao serve de padro para a quantificao do DNAalvo. Em resumo, se conhecemos a quantidade final do fragmento controle e as condies da reao, podemos dizer o quanto de DNA-alvo foi amplificado. Esta tcnica utilizada principalmente em kits diagnsticos (Carga Viral de HIV).

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Identificao dos produtos das reaes Eletroforese: Os ensaios de eletroforese se valem do princpio que determina que a carga global de uma fita de DNA negativa. Portanto, uma soluo que possua ons livres (eletroltica) e que tenha molculas de DNA em suspenso pode ser purificada aplicandose uma dada voltagem. Ao final do processo as cadeias de DNA estaro prximas ao catodo (positivo), atraente de molculas de carga negativa. No entanto, o foco da tcnica separar os fragmentos por tamanho, uma vez que a reao gera fragmentos de mesma extenso. A soluo peneirar o resultado da PCR por peneiras moleculares. As cadeias so empurradas atravs da peneira pela corrente eltrica, e de acordo com o tamanho dos furos dela, elas sero retidas ou liberadas. Na verdade, nos valemos do fato de que cadeias maiores demoram mais tempo para passar pelos poros da peneira, e cadeias menores viajam mais rapidamente atravs dela. A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. So os marcadores de tamanho molecular (Ladders = Escadas), que so misturas de trechos de DNA com tamanhos variveis, normalmente eqidistantes entre si. Por exemplo, um Ladder de 50bp quer dizer na prtica que ele mostrar vrias bandas, cada uma maior 50 pares de base do que a anterior (50bp, 100bp, 150bp, 200bp, 250bp...). Existem dois modelos bsicos de eletroforese: Baseada em gis de agarose ou em gis de poliacrilamida. As duas substncias formam tramas de poros de tamanhos variveis, possibilitando a separao dos fragmentos, que ter sua eficincia dependente da concentrao do polmero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicada. Em qualquer um dos casos, estas substncias so dissolvidas numa soluo-tampo eletroltica, obrigatoriamente a mesma que recobrir o gel na cuba de eletroforese e possibilitar a passagem de corrente eltrica (Tampo de Corrida).Para eletroforese de DNA, normalmente utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris-Acetato EDTA) Quanto aplicao das amostras no gel, importante ressaltar que antes disso elas so misturadas a

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uma outra (Tampo de amostra), que tem como funo aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampo de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema. Alm disso, o tampo de amostra possui um corante, que possibilita a visualizao do andamento da corrida. Usualmente, pode-se utilizar uma mistura de Azul de Bromofenol (Corante), Xileno-Cianol e Glicose (aumentam a viscosidade), dissolvidos no tampo de corrida apropriado para cada reao. Apesar da sua versatilidade e relativo baixo nvel de dificuldade de realizao, a eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho, e no quanto seqncia. Agarose: Polissacardeo em forma de p. Quando suspenso em soluo aquosa e aquecido dissolve-se completamente, solidificando-se vagarosamente conforme a temperatura cai. Enquanto est em forma lquida, colocado num molde que lhe dar o formato de um bloco quando resfriar. Enquanto isso so feitos pequenos furos (poos) em uma das suas extremidades, perpendicularmente ao seu comprimento com o uso de um pente; so os poos que recebero o produto da PCR.

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Fig. 6: Montagem de gel de agarose. A agarose fundida despejada nesta cuba de montagem, onde deixada at a polimerizao. Na foto pode-se ver o pente, utilizado para a formao dos poos. Aps o trmino da polimerizao, o pente retirado e em seu ligar ficam espaos cujo volume pode variar de 10 a 150L, dependendo do volume de agarose e do sistema de montagem

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Aplica-se uma voltagem entre as extremidades do gel que varia entre 10 e 200 V, e corrente de 50 a 3000mA. So utilizadas concentraes de 0,5 a 3% de agarose no gel. Quanto maior a concentrao, maior a sua capacidade de distinguir fragmentos de tamanhos prximos, fator denominado DEFINIO. Por exemplo, um gel de agarose a 1% pode separar fragmentos com uma diferena de tamanho de 80 pares de bases, enquanto a 2,5% pode-se separar fragmentos com diferena de no mnimo 30 pares de bases. A visualizao dos produtos no gel aps a corrida se d pela reao de ligao do DNA com Brometo de Etdio. Este composto tem a capacidade de inserir-se nas fendas da cadeia de DNA e apresenta fluorescncia quando excitado com radiao ultravioleta. Pode-se adicionar o EtBr (10g/mL) no gel liquefeito antes da corrida ou levar o bloco a uma soluo de EtBr com a mesma concentrao e deixar descansar por alguns minutos.

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Fig. 7: Gel de agarose montado em cuba de eletroforese e sendo submetido uma voltagem de 69V.

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Fig. 8: Gel de agarose corado com Brometo de Etdio e visualizado num transluminador, aparelho que emite raios UV. As bandas podem ser identificadas como pequenas faixas fluorescentes. A seta mostra a corrida do padro de peso molecular.

Poliacrilamida: Polimeriza-se a partir da reao da acrilamida (C3H5NO) com a Bis-Acrilamida (N,N- Metileno-bis-acrilamida) em presena de perssulfato de amnio e catalisada por TEMED (N,N,N,N-Tetrametiletilenodiamino). A mistura, dissolvida no tampo de corrida desejado, posta rapidamente para polimerizar numa cuba de montagem semelhante utilizada para agarose, mas orientada verticalmente. Tambm posto um pente para a formao de poos.

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Fig. 9: Gel de poliacrilamida em polimerizao. Pode-se visualizar o pente ainda inserido no sistema.

Aps a polimerizao, os procedimentos so os mesmos em relao a um gel de agarose: Cobertura pelo tampo de corrida na cuba de eletroforese, aplicao das amostras e do ladder, aplicao da corrente eltrica.

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Fig. 9: Gel de poliacrilamida montado em cuba de eletroforese e sendo submetido uma voltagem de 69V.

Normalmente, utiliza-se gis com concentraes de 4 a 25% de acrilamida. A poliacrilamida apresenta definio muito maior do que a agarose: um gel de 10% pode em certas condies separar fragmentos de DNA diferentes em tamanho por apenas um par de bases A identificao dos produtos pode ser feita pela colorao com EtBr, porm o mtodo mais utilizado a impregnao do DNA contido no gel por nitrato de prata. Logo aps a corrida e gel fixado com uma soluo de etanol e cido actico, para impedir a eluio (forma borres no gel) das amostras. Em seguida, colocado por alguns minutos numa soluo de nitrato de prata. Este composto escurece quando oxidado, o que feito passando o gel para uma soluo contendo hidrxido de sdio e formaldedo. A colorao por prata de bem mais

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fcil visualizao do que a oferecida pelo EtBr, alm de ser mais segura, levandose em conta o fato de que este altamente carcinognico.

Fig. 8: Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata. Devido alta sensibilidade do mtodo de colorao, observa-se bandas inespecficas e DNA no amplificado no p da foto. A seta indica a corrida do Ladder.

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