MTODOS DE DIFERENCIACIN DE ANTICUERPOS

Inmunofluorescencia Las pruebas de inmunofluorescencia se basan en que, cualquier antgeno, puede ser marcado especficamente con un fluorocromo coloreado, a travs de un anticuerpo (Ac) especfico. Cuando se irradia este elemento con luz ultravioleta o azul se hace fluorescente. Dos de los mtodos utilizados son: A. Mtodo directo En este mtodo se utiliza antisuero marcado para cada sustancia que se investigue (bacteriano, vrico o proteico); as, cuando el suero antisalmonela fluorescente se aplica a una extensin, procedente de un cultivo que contenga microorganismos del gnero Salmonella, reacciona con el antgeno homlogo, demostrndose una reaccin especfica antgeno!anticuerpo por fluorescencia de las bacterias revestidas con el anticuerpo. B. Mtodo indirecto El antisuero no se marca, sino que se emplea conjugado con suero antiglobulina fluorescente, a travs de una tcnica en dos tiempos. La extensin con la bacteria en cuestin se inunda con el suero conejo antibacteriano. Despus de 10-30 minutos, el suero que no haya reaccionado se elimina mediante lavado, tratndose a continuacin con globulina anticonejo fluorescente. Las clulas bacterianas que hayan reaccionado con el antisuero, estarn revestidas con el anticuerpo (globulina) de conejo, y en consecuencia, reaccionarn con la globulina anticonejo marcada, de tal manera que se pueden identificar por la fluorescencia.

Ultracentrifugacin Permite estudiar las caractersticas de sedimentacin de estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y biomolculas. Utiliza rotores (fijos o de columpio) y sistemas de monitoreo. Existen diferentes maneras de monitorear la sede las partculas en la ultracentrifugacin, el ms comn de ellos mediante luz Uerfresones. Radioinmunoensayo El Radioinmunoensayo es tipo de inmunoensayo o mtodo radioinmunomtrico que se basa en la formacin especfica de los complejos Antgeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los mtodos radiolgicos. La tcnica ha sido prcticamente reemplazada por el mtodo ELISA el cual mide la unin Ag-

Ac mediante colorimetras en lugar de radiometras. Casi todas las molculas pueden ser antignicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa molcula y marcarla radiactivamente. Una buena manera de provocar que una molcula sea antignica est basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune. Un coadyuvante muy usado es la albmina de suero bovino o BSA, por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie aparecern anticuerpos contra el hapteno. Ouchterlony La inmunodifusin doble de Ouchterlony es un mtodo inmunolgico sencillo y rutinariamente usado en el laboratorio clnico. Sobre una placa con gel se corta una serie de hoyos con atencin a la geometra entre un hoyo y los dems. Se coloca un extracto de clulas humanas (extradas de tejido de las amgdalas) en el pocillo del centro. Este extracto contiene un cctel de antgenos humanos naturales que se quiere obtener. El suero sanguneo del paciente es colocado luego en uno de los pocillos exteriores y la placa se deja por 48 horas para su revelado. Durante este tiempo, los antgenos de las amgdalas y los anticuerpos en el pocillo del suero migrarn de manera radial hacia afuera de sus respectivos pocillos. Al encontrarse ambos a mitad de camino y, de haber anticuerpos en contra de los antgenos toncilares, se unirn en una red de enlaces llamado complejo inmune, el cual precipita en el gel revelando una lnea blanquecina.
La precipitacin ocurre con la mayora de los antgenos, debido a que stos tienden a ser multivalente, es decir, tienen varios determinantes antignicos por molcula, al que los anticuerpos pueden enlazarse. Cada anticuerpo, a su vez, tiene por lo menos dos sitios de unin para los antgenos, de modo que se entrecruzan formando una gran matriz de agregados antgeno:anticuerpo. El precipitado que se forma al combinarse el antgeno con los anticuerpos pueden forman una lnea contnua llamada identidad completa, una lnea contnua con un espoln en un lado llamado lnea de identidad parcial, o bien dos lneas que se entrecruzan llamadas lneas de no-identidad.

Inmunoelectroforesis Procedimiento de separacin y de estudio cualitativo de las protenas humorales, sanguneas en particular. Se practica, en primer lugar, una electroforesis de zona sobre una placa de gelatina, y despus se hace difundir en la placa a lo largo de la lnea de migracin de las protenas y perpendicularmente a sta, un suero preparado antihumano o un suero preparado para reaccionar electivamente con una de las protenas plasmticas.

Los anticuerpos de este suero, cuando encuentran sus antgenos especficos, forman un precipitado linear arciforme revelador. Inmunodifusin Mtodo de dosificacin cuantitativa de los antgenos del suero sanguneo. En una placa de gelosa embebida de inmunosuero especfico se practican excavaciones de 2 cm de dimetro donde se deposita el o los sueros a estudiar. Se dejan difundir en la gelosa en cmara hmeda durante 18 horas a 4, los antgenos contenidos en el suero a estudiar . Si el anticuerpo del inmunosuero, que embebe la gelosa, corresponde a uno de esos antgenos se forma un anillo alrededor de la excavacin. La amplitud de ste, comparada con una escala patrn, permite cuantificar el antgeno.

Inmunoensayo Inmunoensayo es un conjunto de tcnicas inmunoqumicas analticas de laboratorio que tienen en comn el usar complejos inmunes, es decir los resultantes de la conjugacin de anticuerpos y antgenos, como referencias de cuantificacin de un analito (sustancia objeto de anlisis) determinado, que puede ser el anticuerpo (Ac) o un antgeno (Ag), usando para la medicin una molcula como marcador que hace parte de la reaccin con el complejo inmune en la prueba o ensayo qumico. La tcnica se basan en la gran especificidad y afinidad de los anticuerpos por sus antgenos especficos y se usan los anticuerpos monoclonales (obtenidos en el laboratorio) o de sueros policlonales (obtenidos de animales), siendo ms especficos los monoclonales. Su gran sensibilidad y especificidad permite la cuantificacin de compuestos presentes en lquidos orgnicos en concentracin reducida, del orden de nanogramos/ml o de picogramos/ml.