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Universidade Federal de Gois Campus Jata Curso de Biomedicina

Hlio de Souza Jnior

Aulas Prticas

Relatrio de todas as aulas prticas realizadas durante o segundo semestre de 2009 apresentado disciplina de Microbiologia Bsica, ministrada pelo Professor Dr. Alexandre Braoios.

Jata GO Dezembro de 2009

SUMARIO 1. Colorao de Gram....................................................................................................01 1.1. Introduo ..........................................................................................................01 1.2. Objetivos............................................................................................................01 1.3. Materiais.............................................................................................................01 1.4. Mtodos..............................................................................................................02 1.5. Resultados..........................................................................................................02 1.6. Concluso...........................................................................................................03 2. Semeadura para Isolamento.......................................................................................04 2.1. Introduo...........................................................................................................04 2.2. Objetivos............................................................................................................05 2.3. Materiais.............................................................................................................05 2.4. Mtodos..............................................................................................................05 2.5. Resultados..........................................................................................................06 2.6. Concluso...........................................................................................................06 3. Meios seletivos e Diferenciais...................................................................................07 3.1. Introduo...........................................................................................................07 3.2. Objetivos............................................................................................................08 3.3. Materiais.............................................................................................................08 3.4. Mtodos..............................................................................................................09 3.5. Resultados..........................................................................................................09 3.6. Concluso...........................................................................................................09 4. Teste para diagnostico de Staphylococcus aureus.....................................................10 4.1. Introduo...........................................................................................................10 4.2. Objetivos............................................................................................................11 4.3. Materiais.............................................................................................................11 4.4. Mtodos..............................................................................................................11 4.5. Resultados..........................................................................................................12 4.6. Concluso...........................................................................................................12 5. Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos.............................................................13 5.1. Introduo...........................................................................................................13 5.2. Objetivos............................................................................................................14 5.3. Materiais.............................................................................................................14 5.4. Mtodos..............................................................................................................14 5.5. Resultados..........................................................................................................15 5.6. Concluso...........................................................................................................15 6. Referncias Bibliogrficas.........................................................................................17

Colorao de Gram

Introduo
A colorao de Gram um mtodo de colorao de bactrias desenvolvido pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com o reagente cristal violeta, lugol, lcool-acetona e fucsina bsica. Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinao da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. A colorao de Gram um dos mais importantes mtodos de colorao utilizados em laboratrios de microbiologia e de anlises clnicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterizao de amostras de bactrias. A tcnica tem importncia clnica uma vez que muitas das bactrias associadas a infeces so prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaos de pus ou de fluidos orgnicos. Essa informao permite ao clnico monitorar a infeco at que dados de cultura estejam disponveis. possvel a anlise de vrios esfregaos por lmina, o que facilita a comparao de espcimes clnicos. As lminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentao.

Objetivo
Confeccionar uma lmina e utilizar a tcnica de gram para visualizar a morfologia das bactrias ao microscpio ptico.

Materiais
1. Lamina;

2. Soluo salina;
3. Ala bacteriolgica; 4. Bico de Bunsen; 5. Colnia de bactrias; 6. Cristal Violeta, Lugol, lcool-acetona, Fucsina;

7. Papel filtro; 8. Microscpico.

Mtodos

4 1. Sobre a lmina de vidro, colocou-se uma gota de soluo salina. Com a ala

bacteriolgica tocar levemente na superfcie da colnia e emulsionar o material na gota de soluo salina (caso o microrganismo seja fornecido em soluo, colocar uma gota na lmina). Deixar secar.
2. Passou-se o esfregao na chama do bico de Bunsen trs vezes a fim de fixar o

material.
3. Posteriormente cobriu-se o esfregao seco com violeta de genciana (cristal

violeta) e deixar por um minuto.

4. Lavou-se com gua corrente. 5. Esgotou-se a lmina, e a cobriu com soluo de lugol e deixar por um minuto. 6. Esgota-se a lmina e, mantendo a mesma inclinada, pingou-se gotas de lcool-

acetona at que no se desprenda mais corante da preparao.

7. Lavou-se com gua corrente. 8. Cobriu-se a lmina com soluo de fucsina e deixar por trinta segundos. 9. Lavou-se a lmina e a cobriu com papel filtro para a secagem da lmina. 10. Em seguida examinou-se ao microscpio com a objetiva de imerso.

Resultados:
Gram (+) coram de roxo, gram (-) coram de rosa.

100X

Concluso

O mtodo da colorao de Gram baseado na capacidade das paredes celulares de bactrias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com lcool-acetona enquanto que as paredes celulares de bactrias Gram-negativas no o fazem. Resumindo, as bactrias Gram positivas coram-se de roxo e as Gram negativas coram-se de vermelho. Esta tcnica de colorao permite ento a distino entre bactrias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruda ou danificada (ex. envelhecimento celular ou aco de lisozimas).

Semeadura para Isolamento

Introduo Identificar um dado organismo como espcie baseia-se no preenchimento das caractersticas atribudas quela espcie. O reconhecimento da fonte ou origem do espcime (ambiente, espcie animal, tipo de patologia e localizao) do organismo s vezes fundamental para identificao e a correta caracterizao cultural do organismo em meios de isolamento primrio, assim como a execuo e interpretao da colorao e reao ao Gram so vitais para o sistema de identificao. Para isolar o microrganismo efetua-se a inoculao ou semeadura, utilizando a tcnica do esgotamento do inculo por estrias, tendo-se o cuidado de usar inteiramente toda a rea do meio para garantir a separao das bactrias, de modo que aps a incubao cada clula separada origine uma colnia. O processo de identificao propriamente dito comea com a observao das caractersticas das colnias isoladas (a olho nu, com lupa ou microscpio, usando a objetiva de menor aumento). Os seguintes critrios so utilizados para a caracterizao colonial: 1. Forma; 2. Tamanho (mm); 3. Elevao - achatada (alta, baixa), espraiada, convexa, etc; 4. Bordos - inteiros, ondulados, lobados, denticulados, franjados, etc.; 5. Superfcie - lisa, rugosa; 6. Estrutura - amorfa, granulosa, filamentosa; 7. Caracteres pticos - opaca, translcida e transparente; 8. Cromogenia ou Pigmentao - amarela, branca, preta, rsea, etc.; 9. Odor ausente, presente, semelhante a... Aps a observao dessas caractersticas devem ser feitos esfregaos para coloraes especiais, para observao da morfologia microscpica (forma, arranjos, tamanho e reao ao Gram), presena ou ausncia de esporos, flagelos, cpsulas, granulaes e colorao bipolar (freqente nas pasteurelas e yersinias). Os procedimentos seguintes envolvem a caracterizao metablica, tolerncia a agentes qumicos e fsicos, a antimicrobianos e fagos (fagotipagem), bem como propriedades antignicas ou sorolgicas e patogenicidade atravs da inoculao em espcies animais susceptveis (apropriadas).

Objetivo
Isolar uma determinada bactria que possa conter na amostra usando os meio de cultura solido gar MacConkey e gar Nutritivo.

Materiais
1. 2. 3. Soluo salina; Ala bacteriolgica; Bico de Bunsen;

4. Amostra de bactrias (colnias); 5. gar MacConkey e gar Nutritivo;

Mtodos
1. Com a ala bacteriolgica devidamente esterilizada, coletou-se amostras de

bactrias;
2. Utilizando a tcnica do esgotamento do inculo por estrias (Figura 1), foi

semeado a amostra de bactrias nos gares Nutritivo e MacConkey.

3. Incubou-se os meios de cultivo slidos. 4. Posteriormente observou-se as caractersticas das colnias que cresceram nos dois

gares (Figura 2).

Resultados
Algumas colnias no gar MacConkey apresentaram colorao rosada, amarelada ou incolores, mucides ou no, odor forte, colnias grandes, brilhantes, enquanto no Agar nutriente cresceram vrios tipos bacterianos, com diferentes caractersticas.

Concluso
Um isolamento bem feito fundamental no processo de identificao das bactrias, visto que a rea de isolamento fundamental para o desenvolvimento dos passos seguintes de identificao. Os gares Nutritivo e MacConkey so exemplos de meio de cultura que podem ser usados num primeiro passo de identificao das mesmas, visto que o Agar Nutritivo permite o crescimento de toda bactria, desde que no seja fastidiosa, tendo o bsico para o crescimento destes microorganismos, e o Agar Maconkey como um meio seletivo e diferencial na suspeita de uma bactria.

Meios Seletivos e Diferenciais (gares SS, Manitol e MacConkey)

Introduo
Meios de cultura consistem da associao qualitativa e quantitativa de substncias que fornecem os nutrientes necessrios ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do

seu meio natural. Tendo em vista a ampla diversidade metablica dos microrganismos, existem vrios tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigncias nutricionais. Quanto composio qumica podem ser simples ou bsicos (que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer, contudo nenhuma exigncia em especial) e complexos ou especiais (quando cumprem com as exigncias vitais de determinados microrganismos). De acordo com a finalidade bacteriolgica ou micolgica os meios especiais podem ser classificados em vrios tipos, por exemplo: Diferenciais - Permitem separar grupos de microorganismos atravs da sua aparncia no meio (caractersticas morfolgicas ou bioqumicas) e contm indicadores, que assinalam as alteraes na aparncia do crescimento bacteriano (colnias) ou no meio (mudana de cor). O mais comum o: gar Sangue contm sangue misturado do gar e usado para verificar a -hemolticas (no h hemlise); capacidade hemoltica dos microorganismos. Bactrias

bactrias -hemolticas (hemlise parcial) e -hemolticas (hemlise total) Seletivos e diferenciais Alm de nutrientes necessrios para o crescimento de todos os microorganismo, contm 1 ou mais compostos que so essenciais devido sua especificidade funcional de isolar grupos especficos, permitindo o seu crescimento em detrimento de outro, pois so formulados para inibir o crescimento de microorganismos que no interessam ao fim em vista. Os agentes de seleo podem ser produtos qumicos, corantes, antimicrobianos. A maioria deles tambm diferencial, permitindo diferenciar as colnias (slidos) dos microorganismos. Os mais conhecidos e que foram usados na aula foram: gar SS possui componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de ferro) que inibem microrganismos Gram positivos. E a incorporao de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo lactose positiva (bactrias que fermentam a lactose produzem cido que na presena do indicador vermelho neutro resulta na formao de colnias de cor rosa), e bactrias que no fermentam a lactose formam colnias transparentes. O tissulfato de sdio e o citrato frrico permitem a deteco de H2S, que evidenciado pela formao de colnias de cor negra no centro. gar Manitol um meio seletivo, pois contm uma concentrao de sal (7,5%) muito elevada, que inibe a maior parte dos microorganismos, permitindo o crescimento principalmente de cocos Gram+. Tambm um meio diferencial, pois contm o lcool manitol

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e 1 indicador de pH, o vermelho de fenol, que passa de amarelo a vermelho, se o manitol for fermentado. gar Macconkey um meio seletivo permitindo o crescimento de bactrias Gram negativas e inibindo o crescimento de Gram positivas (especialmente estafilococos e enterococos) principalmente pela presena de corante cristal violeta e sais biliares e diferencial, pois indica a fermentao de lactose (o meio fica amarelado quando isso ocorre, por causa mudana de pH).

Objetivo
Conhecer os vrios tipos de meios de cultivo, vendo as caractersticas de cada um, visando utilizao dos mesmos na rotina laboratorial na pesquisa de um tipo bacteriano. Observar a importncia destes meios, visto que apresentam caractersticas de inibirem o crescimento de certas bactrias e diferenciar outras com base no seu metabolismo.

Materiais
1. 2. 3.
4. 5.

Soluo salina; Ala bacteriolgica; Bico de Bunsen; Amostra biolgicas do nariz e de fezes; gar SS e gar Manitol.

Mtodos
1. Com a ala bacteriolgica devidamente esterilizada, coletou-se amostras de bactrias do nariz dos prprios alunos e de fezes suspensas em um tubo de ensaio;
2. Utilizando a tcnica do esgotamento do inculo por estrias foi semeado a amostra

de bactrias nos gares SS, Manitol.

3. Incubou-se os meios de cultivo slidos. 4. Posteriormente observou-se as caractersticas das colnias nos gares.

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Resultados
Posteriormente os gares foram analisados, sendo encontradas no gar Manitol (que foi cultivado com amostra de bactrias da boca e de ouvido) duas colnias, uma com aspecto mais mucide (brilhante), e outra de aspecto mais liso, sem odor. Mostrando o predomnio de Gran+. No gar SS (que foi semeado com amostras de fezes) cresceu algumas colnias pretas.

Concluso
Os meios diferenciais e seletivos so de fundamental importncia na identificao das bactrias, uma vez que o laudo apresentado ao clinico deva conter informaes necessrias PA um melhor tratamento da mesma. O resultado, prvio no gar Manitol, indica a necessidade de testes mais especficos para a deteco de Stafilococos sp. No gar SS que indicado para fezes, uma cultura secundaria para as colnias pretas necessria para identificao de Salmonela, que patogenica, visto que uma das diferenas da Proteus, que no patognica, que a ultima apresenta cheiro forte, (j que as duas apresentam-se em colnias pretas).

Testes para diagnstico de Staphylococcus aureus (Reao das enzimas Catalase, Dnase e Coagulase)
Introduo
O teste da catalase realizado com perxido de hidrognio (H2O2) sobre uma lmina e consiste na deteco da enzima catalase em bactrias. Esta enzima atua sobre a gua oxigenada (perxido de hidrognio 3 a 5%) desdobrando-a em oxignio e gua e conseqentemente protege as bactrias dos ataques com superoxidantes produzidos como defesa pelos leuccitos.

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A catalase produzida por muitos microrganismos e usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que so catalase positivos de Streptococcus, que so catalase negativos. A prova considerada positiva quando h borbulhamento ou efervescncia devido liberao do oxignio. O teste de Dnase usado para detectar a degradao do cido Desoxirribonuclico (DNA), contido no meio de cultura, por bactrias que possuem uma enzima extracelular, a desoxirribonuclease, responsvel pela reao. A enzima quebra o DNA em subunidades compostas de nucleotdeos e como conseqncia disso, se ela for fagocitada por um leuccito, o DNA dele pode ser destrudo antes de matar a bactria. O teste til para diferenciar Staphylococcus aureus de outros tipos bacterianos. Ao utilizarmos o meio de gar Dnase, devemos acrescentar uma quantidade de HCl para revelar a atividade enzimtica. Uma zona transparente em volta da colnia indica reao positiva. Caso no haja atividade dessa enzima o HCl reagir com o cido nuclico intacto, formando um precipitado em todo gar. O teste da coagulase utilizado para distinguir espcies patognicas de Staphylococcus de espcies no patognicas, sendo um bom indicador da patogenicidade do S. aureus. As coagulases so enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguneo atravs de um mecanismo similar ao da coagulao normal e conseqentemente, com a formao de cogulos em volta das bactrias o seu reconhecimento e fagocitose pelas clulas do sistema imunitrio so dificultados, e com isso elas ficam protegidas. A prova da coagulase em tubo consiste em juntar num tubo de ensaio contendo plasma sanguneo e uma suspenso de microrganismos. A formao de cogulos s 2 h, s 6 h ou s 24 h de incubao interpretada como uma prova positiva. A ausncia de coagulao aps 24 horas de incubao uma prova negativa.

Objetivo
Cada bactria apresenta caractersticas nicas que podem ser utilizadas para a sua identificao, uma dessas formas consiste nas enzimas que elas produzem ou no. Cada teste bioqumico usado para uma finalidade, sendo que o teste de coagulase tem a finalidade de demonstrar se o microrganismo produz a enzima (coagulase) capaz de coagular o plasma. J o teste de DNAse usado para verificar se o microorganismo produz a enzima extracelular desoxirribonuclease, que capaz de quebrar molculas de DNA e o Teste da catalase verifica se o microorganismo produz a enzima catalase que atua no perxido de hidrognio, degradando-o em oxignio e gua.

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Materiais
1. 2. 3. 5. 6. 8. 9. Soluo salina; Ala bacteriolgica; Bico de Bunsen; Meios de cultura para a semeadura; Lmina; HCl; Soluo de Perxido de Hidrognio.

4. Amostra de bactrias (Stafilococos aureus);

7. Tubo de ensaio contendo plasma;

Mtodos
1. 2. 3. 4. 5. Em uma lmina foi colocado uma pequena quantidade perxido de hidrognio; Com a ala bacteriolgica devidamente esterilizada, coletou-se uma pequena Com a ala bacteriolgica devidamente esterilizada, coletou-se uma pequena Posteriormente foi acrescentado nesse meio de cultura HCl; Em um tubo de ensaio com plasma foi acrescentado uma pequena quantidade de

quantidade de bactrias do meio de cultura solido e acrescentou-se na lamina; quantidade de bactrias e semeou-se em um meio de cultura;

bactria com a ala bacteriolgica devidamente esterilizada.

Resultado
O resultado dos testes descritos acima mostraram que a bactria Stafilococos aureus catalase positiva, DNAse positiva e Coagulase positiva.

Concluso
Quando nos deparamos com um material biolgico, a fim de identificar os tipos bacterianos presentes ali, vrios mtodos de identificao, de isolamento, diferenciais e seletivos so utilizados, porm os testes bioqumicos so de fundamental importncia, uma vez que podemos identificar bactrias que possuem mecanismos de fuga do Sistema Imune com base nas enzimas que elas produzem. Alm do papel de diferenciao entre bactrias de um

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mesmo gnero, como os Stafilococos que so catalase positivo, mas que s o S. aureus DNAse positivo e coagulase positivo.

Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

Introduo
Mtodo de Difuso:
Antibiograma ou Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (T.S.A.) uma prova utilizada para alguns grupos de bactrias, principalmente as que adquirem resistncia facilmente, entre elas as Enterobactrias. Os testes para a deteco de resistncia so realizados em bactrias isoladas de amostras representativas de um processo infeccioso, no qual a sensibilidade aos antimicrobianos no previsvel ou quando existem problemas de resistncia antibiticos. No indicada a realizao do T.S.A. em microorganismos da microbiota normal dos stios anatmicos

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analisados. Por estes fatores o antibiograma uma das principais funes do laboratrio de microbiologia clnica. O meio que deve ser utilizado para esta prova o Mueller-Hinton por possuir propriedades que permitem o crescimento da maioria dos microorganismos no permitindo que seu perfil nutricional interfira na sensibilidade ou resistncia das bactrias aos antibiticos. Em casos de bactrias fastidiosas a adio de sangue recomendada. Para a realizao do TSA, necessariamente a bactria em questo, primeiramente deva ter sido isolada e realizado os testes de gram, catalase, DNAse e coagulase, a fim de fazer uma previa identificao da bactria para a escolha dos discos de antibiticos adequados. Exemplos de Discos utilizados para o antibiograma:

Materiais
1. Ala bacteriolgica; 2. Bico de Bunsen; 3. Colnia de bactria a ser testada;
4. Swab esterilizado; 5. gar Mueller-Hinton;

6. Tubo com escala 0,5 Mac Farland;

7. Tubo com soluo salina estril (NaCl 0,85%); 8. Pina de metal. 9. Discos de variados Antibiticos (cada um destes apresenta uma concentrao padro,

fixa).

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Objetivos Verificar a sensibilidade da espcie de bactria Pseudomonas a diferentes tipos de antibiticos com base no teste de antibiograma. Mtodos
1. Com uma ala bacteriolgica devidamente flambada e resfriada, tocar a colnias da bactria em anlise;
2. Suspender as colnias em soluo fisiolgica estril (NaCl 0,85%) at se obter uma

turvao compatvel com o grau 0,5 da escala Mac Farland; Nestas condies o inculo estar contendo 108 bactrias/mL, quantidade padronizada pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards).
3. Embeber um swab estril na suspenso bacteriana, comprimindo-o contra as paredes

do tubo para tirar o excesso, e semear em seguida de forma suave em todas as direes na placa (gar Mueller-Hinton), procurando abranger toda a superfcie; 4. Aguardar a superfcie do gar secar;
5. Com auxlio de uma pina flambada, colocar os discos sobre a superfcie do meio

inoculado, exercendo uma leve presso com a ponta da pina para uma boa adeso dos discos; 6. Incubar a placa com os discos.

Resultados
Com o auxlio de uma rgua foi medido o dimetro dos halos inibitrios de cada disco, com posterior consulta a uma tabela apropriada, para determinar se a bactria em anlise sensvel ou no ao antibitico testado.

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Os resultados obtidos na aula prtica, com base na medida do dimetro do alo formado em volta dos discos, mostraram que a Pseudomonas resistente a Tetraciclina (TT), pois no apresentou alo em volta do disco e a Lincomicina (LIN), e se mostrou sensvel a Tobramicina (TOB) com um alo de 16 mm e a Ampicilina (AMP) com 24 mm.

Concluso
Segundo este mtodo, as estirpes bacterianas podem ser classificadas como Sensveis (S), Resistentes (R) ou Intermdias (I). A categoria sensvel (S) implica que a infeco causada pela cepa bacteriana isolada pode ser adequadamente tratada com a dosagem do antimicrobiano recomendada para o tipo de infeco e o agente infeccioso. A categoria intermediria (I) inclui isolados cujos MICs so prximos aos do sangue e tecidos. Ela permite a aplicabilidade do antimicrobiano em infeces em stios onde as drogas so fisiologicamente concentradas ou quando doses maiores podem ser utilizadas. A categoria resistente (R) inclui isolados que no so inibidos pelas concentraes usuais do antimicrobiano na dosagem padro e/ou falha quando um especfico mecanismo de resistncia expressado. A orientao fornecida por este teste ao clnico permite que este avalie a maior ou menor eficcia de determinada droga contra um agente infeccioso, o que de grande valia, visto que diferentes espcies bacterianas, ou diferentes cepas de uma mesma espcie, podem mostrar diferentes nveis de sensibilidade a uma mesma droga.

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Referncias Bibliogrficas
TRABULSI, L. R., Alterthum, F.; Microbiologia, 5 ed., So Paulo, Editora Atheneu, 2008. <http://www.livronline.com/servicos/gratuitos/mb1504/indice.html> 09/12/2009. <http://docs.google.com/viewer? a=v&q=cache:ioq1uy2dkG0J:www.fop.unicamp.br/microbiologia/aulas/isolamento.pdf> Acessado em 09/12/2009. <http://docs.google.com/viewer? a=v&q=cache:hjOP1Wj35e8J:www.uma.pt/gcosta/docs/microbiology/prat1a.pdf> em 09/12/2009. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA). Disponivel em
<http://users.med.up.pt/cc04-10/micropratica/micro_p_5.doc> Acessado em 09/12/2009.

Acessado

em

Acessado

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MEIOS 10/12/2009.

DE

CULTURA.

Disponivel

em

<

http://www.microbiologia.ufba.br/aulas/MEIOS%20DE%20CULTURA.doc> Acessado em