Biotecnologia de La Reproduccion

Transferencia de embriones
Prefacio Con la finalidad de incrementar la tasa reproductiva de la hembra bovina se desarroll la transferencia de embriones hace 20 aos. La experiencia obtenida en ese tiempo indic que el efecto de la transferencia de embriones sobre la multiplicacin de la descendencia es limitado, sin embargo permiti el desarrollo de una nueva constelacin de biotecnologas al permitir disponer de embriones en estadios tempranos durante su trnsito uterino. En la actualidad los embriones bovinos son congelados, divididos, clonados, microinyectados y cultivados in vitro durante un tiempo ms o menos prolongado. La necesidad de disponer de un gran nmero de embriones en estadios ms tempranos, durante su trnsito oviductal, motiv el estudio y desarrollo de su pro-duccin in vitro. Este libro fue escrito para mdicos veterinarios, genetistas, bilogos, estudiantes de medicina veterinaria y biologa, interesados en los fundamentos bsicos e implementacin prctica de la manipulacin embrionaria como as tambin en los actuales mtodos biotecnolgicos de la reproduccin bovina y su impacto gentico. El contenido del mismo fue dividido en tres partes para su mejor desarrollo y comprensin. La primera parte describe en detalle la informacin descriptiva, el modus operandi y los resultados obtenidos y esperables con el empleo de la transferencia de embriones. Se dio especial importancia a la descripcin y discusin de los diferentes mtodos y tcnicas como as tambin a los tratamientos ms empleados. En la segunda parte se presentan las biotecnologas asociadas que son aplicadas en la prctica y las que se encuentran an en la fase experimental. De las tcnicas aplicadas en la rutina mdicoveterinaria los autores hacen referencia a las que fueron desarrolladas o aplicadas en sus laboratorios y en los de otros autores. De aquellas sobre las que no existe an informacin suficiente en la especie bovina, se recurri a la descripcin en otras especies. En la tercera parte se hace referencia a las aplicaciones de las biotecnologas descriptas en la produccin animal, considerando estrictamente sus efectos sobre el mejoramiento gentico. Es nuestro deseo que este libro contribuya a responder a las necesidades e interrogantes de profesionales y estudiantes y con ello a desmistificar la tcnica de la transferencia de embriones y sus biotecnologas asociadas en la especie bovina.
G.A. Palma
G. Brem
Munich, enero de 1993
Biotecnologa de la Reproduccin
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Indice de autores
Indice de autores
Ricardo H. Alberio. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria, Prof. titular de la Ctedra de post-grado de Fisiologa Animal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Mar del Plata. Tcnico del Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA), Balcarce. Depto. de Prod. Animal, Unidad Integrada FCA-INTA. C.C. 276. 7620 Balcarce, Buenos Aires. Repblica Argentina. Ulrike Berg. Farmacloga, Dr. en Ciencias Naturales. Miembro del staff cientfico de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian, Munich. Lehrstuhl fr Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universitt, Mnchen. Veterinrstrae 13, 8000 Mnchen 22. Repblica Federal de Alemania. Gottfried Brem. Med. Vet., Ing. Agr., Dr. en Medicina veterinaria. Prof. titular de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, Repblica Federal de Alemania Miembro ordinario de la Academia de Ciencias de Rusia. Prof. invitado de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Budapest, Hungra. Lehrstuhl fr Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universitt, Mnchen. Veterinrstrae 13, 8000 Mnchen 22. Repblica Federal de Alemania. Jorge Cabodevila. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Prof. Adjunto de la Ctedra de Obstetricia y Ginecologa de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Centro de la Pcia. de Buenos Aires. Pinto 399, 7000 Tandil, Buenos Aires. Repblica Argentina. Annette Clement-Sengewald. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff cientfico de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Miembro cientfico del Laboratorio para la investigacin del clonado de Bavaria. Bayerische Klonierungs-forschungsgesellschaft GmbH & Co KG. Hackerstrae 27, 8042 Badersfeld. Repblica Federal de Alemania. Peter Dovc. Ing. Agr., Dr. en Ciencias Agrarias. Miembro del staff cientfico del Instituto de Produccin Animal de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, Repblica Federal de Alemania. Institut fr Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universitt Mnchen. Veterinrstre 13, 8000 Mnchen. Repblica Federal de Alemania Horst Krulich. Ing. Agr., Dr. en Ciencias Agrarias. Prof. emrito de la Ctedra de mejoramiento Animal y Director del Instituto de Produccin Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Dr. honoris causa otorgado por la Universidad de Gdll, Hungra. Dr. honoris causa otorgado por la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich, Alemania. Institut fr Tierzucht der Ludwig-Maximilians-Universitt, Mnchen. Veterinrstrae 13, 8000 Mnchen. Repblica Federal de Alemania. Gustavo A. Palma. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Prof. libre de la Ctedra de Anatoma y Fisiologa Animal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Mar del Plata, Argentina. Miembro de la carrera de investigador cientfico del Concejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET), Argentina. Miembro del staff cientfico de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Miembro cientfico del Laboratorio para la investigacin del clonado de Bavaria. Bayerische Klonierungsforschungsgesellschaft GmbH & Co KG. Hackerstrae 27, 8042 Badersfeld. Repblica Federal de Alemania.
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Transferencia de embriones
Horst Reichenbach. Med. Vet., M.Sc., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff cientfico de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Ludwig-Maximilian de Munich. Lehrstuhl fr Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-universitt, Mnchen. Hackerstrae 27, 8042 Badersfeld, Repblica Federal de Alemania. Gonzalo Rivera. Med. Vet., becario del Concejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET), Argentina. Laboratorio de Reproduccin y Lactancia (LARLAC, CONICET). CC. 855, 5500 Mendoza, Repblica Argentina. Sergio Torquati. Med. Vet. Centro Integral Baha Blanca de Inseminacin Artificial (CIBBIA). Ruta 35. Km 9,5; 8000 Baha Blanca, Buenos Aires. Repblica Argentina. Eckard Wolf. Med. Vet., Dr. en Medicina Veterinaria. Miembro del staff cientfico de la Ctedra de Produccin Animal Molecular de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad LudwigMaximilian de Munich. Lehrstuhl fr Molekulare Tierzucht der Ludwig-Maximilians-universitt, Mnchen. Veterinrstrae 13, 8000 Mnchen 22. Repblica Federal de Alemania.
Abreviaturas y smbolos
Abreviaturas y smbolos
AA ADN AMPc ADNc ARNm B Be Bp BSA Bt PT, BV CE CG Cito B CL COB COB Cov G d DMSO E E2 ec eCG EPE-HAP ES FD FF FIV FSH FSH-p GH G/L GnRH h h2 HCG HE HMG IA IETE IGFI LH LUV M Mt MC Mc MCCG MCCO
aminocidos cido desoxirribonucleico adenosin monofosfato cclico cido desoxirribunucleico complementario cido ribonucleico mensajero blastocisto blastocisto expandido blastocisto protruido bovine serum albumin, albmina srica bovina blastocisto temprano padres de toros ciclo estral clulas de la granulosa citocalasina B cuerpo lteo clulas del oviducto bovino complejo ovocito blastmero covalencia progreso gentico da dimetilsulfxido embrin estradiol clulas embrionarias equine corionic gonadotropin, gonadotrofina corinica equina extracto de pituitaria equina clula embrionaria primordial totipotente folculo dominante fluido folicular fecundacin in vitro follicle stimulant hormone, hormona folculoestimulante follicle stimulant hormone porcine, hormona folculoestimulante de origen porcino growth hormone, hormona de crecimiento, somatotrofina intervalo generacional gonadotropin realising hormone, hormona liberadora de gonadotrofinas hemi heredabilidad human corionic gonadotropin, gonadotrofina corinica humana hemi-embriones gonadotrofina menopusica humana inseminacin artificial International Embryo Transfer Society, Sociedad internacional de transferencia de embriones Insulin like growth factor I, factor de crecimiento similar a la insulina hormona luteinizante luz ultravioleta mrula mrula temprana microciruga mrula compacta medio condicionado con clulas de la granulosa medio condicionado con clulas del oviducto
Palma & Brem
Transferencia de embriones y biotecnologa
MCI MFCZ MOET MP MPM MV, KM OD OI OT pb, pB PBS PBSS P4 PCR PEG PGF2 PIV PLFR PMSG PV, KV RN RS SOTE SFB SVC STH TL TE VEM VNTR ZP
masa celular interna medio de fusin celular de Zimmermann multiple ovulation and embryotransfer, ver SOTE membrana pelcida modified Parker's medium, medio Parker modificado madres de vacas ovario derecho ovario izquierdo oxitocina pares de bases solucin fosfatada bufferada solucin fosfatada bufferada con suero progesterona polymerase chain reaction, reaccin en cadena de polimerasa polietilenglicol prostaglandina F2 produccin in vitro restrictions-fragment-large polymerase pregnancy mare serum gonadotropin, gonadotrofina srica de yegua preada padres de vacas reproduccin normal respuesta superovulatoria superovulacin y transferencia de embriones suero fetal bovino suero de vaca en celo somatotropin hormone, hormona somatotrfica tirodes lactato transferencia de embriones valor de la eficiencia de los mellizos variable numberd tandem repeats zona pelcida
Biotecnologa
BIOTECNOLOGIA EN PRODUCCION ANIMAL

A. Clement-Sengewald, G. Palma & G. Brem Introduccin La mayor intervencin del hombre en el pool gentico de los actuales animales domsticos fue a travs de la domesticacin. Ninguna otra medida productiva puede o podr afectar el componente gentico poblacional en una forma tan completa. En los comienzos de la domesticacin el hombre no produjo cambios en la reproduccin de los animales. De esta forma se mantuvo la seleccin natural. Posteriormente se observ que la reproduccin programada de los animales conduca a un aceleramiento de la seleccin. A travs del aprovechamiento de la variabilidad gentica podan criarse animales, que respondan mejor al fenotipo establecido, o sea aquellos que posean las caractersticas externas deseadas. Con el tiempo se establecieron programas de mejoramiento que no respondan solamente al deseo de una persona sino de varias y ms tarde al objetivo de agrupaciones de criadores. El empleo de la gentica poblacional como tambin de los mtodos gentico-estadsticos permiti, junto con la aplicacin de la inseminacin artificial, el desarrollo de exigentes programas de seleccin y evaluacin de la descendencia. Con el desarrollo de la biotecnologa se alcanz un nivel, en el cual es posible la manipulacin dirigida del genoma o determinados genes con mayor rapidez. Es posible adems alcanzar la manifestacin de algunas particularidades productivas, las cuales con la seleccin natural o programas de mejoramiento seran difciles de alcanzar. Las tcnicas reproductivas, mediante las cuales es posible afectar el genoma de los animales (cuadro 2), se diferencian de las tcnicas gnicas, las cuales se ocupan de los genes en forma individual (cuadro 3). Tcnicas reproductivas Las tcnicas reproductivas abarcan la inseminacin, la congelacin de semen, la micromanipulacin, la produccin in vitro, el clonado y la congelacin de los embriones. Los tratamientos hormonales de induccin y sincronizacin del celo de las hembras receptoras de semen y embriones como as tambin de las donantes de embriones, garantizan en muchos casos que las mencionadas tcnicas se cumplan con xito. La tcnica reproductiva de mayor aplicacin es la inseminacin artificial (IA) y con ella la congelacin de semen. A pesar de la resistencia presentada originalmente por razones ticas se reconoci rpidamente una de las ventajas de la IA con la disminucin de las enfermedades infecciosas transmitidas a travs de la cpula. Con la misma celeridad se observ que era posible obtener una mayor descendencia de un solo macho dividiendo el semen de un eyaculado en porciones e inseminando con las mismas varias hembras simultneamente. De esta forma es posible aprovechar el potencial de los machos en forma intensiva y mejorar as la estimacin del valor gentico de los reproductores, dado que las particularidades heredables son mejor evaluadas con un gran nmero de hijos. La conservacin de semen congelado en nitrgeno lquido posibilit su almacenamiento durante dcadas, sin que ello afecte la fertilidad del mismo. La IA juega, junto con la congelacin de semen, un rol de importancia en la produccin bovina. La inseminacin artificial en las especies ovina, porcina y equina no alcanz un significado equivalente al existente en la especie bovina. En las dos ltimas es necesario modificar an los mtodos empleados para mejorar los resultados. La tcnica de inseminacin artificial por medio de laparoscopa en la especie ovina permite actualmente obtener resultados satisfactorios, lo que abri las posibilidades del comercio internacional de semen. La transferencia de embriones es una tcnica reproductiva en constante desarrollo. Su evolucin es observable particularmente en la especie bovina. La TE asociada a la superovulacin de las donantes (captulos, II al VIII) puede aumentar considerablemente el nmero de la descendencia por donante y de esta forma multiplicar el componente gentico materno (captulo XVII). En la tabla 1 se resume el significado que tiene la transferencia de embriones actualmente en Europa. Lamentablemente se
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dispone de poca informacin de la TE en pases sudamericanos aunque las actividades y comercializacin con embriones frescos y congelados son actualmente relevantes en Argentina (cuadro 1), Brasil y Paraguay. Tabla 1: Transferencias de embriones en Europa durante el ao 1991 (8th Scientific Meeting, A.E.T.E., Lyon, 11-12 sept. 1992) Embriones por donante tiles Transferidos (n) frescos % 5 62 5 54 4 59 6 32 3 43 4 71 6 49 5 50 3 50 6 63
Pais Alemania Blgica Francia Holanda* Inglaterra* Checoslovaquia Union Sovitica* Irlanda Espaa Italia
Lavajes de donantes (n) 4170 2169 7896 2521 2141 1507 4800 979 306 1060
9 8 8 s.i. s.i. 7 10 7 7 9
Congelados % 38 46 41 68 57 29 51 50 50 37
s.i.: Sin informacin; *: registros de la misma fuente del ao 1990 Produccin de terneros por medio de transferencia de embriones durante un ao (7.917.92) en la Repblica Argentina (Memorias de la Sociedad Rural Argentina, 1992) Raza Aberdeen Angus Holando Argentino Hereford Limousin Fleckvieh Otras Total Descendencia (n) 804 704 556 129 83 121 2897
Cuadro 1:
A travs de la TE es posible aumentar el progreso gentico, porque a travs del aumento del nmero de embriones y terneros el potencial gentico de la hembra puede reproducirse y emplearse con ms eficacia. Razas y animales exticos pueden, segn las necesidades, reproducirse rpidamente. La eficiencia de los programas de seleccin y cruzamiento aumentan considerablemente con la aplicacin de la transferencia de embriones. Junto con la TE es preciso tambin mencionar la congelacin de embriones por medio del mtodo estndar y vitrificacin (captulo IX). El almacenamiento de los embriones congelados se lleva a cabo en nitrgeno lquido (-196oC). De la misma forma que el semen los embriones pueden almacenarse durante dcadas. Las ventajas que ofrece esta tcnica es una mayor eficacia y ahorro en el uso de las receptoras en un programa de TE, facilidad en el transporte de los embriones y en consecuencia la posibilidad del comercio de material gentico. De esta forma los animales nacen en el lugar de destino y se adaptan al macro- y microclima
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de la regin. La congelacin de los embriones permite la formacin de reservas genmicas en forma de bancos de embriones. Ello tiene particular importancia en la conservacin de razas en peligro de extincin, cuya produccin y mantenimiento en establecimientos ganaderos son sumamente costosos. Cuadro 2: Objetivos de las tcnicas reproductivas en el bovino
- IA y Congelacin de semen Combate y disminuye enfermedades sexuales Empleo intensivo del potencial gentico del macho y mejoramiento de la estimacin del valor gentico (prueba de la descendencia) - Sincronizacin del celo induccin de la ovulacin y el parto Facilidad en el manejo reproductivo y productivo Disminucin de la mortalidad neonatal - Superovulacin, TE, congelacin de embriones Optimizacin del potencial de la hembra Rpida reproduccin de individuos exticos o razas en peligro de extincin Formacin de bancos de reservas genmicas Facilidad en la importacin y exportacin del material gentico - Manipulacin y microciruga de embriones para la produccin de mellizos monocigotas y quimeras Aumento del nmero de animales nacidos por embrin recolectado Optimizacin de la estimacin del valor gentico Creacin de modelos de investigacin - Determinacin del sexo Seleccin del sexo de acuerdo a los objetivos establecidos - Produccin in vitro de embriones Ahorro de donantes Produccin de embriones de vacas donantes que no responden a los tratamientos superovulatorios - Clonado de embriones por medio de transferencia nuclear Variabilidad libre de recombinaciones de genotipos individuales Aumento del nmero de terneros por embrin La TE posibilit la microciruga de los embriones, con la produccin de mellizos monocigotas (captulo X) y quimeras a travs de la combinacin de mitades de embriones diferentes. Por medio de la divisin de los embriones es posible aumentar el nmero de embriones producidos en un programa convencional de TE de 0,6-0,7 a 0,9-1,2 terneros por embrin dividido. Los mellizos producidos de esta forma constituyen modelos adecuados en produccin animal e investigacin. Las pruebas llevadas a cabo con mellizos idnticos permite una mayor exactitud de la estimacin del valor gentico de los padres, dado que la varianza de los mellizos es menor que las de los hermanos enteros y medio hermanos (captulo XX). Posibilita tambin la evaluacin de la influencia ambiental sobre los reproductores; si los animales idnticos se cran en medios diferentes su condicin gentica idntica facilitar la determinacin de cada diferencia ambiental (foto 1).
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Foto 1: Mellizos monocigotas de la raza Fleckvieh producidos por medio de Micromanipulacin (BREM, captulo X) La produccin microquirrgica de quimeras puede llevarse a cabo de dos formas. En primer lugar a travs de la inyeccin de clulas en el blastocele de embriones, en este caso se espera que las clulas inyectadas tomen parte en el desarrollo del embrin. Otro mtodo es la produccin de quimeras a travs del agregado de embriones o hemi-embriones diferentes en una misma zona pelcida (figura 1). Las dos o ms mitades o embriones enteros a agregar son liberados de la membrana pelcida y posteriormente las combinaciones deseadas nuevamente transportadas a una zona pelcida comn. El nuevo embrin, producto del agregado, se organiza rpidamente y se transfiere de acuerdo con el programa convencional. Embrin I Embrin II Embrin I Embrin II
Fig. 1: Modelo de produccin de quimeras a partir de varios embriones
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Si se emplea como marcador el color de piel, la presencia de la quimera se determinar por los diferentes colores del pelaje (foto 2).
Foto 2: Quimera producida con las razas Fleckvieh y Murnau Werdenfelser (BREM, 1986) Las quimeras se emplean en la investigacin gentica bsica de mutaciones y fallas genticas dado que es posible establecer como se comportan dos lneas diferentes en un individuo y su efecto sobre el desarrollo corporal. Intensos trabajos de investigacin en los ltimos 10 aos hicieron posible la produccin in vitro (PIV) de embriones (captulo XI) y de la misma forma su cultivo hasta estadios transferibles en condiciones convencionales. Las ventajas de la PIV de embriones son numerosas: disminucin del costo de los embriones, disponibilidad de embriones en estadios tempranos de desarrollo a bajos costos, dado que con la produccin in vivo la recoleccin de los embriones del oviducto se lleva a cabo por medio de ciruga. El nmero de donantes pude reducirse. La PIV de embriones puede ser utilizada adems en aquellos casos en los cuales una vaca no puede ser sometida a los lavajes convencionales o debe ser sacrificada. Esto es particularmente importante cuando se trata de animales de alto valor gentico como as tambin razas en peligro de extincin (foto 3).
Foto 3:
Ejemplar de la raza Murnau Werdenfelser en peligro de extincin, obtenido por medio de la produccin in vitro de embriones (BERG, captulo XI)
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Hace pocos aos se emplea la tcnica de transferencia nuclear en la produccin de clones, esto es, la posibilidad de producir varios embriones genticamente idnticos (captulo XII). Con ayuda del clonado es posible transferir algunos embriones para probar los animales nacidos mientras otros tantos permanecen congelados. Si el resultado de las pruebas es positivo los embriones pueden descongelarse emplearse como donantes de blastmeros en un reclonaje. En teora se dispone de un nmero ilimitado de ncleos para nuevos reclonados. Las aplicaciones de esta tcnica son interesantes como numerosas: las pruebas de evaluacin con estos animales es ms exacta por la menor variabilidad gentica de los clones, posibilitando una evaluacin ms precisa de las influencias ambientales. Ahorra animales de experimentacin y de prueba (por ejemplo, descendencia) frente a aquellos con un menor vnculo familiar. Con la multiplicacin de animales de alto valor gentico puede acelerarse el progreso gentico. Adems es posible destinar un embrin para diagnosticar el sexo del clon, lo que permite seleccionar los animales producidos tambin por su sexo.
Tcnicas gnicas Las tcnicas gnicas conocidas tambin como de ingeniera gentica incluyen el clonado de genes, el anlisis de los mismos para el diagnstico de determinadas variantes gnicas, que llevan consigo particularidades positivas o negativas y la transferencia gnica (Cuadro 3). Cuadro 3: Objetivos de las tcnicas gnicas en produccin animal
- Produccin gnica de productos a travs de la transformacin de clulas de levaduras, de bacterias o de animales mamferos con un ADN recombinante in vitro - Formacin de un banco de genes para la conservacin de material gentico - Modificacin gnica de los microorganismos del rumen con el objeto de alcanzar una digestin ms eficiente y la disposicin endgena de producir componentes metablicos esenciales - Mtodos analticos (Anlisis gnico) Ayuda en la orientacin de anlisis gnicos posteriores Estudio de la relacin entre marcadores ADN e importantes caractersticas productivas - Diagnstico Estudio gentico y diagnstico de fallas genticas Determinacin de variantes gnicas definidas para caractersticas deseadas Determinacin de la identidad de la ascendencia de animales reproductores ("impresin digital ADN") - Transferencia de genes Mejoramiento de la calidad de productos animales Produccin de animales resistentes a enfermedades Mejora de la eficiencia productiva Produccin de protenas (Gene Farming) En la tcnica de produccin gnica de sustancias por medio de la transformacin de clulas de levaduras, de bacterias o de mamferos se introduce un ADN recombinante en las clulas a fin de capacitarlas en la produccin de protenas. De esta forma pueden producirse hormonas, vacunas y otras sustancias en forma idntica a la natural, pura y a bajos costos.
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El empleo de microorganismos ruminales modificados gnicamente permiti reducir el nivel de hidrlisis de nitrgeno, la protelisis y la produccin de lactato regulando la relacin de acetato, propionato y butirato. A travs de los organismos ruminales modificados genticamente se espera una digestin ms eficiente y una mejora de la disponibilidad de aminocidos y vitaminas. Este mtodo de tcnica gnica se encuentra an en la fase de prueba y sometido a discusin sobre su libertad de aplicacin, dado que los microorganismos del rumen son liberados tambin en el ambiente. El anlisis genmico tiene el objetivo de describir una especie animal en forma progresiva y completa con ayuda de mtodos celulares y gnicos. El mismo pretende identificar los genes y analizar sus secuencias de nucletidos para aclarar finalmente el modo de efecto de genes o complejos de ellos (captulo XV). Contrariamente a la especie humana, sobre la cual se discute el conflicto tico de analizar la totalidad del genoma, ese aspecto no juega rol alguno en produccin animal. Un anlisis completo significa, sin embargo, costos y esfuerzos muy grandes, razn por la cual slo se llevan a cabo anlisis parciales. Los conocimientos obtenidos en la especie humana, ms avanzados que en otras especies, convierten a la primera en una modelo adecuado para el anlisis del genoma de los animales de inters zootcnico. Una vez identificado el gen deseado pueden buscarse las variantes naturales del mismo y emplear los animales portadores en programas de mejoramiento. El nmero de genes identificados en animales de inters productivo no supera en la actualidad los 100. En el hombre se identificaron hasta ahora ms de 3000 genes. El anlisis genmico comprende 3 reas: Mapa gnico Anlisis de acoplamiento Caracterizacin individual de genes
El mapeo gnico pretende determinar la localizacin de caractersticas heredables en los cromosomas y establecer una relacin lineal entre ellos. Entre los mtodos de mapeo se incluyen el empleo de hbridos celulares, la hibridacin in situ, la microdiseccin cromosmica y la subordinacin de una caracterstica al efecto conjunto de varios genes. Los mapas gnicos sirven de orientacin en el genoma. Cuanto ms exacto es el conocimiento de la estructura y localizacin individual de los genes, ms exacto es el reconocimiento de la totalidad del genoma. El anlisis de acoplamiento gentico pretende determinar la distancia entre dos localizaciones gnicas. En produccin animal se intenta establecer una relacin entre marcadores ADN y caractersticas de importancia productiva. De esta forma el marcador ADN se convierte en el punto de partida del segmento que contiene el gen de inters. Actualmente se dispone de dos mtodos de anlisis de acoplamiento gentico: polimorfismo del largo del fragmento de restriccin (restrictions-fragment-large-polimorphisms) PLFR y el VNTRs. El PLFR basa su actividad en la capacidad de las enzimas de restriccin de cortar una cadena de ADN slo en aquellas posiciones donde se encuentran las secuencias de bases que responden a la enzima de restriccin. Si se modifican slo los pares de bases, se originan fragmentos de restriccin de diverso largo, que pueden separase con ayuda de electroforesis en gel. Si la caracterstica en cuestin aparece en una familia, se aisla el ADN de cada uno de los miembros y con ayuda de enzimas de restriccin y una sonda de ADN se producen muestras fragmentadas. Cuando el marcador gentico se encuentra ubicado lo suficientemente cercano al segmento de ADN que codifica la caracterstica a estudiar, se heredar siempre junto con l. Esto es, estn acoplados. El segundo mtodo de acoplamiento es el conocido como "variable numberd tandem repeats" (VNTR). Estas son pares de bases muy cortas ordenadas en tandem con diferente nmero de copias y que pueden estar distribuidas en gran nmero sobre todo el genoma. La diferencia de largo se establece por medio de PLFR. La diferencia se basa en que dada la frecuencia de su presencia con este mtodo se aumenta la posibilidad de establecer un acoplamiento. El tercer campo de anlisis genmico es el de la caracterizacin individual. Genes individuales de
importancia para la produccin animal son caracterizados en su estructura de secuencia ADN a fin de establecer un cuadro exacto de los fenmenos hereditarios a nivel molecular. Un ejemplo de ello es la aracnomegalia en la raza Braunvieh europea, gen letal con un ndice endmico de 5%. Etiolgicamente se supone un defecto en los genes responsables de la produccin del colgeno. Si ese gen fuera identificado a nivel molecular podra ser evaluada su presencia en cada reproductor de forma tal de eliminar a los portadores. Con el diagnstico gnico se pretende en produccin animal reconocer variantes gnicas, que influencian en forma positiva ciertas caractersticas de inters productivo. En la actualidad existen dos mtodos diagnsticos disponibles para determinar segura y rpidamente la presencia de esas variantes gnicas: hibridacin y sonda de ADN o PCR (Polymerase-Chain-Reaction). La hibridacin consiste en el corte de la hlice de ADN en fragmentos por medio de enzimas de restriccin, los fragmentos son separados electroforticamente. Genes individuales pueden ser identificados con ayuda de una sonda gnica, dado que sta se deposita en el fragmento de ADN. PCR permite obtener de un slo fragmento de ADN varios millones de copias en un lapso de pocas horas. Estas se hacen visibles con ayuda de una minielectroforesis, ahorrando el trabajoso mtodo de hibridacin. Con ambos mtodos de diagnstico gnico pueden identificarse variantes gnicas an cuando se presentan en estado heterocigota. Un ejemplo de ello es la determinacin del sexo de embriones, que se lleva a cabo con PCR antes de la transferencia (captulo XV). El principio del fenmeno conocido como impresin digital ADN se basa en que si el genoma total de los animales fuera cortado y evaluado con diferentes pruebas se observara que ningn animal es idntico a otro, respondiendo al mismo principio de la impresin digital. A ello se lo denomina polimorfismo del lugar de corte. El mismo est determinado por fenmenos de mutacin natural y tiene como consecuencia diferentes largos de fragmentos de restriccin, lo que establece un modelo individual para cada animal. En teora puede identificarse cada animal sin riesgo de confusin. Dado que el ADN se transmite a la descendencia y las mutaciones ocurren raras veces se emplea este mtodo para la determinacin de la ascendencia, ya que los hijos portan slo fragmentos de ADN que estn presentes en los padres. La transferencia de genes (captulo XIII) se estableci como tcnica a partir de la dcada de 1980 transfiriendo, en primeras experiencias, secuencias recombinadas a ratones. A partir de 1985 se inform sobre los primeros animales domsticos transgnicos. Para la transferencia gnica es importante que cada gen sea aislado, caracterizado y recombinado con elementos reguladores adecuados. Ello ocurre gracias a la ayuda de mtodos biolgico-moleculares. La transferencia gnica debe llevarse a cabo en lo posible en estadios embrionarios tempranos, a fin de que la estructura gnica se integre en todas las clulas corporales. Por esa razn el mejor momento del desarrollo del individuo es el estadio unicelular. Para llevar a cabo la transferencia de genes existen 3 tcnicas disponibles: la microinyeccin de ADN en el proncleo de los cigotos, la transferencia a travs de vectores retrovirales y a travs de clulas totipotentes transformadas genticamente. El espectro de aplicaciones de la transferencia gnica en produccin bovina es grande. En primer lugar pueden mejorarse la calidad o la composicin de sus productos. Ejemplos de ello son: la produccin de leche libre de lactosa para aquellas personas que sufren de insuficiencia de lactasa, la mejora en la composicin crnea de la res, la produccin de animales resistentes a enfermedades, la produccin de protenas importantes para el hombre en animales. En ese "gene farming" se acoplan promotores a interesantes estructuras gnicas (factores de la coagulacin, por ejemplo) y transfieren a animales que producirn la protena deseada. Adems se pretende modificar el equilibrio dinmico entre la biosntesis y degradacin de determinados productos a travs de enzimas claves para favorecer la produccin de ciertos productos de regulacin compleja. La investigacin y desarrollo de estas tcnicas significan un esfuerzo econmico de magnitud y una inversin de tiempo muy grande. Es de esperar, sin embargo, que los resultados brindarn importantes aportes a la produccin animal.
Alberio
MANEJO DE DONANTES Y RECEPTORAS R.H. Alberio Introduccin La produccin de embriones por las donantes y la transferencia a receptoras es el trabajo bsico de la transferencia de embriones. El manejo de las donantes para maximizar la produccin de embriones y el de las receptoras para tenerlas disponibles en el momento oportuno y para que tengan una buena fertilidad, forma parte de las tareas ms importantes de la TE. La evolucin hacia un sistema de manejo eficiente toma tiempo y paciencia y vara ligeramente de situacin en situacin.
Donantes El manejo de las donantes es uno de los puntos crticos. Si estas hembras no estn reproductivamente bien y en un adecuado estado de balance nutricional el programa puede fracasar antes de haber comenzado. Slo ocasionalmente se deber trabajar con vacas que carezcan de una ptima historia reproductiva o que tengan algn problema reproductivo determinado. Estos son casos especiales que no siempre se pueden rechazar y en los cuales las probabilidades de xito son menores. En tales casos se debe prevenir al propietario sobre el mayor riesgo y el animal ser tratado en relacin con el problema detectado. El manejo de la donante debe comenzar bastante antes de entrar en el programa y en esta etapa se deber cumplir con el propietario para que comprenda y aprecie cmo debe ser manejada la vaca y cul es su responsabilidad en ello. Por ejemplo, si la vaca ir a un Centro de TE es importante sealar al propietario la necesidad de establecer un seguro para la misma como se hace con un toro cuando va a un Centro de IA. Si la vaca tiene un ternero al pie, es conveniente que el mismo sea destetado o dejado con una vaca ama. Esto es particularmente importante si la donante es trasladada a un Centro de transferencia. No slo importa por la salud del ternero sino tambin para el mejor rendimiento de la madre a quien, adems del stress del cambio se suma el de la lactancia y cuidados del ternero. Muchas vacas ciclarn en forma irregular en los dos primeros meses posparto si estn bien nutridas y luego comenzarn a ciclar ms regularmente. Otras no ciclarn mientras tengan su ternero al pie aun estando bien nutridas y esto no constituye una patologa sino que es una respuesta natural en los mamferos. Una alternativa de manejo cuando hay varias donantes con cra, es llevar a los terneros a mamar una o dos veces por da. Algunas razas requieren esto ms que otras por lo que sus necesidades se establecern en funcin del conocimiento que se tenga de la misma. Las vacas primparas o las vacas viejas representan un problema particular en estos casos. En general se debera disponer de una buena historia reproductiva de una donante antes de incluirla en un programa de TE. Muchos productores no hablarn fcilmente de sus vacas problema y un cuidadoso cuestionario permitir detectar tales situaciones. Es frecuente escuchar por ejemplo "la vaca est seca porque el ternero muri de diarrea" o "que no ha parido este ao porque fue preparada para una exposicin". Lo que no se dice es que la muerte del ternero o la exposicin han ocurrido dos o tres aos antes y que luego de ese perodo la vaca no ha quedado nuevamente gestante. Con respecto al estado nutricional, uno de los problemas importantes en TE es paradojicamente el inverso al que ocurre en la vaca de cra; es decir el de las vacas demasiado gordas. El propietario deber ser advertido que este exceso de alimentacin tiene un efecto negativo sobre la reproduccin, la lactancia y la longevidad. Indicaciones referentes a las hembras que son trasladadas al Centro de transferencia Si bien la mayora de estas observaciones aparecen como obvias, es siempre conveniente hacer un
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repaso de las mismas para asegurarse de su cumplimiento. - Al llegar la vaca al centro, se debern tomar todos los datos posibles tales como da, hora, nombre del propietario y del transportista, tipo de animal, nmero de caravana o tatuaje, etc. Se determinar el estado general del animal, presencia de golpes, lastimaduras, etc. con lo que se har un informe firmado por el transportista. - Se pesar la vaca y su peso ser registrado. - Se har una revisacin completa del animal ya que, si bien el tracto genital es de particular inters, tambin se deber determinar la existencia de problemas de locomocin, ojos, abscesos, etc. los que sern informados al propietario. - Suele ocurrir que se envan vacas preadas por descuido o por simple desconocimiento de su estado. No hacer abortar a estos animales sin consultar a su propietario. - Si la vaca se encuentra con alguna infeccin o problema especial, se establecer un tratamiento adecuado para el caso previniendo nuevamente al propietario. - Cuando las vacas van a un potrero definitivo y reciben racin, es conveniente separarlas de acuerdo a edad, tamao, estado (seca o lactando), presencia o ausencia de cuernos. La racin como nico alimento o como suplemento de la pastura ser balanceada para permitir el mantenimiento del peso o ligeras ganancias de acuerdo con la edad, condicin corporal y estado fisiolgico. Un nfasis particular debe ser puesto en lo correspondiente a la suplementacin mineral. Se debe recordar asimismo que los animales necesitan ms energa en tiempo fro y hmedo que en clido y seco. La presencia de parsitos debe ser controlada cuidadosamente, ya que su incidencia es mayor en sistemas con alta concentracin de animales. Aproximadamente cada 60 das se deber realizar un tratamiento de rutina. La revisacin y cuidados de los animales deben ser exhaustivos y en general, no se cargan en los costos de mantenimiento. Cunto tiempo se debe mantener la vaca en el sistema? En general esto es una decisin del propietario y no se la debe tomar por l, a menos que la vaca ya no produzca embriones en cantidad que justifique continuar con los tratamientos o que haya aparecido algn problema. En principio, una vaca de alto valor gentico debe permanecer el mayor tiempo posible en un programa de TE. En cuanto a la produccin de embriones en forma permanente, el tiempo de estada vara en la mayora de los casos de una vaca a otra. Habr hembras que luego de uno o dos tratamientos disminuyen su produccin y otras que la mantienen por aos. En tanto una vaca produzca terneros cuyo precio justifique los costos, sta debera permanecer en el sistema. Muchos productores se preocupan sin embargo por el retorno de la vaca al servicio luego de un tiempo. Esto es correcto si slo es necesario un nmero determinado de embriones, pero se deber tener en cuenta que al poner la vaca en servicio se perder como mnimo un ao en la produccin de embriones. En ese ao la vaca puede morir, enfermar, quedar estril o ser superada por otra vaca. Es necesario sin embargo remarcar que desde un punto de vista biolgico no hay problemas para prear vacas que han estado sometidas a TE salvo que tengan un problema reproductivo especfico. Lo nico que puede ocurrir es que una vaca mantenida por largos perodos en un programa de TE necesite mayor nmero de inseminaciones para concebir. Esto suele ocurrir cuando hay un gran apuro en dar servicio a la vaca luego de la ltima recoleccin. Pero si se espera 2 3 meses, al primer o segundo servicio concebir sin problemas. Cuando una vaca est lista para retornar a su lugar de origen, se deber hacer un chequeo clnico completo y se elaborar un informe para el propietario. Cualquier problema observado durante la estada deber ser protocolado e informado.
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Receptoras Las receptoras forman una parte esencial del programa de TE y tambin uno de los problemas ms serios. Las buenas receptoras son caras, su mantenimiento costoso y su estado de salud es crtico para el xito de la TE. Ya sea que el programa se lleve a cabo en el campo o en un Centro, la obtencin y mantenimiento de las receptoras condicionarn el xito o el fracaso del mismo. Desde el punto de vista reproductivo una buena receptora es la hembra capaz de recibir un embrin y llevarlo a trmino. Ms an, la receptora deber ser capaz de parir sin grandes dificultades y luego alimentar al ternero de manera que le permita expresar su potencial gentico. En consecuencia, deber ser de buen tamao, tanto general como reproductivamente sana y de buena capacidad lechera. Esto no parece ser tan complicado, sin embargo tanto el tamao como la produccin de leche pueden tener significados diferentes. El tamao de la receptora depender del tipo de animal (embrin) que se transferir. De acuerdo con las tendencias actuales, particularmente en las razas para carne, se busca un gran tamao de ternero con pesos al nacimiento de 40 50 kg y an ms. Por lo tanto, no se deben tener dudas de elegir hembras de gran tamao. La edad de la receptora es un aspecto importante en el cual sin embargo, no hay coincidencias entre autores. En general se difiere en el criterio s es mejor una vaquillona que una vaca que ya ha parido alguna vez. Una forma de tomar el problema que puede resumir las diferentes posiciones es la siguiente: la vaquillona permite obtener tasas de preez ligeramente superiores, sin embargo los problemas de manejo durante la gestacin, el parto y la lactancia pueden producir resultados finales inferiores a los de las vacas. El uso de vacas multparas, con historia reproductiva conocida, que garantiza en cierta manera su comportamiento futuro, sumado al hecho de tener menos problemas de parto, hacen que ste sea finalmente el animal de eleccin. Se debe recordar que el genotipo del embrin transferido es diferente al que la vaca hubiese tenido en un servicio de la propia raza. Uno de los errores ms frecuentes que se cometen al hablar de las receptoras, es relacionar su tamao con el tamao al nacimiento del embrin transferido. Mucha gente cree que a mayor tamao de la receptora, mayor tamao de la cra y viceversa. El largo de gestacin y el peso al nacimiento son determinados genticamente y poco afectados por el ambiente uterino de la receptora. Su gentica no juega ningn rol en el tamao o estructura del ternero resultado de una transferencia. Este concepto no parece tener actualmente la certeza que se le asignaba aos atrs. Si bien es cierto que la gentica de la receptora no influye en la gentica del embrin, el ambiente uterino (especialmente el espacio o tamao) parece tener una interaccin con el genotipo del feto mayor que la supuesta. Algunos trabajos con animales de laboratorio han demostrado la magnitud de esta interaccin y la misma es coincidente con observaciones empricas provenientes de trabajos en bovinos. El punto importante es no poner embriones que darn nacimiento a terneros de gran tamao en vacas que son demasiado pequeas y en general disponer de vacas grandes que minimizan los problemas y permiten expresar el potencial de crecimiento fetal. De acuerdo con nuestra experiencia bajo condiciones extensivas los resultados con vacas jvenes (primera y segunda paricin) han sido superiores a los obtenidos con vaquillonas y los problemas de parto en las primeras son casi inexistentes. El programa de alimentacin de las receptoras es vital en el xito final de la transferencia. La hembra gestar y amamantar a los terneros de mayor valor del establecimiento. Criar terneros que son mayores a los que hubiera producido y deber proveer nutrientes en forma suficiente para que se exprese el potencial gentico del ternero. Ante estas consideraciones, la receptora preada no debe ser tratada como cualquier otra vaca de cra sino, al menos, como lo son las donantes.
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Uno de los puntos crticos es dnde conseguir vacas receptoras. Lo ideal es obtenerlas del propio establecimiento con el consiguiente conocimiento de su historia reproductiva. Estas vacas sern a su vez portadoras de inmunidad a las bacterias y virus locales y la pasarn a sus cras. Su stress ser menor al haber sido criadas en el lugar. En general las tasas de preez que se obtienen en este tipo de receptoras suele superar en 10 a 15% a las obtenidas en animales recientemente incorporados. Si la situacin anterior no es posible, se debern comprar receptoras. Desde el punto de vista reproductivo, la mejor receptora es la vaca preada o la que tiene un ternero al pie. Sin embargo, estas vacas cuestan ms y tienen mayores problemas de manejo que una vaca seca. Otra alternativa es comprar vacas con preez de 90 a 120 das, hacerlas abortar y usarlas como receptoras un mes ms tarde. Si bien esta metodologa se lleva a cabo sin inconvenientes, la desconfianza que este manejo implica hace que no sea aconsejable salvo que se est muy seguro en su aplicacin. En general se tiende a comprar vacas secas o vaquillonas, es a veces una buena opcin la compra de animales lecheros de descarte por baja produccin. El manejo de los animales en estas condiciones es mucho ms simple que con las vacas con cra. La compra de vacas exige precauciones y tratamientos particulares segn los casos. Una vaca preada o con cra "habla por s sola" y no requiere muchas ms informacin. Si se compra una vaca vaca, es importante saber si tuvo o no servicio, si el mismo fue por medio de IA o natural, cunto dur, etc. ya que en cada caso el problema puede ser diferente. Otro aspecto de importancia en la compra de vacas vacas, es verificar este estado ya que es frecuente encontrar una buena proporcin de ellas en condicin gestante. Una vez conseguidos los animales, stos sern sometidos a un exhaustivo examen clnico tanto general como ginecolgico en particular. Se tomarn muestras de sangre para determinar brucelosis y cualquier otra enfermedad endmica en la regin de compra. Se proceder a la correcta identificacin de cada animal establecindose una ficha individual. Si tienen preez reciente se abortarn con prostaglandina. Se harn las vacunaciones de rutina y se desparasitarn. Debern ser alimentadas de manera tal de ganar 500 a 600 g/da. Se detectar celo dos veces al da y si una vaca no ha sido vista en celo en 25 das, ser palpada de nuevo y se proceder de acuerdo al diagnstico. La sincrona de celos entre donante y receptoras puede obtenerse de formas diferentes. Si la disponibilidad de receptoras es muy alta (feed-lot) es probable que los animales en celo en un da determinado sean suficientes para los embriones producidos ese da. Esto no es lo ms frecuente. En general se procede a utilizar diferentes esquemas de sincronizacin artificial de los celos. Esto implica en primer lugar que las hembras sean cclicas y en segundo lugar, que alrededor de slo un 70% responder al tratamiento. Los tratamientos pueden seguir la rutina clsica de doble aplicacin de PGF2 con un intervalo de 11 das o alternativas de menor costo. Ejemplo: palpar un nmero mayor del necesario, elegir aquellas con cuerpo lteo e inyectar con PGF2alfa. Esta inyeccin se har el da previo a la inyeccin de PGF2alfa que reciben las donantes ya que en stas ltimas, la presentacin de celo es ms temprana y la ovulacin se puede extender durante un perodo que puede superar las 12 h. Cada receptora podr tener tres oportunidades "buenas" de quedar gestante. Esto significa haber sido transferida correctamente con un buen embrin. Las tasas de gestacin en la primera y segunda transferencia son similares y disminuyen en la tercera oportunidad. Luego de esto la cada es alta y no justifica el mantenimiento de esta vaca. La tasa de abortos en las receptoras preadas puede ser ligeramente superior a la de vacas servidas normalmente. Por ello nunca se deber entregar una receptora sin verificar previamente su estado de gestacin. En sntesis, el manejo de las receptoras incluye la eleccin de hembras de buena calidad que sean reproductivamente aptas, que tengan un buen nivel de alimentacin y estn libres de enfermedades. Los sistemas para conseguirlas son tan variados como oportunidades aparezcan. No olvidar que las receptoras constituyen uno de los puntos clave de la TE exitosa y por ello debern ser tratadas en consecuencia.
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PROGRAMA DE TRANSFERENCiA DE EMBRIONES J. Cabodevila Introduccin La transferencia embrionaria puede ser llevada a cabo en Centros de TE o directamente en el campo. Existen opciones intermedias, por ejemplo, que las donantes se encuentren en un Centro de TE donde se efecta la recoleccin de los embriones, las receptoras en un campo cercano, donde se llevan a cabo las transferencias. La organizacin del programa de TE es diferente en cada una de estas circunstancias. En todos los casos, comienza con la seleccin de las donantes y finaliza con el diagnstico de preez efectuado a los 60 das post-transferencia. En general, la seleccin de hembras como donantes es responsabilidad del productor y al profesional le queda la opcin de aceptarlas o no despus de: 1. 2. Efectuar una anamnesis exhaustiva considerando especialmente los antecedentes de superovulacin. Llevar a cabo un examen clnico a donde se considere el estado corporal y el estado de los rganos genitales (ver planilla de anamnesis y examen clnico de donantes).
Teniendo en cuenta la variabilidad que existe en la respuesta a los tratamientos de superovulacin y la importancia econmica que tiene la sincronizacin de las receptoras en la financiacin de un programa de TE, es conveniente efectuar el mismo, con un mnimo de 3 donantes. Para ingresar a un programa de TE, las donantes seleccionadas deben cumplir los siguientes requisitos: - Tener un perodo post-parto no menor a 60 das, habiendo registrado un ciclo previo de duracin normal. - Haber transcurrido ms de 50 das de un tratamiento superovulatorio anterior. - Es conveniente que al efectuar el tratamiento la donante no se encuentre con cra al pie. Para facilitar la comprensin del programa se debe considerar en primer trmino, la sincronizacin de celos en las donantes y luego en las receptoras. Sincronizacin de celos en donantes La forma ms comn de sincronizar el celo en las donantes es mediante la administracin de PGF2alfa o sus anlogos sintticos. Otra forma, es prolongar la fase luteal de manera artificial mediante la administracin de progesterona o progestgenos. Cuando se inyecta PGF2alfa, puede ocurrir: - Que todas las donantes presenten celo inducido o natural en los prximos 5 das. - Que no todas presenten celo. En ese caso, al administrar una segunda dosis de PGF2alfa 11 das despus, todas las donantes estarn en fase luteal. Luego de la presentacin del celo natural o inducido (da 0 -cero-), el tratamiento de superovulacin puede comenzar indistintamente entre los das 8 y 12 del ciclo estral. Es decir que, la induccin puede comenzar en el mismo momento en aquellas donantes en las que la diferencia entre sus das 0 no sea mayor de 4 das. En el cuadro 1 se presenta un programa de TE donde la sincronizacin de celos entre donantes y receptoras se lleva a cabo con PGF2 y la induccin a la superovulacin con FSH-p. La sincronizacin de celos en las donantes puede efectuarse tambin mediante el empleo de distintos dispositivos con
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progesterona o progestgenos (PRID), esponjas intravaginales, implantes subcutneos (MAPLETOFT, 1987) o directamente inyectando diariamente progesterona durante 9 das (MAPLETOFT, 1982). La utilizacin de progesterona o progestgenos tiene la ventaja de poder comenzar el programa de TE en forma inmediata independientemente que la donante se encuentre en fase luteal.
Donantes
Receptoras
1a dosis PGF2
Da 0 (natural o inducido) 07h 5 mg FSH-p 19h 5 mg FSH-p
Da 102
Da 112
07h 4 mg FSH-p 19h 4 mg FSH-p 2a dosis* PGF2
Da 122
07h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2 19h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2
Da 132
07h 3 mg FSH-p 19h 3 mg FSH-p + deteccin de celo deteccin de celo e IA
Deteccin de celo Da 0 = celo inducido
Da 142
Da 152
IA
Recoleccin de embriones mtodo no quirrgico
Da 71
TE
Cuadro 1: Programa de TE donde la sincronizacin de celos entre donantes y receptoras se lleva a cabo con PGF2alfa y la induccin a la superovulacin con FSH-p. * La sincronizacin de celos en receptoras puede efectuarse tambin administrando una sola dosis de PGF2alfa a hembras seleccionadas, mediante palpacin transrectal, por poseer un cuerpo lteo. En el cuadro 2 se describe un programa de TE donde la sincronizacin de celos en las donantes se lleva a cabo con progesterona o progestgenos. La sincronizacin de celos en las receptoras no sufre variaciones con respecto a lo descrito en el cuadro 1. Durante el perodo de deteccin de celo en donantes y receptoras, cuadros 1 y 2, es conveniente efectuar 3 detecciones diarias (maana, medioda, tarde) empleando el mtodo visual, 30 minutos en cada oportunidad.
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Da 0 Colocacin del PRID, esponja intravaginal o implante subcutneo
Da 7
07h 5 mg FSH-p 19h 5 mg FSH-p
Da 8
07h 4 mg FSH-p 19h 4 mg FSH-p
Da 9
07h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2 retiro del PRID, esponja o implante 19h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2 07h 3 mg FSH-p
Da 10
19h 3 mg FSH-p + deteccin de celo deteccin de celo e IA IA
Da 0 = celo inducido
Da 11 Da 12
Da 18
Recoleccin de embriones mtodo no quirrgico
Cuadro 2: Programa de TE donde la sincronizacin de celos en las donantes se lleva a cabo con progesterona o progestgenos
Sincronizacin de celos en receptoras La transferencia de embriones puede efectuarse indistintamente sobre celo natural o inducido. Hay que tener en cuenta que para obtener buenos resultados de preez, el celo de las receptoras deber tener una sincronizacin no mayor a las 24 h con el de la donante, ver captulo VIII, (ROWSON y col., 1972). La sincronizacin de celos con PGF2 se describi en la Tabla 1. Cuando se efecta la administracin de una sola dosis de PGF2 a hembras seleccionadas por poseer un CL es necesario reservar un nmero mayor de receptoras por donante porque el diagnstico de CL mediante palpacin transrectal tiene una eficacia que vara entre el 71 y el 96% (FORTIN, 1989). En general, considerando que el promedio de embriones transferibles por cada donante es alrededor de 5, se sincronizan 8 receptoras por donante dado que algunas deben ser descartadas antes de efectuar la transferencia por razones diversas: quistes ovricos, celos anovulatorios, imposibilidad de cateterizar la crvix.
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La donante presenta celo generalmente 48 h post primera administracin de la PGF2alfa. Se efectan 2 inseminaciones, la primera a las 8-12 h del comienzo del celo y la segunda IA, 12 h despus de la primera. En cada IA, se utiliza una dosis de semen de ptima calidad. Cuando la donante no presenta celo, la decisin a tomar depender de cada situacin en particular. Hay que tener presente que las donantes que sufren un desfasaje en la presentacin del celo o que directamente no presentan celo generalmente tienen una respuesta superovulatoria pobre o nula. Toda la informacin relacionada con donantes y receptoras se anota en las planillas respectivas. Luego de la transferencia, en las receptoras se controla el no retorno. A los 14 das post-transferencia puede extraerse una muestra de sangre para efectuar un dosaje de progesterona en plasma. Finalmente, a los 60 das post-transferencia se hace la palpacin transrectal. Manejo de la hormona El FSH-p se diluye en solucin fisiolgica estril (la relacin 1 mg = 1 ml, es la ms prctica) y se conserva refrigerada o congelada. Es conveniente fraccionarla de manera tal que la totalidad de la hormona descongelada sea utilizada en el mismo momento. Caso contrario hay que refrigerarla sin volver a congelarla. La hormona debe ser descongelada o calentada a temperatura ambiente.
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PROTOCOLO DE SUPEROVULACION DONANTE N : .......................... PROCEDENCIA: ...................... FECHA LTIMO CELO: ................ OBSERVACIONES ................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................. .................................................................................................................................................................. SUPEROVULACION: DILUCION: ....................................... ESQUEMA DE TRATAMIENTO: .................................................................................................................................................................. ................................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................... ..................................................................................................................................................................... FECHA DEL CELO: ...................... INSEMINACION ARTIFICIAL: 1o I.A.: 2o I.A.: OBSERVACIONES: ....................................................................................................... ............................................................................................................................................... TACTO PREVIO: OVARIO DERECHO OVARIO IZQUIERDO ........................................... ........................................... HORA: ............... DROGA: .................................... RAZA: ........................................ EDAD: ........................................
FOLICULOS: ............................................. CUERPOS LUTEOS: .................................. RECUPERACION DE EMBRIONES: DIA: ........
OBSERVACIONES: ....................................................................................................... . ............................................................................................................................................ EVALUACION MORFOLOGICA: EMBRIONES VIABLES: CLASIFICACION: ...........................................
EMBRIONES ANORMALES: ........................................... OVOCITOS SIN FERTILIZAR:........................................... TOTAL RECUPERADO: CELO POST-SUPEROVULACION: .................................... ........................................... firma del profesional
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TRANSFERENCIA DE EMBRIONES PROTOCOLO DE DONANTES Donante N : Raza: Edad: Peso actual: Fecha ltima participacin en Exposicin Rural: Comentarios: Nmero de partos: Fecha del ltimo parto: Para la ltima gestacin cuntos Servicios Recibi?.... Ha sido repetidora?: Fecha del ltimo celo: Fecha ltimo servicio: REVISACION CLINICA Estado Corporal: Estado de los rganos genitales en general: Estado de los ovarios en particular: O.D. Tamao: Folculos: Cuerpos Lteos: .............. .............. ............. O.I. .............. .............. .............. 1.Normal, 2.Distcico, 3.Ternero Muerto 4.Cesrea Tipo de parto: Procedencia:
Semen que se utilizar: Prueba de enhebrado con pipeta de I.A.: Fecha: Resultado:
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1. Pasa sin Dificultad 2. Pasa con Dificultad 3. No pasa
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ANTECEDENTES DE SUPEROVULACION
PRIMER TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:
SEGUNDO TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:
Total de Ovocitos y Embriones Recuperados: Embriones Transferibles: Preeces: Terneros Nacidos Vivos: Semen utilizado:
Total Ovocitos y Embriones Recuperados: Embriones Transferibles: Preeces: Terneros Nacidos Vivos: Semen utilizado:
TERCER TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:
CUARTO TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:
Bibliografa FORTIN, M. 1989. Sincronizacin de celos en bovinos con prostaglandinas. Aspectos prcticos. CABIA, 15: 29-39. MAPLETOFT, R. 1982. Superovulation and recovery of ova from the bovine. Proc. Owners. Managers Workshop IETS, 37-50. MAPLETOFT, R.1987. Sincronization of donor cows and recipients. XI Jornadas de Reproduccin Animal del CIAVT. Venado Tuerto, Pcia. de Santa Fe. ROWSON, L., LAWSON, R., MOOR, R., BAKER, A. 1972. Egg transfer in the cow: Synchronization requirements. J. Reprod. Fert. 28: 427-431.
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Rivera
REGULACION NEUROENDOCRINA DE LA FUNCION OVARICA G. Rivera Introduccin. Control de la secrecin de gonadotrofinas La secrecin de gonadotrofinas hipofisarias (LH y FSH), es el principal factor que regula la funcin ovrica. Neuronas hipotalmicas especializadas (decapeptidrgicas), producen y secretan la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), que controla la funcin hipofisaria. A su vez, otros sistemas de neuronas (catecolaminrgicas y opioidrgicas) integran la informacin del medio externo (luz, temperatura, olores, interacciones sociales) e interno (concentracin de esteroides), y convergen sobre la neurona decapeptidrgica para regular su funcin (KALRA y KALRA, 1984). La GnRH es secretada en forma de pulsos discretos (CLARKE, 1988), que -va sistema porta-hipofisario- alcanzan la adenohipfisis. Los pulsos de GnRH determinan la secrecin tpica de pulsos de LH/FSH. Los esteroides ovricos afectan la secrecin de LH/FSH a travs de un mecanismo de retroaccin negativa (GOODMAN y KARSCH, 1980; CLARKE, 1988; PRICE y WEBB, 1988). La progesterona (P4) inhibe la liberacin de LH, que es secretada en pulsos caractersticos de baja frecuencia (1 c/6-8 h) y gran amplitud durante la fase luteal (RAHE, 1980). Cuando se produce la lutelisis, la concentracin de P4 en sangre disminuye y aumenta la frecuencia de los pulsos de LH. Estos, estimulan la produccin de andrgenos tecales, que son convertidos a E2 en las clulas granulosas. El E2 estimula la secrecin de pulsos de LH de alta frecuencia, pero de baja amplitud (GOODMAN y KARSCH, 1980; KARSCH, 1987). En el control de la secrecin de FSH interviene, adems de E2, la inhibina que es un pptido de origen ovrico (FINDLAY y CLARKE, 1987).
Regulacin endocrina de la funcin ovrica El ciclo estral (CE) de la vaca tiene una extensin media de 21 das. El celo dura aproximadamente 18 h y la ovulacin tiene lugar 15 h despus de la finalizacin del mismo. El CL se desarrolla y la secrecin de P4 aumenta entre el 4 y 12 da del ciclo y permanece constante hasta la lutelisis. La regresin del CL es variable y ocurre entre el 15 -20 da del CE (HANSEL y ECHTERNKAMP, 1972; LUQUE y col., 1983). Con el objeto de hacer un anlisis detallado de las interacciones endocrinas durante el CE, es conveniente dividirlo en 3 etapas (HANSEL y CONVEY, 1983): - fase folicular o de regresin luteal - fase periovulatoria - fase luteal
Fase folicular o de regresin luteal Las concentraciones de P4 en sangre, decaen abruptamente a niveles 1 ng/ml entre las 24-36 h de iniciada la lutelisis, ya sea en forma natural (DIELEMAN y col., 1986) o inducida por PGF2 (SCHAMS, 1987). La cada de las concentraciones de P4 por debajo de un determinado nivel "umbral", en presencia de concentraciones bajas de E2, elimina la retroaccin negativa sobre la secrecin de gonadotrofinas. Consecuentemente, aumenta la frecuencia de la descarga de LH y, en menor grado, la de FSH (SCHAMS, 1987). En esta fase, la hipfisis secreta aproximadamente 1 pulso de LH/FSH cada 60 min. El incremento en la frecuencia de pulsos de LH/FSH estimula el desarrollo de un folculo grande, que secreta cantidades crecientes de E2. El E2 se secreta en forma de pulsos, que son detectados en la vena cava (SCHAMS, 1987), concomitantes o inmediatamente despus de los pulsos de LH. El grado de desarrollo folicular al momento de la lutelisis determina el tiempo que transcurre hasta que un folculo completa su crecimiento y es capaz de producir cantidades suficientes de E2 como
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Regulacin neuroendcrina
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para iniciar el celo y la onda preovulatoria de LH (IRELAND y ROCHE, 1987). DIELEMAN y col. (1986) determinaron que un folculo con un dimetro <8 mm alcanza un tamao preovulatorio (20 mm) durante los 2,5 das previos a la onda de LH.
Fase periovulatoria Durante este perodo se producen importantes fenmenos: inicio del celo, onda preovulatoria de gonadotrofinas y ovulacin. El intervalo entre el inicio de la lutelisis y el comienzo del celo es de 58-60 h aproximadamente (DIELEMAN y col., 1986). Los niveles de E2 aumentan desde la regresin luteal hasta alcanzar un plateau el da previo al inicio del celo. Dicha elevacin del E2 provoca el comportamiento propio del celo (HURNIK, 1987) y desencadena la onda preovulatoria de LH. Esta, tiene una duracin de 6-10h, se inicia junto con el celo y alcanza su valor mximo (pico) 4-5 h ms tarde (RAHE y col., 1980; DIELEMAN y col., 1986). Mediante la toma de muestras de sangre c/5 min se determin que el intervalo entre pulsos de LH/FSH previo a la onda gonadotrfica es de 38-40 min (WALTERS, 1984). Durante la onda preovulatoria, tanto la descarga de LH (RAHE y col., 1980; WALTERS y SCHALEMBERGER, 1984), como la de FSH siguen un patrn pulstil (WALTERS y SCHALEMBERGER, 1984). El E2 acta mediante los siguientes mecanismos para desencadenar la secrecin preovulatoria de LH: * Aumenta la sensibilidad hipofisaria al estmulo de la GnRH (KESNER y col., 1981). * Aumenta el nmero de receptores para GnRH en las clulas hipofisarias (SCHOENEMANN y col., 1985). * Estimula la sntesis de gonadotrofinas, dado el incremento que se observa en el contenido de ARNm para estas hormonas previo y durante la onda de LH (LANDEFELD, 1985). * Aumenta el efecto "preparador" (self-primming effect) de la GnRH (KESNER y col., 1981; PADMANABHAN y col., 1981), esto es, el proceso mediante el cual la GnRH incrementa la respuesta hipofisaria a exposiciones sucesivas de esta hormona. * Establece un mecanismo a nivel hipotalmico que culmina en la liberacin de una onda de GnRH, que a su vez induce la onda de gonadotrofinas (HANSEL y CONVEY, 1983). Las observaciones de WALTERS y SCHALEMBERGER (1984) determinaron que las concentraciones de E2 disminuyen al menos durante los 60 min previos al comienzo de la onda de LH y aumentan con su iniciacin. Los mismos autores propusieron que esta disminucin en los niveles de E2 es la seal que dispara la onda de LH, al remover su efecto inhibitorio sobre el hipotlamo. Despus de la onda preovulatoria, no se detectan pulsos de LH durante 6-12h (WALTERS y SCHALEMBERGER, 1984), lo que refleja el agotamiento del contenido pituitario de esta hormona. Sin embargo, la secrecin de FSH contina y se produce un segundo pico de la misma (HANSEL y CONVEY, 1983; IRELAND y ROCHE, 1987; WALTERS y SCHALEMBERGER, 1984), que parece deberse a la remocin del feed-back negativo de la inhibina al destruirse su fuente de produccin (folculo) al momento de la ovulacin.
Fase luteal El CL se desarrolla completamente durante la primera semana post-ovulacin y la concentracin de P4 en plasma aumenta hasta alcanzar un pico al dia 10 del ciclo (HANSEL y col., 1973). Un segundo pico de E2 se produce en este momento, cuyo origen es la presencia de folculos estrgeno activos en el ovario (IRELAND y ROCHE, 1987). La secrecin de LH contina en forma de pulsos, que son menos frecuentes a medida que avanza la fase luteal (WALTERS y col., 1984). Las concentraciones elevadas de P4 determinan una pulsatilidad de LH de baja frecuencia y gran amplitud (RAHE y col., 1980). Durante la fase luteal media la frecuencia de secrecin de pulsos de FSH es mayor que la de LH
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(WALTERS y col., 1984) y aquellos son seguidos por pulsos de P4. Esto indicara que la FSH tambin es un importante estmulo para la secrecin de P4 en la vaca y que los esteroides ovricos modulan la secrecin de FSH en menor extensin que la de LH. Funcin del cuerpo lteo El cuerpo lteo ocupa una posicin central en el proceso reproductivo de los mamferos. La P4 es el producto de secrecin endocrino primario, aunque el CL secreta prostaglandinas (PG), una variedad de hormonas peptdicas y proteicas (relaxina, oxitocina, vasopresina) y en algunas especies estradiol (NISWENDER y NETT, 1988; SCHAMS y col., 1987). La P4 prepara el endometrio para la implantacin y mantiene la gestacin. Si no hay fecundacin la funcin luteal declina y se reanuda el ciclo ovulatorio, lo que indica que una segunda funcin del CL es bloquear la ovulacin. El CL est formado por dos tipos de clulas esteroidognicas; las clulas luteales grandes y las pequeas. Las primeras derivan de las clulas de la granulosa y las segundas de las clulas tecales (HANSEL y DOWD, 1986; AULETTA y FLINT, 1988). No obstante se observa una poblacin de clulas grandes que derivaran de clulas pequeas de origen tecal, dado que unen anticuerpos monoclonales dirigidos contra antgenos tecales (ALILA y HANSEL, 1986). Las caractersticas principales de cada tipo celular pueden resumirse como sigue (SMITH, 1986; AULETTA y FLINT, 1988; NISWENDER y NETT, 1988): si bien ambos tipos celulares producen P4 in vitro, las clulas pequeas son ms sensibles a la LH, poseen mayor cantidad de receptores para esta hormona y la respuesta es mediada por el sistema AMPc-adenilato ciclasa. Las clulas luteales grandes poseen menos receptores para LH (la mayor parte de los receptores son para PGF2 y E2) y producen oxitocina (OT). A diferencia de las clulas luteales pequeas, en stas la produccin de P4 sera controlada (al menos parcialmente) por el sistema Ca++ - fosfatidil inositol quinasa C. La regulacin de la funcin luteal es un proceso complejo. En ella intervienen factores trficos y lticos que estan presentes en forma concurrente durante todo el ciclo estral y por lo tanto la estimulacin o la inhibicin de la sntesis y secrecin de P4 depende del balance entre estos factores. Factores luteotrficos Numerosos estudios in vivo e in vitro han demostrado que la LH es el factor luteotrfico ms importante en la vaca (HANSEL y CONVEY, 1983; SMITH, 1986; NISWENDER y NETT, 1988). La administracin de LH in vivo prolonga la vida del CL (DONALDSON y HANSEL, 1965; HANSEL, 1967) e in vitro estimula la secrecin de P4 (HANSEL; 1967), mientras que el suero anti-LH provoca lutelisis in vivo (HOFFMAN y col., 1974). En un estudio detallado de la fase luteal (WALTERS y col., 1984), se observ secrecin de pulsos adicionales de FSH (en relacin a los de LH) que fueron seguidos por pulsos de P4. Por otra parte, se ha descrito la presencia de receptores para FSH en el CL bovino (MANSS y col., 1984). En conjunto estas observaciones demuestran que tanto la LH como la FSH ejercen una importante accin luteotrfica en la vaca. A diferencia de los animales de laboratorio, la prolactina no tiene accin luteotrfica en la especie bovina (HOFFMAN y col., 1974). Algunos compuestos derivados del metabolismo del cido araquidnico (AA) tambin tienen accin trfica sobre el CL (HANSEL y DOWD, 1986). La metabolizacin del AA (MILVAE, 1986) produce -va cicloxigenasa- 3 compuestos principales: PGI2 (prostaciclina), PGF2 y tromboxano A2. A travs de la va lipoxigenasa se generan diversos metabolitos, siendo los ms importantes los leucotrienos y las lipoxinas. La PGI2 estimula la sntesis de P4 in vivo e in vitro (MILVAE y HANSEL, 1980b). El contenido y la biosntesis de PGI2 en el tejido luteal es mayor en los estadios tempranos del CE (MILVAE y HANSEL,
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1983). Adems, la relacin PGI2/PGF2alfa como la produccin de P4 disminuyen con el envejecimiento del cuerpo lteo (MILVAE y HANSEL, 1983). La administracin de indometacina, un inhibidor de la va cicloxigenasa entre los das 4-6 del ciclo estral, reduce la secrecin de P4 y la vida del CL (MILVAE y HANSEL, 1985). La informacin precedente demuestra que la prostaciclina es un importante regulador de la funcin luteal. En forma directa, actuara sobre las clulas luteales estimulando la produccin de P4 a travs de un aumento intracelular en los niveles de AMPc (HANSEL y DOWD, 1986) indirectamente mediante su accin angiognica y aumentando el flujo sanguneo hacia el ovario (SMITH, 1986). Factores luteolticos An no se conocen exactamente los mecanismos que provocan la lutelisis ni cul es la seal que la inicia. La regresin luteal es consecuencia de una compleja interaccin entre receptores y hormonas, donde intervienen por lo menos la PGF2alfa, la oxitocina y el E2 (AULETTA y FLINT, 1988). La PGF2alfa parece ser el factor uterino endgeno que inicia la lutelisis en los rumiantes (INSKEEP y MURDOCH, 1980; NISWENDER y NETT, 1988). El tratamiento de animales intactos con inhibidores de la sntesis de prostaglandinas tales como la indometacina (TROXEL y KESLER, 1984) o la inmunizacin pasiva contra PGF2 (FAIRCLOUGH y col., 1981; COPELIN y col., 1989) bloquea la lutelisis espontnea en la vaca. ARMSTRONG y HANSEL (1959) observaron que la administracin de oxitocina entre los 2-6 d del ciclo estral provoc lutelisis y retorno al celo en vacas intactas pero no en animales histerectomizados. En aqullas con histerectoma unilateral la oxitocina indujo lutelisis slo cuando el cuerno uterino remanente era ipsilateral al ovario con CL (GINTHER y col., 1967), lo que sustenta la hiptesis de un mecanismo de transferencia tero-ovrico local. No obstante, no hay evidencias concluyentes sobre la presencia de tal mecanismo en la vaca. Si bien la administracin de OT durante la fase luteal temprana indujo un aumento en las concentraciones de PGF2 en la vena uterina y una declinacin en las de P4 en yugular, los niveles de PGF2alfa en la arteria ovrica permanecieron bajos y fueron semejantes a los observados en circulacin perifrica (MILVAE y HANSEL, 1980a). La lutelisis en la vaca es consecuencia de una interaccin entre la secrecin de OT luteal y la de PGF2alfa endometrial (AULETTA y FLINT, 1988). La OT luteal es producida por las clulas luteales grandes en el bovino (SCHALLEMBERGER y col., 1984; O'SHEA, 1987). La tasa de sntesis es mayor en la fase luteal temprana y luego se almacena, de tal forma que el contenido de OT en el tejido luteal aumenta en la fase luteal media-tarda. Al iniciarse la lutelisis la secrecin de OT se incrementa en forma paralela a los niveles de PGF2 (SCHAMS, 1987; PETER y col.1989). La PGF2alfa estimula la secrecin de OT luteal (SCHAMS, 1987) y sta a su vez, induce la secrecin de PGF2alfa endometrial (MILVAE y HANSEL, 1980a). Este mecanismo de feed-back positivo es responsable de la regresin del CL (AULETTE y FLINT, 1988). La sensibilidad del mecanismo mencionado est condicionada por el medio esteroidal endgeno. En vacas ovariectomizadas el E2 estimula y la P4 deprime la secrecin de PGF2 inducida por OT (LAFRANCE y GOFF, 1988). En vaquillonas, las concentraciones de P4 no caen por debajo de 1 ng/ml hasta 32 h posteriores a la aplicacin de PGF2 durante la fase luteal media, mientras que durante la fase luteal temprana o tarda la declinacin se produce dentro de las 24 h (BERARDINELLI y ADAIR, 1989). SILVIA y TAYLOR (1989), observaron una relacin positiva entre la magnitud de la respuesta a OT y la tasa de E2/P4 en la fase luteal temprana y tarda, pero no en la fase luteal media. Aparentemente la variacin en la respuesta a la OT est relacionada con la fluctuacin en la cantidad de sus receptores endometriales a lo largo del CE. Los receptores para OT alcanzan una concentracin mxima durante el celo, disminuyen a niveles casi indetectables durante la fase luteal media y aumentan nuevamente entre los das 18-19 del CE (SCHAMS y col., 1987). En ovejas el E2 induce la formacin de receptores para OT (Mc CRAKEN, 1984). Durante la fase luteal la P4 bloquea la acumulacin nuclear de receptores de E2 y en consecuencia, la capacidad de E2 para mantener la sntesis de receptores para OT. Cuando la accin de la P4 sobre el tero comienza a disminuir (fase
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luteal tarda), el E2 estimula la sntesis de receptores para oxitocina. Las concentraciones basales de sta interactan con sus receptores uterinos, lo que amplifica la liberacin endometrial de PGF2alfa y desencadena la lutelisis (Mc CRAKEN, 1984; SCHALEMBERGER y col., 1984; SCHAMS y col., 1987). La PGF2alfa ejercera sus efectos luteolticos a travs de los siguientes mecanismos (AULETTA y FLINT, 1988; NISWENDER y NETT, 1988): disminucin rpida del flujo sanguneo luteal, desacople del complejo receptor LH-adenilato ciclasa, y accin citotxica sobre las clulas luteales. Numerosos experimentos demuestran que el E2 es un potente factor luteoltico en la vaca (HANSEL y col., 1973). El E2 administrado en forma sistmica durante la fase luteal media provoca lutelisis (ELEY y col., 1979) y la destruccin folicular mediante irradiacin X prolonga la funcin luteal (VILLA-GODOY y col., 1981). La secrecin de PGF2 aumenta en respuesta al suministro de E2 en forma local o sistmica (TATCHER y col., 1984), lo que demuestra una interaccin entre estas hormonas durante la lutelisis en rumiantes. En relacin a la lutelisis inducida por PGF2alfa intervienen dos factores principales en la variabilidad asociada a la sincronizacin de celos: el estadio del ciclo estral al momento de la aplicacin y la dosis utilizada. BERARDINELLI y ADAIR (1989), demostraron la existencia de una interaccin entre ambos factores que puede sintetizarse as: con dosis bajas se observa una proporcin creciente de vacas en celo a medida que el estadio del CE avanza (envejecimiento del cuerpo lteo), mientras que con dosis altas la proporcin de vacas en celo es mayor, an en los estadios iniciales del ciclo y mxima en la fase luteal tarda. La confluencia de los factores mencionados explicara la variacin observada en las respuestas a los tratamientos de sincronizacin de celos con agentes luteolticos.
Crecimiento y desarrollo folicular Aspectos morfolgicos La gametognesis en la hembra incluye dos procesos: ovognesis y foliculognesis. Durante la vida fetal (50-130 d de gestacin), se produce la multiplicacin (mitosis) de las ovogonias. Aproximadamente a los 80 das de la gestacin los ovocitos inician la meiosis, detenindose el desarrollo (arresto meitico) en el estadio de dictiotene de la profase I (WASSARMAN, 1988). La meiosis se reanudar slo en algunos ovocitos, despus de una onda preovulatoria de LH en cada CE (animal adulto). La funcin primaria del folculo ovrico en mamferos es la liberacin de un ovocito apto para ser fertilizado. La foliculognesis puede ser definida como la formacin de folculos maduros, preovulatorios (de De GRAAF), a partir de una reserva de folculos primordiales (SPICER y ECHTERNKAMP, 1986). La foliculognesis comienza en la vida fetal con la formacin de los folculos primordiales. Este proceso consiste en: crecimiento del ovocito, diferenciacin de una capa de clulas granulosas (planas) y de una capa celular (teca interna) por fuera de la membrana basal (GREENWALD y TERRANOVA, 1988). Se constituye as una reserva de folculos cuyo crecimiento se encuentra detenido (nongrowing pool). Los folculos primordiales entran a la reserva de folculos en crecimiento (preantrales y antrales) por medio de un estmulo no identificado an, que parece ser independiente de la presencia de las gonadotrofinas (SCHAMS, 1987). Despus de la reanudacin del desarrollo, se forman los folculos primarios, que se caracterizan por poseer una capa de clulas granulosas cuboidales y un mayor desarrollo de la teca interna. Cuando el folculo presenta dos o ms capas de clulas granulosas cuboidales se denomina folculo secundario. Ambos, primario y secundario, son folculos preantrales. El nmero relativamente constante de folculos preantrales presentes en el ovario a travs del CE, se ha descripto frecuentemente, como una evidencia de la independencia de su crecimiento en relacin al nivel de gonadotrofinas. No obstante, diversos estudios (GREENWALD y TERRANOVA, 1988) demostraron que el nmero de folculos preantrales disminuye significativamente luego de la hipofisectoma en varias especies (rata, hamster, oveja), lo que indica que el desarrollo folicular an desde sus estadios iniciales es influenciado por las gonadotrofinas.
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El paso siguiente en la foliculognesis es la formacin del antro, por medio de la coalescencia de pequeas gotas de fluido folicular (FF) secretadas por las clulas granulosas. El nmero de folculos antrales o terciarios depende del nivel de gonadotrofinas. Un porcentaje inferior al 1% de los folculos desarrollar hasta la fase preovulatoria, mientras que el resto sufrir un proceso de regresin o atresia. La atresia puede comenzar en cualquier estadio del desarrollo y se caracteriza por: picnosis y fragmentacin de las clulas granulosas, invasin leucocitaria, prdida de contacto intercelular, aumento de la permeabilidad de la membrana basal, hipertrofia de las clulas tecales y disminucin de la secrecin de E2 (RYAN, 1981; GREENWALD y TERRANOVA, 1988). Dinmica folicular. Su importancia La produccin econmica del nmero mximo de embriones de excelente calidad es uno de los objetivos clave para el xito de los programas de transferencia embrionaria a nivel comercial. Esto tiene una estrecha relacin con la comprensin de los mecanismos que controlan el crecimiento y la maduracin del folculo y del ovocito. Los procesos recurrentes de crecimiento folicular y ovulacin, son regulados por complejas interacciones entre hormonas, factores de crecimiento y sistemas de comunicacin intercelular. La amplia variabilidad observada en respuesta a los tratamientos superovulatorios responde entre otros, a factores inherentes al animal (MAPLETOFT y MURPHY, 1987). Uno de ellos es el estadio del ciclo o "status" ovrico al momento de iniciarse el tratamiento. A continuacin se analiza la dinmica del crecimiento folicular a lo largo del ciclo estral.
Desarrollo folicular durante el ciclo estral GOODMAN y HODGEN (1983), sugirieron el uso de los siguientes trminos para describir la folculognesis: * Reclutamiento: Etapa en la que un grupo o "cohorte" de folculos adquiere la capacidad de responder a las gonadotrofinas y necesita de ellas para seguir creciendo. * Seleccin: Proceso por el cual slo "unos pocos" folculos reclutados escapan a la atresia y continan su desarrollo. * Dominancia: Es el conjunto de mecanismos por los que un folculo alcanza un tamao marcadamente superior a los dems, es responsable de la mayor parte de la secrecin de E2, puede detener el crecimiento de otros folculos y/o adquiere la capacidad de continuar su desarrollo en un medio hormonal adverso para el resto de los folculos. Existe una amplia variacin entre animales en cuanto a la distribucin de los folculos antrales a lo largo del ciclo estral. No obstante, mediante el examen histolgico se ha observado la presencia de un folculo nico (>10mm de dimetro) por par de ovarios, en la mayora de los das de un ciclo. Este folculo posee varios mm de dimetro ms que el que le sucede en tamao. Usualmente lo acompaan en la superficie ovrica, 2 a 4 folculos de 4-8mm de dimetro y 20-40 folculos de 1-3mm (IRELAND, 1987). RAJAKOSKI (1960), fue el primero en sugerir la existencia de "dos ondas" de crecimiento folicular durante el CE bovino. La primera, entre los das 3 y 12 del CE, culmina con el desarrollo de un folculo de tamao ovulatorio que generalmente sufrir atresia. La segunda, desde la mitad del ciclo en adelante, termina con el desarrollo del folculo ovulatorio. No obstante, la evaluacin estadstica de los datos que sustentan esta hiptesis ha sido cuestionada por SPICER y ECHTERNKAMP (1986), quienes propusieron un modelo de desarrollo continuo en el que la tasa de entrada de folculos al crecimiento, la tasa de crecimiento y la tasa de atresia se aceleran a medida que se acerca el momento de la ovulacin. Algunos estudios (DUFOUR, y col., 1972; MATTON y col., 1981) han determinado el recambio (turnover) folicular durante el CE in vivo, mediante la inyeccin de tinta India en el estroma que rodea a los 2 4 folculos ms grandes presentes en el ovario (mediante laparotoma). El folculo
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ms grande marcado dentro de los 3 das que preceden al celo ovul en 8/8 vaquillonas (DUFOUR, y col., 1972). Cuando la marcacin fue previa, algn otro folculo ovul, lo que indica que el folculo ovulatorio puede ser identificado confiablemente slo dentro de los 3 das previos al celo. MATTON y col. (1981), determinaron que uno de los 2 folculos ms grandes por par de ovarios presentes al da 3 del CE, persisti hasta el da 13 y desapareci hacia el da 18. De los 10 folculos ms grandes marcados el da 13, slo uno permaneci como el 2 folculo de tamao ovulatorio del CE. Estos datos refuerzan la hiptesis de las 2 ondas de crecimiento folicular propuesta por RAJAKOSKI (1960). Mediante las tcnicas mencionadas (histologa, marcacin in vivo), la mayora de las observaciones son slo puntuales (en el tiempo y en el animal), lo que dificulta la obtencin de un cuadro exacto de la dinmica del crecimiento y regresin folicular en el ciclo estral. Con el advenimiento de la tecnologa del ultrasonido (ecografa), y con ella la posibilidad de realizar un monitoreo diario sobre el mismo animal, se observ la presencia de 2-3 folculos dominantes durante el ciclo estral (PIERSON y GINTER, 1988; SAVIO y col., 1988). El primer folculo dominante, fue detectado en promedio en el dia 4 del ciclo estral y alcanz un dimetro mximo (13-16mm) hacia el da 6-7. Luego sobrellev un perodo de estabilidad relativa entre los das 6-10, y comenz a involucionar hasta no ser detectable hacia el da 15 del CE. Los folculos medianos "no dominantes" de la 1 onda cesaron su crecimiento cuando se desarroll el FD. El segundo folculo dominante fue detectado hacia el da 10 cuando fue ovulatorio (KNOPF y col., 1989) 12 cuando no lo fue (SAVIO y col., 1988). En este caso regres y no pudo ser identificado hacia el da 19 del ciclo. El tercer folculo dominante (ovulatorio) fue identificado en promedio el da 16, y alcanz su tamao mximo el da 21. El segundo folculo dominante ovul en los ciclos de duracin ms corta (GINTER y col., 1989), lo que sugiere que el momento en que se produce la regresin del cuerpo lteo, determina la presencia de 2 3 FD durante el CE. SAVIO y col. (1988), observaron que la tasa de crecimiento fue mayor para el primero y tercero de los folculos dominantes, lo que implicara que durante la fase luteal media la velocidad de crecimiento disminuye probablemente debido al feed-back negativo de P4 sobre las gonadotrofinas. Este momento quizs sea el de mayor dificultad para estimular el crecimiento folicular, lo que tendra implicancias en las respuestas a los tratamientos superovulatorios iniciados en dicho perodo. Secrecin de E2 durante el ciclo estral Los cambios en la concentracin de E2 en cada vena ovrica durante un CE, constituyen el mejor marcador endocrino para describir los procesos de seleccin y dominancia (IRELAND y ROCHE, 1982). En las especies mono-ovulatorias, la produccin de E2 simtrica es indicativa del proceso de seleccin, mientras que la secrecin asimtrica de E2 lo es de la fase de dominancia. Algunas evidencias indican que un folculo nico es responsable de la mayor parte del E2 secretado durante el CE. Un folculo estrgeno-activo, que posee varios mm ms de dimetro que el que le sigue en tamao, est presente durante el estro, otro durante la fase luteal temprana y otro en la fase luteal media (31). Estos folculos tienen concentraciones de E2 ms altas que las de P4 y andrgenos (E2/P4+A) en el FF. En cambio, los folculos 6 mm de dimetro que acompaan a los anteriores, son estrgeno-inactivos (atrsicos) puesto que las concentraciones de P4+A son mayores que las de E2 en su fluido folicular. Los folculos ms grandes secretaron 500-1000 veces ms de E2 que los pequeos cuando fueron removidos e incubados in vitro (STAIGMILLER y ENGLAND, 1982). A lo largo del ciclo estral se producen 3 picos de E2, tanto en circulacin perifrica como en venas ovricas, que son coincidentes con los perodos de dominancia folicular (IRELAND y ROCHE, 1987). Modelo para la foliculognesis durante el ciclo estral (IRELAND y ROCHE, 1982; IRELAND, 1987) Durante el CE se suceden perodos recurrentes de crecimiento y atresia folicular (turnover)
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independientemente de la presencia o ausencia de progesterona. La FSH desempea un papel fundamental en el proceso de reclutamiento folicular, en tanto que niveles basales de esta hormona son suficientes para permitir el crecimiento de una "cohorte" de folculos de 4-8 mm y luego el desarrollo de un folculo dominante. Este, suprime el crecimiento de los otros folculos medianos y grandes que lo acompaan (atresia). Los folculos dominantes que desarrollan en presencia de un CL activo (primero en ciclos c/2 folculos dominantes y segundo en ciclos c/3 FD) tambin sufrirn atresia, debido a la ausencia de un patrn pulstil apropiado de LH capaz de estimular la sntesis de andrgenos y en consecuencia de estrgenos, suficientes como para desencadenar una onda de LH. El FD (no atrsico) presente al momento de la lutelisis, recibir una frecuencia de pulsos de LH adecuada (1 c/40-60 min) que estimular su maduracin final, la secrecin de E2, la descarga preovulatoria de LH y la ovulacin. Las etapas de seleccin y dominancia constituyen un proceso que involucra 3 componentes: * Capacidad de respuesta del folculo preantral a las gonadotrofinas: determinado por el nmero de clulas granulosas y/o tecales o bien por la cantidad de receptores para gonadotrofinas. * Sntesis y secrecin de factores inhibitorios por el folculo dominante: se ha demostrado que el folculo produce factores hormonales y no hormonales que pueden controlar la seleccin modulando la respuesta a las gonadotrofinas. As, el folculo dominante inhibe el desarrollo de los otros folculos que lo acompaan, pero no su propio desarrollo. Uno de los factores implicados es la PRF (protena regulatoria folicular), que bloquea la actividad aromatasa de las clulas granulosas in vitro. En la fase de dominancia, el folculo secreta cantidades elevadas de protena regulatoria, que inhibira la sntesis de E2 en los folculos no dominantes y provocara su atresia. * Establecimiento de un sistema feed-back entre el folculo dominante y la hipfisis: el FD posee en el fluido folicular concentraciones de inhibina y E2 marcadamente superiores a las de otros folculos. Un sistema de feed-back negativo largo clsico se establece entre el folculo dominante y la hipfisis a travs del cual disminuyen los niveles perifricos de FSH, lo que bloquea el reclutamiento de nuevos folculos.
Mecanismos de accin de las gonadotrofinas Los mecanismos de accin de las gonadotrofinas sobre las clulas granulosas y tecales han sido revisados ampliamente (RICHARDS, 1980; IRELAND y ROCHE, 1982; NISWENDER y NETT, 1988). Las clulas granulosas de los folculos preantrales poseen receptores p/FSH, mientras que los receptores p/LH slo aparecen cuando se forma el antro. En cambio, las clulas tecales poseen receptores p/LH desde el estadio preantral, pero nunca desarrollan receptores p/FSH. Durante la foliculognesis, la FSH induce la sntesis de sus propios receptores y luego los de LH en las clulas granulosas. La teora denominada "dos clulas, dos gonadotrofinas" (ERICKSON y col., 1985), es la que mejor explica la biosntesis de esteroides en el ovario. Las gonadotrofinas se unen a sus sitios receptores y activan el sistema de respuesta adenilato ciclasa-AMPc. La adenilato ciclasa posee una subunidad regulatoria (prot G) que es activada por nucletidos de guanina. Posee adems, una subunidad cataltica que metaboliza ATP a AMPc cuando est unida a la prot G. Como resultado del incremento en los niveles intracelulares de AMPc, se produce la activacin de las proten-quinasas que estimulan la fosforilacin de enzimas esteroidognicas y en consecuencia, la sntesis de esteroides. Durante la foliculognesis las clulas de la teca responden a LH, principalmente mediante la activacin de la enzima que cliva la cadena lateral del colesterol (SCC) y las enzimas que intervienen en la biosntesis de andrgenos. Los andrgenos tecales atraviesan la membrana basal y son convertidos a estrgenos (sistema aromatasa) en las clulas granulosas. El desarrollo de un sistema aromatasa activo, regulado por la FSH, constituye un paso clave para la iniciacin de la dominancia folicular. El E2 es un potente amplificador de los efectos de la FSH, aunque otros factores (esteroideos y proteicos) modulan la accin de las gonadotrofinas. La accin de la LH sobre las clulas luteales involucra adems
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del clsico sistema adenilato ciclasa-AMPc, un mecanismo donde interviene el metabolismo de fosfolpidos tales como el fosfatidil-inositol (HANSELy DOWD, 1986; SMITH, 1986; NISWENDER y NETT, 1988). Despus de la unin de la hormona con su receptor, una enzima cliva el fosfatidil-inositol 4-5 difosfato en diacilglicerol (DG) y trifosfato de inositol (IP3). El IP3 libera Ca++ intracelular, mientras que el DG activa una proten-quinasa Ca++ dependiente (quinasa C) que desencadena una respuesta celular. Luego de una serie de conversiones el IP3 y el DG se combinan para resintetizar el fosfatidil-inositol 4-5 difosfato. Este mecanismo parece tener mayor importancia en las clulas luteales grandes.
Otros mecanismos de regulacin Adems del control endocrino, existen mecanismos de regulacin paracrina y autocrina de la funcin ovarica (HAMMOND y col., 1988). El sistema endocrino clsico involucra a diversas glndulas endcrinas que secretan sus hormonas a la circulacin (sangunea o linftica) a travs de la que son transportadas hasta sus rganos blanco. Los mecanismos de regulacin parcrina implican la difusin local de factores de crecimiento o regulacin a las clulas efectoras. Esta forma de comunicacin intercelular tiene gran importancia durante el desarrollo embrionario, previo al establecimiento del sistema circulatorio. La regulacin autcrina es un proceso a travs del cual una clula secreta una hormona, factor de crecimiento o regulacin, para el cual posee receptores funcionales. Diversas sustancias han sido caracterizadas como hormonas intraovricas (factores de regulacin paracrina y autocrina), bajo los siguientes criterios (TSAFRIRI, 1988): a) ser encontrada en ovario sin existir evidencias de un origen extraovrico; y b) demostracin de su efecto biolgico en el ovario in situ, in vitro o en preparaciones de clulas ovricas in vitro. En el FF tanto como en extractos ovricos se han aislado numerosos moduladores de la ovognesis y de la foliculognesis (IRELAND y ROCHE, 1982; TSAFRIRI, 1988), entre los ms importantes se encuentran: inhibidor de la maduracin ovocitaria (OMI); factores de crecimiento y mitognicos: factor de crecimiento epidermal (EGF); factor de crecimiento fibroblstico (FGF); factor de crecimiento de origen plaquetario (PDGF); factores de crecimiento semejantes a insulina (IGF-I/II), protena regulatoria folicular (FRP), factores angiognicos, pptidos semejantes a GnRH, etc. Para muchas de estas sustancias se han determinado receptores en las clulas ovricas. Por ejemplo para el IGF-I, que estimula la mitosis de las clulas granulosas y la esteroidognesis in vitro (HAMMOND y col., 1988). ECHTERNKAMP y col. (1990), demostraron que las vacas genticamente seleccionadas por produccin de mellizos dicigticos, poseen concentraciones de IGF-I en suero y en el fluido folicular ms altas que las no seleccionadas. El IGF-I participa en la regulacin de la foliculognesis y es aparentemente mediador de un componente gentico responsable de las ovulaciones mltiples en la vaca.
Conclusiones El amplio desarrollo de las tcnicas radioinmunolgicas durante los ltimos 20 aos, ha posibilitado conocer detalladamente los ritmos de secrecin endocrina y las interacciones entre los componentes del eje hipotlamo-hipfisis-ovario. El establecimiento de las bases fisiolgicas del proceso reproductivo de la vaca permiti el desarrollo de diversos mtodos para el control del ciclo estral, de gran importancia para el incremento de la eficiencia reproductiva y para los programas de mejoramiento gentico. Asimismo, el estudio de la funcin ovrica mediante la ecografa y las diversas tcnicas de biologa molecular, contribuy a una mejor comprensin de la foliculognesis y de la regulacin luteal.
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A pesar de los esfuerzos realizados, an se desconocen muchos mecanismos fisiolgicos de la actividad neuroendocrina del ovario, como por ejemplo: I) II) III) IV) Factores que controlan la maduracin ovocitaria El ingreso de los folculos con crecimiento detenido al pool de folculos en crecimiento La regulacin de la secrecin de FSH, inhibina y activina Los mecanismos por los que un folculo dominante suprime el crecimiento de los dems folculos durante la fase de dominancia y V) Sistemas de comunicacin intercelular que intervienen en el desarrollo folicular, la esteroidognesis y la regresin luteal.
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Superovulacin
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SUPEROVULACION J. Cabodevila & S. Torquati Introduccin El objetivo de la transferencia de embriones es obtener a partir de progenitores de alto mrito gentico, el mayor nmero posible de descendientes utilizando el tero de receptoras de menor valor econmico para llevar la gestacin a trmino. Para lograr dicho objetivo es necesario, en primera instancia, contar con un nmero elevado de embriones transferibles. A tal fin, debe provocarse en la hembra donante una estimulacin ovrica adecuada mediante la administracin de gonadotrofinas. Esto debe complementarse con un rgimen ptimo de insemina-cin artificial, utilizando semen de muy buena calidad. DONALDSON (1984e), demostr que a pesar de que se cumpla con todos estos requisitos, la respuesta superovulatoria (RS) resulta muy variable. En un estudio retrospectivo que incluy 1263 donantes, el autor encontr que solamente el 68% de las hembras inducidas a superovular produjeron embriones transferibles. El 32% restante lo integraron: 7% de donantes en las que no se produjo estimulacin ovrica. 7% de donantes en las que no se recolectaron ni ovocitos ni embriones. 17% de donantes en las que no se obtuvieron embriones transferibles. 1% de donantes en las que no se efectu la recoleccin de embriones porque presentaron celo antes de administrrsele la prostaglandina F2 (PGF2 ) durante el tratamiento hormonal.
Estos porcentajes, con algunas variaciones, se repiten cada vez que se analiza la produccin de embriones de un nmero significativo de donantes superovuladas. A continuacin se analizan los factores responsables de la variabilidad en el RS y se aportan recomendaciones prcticas tendientes a disminuirla.
Variabilidad de la respuesta superovulatoria El anlisis se efecta en base a lo propuesto por MAPLETOFT y MURPHY, 1987) quienes consideraron por un lado, la variabilidad debida a los tratamientos hormonales y por otro, la variabilidad inherente a la donante y su medio ambiente.
Variabilidad debida a los tratamientos hormonales Gonadotrofina empleada: La induccin a la superovulacin se efecta principal-mente con gonadotrofina srica de yegua preada -PMSG- o con extractos de pituitaria porcina que generalmente se conocen como FSH-p, a pesar de que en muchos casos contienen mayor cantidad de hormona luteinizante -LHque de hormona folculo estimulante -FSH-. La PMSG, tambin denominada gonadotrofina corinica equina -eCG-, es una glicoprotena producida por los clices endometriales y se comprueba biolgica-mente entre los das 35 y 140 de gestacin. La relacin FSH/LH de esta hormona vara durante la preez. (GODKE y col., 1978; PAPKOFF, 1981) La PMSG debido a su elevado peso molecular no atraviesa el filtro renal y por lo tanto, tiene larga vida media en sangre. Esto permite inducir superovulacin en la hembra bovina mediante la administracin de una dosis nica entre los das 8 y 14 del ciclo estral (SAUMANDE y CHUPIN, 1984). Sin embargo, su permanencia prolongada en sangre provoca un crecimiento folicular disperso, con niveles altos de
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Cabodevila & Torquati
estrgenos que afectan tanto la tasa de fertilizacin como la calidad embrionaria. Adems de generar procesos inmunitarios que hacen necesario, en tratamientos posteriores, emplear una mayor dosis de hormona para lograr el mismo efecto (RAMAKRISHNA y RAMACHANDRAIAH, 1989). BINDON y PIPER, (1977) informaron la utilizacin de un suero anti-PMSG para eliminar los efectos indeseables de esta hormona, luego de inducida la superovulacin. Distintas especies han sido empleadas para obtener este suero: pavos (DHONT y col., 1978), cabras (KUMMER y col., 1980), bovinos (KIM y col., 1987; SAUMANDE y CHUPIN 1981) y ovinos (KIM y col., 1987). Asimismo, se han efectuado estudios in vitro e in vivo para determinar la efectividad de esos sueros (SAUMANDE y CHUPIN, 1987). Tambin se han hecho estudios comparando anticuerpos mono y policlonales (DIELEMAN y col., 1987; GRASSO y col., 1989; MOYAERT y col., 1985). El momento ms oportuno para administrar el suero anti-PMSG es luego de producido el pico preovulatorio de LH (ALFORAIJI y col., 1989; DIELEMAN y col., 1987); en la prctica, en el momento de la primera o segunda IA (SAUMANDE y CHUPIN, 1984; WANG y col., 1987) debido a que el suero antiPMSG reacciona en forma cruzada con las gonadotrofinas hipofisiarias y puede interferir con el pico preovulatorio de LH (DHONT y col., 1978). La mayora de los investigadores coincide en sealar que la administracin del suero anti-PMSG produce una mejora en los parmetros con los que se mide la RS, o sea: nmero de ovocitos y embriones recolectados (KUMMER y col., 1980) y nmero de embriones transferibles (DIELEMAN y col., 1987; 1989; KUMMER y col., 1980; SAUMANDE y CHUPIN, 1981). La misma puede atriburse a un incremento en las tasas de ovulacin y fertilizacin (BOLAND y col., 1981; DHONT y col., 1978; KUMMER y col., 1980). Tambin se ha comprobado en los animales tratados con suero anti-PMSG, menor duracin del celo (DHONT y col., 1978; KUMMER y col., 1980; MOYAERT y col., 1985), menor nmero de folculos mayores de 10 mm no ovulados (DHONT y col. 1978; MOYAERT y col. 1985; SAUMANDE y CHUPIN, 1981) y una mayor normalidad en la esteroideognesis folicular (KUMMER y col., 1980; MOYAERT y col., 1985). Si bien en general el suero anti-PMSG mejor los resultados de la superovulacin con esta gonadotrofina, tambin se registran casos en los que no ejerci ningn efecto beneficioso (CHUPIN y PROCUREUR, 1988; ZEITOUN y col., 1988). A los efectos de profundizar el conocimiento de los mecanismos de accin de la PMSG y del suero anti, se han efectuado recientemente numerosos estudios endcrinos y de histologa folicular (BEVERS y col., 1988; CALLESEN y col., 1989a,b; DIELEMAN y col., 1988a,b, c, d, e). Estos estudios han demostrado que la neutralizacin de la PMSG, pocas horas despus de producido el pico de LH, sincroniza la maduracin folicular y acorta el perodo en el que ocurren las ovulaciones mltiples. La FSH-p es la gonadotrofina ms empleada en el pasado y el presente de la superovulacin de hembras bovinas. El tratamiento de superovulacin con esta hormona se basa en la administracin de dos dosis diarias durante 4 5 das (LOONEY y col., 1981), comenzando en general entre los das 9 y 13 del ciclo estral (DONALDSON, 1984). ELSDEN y SEIDEL, jr. (1990) emplean tambin el dia 14 del ciclo. En el cuadro 1 se presentan resultados de tratamientos efectuados para comparar la respuesta superovulatoria a la PMSG y a la FSH-p.
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Superovulacin
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Cuadro 1:
Comparacin de la respuesta superovulatoria despus de tratamientos con PMSG y FSH-p
Gonadotrofina
Ovocitos y embriones recolectados x DS
Embriones transferibles x DS 4 3 2 41 61
Autor/es
PMSG (2500 UI) + anti PMSG FSH-p1 (28 mg) FSH-p2 (400 mg) purificada PMSG (3000 UI) FSH-p (40 mg)
5 5 4 72 92
KIM y col. (1988)
MAPLETOFT (1980)
PMSG (2500 UI) FSH-p (50 mg)
66 97
35 44
MONNIAUX (1983)
col.
PMSG (300 UI) PMSG (3000 UI) + anti PMSG FSH-p (32 mg)
1
NR NR NR 9b 5a
5a
FOOTE y col. (1989)
Burns-Biotec, Oakland, CA 2 Folltropin, Vetrepharm, Ontario NR: no registrado. Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren significativamente (p < 0,05).
En menor medida, se han utilizado extractos de pituitaria equina -EPE- o -HAP-, ovina (FSH-o) (ALBERIO y col., 1991b; DONALDSON, 1989) y una gonadotrofina aislada de la orina de mujeres menopusicas -HMG-. El extracto de pituitaria equina se administra en dosis diarias decrecientes durante 3 4 das. Fu utilizado a fines de la dcada del 70 obtenindose resultados similares a los logrados con PMSG (DANNER y col., 1979 y 1980). La utilizacin repetida induce la produccin de anticuerpos (ALWAN y col., 1988) y por consiguiente provoca una cada de la respuesta superovulatoria (YIGEZU y col., 1988). La HMG es un preparado altamente purificado de vida media muy corta. Requiere un esquema de administracin idntico al de la FSH-p (LAURIA y col., 1982a; LINDSEN y col., 1986; Mc. GOWAN y col., 1983; STORRING y col., 1976). Los resultados de superovulacin con esta hormona son comparables con los de la PMSG (ABDUL SAEED y col., 1989; NEWCOMB, 1980) y con los de la FSHp (CRITSER y col., 1982; LAURIA, y col., 1982b; MAPLETOFT y col., 1988a,b). ALCIVAR y col. (1984) observaron con la HMG un porcentaje de preez menor luego de la transferencia no quirrgica de los embriones con respecto al obtenido con la FSH-p. A fin de evitar la gran variabilidad en las propiedades bioqumicas y biolgicas que presentan las gonadotrofinas, ha sido producida una FSH bovina (FSH-b) mediante recombinacin de ADN (BELLOWS y col., 1991; CHAPPEL y col., 1975; WILSON y col., 1988). Los resultados preliminares
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obtenidos son altamente satisfactorios (LINDSELL y col., 1988). Dosis de gonadotrofinas En los tratamientos de superovulacin, la existencia de una relacin dosis-respuesta ha sido demostrada para distintas gonadotrofinas y en razas diferentes (DONALDSON, 1984b; 1985; Mc GOWAN y col., 1983; PAWLYSHYN y col., 1986; SAUMANDE y CHUPIN, 1986b; WANG y col., 1988; WU y col., 1988a; ZEITOUN y col., 1988). Esto significa que cuando la dosis se incrementa ms all de lo ptimo, el nmero de ovulaciones no aumenta y el de ovocitos fertilizados y embriones transferibles disminuye (ver Cuadro 2). Los efectos negativos de altas dosis de gonadotrofinas se relacionan con los fenmenos de sobreestimulacin ovrica que sern considerados cuando se trate la influencia de la edad de la donante. En los animales sobreestimulados, generalmente se obtiene tambin una menor tasa de recoleccin (ovocitos y embriones recolectados/cuerpos lteos palpados y observados). Se han adjudicado para ello distintas razones: a) Retencin de ovocitos en los folculos luteinizados y en los CL (MONNIAUX y col., 1983). b) Retencin de ovocitos y/o embriones en los oviductos (Mc GOWAN y col., 1985). c) Niveles muy altos de estrgenos producidos por los grandes folculos no ovulados que bloquearan la capacidad de captacin de las fimbrias con la consiguiente cada de ovocitos en la cavidad abdominal (BOOTH y col., 1975). A pesar de que en la prctica, cuando una donante no responde a la dosis inicial de FSH-p (generalmente 28 a 40 mg Armour) es comn incrementar la misma para un segundo tratamiento; el anlisis de la informacin disponible revela que este aumento de la dosis de gonadotrofina no es til en el tratamiento de donantes "problema". Adems, al incrementar la dosis de gonadotrofina aumenta el porcentaje de recolecciones en las que no se obtienen embriones transferibles (DONALDSON, 1984; ver Cuadro 3). Relacin FSH/LH de la serie de gonadotrofina: En los mamferos, la foliculognesis depende tanto de la FSH como de la LH. Las gonadotrofinas utilizadas para inducir superovulacin tienen relaciones FSH/LH diferentes. Las preparaciones hormonales producidas en un momento determinado y bajo las mismas normas de procesamiento presentan igual nmero de serie. La relacin FSH/LH de cada serie de gonadotrofina es distinta (MURPHY y col., 1984). En el caso de la PMSG, la diferencia se debe a variaciones individuales entre donantes y tambin al momento de la gestacin en el que es obtenida la hormona (GONZALEZMENCIO y col., 1978). En la FSH-p las variaciones se relacionan fundamentalmente con la dificultad para separar ambas hormonas a partir de extractos hipofisiarios (LINDSELL y col., 1989). nicamente la HMG se caracteriza por poseer cantidades equivalentes de FSH y LH que adems, permanecen constantes. Se han hecho numerosos estudios para establecer relaciones FSH/LH ptimas para la superovulacin de hembras de razas distintas, productoras de carne o leche (ALBERIO y col., 1989; 1991a; CABODEVILA y col., 1989; CHUPIN, y PROCUREUR, 1984; 1985; DONALDSON, 1987; HILL y col., 1984; 1985; LAURIA y col., 1983; LINDSELL y col., 1986a, b; MAPLETOFT, 1980; SHMIDT y col., 1988). CHUPIN y col., (CHUPIN y PROCUREUR, 1985) observaron que las donantes de razas lecheras son ms sensibles que las productoras de carne, a cantidades excesivas en la preparacin hormonal. A fin de corroborar esta informacin, ALBERIO y col. (1991) trataron vacas Holando Argentino con una FSH-p cuya relacin FSH/LH fue 10. Las mismas donantes fueron tratadas alternativamente de manera diferente: En un caso, se mantuvo la relacin FSH/LH 10 constante y en el otro, se le incorpor a la FSH-p cantidades crecientes de LH pura a partir de la 3ra. inyeccin.
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Superovulacin
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Cuadro 2:
Respuesta superovulatoria obtenida con distintas dosis de gonadotrofinas Embriones obtenidos 12 11 15 12 11 9 12 11 7 7 7 8 1 0,5b 4 1b 14 2a 15 3a 5b 19a 25a 15a 0,8 6 8 8 8 9 6 3 5 3
Hormona FSH
Dosis 24 mg 28 mg 38 mg 40 mg 50-52 mg 60 mg
Transferibles 56 66 56 56 45 34 1 0,4 31 7 1b 2 0,7a 3 6 5 0,2 0,3 3 3 3 3 3 2 NR NR NR
(%) 57 37a 45 35a 52 34a 43 42a 47 36a 40 38b NR NR NR NR 55 34 20 1 38 52 40 41 35 33 40 43 25 15
Autor/es DONALDSON (1984)
HMG
25% 50% 100%+ 200%
MAURER y col. (1985)
FSH-p
15 mg 30 mg 45 mg 60 mg
PAWLYSHYN y col. (1986)
FSH-p**
5 mg 10 mg 15 mg 20 mg 25 mg 30 mg 40 mg 1500 UI 3000 UI 6000 UI
WU y col. (1988)
ZEITOUN y col. (1988)
NR: no registrado; *: equivale a 1050 UI de actividad de FSH como de LH. **: FSH-p con bajo contenido de LH, 20 mg = 35 mg FSH standard NIH. Todas las FSHs estn expresadas en unidades Armour. Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadsticamente (p < 0,05).
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Cuadro 3:
Porcentaje de recolecciones en las que no se obtuvieron ovocitos ni embriones en relacin a la dosis de FSH-p (DONALDSON, 1984) Dosis de FSH (mg) 35 35-42 533 17%a 30%a 42 180 21%b 44%b
No de recolecciones Sin ovocitos y embriones recolectados Sin embriones transferibles
393 12%a 27%a
Los valores con letras diferentes dentro de una misma lnea difieren estadsticamente (p < 0,001). La respuesta superovulatoria en ambos tratamientos fue similar. Sin embargo, cuando se incorpor la LH se obtuvo una respuesta menor en el 50% de las donantes siendo afectada de manera significativa la tasa de recoleccin. Una cantidad excesiva de LH en la preparacin hormonal provoca: - menor tasa de ovulacin (DONALDSON y WARD, 1987; FAROOKI, 1981). - menor tasa de fertilizacin (DONALDSON, L. y col. 1986). - menor nmero y porcentaje de embriones transferibles (CHUPIN y PROCUREUR, 1984; DONALDSON y col., 1986; DONALDSON y WARD, 1987. El nmero de ovulaciones se vera disminuido al alterarse la relacin andrgenos-estrgenos que es crtica para evitar la atresia de los folculos antrales (FAROOKI, 1981). Las donantes tratadas con preparaciones hormonales con un contenido excesivo de LH presentan niveles altos de progesterona en el momento del celo. Este hecho se debera a una accin luteotrfica ejercida por la LH sobre los folculos preantrales y los grandes folculos luteinizados. El aumento en los niveles de progesterona, acelera el transporte de los ovocitos (CRISMAN, y col., 1980) y de esta manera, sera el responsable de la menor tasa de fecundacin. El menor nmero y porcentaje de embriones transferibles tambin podra estar relacionado con el desequilibrio endcrino que producen las preparaciones hormonales con una cantidad excesiva de LH (MAURER y ECHTERNKAMP, 1982; MULLINS y col., 1980). En el Cuadro 4 se presenta un resumen de tratamientos de superovulacin efectuados con FSH-p con diferentes relaciones FSH/LH. Dosis y frecuencia de administracin de la PGF2 durante la induccin Durante el tratamiento de superovulacin, independientemente de la gonadotrofina que se emplee, a las 48-72 h de haber comenzado la induccin, se debe administrar PGF2 o alguno de sus anlogos sintticos (PERRY y DONALDSON, 1984).
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Superovulacin
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Cuadro 4:
Resultados de tratamientos superovulatorios efectuados con FSH-p con diferentes relaciones FSH/LH. Ovocitos y embriones recolectados x + DS 4a 10b 5a 11 10 12 10 0,5a 3a 7b 45 43 10 6 6 6 4 6 9 8 41 92 51 Embriones transferidos n (%) 2a (52a) 6b (55) 2a (35) 34 6 7 (47 35) 0,5a(NR) 2a (NR) 5b (NR) 3 5 (68) 3 2 (62) 7 (NR) 6 (NR) 4 (76) 4 (76) 3 (69) 0,8(NR) 5 (NR) 5 (NR) 2 0,7 3 0,7 2 0,7
Relacin FSH/LH 2000 500-3000 140 8,2 100 0,1 0,5 8,7 0,02 3,9 Comercial A Comercial B 0,2 3 3,9 100 10 5 1,25 2,5 5
Autor/es DONALDSON y WARD (1987) DONALDSON y col. (1986) CHUPIN y col. (1984) ALBERIO y col. (1989) BECKERS (1987) CABODEVILA y col. (1989) SCHMIDT y col. (1988) HASLER (1983)
NR: no registrado Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadsticamente (p< 0,05).
La regresin completa del CL durante la induccin tiene vital importancia dado que influye sobre: a) el porcentaje de donantes que presentan celo -muy importante si se tiene en cuenta que la presentacin de celos- se correlaciona positivamente con el grado de estimulacin ovrica (DONALDSON, 1984). el nmero de ovocitos y embriones recolectados y
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b)
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c) el nmero de embriones transferibles (PHILLIPPO y ROWSON, 1975). La dosis, el nmero de veces en que sta se divide y la va de administracin, dependen de la PGF2 o del anlogo que se utilice. En el caso de la PGF2alfa, se ha observado que es ms importante el nmero de veces que se administra que la dosis total (DONALDSON, 1983; LOONEY y col., 1985). La informacin disponible sobre el efecto de la aplicacin intravenosa o intramuscular sobre el nmero de embriones transferibles es contradictoria (ALMEIDA, 1987; PERRY y DONALDSON, 1984). Para el Cloprostenol, la utilizacin de una dosis doble a la necesaria en un tratamiento luteoltico standard, dividida en dos aplicaciones, ha tenido un efecto beneficioso sobre la respuesta superovulatoria. Resta confirmar si el mismo se debi al empleo de una dosis mayor o a la administracin fraccionada (HUTTER y col., 1988). Sin embargo, en Francia (G.I.E. Nord Est Embryo, comunicacin personal) utilizaron la doble dosis de Cloprostenol por varios aos y en la actualidad, emplean una nica dosis sin observar variaciones en la respuesta superovulatoria. En estudios comparativos, el Delprostenate tendi a producir un nmero mayor de embriones transferibles que el Cloprostenol y el Tiaprost (CABODEVILA y col., 1989). En cambio, no se registraron diferencias entre PGF2alfa, Cloprostenol (DONALDSON, 1984f; PERRY y DONALDSON, 1984) y Fenprostaleno (PERRY y DONALDSON, 1984).
Modificaciones en los esquemas de tratamiento Las modificaciones en los esquemas de tratamiento se limitan exclusivamente a la FSH-p. Entre las innovaciones menores, se destaca la introducida por CHUPIN y PROCUREUR (1982) quienes comprobaron que la respuesta superovulatoria era mayor, administrando dosis diarias decrecientes en lugar de dosis constantes, durante los 4 5 das de tratamiento. La utilizacin de dosis decrecientes no result en una mejora en la respuesta superovulatoria cuando se utiliz FSH-p con bajo contenido de LH (MAPLETOFT, 1988). Teniendo en cuenta que el actual esquema de aplicacin de la FSH-p representa un problema desde el punto de vista prctico, se han implementado distintas modificaciones con el objeto de resolverlo: a) Reduccin en la duracin del tratamiento.
A diferencia de lo ocurrido cuando se redujo la duracin del tratamiento de 5 a 4 das, el acortamiento a 3 das produjo una disminucin de la respuesta superovulatoria (GARCIA y col., 1982; MAPLETOFT, 1988). La administracin de FSH-b durante 3 das ha permitido (BELOWS y col., 1991; JONES y WILSON, 1992) obtener una respuesta superovulatoria mayor a la que se registra con los tratamientos clsicos con FSH-p. b) Administracin de una sola inyeccin.
Otra forma de simplificar el rgimen, fue reducir las 2 dosis diarias, con 12 h de intervalo, a una sola inyeccin por da (Mc Farland y col., 1985). Se utiliz un vehculo gelatinoso a los efectos de retardar la liberacin de hormona a sangre (LOONEY y col., 1981; WARFIELD y col., 1986). A pesar de haberse obtenido resultados preliminares similares a los de los esquemas tradicionales, esta innovacin fue dejada de lado. DEMOUSTIER y col., 1988 observaron que la FSH no es detectable en plasma a partir de 10-12 h postinyeccin. A pesar de ello, recientemente se ha insistido con esta innovacin, obtenindose con una sola inyeccin diaria, una respuesta superovulatoria similar a la que se registr con un tratamiento clsico (CAMPARA, comunicacin personal).
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Superovulacin
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c)
Cambios en la va de administracin.
La FSH-p generalmente se administra por va intramuscular en solucin salina. Las modificaciones en este sentido se han orientado por un lado, a utilizar la infusin continua por va intra-arterial (GUILBAULT y col., 1987) o intravenosa (GODKE y col., 1978; WARREN y col., 1978) tratando de mantener un nivel de hormona constante en sangre y por otro, en emplear la va subcutnea bajo la forma de un implante en vehculo gelatinoso (LOONEY y col., 1982; SCHALLEMBERGER y col., 1988; WUBISHET y col., 1986b). En todos los casos, se han obtenido respuestas superovulatorias menores que con los tratamientos tradicionales. GUILBAULT (1990) cree que cuando se utilizan las vas intraarterial o intra-venosa se produce una saturacin de los receptores a FSH. BO y col. (1991) indicaron que administrando 400 mg NIH de FSH-p (Folltropin) en una inyeccin subcutnea de 20 ml el primer da de tratamiento, es posible obtener una respuesta superovulatoria comparable con la del esquema de inyecciones mltiples. Recientemente el mismo grupo de investigacin (HOCKEY y col., 1992) logr obtener 9 embriones transferibles (15 recolectados) aplicando igual dosis y de la misma forma a donantes de razas productoras de carne. Dosis mayores condujeron a una disminucin del nmero de embriones recolectados y transferibles.
Combinacin de las gonadotrofinas con otras hormonas La asociacin ms importante es la que se efecta con progesterona o progestgeno a los efectos de sincronizar los celos de las donantes que ingresan a un programa de TE. Cuando se utilizan progesterona o progestgeno y a diferencia de lo que ocurre con la PGF2 , el programa puede comenzar en forma inmediata independiente-mente de que las donantes se encuentren en fase luteal. Adems, puede inducirse la superovulacin en donantes que se encuentran en anestro post-parto (DONALDSON, 1984). Se utilizan implantes subcutneos con progestgenos y dispositivos intravaginales con progesterona (PRID) o progestgenos (esponjas) durante 9-11 das, comenzando el tratamiento de superovulacin 48 h antes del retiro del implante o del dispositivo (ALBERIO y col., 1991e); ELLINGTON y col., 1987). La informacin sobre administracin de FSH-p y PMSG en el curso de un tratamiento con progestgenos es muy abundante (PERRY y DONALDSON, 1984; SHEA y col., 1984; HILL y col., 1984; KIM y col., 1987; LUSSIER y CARRUTHERS, 1987; LOONEY y col., 1988; HERRLER y col., 1989). En muchos casos, se obtuvo una respuesta superovulatoria menor que la registrada con los tratamientos iniciados sobre ciclos naturales o inducidos con PGF2 (ALMEIDA, 1987a; 1987e; SCHALLEMBERGER y col., 1988). ALBERIO y col. (1991e) partieron de la hiptesis que la respuesta superovulatoria de los animales cclicos depende del momento del ciclo estral en que se induce la superovulacin. Para demostrarlo, colocaron esponjas intravaginales en distintos momentos del ciclo. El tratamiento superovulatorio comenz siempre 7 das despus de haber colocado las esponjas. Se utilizaron 32 mg Armour de FSHp divididos en 8 dosis decrecientes, administradas cada 12 horas en 8 dosis decrecientes, administradas cada 12 horas. Las esponjas permanecieron durante 9 das, al retirarlas se administr la 1ra. PGF2alfa. Como control, se utiliz un grupo de vacas que recibieron el mismo tratamiento superovulatorio, comenzando el da 9 del ciclo estral. El esquema utilizado y los resultados obtenidos se presentan en la tabla 1.
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Tabla 1
Respuesta superovulatoria de donantes tratadas previamente con progestgeno en diferentes momentos del ciclo estral (ALBERIO y col, 1991e) Grupo Colocacin de la esponja, dias 0-6 7-13 14-20 8-12 CL n 64 74 43 76 O/ER n 54 55 24 86 ETr n 43 45 23 55
I **** n= 12 II **** n= 12 III **** n= 12 Control IV **** n= 12
*: FSH-p; *: FSH-p + PGF2 + retiro de la esponja CL: cuerpos lteos palpados O/ER: Ovocitos y embriones recolectados ETr: Embriones transferibles Cuando la superovulacin fue inducida en el curso de un tratamiento con progestgenos la respuesta superovulatoria result inferior, especialmente cuando comenz a administrarse la FSH-p al final del ciclo estral (Grupo III). GARCIA-WINDER y col. (1988) utilizaron implantes y no administraron estradiol en el momento de su colocacin. Obtuvieron una respuesta semejante a la de los controles no implantados pero la tasa de recoleccin result inferior. Adjudicaron este hecho a desbalances endocrinos que pueden haber afectado el transporte de los gametos. Esta observacin no fue corroborada por otros investigadores (WU y col., 1988b). PATTERSON y col. (1992) superovularon donantes de raza Aberdeen Angus jvenes (alrededor de un ao de edad) provocando el celo con progestgeno administrado en forma oral. La tasa de embriones transferibles (19-29%) no fue diferente estadsticamente entre los grupos tratados con progestgeno y prostaglandina respectivamente. A pesar de la inconveniencia de superovular hembras que presentan baja fertilidad o ciclos estrales irregulares, la asociacin de progesterona o progestgenos con gonadotrofinas puede ser til para lograr en estas donantes una mayor sincrona y reducir el nmero de ovocitos sin fertilizar y embriones degenerados (ALBERIO y col., 1991e; ELSDEN y col., 1983). La aplicacin de hormona liberadora de gonadotrofinas GnRH o gonadotrofina corinica humana -HCGen hembras inducidas a superovular, tiene por objeto provocar el pico preovulatorio de LH en el momento adecuado y producir as, una ovulacin ms sincrnica. La GnRH o su anlogo sinttico buserelina, se han administrado en el perodo comprendido entre las 48 hs. pos-inyeccin de la PFG2 y las 24 h de iniciado el celo. Estos tratamientos generalmente no modificaron la respuesta superovulatoria (FAROOKI, 1981; PRADO DELGADO y col., 1984; 1989; VOSS y col., 1989). Sin embargo, WUBISHET y col., 1986a) obtuvieron una mayor tasa de fecundacin y un mayor nmero de embriones transferibles. La administracin de HCG no modific significativamente ninguno de los parmetros con los que se mide la respuesta superovulatoria (KUNKEL y col., 1987). En trabajos experimentales, la FSH-p ha sido combinada con estrgenos y la PMSG con antiesteroides ovricos. La suplementacin con estrgenos tuvo por objeto aumentar el nmero de folculos antrales pequeos que alcanzan el estado preovulatorio (SAVAGE, MAPLETOFT, 1984). Normalmente llegan a este estado nicamente los folculos que tienen un alto tenor de estrgenos lo que les permite sintetizar receptores a LH en las clulas de la granulosa, siendo ste un requisito imprescindible para el proceso
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de foliculognesis. La administracin de 17 estradiol o cipionato de estradiol, 36 h despus de la PGF2 , no mejor la respuesta superovulatoria (ELLINGTON y col., 1987; SAVAGE y MAPLETOFT, 1987). Por el contrario, el cipionato de estradiol disminuy el nmero de embriones transferibles en vaquillonas (ELLINGTON, y col., 1987). En estudios efectuados en animales hipofisectomizados se comprob que la secrecin de gonadotrofinas tiene dos mecanismos de control. Al feed-back ejercido por la inhibina se le suma un sistema local mediado por esteroides ovricos (BINDON y PIPER, 1977; CAHILL, 1984). En primera instancia, se trat de incrementar la tasa de ovulacin provocando directamente la inmunizacin activa contra estos esteroides, los resultados fueron negativos. Posteriormente, a vacas inmunizadas contra testosterona se las indujo a superovular con PMSG obtenindose en un caso, un nmero mayor de ovulaciones que en el grupo control no inmunizado (BOLAND y col., 1985) y en otro, ningn beneficio sobre la respuesta superovulatoria (G.I.E. Nord Est Embryos, comunicacin personal). Variabilidad inherente a la donante y su medio ambiente: Las diferencias individuales y de medio ambiente son la mayor fuente de variacin de la respuesta superovulatoria (SUITOYUS y VASHKAS, 1989; XU y col., 1988).
Estado del ovario en el momento del tratamiento Los folculos primordiales, formados durante la vida intrauterina comienzan paulatinamente, durante la vida reproductiva, su proceso de desarrollo. En ste, los folculos primordiales se convierten sucesivamente en preantrales (primarios o secundarios) y antrales, siguiendo luego la atresia (en la gran mayora de los folculos) o la ovulacin (IRELAND y ROCHE, 1983). El motivo por el cual los folculos primordiales comienzan a desarrollar convirtin-dose en preantrales no es conocido. La formacin del antro folicular es independiente del nivel de gonadotrofinas, sin embargo el nmero de folculos que alcanzan tal desarrollo s depende del nivel de stas. Cuando se efecta un tratamiento superovulatorio, la administracin de gonadotrofinas tiene por objeto incrementar el nmero de folculos preantrales que se convierten en antrales y reducir a su vez el nmero de folculos antrales que sufren atresia. MOOR y col. (1984) demostraron que las gonadotrofinas exgenas provocan la ovulacin de folculos antrales de tamao mediano. Una mayor proporcin de estos folculos se encuentran en los ovarios entre los das 0-5, y 9-13 del ciclo estral. Esto hizo suponer una mejor respuesta superovulatoria a tratamientos efectuados en esos das. LINDSELL y col. (1985 y 1986b) compararon tratamientos de superovulacin que comenzaron en diferentes das del ciclo estral. Observaron un nmero inferior de ovulaciones y de embriones recolectados en las que comenzaron el da 3 con respecto a las que lo hicieron el da 9 (ver Cuadro 5). Surgi entonces la hiptesis de que la respuesta superovulatoria depende de otros factores, adems del nmero de folculos receptivos a las gonadotrofinas presentes en un momento determinado del ciclo estral. Entre estos factores estaran: .- la presencia o no de un folculo dominante no ovulatorio (GRASSO y col., 1989a). .- la concentracin de hormonas esteroideas en el fluido y el nmero de receptores a las gonadotrofinas presentes en las clulas de la teca y de la granulosa (IRELAND y ROCHE, 1983). .- los niveles de aromatasa en la clulas de la granulosa (Mc. NATTY y col., 1984).
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Cuadro 5:
Produccin de embriones en vaquillonas superovuladas en cuatro das diferentes del ciclo estral (LINDSELL y col., 1986). Da del ciclo estral CL palpados x DS 3 6 9 12 9 2b 11 2ab 16 1 12 2b Ovocitos y embriones recolectados x DS 10 2 11 3 17 3 12 4 Embriones transferibles x DS 31 42 71 42
Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadsticamente (p< 0,05). El tratamiento de superovulacin puede comenzar en das diferentes dentro del perodo comprendido entre los das 9 y 13 del ciclo estral, sin que se modifique la respuesta superovulatoria (CABODEVILA y col., 1989; DONALDSON, 1984a; LERNER y col., 1986). Con el objetivo de tener un mayor nmero de folculos receptivos a las gonadotrofinas en el momento del tratamiento, se ha administrado al comienzo del ciclo estral fluido folicular o FSH-p en baja dosis. Los resultados han sido dispares (ALBERIO y col., 1991b; GUILBAULT y col., 1987; LUSSIER y CARRUTHERS, 1987a; 1989; RAJAMAHENDRAN y col., 1987; TOTEY y col., 1989; 1990; GRASSO y col., 1989b).
Efecto de la edad El efecto que tiene la edad de la donante sobre la respuesta superovulatoria ha sido muy estudiado en ganado lechero. HASLER y col. (1981) y HARRISON y col. (1982) obtuvieron un nmero mayor de embriones transferibles en las donantes de 3 a 6 aos que en las vaquillonas y las vacas mayores de 10 aos. En otro trabajo de los mismos investigadores no se repitieron tales diferencias (HASLER y col., 1981). LERNER y col. (1986) sostienen que existe una interaccin entre la edad de la donante y la dosis de gonadotrofina (ver Figura 1). Segn su interpretacin, cuando animales jvenes son tratados con dosis elevadas de gonadotrofinas, se produce una sobreestimulacin ovrica donde muchos folculos comienzan a desarrollar pero pocos son capaces de ovular y la mayora sufre luteinizacin o se atresian. Los motivos seran un insuficiente aporte sanguneo a determinados folculos debido a limitantes fsicas del ovario para albergar tantos folculos en crecimiento y por otro lado, alteraciones endocrinas con excesiva produccin de esteroides ovricos que interfieren con el propio desarrollo folicular y la ovulacin. En su trabajo, observaron que al aumentar la edad de la donante disminuyeron el nmero de ovulaciones, la tasa de fertilizacin y la calidad embrionaria. La disminucin en el nmero de ovulaciones se debera a una menor disponibilidad de folculos capaces de responder a las gonadotrofinas exgenas. Al haber menos folculos en crecimiento, los niveles de inhibina bajaran y habra un aumento de la FSH endgena que hara que en estos animales, en cualquier momento del ciclo estral, los folculos en crecimiento estuvieran en un estado de desarrollo ms avanzado que aquellos folculos en los animales ms jvenes. Al comenzar el tratamiento con gonadotrofinas, los folculos ms maduros seran los primeros en producir grandes cantidades de estrgenos. Por lo tanto, los ovocitos dentro de estos folculos, estaran expuestos a altas concentraciones de estrgenos por largos perodos antes de la ovulacin, comparndolos con los ovocitos dentro de los folculos menos
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desarrollados. Esta exposicin a alta concentracin de estradiol podra ser la causa de la disminucin en la tasa de fertilizacin y en la calidad embrionaria. El aumento de la tasa de fertilizacin y de embriones transferibles observado por estos autores cuando incrementaron la dosis de FSH-p en los animales viejos, se debera a un aumento en la proporcin de folculos relativamente menos maduros que fueron estimulados a desarrollar rpidamente. Coincidentemente con ello PATTERSON y col. (1992) obtuvieron slo un 20% de embriones transferibles (2,4/120) de vaquillonas prepberes sincronizadas con prostaglandina y superovuladas con 40 mg de FSH-p. Basado en estas observaciones, resulta claro que para lograr un alto nmero de embriones transferibles, la dosis de gonadotrofina debe ajustarse a la edad de la donante. Manteniendo una dosis de gonadotrofina constante, el nmero de ovocitos y embriones recolectados debera aumentar con la edad en los animales jvenes (debido a una disminucin en el grado de sobeestimulacin ovrica) hasta alcanzar un pico y luego disminuira con la edad en las vacas ms viejas (debido a una menor disponibilidad de folculos en crecimiento). En razas productoras de carne, se observ que con el transcurrir de los aos si bien se mantuvo el nmero de ovulaciones, la tasa de fertilizacin y la calidad embrionaria disminuyeron (DONALDSON, 1984a). Esto no pudo ser corregido aumentando la dosis de FSH-p (MOOR y col., 1984).
Figura 1: Nmero de embriones producidos en funcin de la edad de la vaca y la dosis de FSH (LERNER y col., 1986) Efecto del estado nutricional de la donante El estado nutricional de la donante puede influenciar tanto las tasas de ovulacin y de fecundacin como la viabilidad embrionaria. En la mayora de los estudios realizados, se ha considerado nicamente la importancia de la nutricin en animales inducidos a tener ovulaciones dobles para que gesten mellizos. En estos trabajos, tanto la respuesta ovrica a los tratamientos hormonales como la tasa de fecundacin no han sido modificadas por variaciones en el peso diario de 500 g (DUN, 1980). El efecto del stress nutricional sobre la viabilidad embrionaria, en los estadios preimplantatorios, no ha
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sido estudiado en el bovino pero si muy extensamente en el ovino con resultados contradictorios (CUMING y col., 1975; EDEY, 1966; 1970a, b, c; GUILBAULT y col., 1990). Teniendo en cuenta que la alimentacin con raciones con alto contenido energtico, eleva los niveles plasmticos de cido propinico y glucosa, se ha hipotetizado que este aumento de la glucemia podra estimular a los centros hipotalmicos y consecuentemente incrementar la actividad ovrica (HOWALAND y col., 1966). En base a esto, se han efectuado trabajos en animales superovulados, suplementndole la racin con monensina sdica. Se ha registrado un aumento en la ganancia de peso diaria y en el nmero de CL (ORTUNO y CARSON, 1985), sin embargo no se ha modificado el nmero de embriones transferibles (SAUMANDE y CHUPIN, 1986a). Como la respuesta result variable, queda por definir an la condicin corporal ms adecuada para lograr un mayor efecto. La suplementacin con monensina puede constituirse en una alternativa de inters en la superovulacin de vaquillonas, si se repite lo observado por (HARRISON y col., 1982) quienes lograron en los animales suplementados, una mayor respuesta a bajas dosis de FSH-p administradas para inducir ovulaciones dobles. Esto permitira utilizar tratamientos de superovulacin con dosis bajas de gonadotrofinas evitando as, los fenmenos de sobre estimulacin ovrica. Historia reproductiva: Deben considerarse aqu dos situaciones totalmente diferentes, por un lado, la TE ha demostrado ser un mtodo alternativo til para el diagnstico y tratamiento de aquellos casos en que la infertilidad no se debe a problemas intrnsecos del embrin sino al medio ambiente uterino o algn otro factor materno (BOWEN y col., 1978; MAPLETOFT, 1980). Por otro lado, existen estudios en los que se observ claramente que las donantes que ingresan a Programas de TE con antecedentes de infertilidad tienen una menor produccin que aquellas donantes consideradas sanas (GUNN y col., 1972). Los problemas de fertilidad incluyen anormalidades detectables por palpacin transrectal (quistes ovricos, adherencias e infecciones uterinas) y otras no diagnosticadas por palpacin y an por laparoscopa como por ejemplo, obstrucciones oviductales. En un estudio comparativo (HASLER, y col. 1981), se demostr que en las donantes infrtiles el nmero de embriones transferibles es menor y que los porcentajes de preez son ms bajos. Adems, una mayor proporcin de estas donantes, en el momento de efectuar la recoleccin, no produjeron embriones transferibles (ver Cuadro 6). Cuadro 6: Efecto de la historia reproductiva sobre la respuesta a la primera superovulacin (HASLER y col., 1983)
Estado reproductivo Parmetros Frtil No de animales x de ovocitos y embriones recolectados/donante x de embriones transferibles/donante Donantes sin embriones transferibles No de embriones transferidos Receptoras preadas % 666 10 Infrtil 318 6
6a
2b
14a 3707 68a
51b 604 58b
Los valores con letras diferentes dentro de una misma lnea difieren estadsticamente (p< 0,05).
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En otro estudio con resultados similares, ELSDEN y col. (1978) dividieron para su anlisis a las donantes infrtiles segn la etiologa fuese o no conocida (ver Cuadro 7). En el grupo de donantes con infertilidad diagnosticada y que se trataron previamente a la superovulacin, los autores encontraron diferencias en la respuesta segn las distintas etiologas. La respuesta en las vacas con quistes ovricos fue inferior a la de las donantes con adherencias. Las tratadas contra infecciones uterinas se colocaron en un nivel intermedio dado que la respuesta ovrica fue buena pero hubo un alto porcentaje de ovocitos sin fertilizar debido probablemente a modificaciones en el medio uterino que resultaron perjudiciales para los espermatozoides. Cuadro 7:
Superovulacin de donantes infrtiles (ELSDEN y col., 1979). Estado reproductivo Adherencias 3 8ab 4a 3a 10
Parmetros Nmero de tratamientos CL/tratamiento Embriones transferidos/tratamiento Preeces/tratamiento de preeces
Infeccin uterina 11 10a 2ab 1ab 12
Quistes ovricos 16 4b 0,2b 3 3
Los valores con letras diferentes dentro de una misma columna difieren estadsticamente (p< 0,05).
Efecto de los tratamientos sucesivos El efecto que tienen los tratamientos sucesivos sobre la respuesta superovulatoria no puede ser separado del que ejercen la edad de la donante y la dosis de gonadotrofina. La mayora de los investigadores coincide en que la respuesta superovulatoria disminuye con los tratamientos sucesivos. Algunos sostienen que el nmero de embriones transferibles declina a partir del cuarto o quinto tratamiento (BASTIDAS y RANDEL, 1987b; HERRLER y col., 1988), otros ubican esta declinacin a partir del tercer tratamiento (DONALDSON y PERRY, 1984a; WARFIELD y col., 1986). Este criterio no es compartido por DONALDSON, y PERRY, 1983) quienes no encontraron variaciones en la respuesta superovulatoria a lo largo de diez tratamientos sucesivos. Es conveniente que los tratamientos estn separados por un perodo mnimo de 60 das dado que este lapso es el que tardan los folculos primarios en alcanzar el estado preovulatorio (ALI DINAR y col., 1987; LUSSIER y CARRUTHERS, 1987). Si no se respeta este perodo mnimo, la respuesta superovulatoria se afecta notoriamente (ver Cuadro 8). Cuadro 8: Promedio de embriones transferibles segn el intervalo entre tratamientos (SHALOVILO y col., 1989) Embriones transferibles Intervalo entre tratamientos 80-90 das 45-60 das 1o tratamiento 4 1 2o tratamiento 5 3 3o tratamiento 3 2 4o tratamiento 6 -
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SAUMANDE y CHUPIN (1977) concluyeron que las respuestas pobres a un primer tratamiento superovulatorio tienen alta repetibilidad. Esto fue corroborado por LAMBERSON y LAMBETH (1986) quienes informaron un 64% de repetibilidad para las respuestas pobres al primer tratamiento y aproximadamente un 45% para las medias o altas. Efecto de la raza Las donantes que ingresan en Programas de TE presentan diferencias en su estado nutricional, sanitario y reproductivo, como tambin en el nmero previo de tratamientos de superovulacin. Por lo tanto, no cabe considerar la produccin de estas hembras como totalmente representativa de la raza. En un estudio retrospectivo sobre 1596 tratamientos de superovulacin efectuados en donantes de 13 razas distintas productoras de carne, DONALDSON (1984e) encontr que la raza de la donante es un factor de variacin en aspectos tales como:
- nmero de ovocitos y embriones recolectados - nmero de embriones transferibles - porcentaje de embriones transferibles - nmero de preeces/recoleccin - porcentaje de preez La proporcin de hembras que presentaron celo y el momento de aparicin del mismo fue diferente en las distintas razas. Sin embargo, este factor no fue considerado por no ser determinante del nmero de preeces/recoleccin como los porcentajes de preez fueron influenciados por la raza de las receptoras, siendo imposible discriminar estos efectos de los de la raza de la donante. La comparacin de estos resultados con otros de donantes de raza Holstein, ubica a esta raza en un trmino medio en lo que respecta al nmero de ovocitos y embriones recolectados, mejorando su performance cuando se considera el porcentaje de embriones transferibles (HASLER y col., 1981; WALTON y STUBBINGS, 1986). En un estudio retrospectivo hecho en donantes de razas lecheras y productoras de carne, se observ en la raza Jersey una mayor proporcin de donantes con respuesta ovrica excesiva, sin aumentar el nmero de embriones transferibles/ recoleccin (HOLM y col., 1987). En ganado Bos indicus, independientemente del grado de respuesta ovrica, los resultados pueden ser alterados por las caractersticas propias del tracto genital de estas hembras que ofrece dificultades para efectuar la recoleccin (ELSDEN y col., 1979). Efecto estacional En algunos trabajos realizados en Canad y EE.UU. no se demostr un efecto estacional sobre la respuesta superovulatoria (CRITSER, y col., 1980; MASSEY y ODEN, 1984). Sin embargo, un menor nmero de embriones transferibles ha sido observado durante el invierno en Texas, EE.UU. (ALMEIDA, 1987b) y en verano, en Israel y Arabia Saudita (BOLAND y col., 1981; GORDON y col., 1987). En un trabajo experimental, PUTNEY y col. (1988) sometieron a las donantes a elevadas temperaturas en el perodo comprendido entre la IA y la recoleccin y observaron que el calor produce una mayor proporcin de embriones degenerados y retardados. Se puede concluir que la respuesta superovulatoria puede ser alterada por situaciones climticas extremas (NEWCOMB, 1980), dependiendo stas si
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ocurren en invierno o verano segn la ubicacin geogrfica del lugar donde se realiza el tratamiento.
Conclusiones A pesar de los avances que se han registrado en el conocimiento de la fisiologa reproductiva de la hembra bovina en los ltimos diez aos, la variabilidad en la respuesta superovulatoria permanece en niveles similares a lo observado a fines de la dcada del setenta (ELSDEN y col., 1978). Para reducir tal variabilidad es necesario en primer lugar, optimizar las preparaciones hormonales y luego efectuar el tratamiento en hembras frtiles, en el momento adecuado y en un ambiente propicio. Los tratamientos hormonales deben producir un nmero elevado de embriones transferibles y ser de fcil aplicacin. Hasta ahora, para cumplimentar el primer requisito se ha insistido en encontrar una relacin FSH-LH adecuada. Sin embargo, la respuesta superovulatoria se modific nicamente cuando las relaciones fueron muy dispares. Posiblemente, la purificacin de los extractos hipofisiarios sea ms importante para evitar que lleven incorporados otras hormonas que para encontrar una relacin definida. BECKERS y col., (1988) sostienen que los extractos poco purificados pueden ir acompaados por hormonas tales como la de crecimiento -STH- que podran competir con las gonadotrofinas por los receptores ovricos. La simplificacin de los tratamientos puede conseguirse empleando PMSG, si se logra mantener el nivel de resultados alcanzado en algunos trabajos en los que se utiliz con el anti suero correspondiente (DIELEMAN y col., 1987). Con el mismo objetivo y debido a las ventajas prcticas que ofrece, debe ser motivo de mayor investigacin la combinacin de gonadotrofinas con dispositivos o implantes con progesterona o progestgenos. Si los resultados preliminares obtenidos con la FSH-b se confirman, la produccin de hormona por recombinacin de ADN resolver el problema de la variabilidad debida a los tratamientos. La induccin a la superovulacin debe efectuarse en presencia de un cuerpo lteo funcional y evitando la accin de los folculos dominantes no ovulatorios (GORDON y col., 1987). La mejor forma de determinar la presencia de un CL funcional es, de manera indirecta, a travs del dosaje de progesterona. A tal fin, ha comenzado a utilizarse la medicin en plasma empleando la tcnica enzima inmunoensayo (ELISA) (ALI DINAR y col., 1987; ALLEN y FOOTE, 1987) o leche, mediante un procedimiento colorimtrico (HERRLER y col., 1988). Del mismo modo, la ecografa es considerada la tcnica ms idnea para el seguimiento de la dinmica folicular (SAVIO y col., 1988).
Recomendaciones finales En base a experiencias personales recogidas y a los datos obtenidos de otros autores, se hacen algunas recomendaciones prcticas tendientes a disminuir la variabilidad en la respuesta superovulatoria: 1. 2. Elegir como donantes hembras frtiles. Inmediatamente antes de comenzar el tratamiento de superovulacin, controlar la funcionalidad de los ovarios. En caso de no poder recurrir al dosaje de progesterona y a la ecografa, utilizar la palpacin transrectal. Utilizar extractos hipofisiarios purificados. Adecuar la dosis de gonadotrofina a la relacin FSH/LH del preparado hormonal, a la raza de la donante y a su edad. Tambin deben tenerse en cuenta los antecedentes de tratamientos superovulatorios previos.
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En el caso de hembras superovuladas por primera vez: a) Tratar con una dosis media (32-36 mg Armour). b) Si no responde, efectuar otro tratamiento empleando la misma dosis y si nuevamente no responde, descartar esta hembra como donante. c) Si en el primer tratamiento se registra una respuesta baja, aumentar la dosis a 40 mg Armour. d) Si la respuesta al primer tratamiento es alta, con embriones de mala calidad, bajar la dosis a 2830 mg Armour. Dejar transcurrir un mnimo de 50 das post-parto hasta efectuar un trata-miento superovulatorio. Entre tratamientos, debe transcurrir un perodo mnimo de 60 das.
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RECOLECCION DE LOS EMBRIONES G. A. Palma Introduccin Los embriones bovinos, destinados a un programa de TE pueden ser obtenidos del tero por medios no quirrgicos. Su recoleccin y transferencia con xito dependen de varios factores. En primer lugar de la resistencia de stos para sobrevivir y llegar a trmino despus de ser recolectados del tracto genital, evaluados in vitro y transferidos a un genital receptor, con cambios de medio y temperatura. En segundo lugar depende de que la tcnica de obtencin no ponga en peligro la integridad del tracto genital, a fin de poder repetirla tantas veces como sea deseable y conveniente. La primera tcnica de recoleccin de embriones bovinos usada hace aproximadamente dos dcadas, fue quirrgica. La misma requera anestesia general, inducida por medio de barbitricos y mantenida por medio de inhalacin (halotano). Por medio de una incisin de 15 cm de longitud en la lnea media, por delante de la glndula mamaria, se extraan los cuernos uterinos con los ovarios. El lavaje de los cuernos y oviductos se llevaba a cabo el da 5-7 introduciendo catteres de goma a travs de la pared dorsal del cuerno uterino y en la ampolla del oviducto. Cada cuerno era lavado con volmenes variables de 40-60 ml de una solucin buffer (M 199). La manipulacin quirrgica del tero y de los ovarios conduce a lesiones que provocan formacin de fibrina y adherencias. Para minimizar ese efecto fue necesario trabajar con buenas condiciones de asepsia, lavando el tero y los rganos adyacentes con solucin fisiolgica estril, conteniendo heparina. Con estas precauciones era posible llevar a cabo el lavaje a una vaca slo tres veces como mximo, lo que constituye una seria limitante en el uso repetido de esta tcnica. La tasa de xito vari entre 50 y 70% de embriones y ovocitos obtenidos, en funcin del nmero de cuerpos lteos presentes. Otra variante de la recoleccin quirrgica fue el by-pass propuesto por TESTART y GODARD-SIOUR (1975), colocando la sonda a travs de la pared uterina por medio de vaginotoma (Fig. l) bajo anestesia epidural.
Fig. 1: Mtodo transvaginal GODARD SIUR, 1975)
(TESTARD
Despus de la colocacin, el catter de goma era fijado por medio de un baln inflable. El tero era lavado con 50-70 ml de medio. Esta tcnica permiti obtener 40-50% de embriones. Las infecciones y adherencias en los cuernos uterinos y oviductos constituyeron las desventajas que limitaron, como en el caso anterior, la repetibilidad de la recoleccin e impidieron su difusin en la prctica. Ello provoc uno de los mayores cambios en la tcnica de transferencia de embriones de la dcada del `70. Aunque las
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Recoleccin de los embriones
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primeras experiencias con la recoleccin no quirrgica de embriones se remontan a la dcada del cuarenta (ROWSON y DOWLING, 1949), recin a partir del trabajo de SUGIE y col. (1972) se obtuvieron resultados satisfactorios y repetibles (SEIDEL y col., 1977). Mtodos no quirrgicos de recoleccin La posibilidad de colocar en la especie bovina la sonda a travs de la crvix abri nuevas posibilidades a la recoleccin de embriones, simplificando el procedimiento y disminuyendo el trauma uterino. Para ello se crearon diferentes modelos de catteres: rgidos (SUGIE y col., 1972), semirgidos (RASBECH, 1976) y flexibles (DROST, 1976; NEWCOMB y col., 1978; HAHN, 1978). Los mismos podan tener 2 vas, una para insuflar el baln de goma e inmovilizar el catter y la segunda para inyectar y recolectar el medio. RASBECH desarroll en 1976 un sistema semirgido de recoleccin, a partir de una sonda Foley de 2 vas. El volumen de aire a insuflar oscilaba entre 12-15 ml. La inyeccin de medio se llevaba a cabo con una jeringa de 60 ml. La sonda Foley era introducida en un tubo rgido, quedando libre el extremo anterior, a partir del baln para el aire y el extremo posterior. Los resultados obtenidos por el autor (tabla 1) indican el xito de la tcnica propuesta, que constituy el punto de partida de los catteres flexibles de 2 vas, empleados actualmente. Las experiencias y recomendaciones de RASBECH siguen an vigentes. Tabla 1: Resultados obtenidos con la recoleccin no quirrgica de embriones con el catter semirgido de RASBECH (1976) CL (n) izq. 7 2 9 6 der. 6 3 7 3-4 Ovocitos/embriones recolectados (n) izq. 7 2 7 5 der. 4 3 4 3 Medio de lavaje recolectado (%) izq. 86 100 100 100 der. 96 100 100 100
Vaca Nr. 1 2 3 4
Los catteres de 3 vas permiten inyectar el medio por la segunda va mientras la tercera conduce el lquido fuera del tero. En la actualidad se emplean catteres rgidos y flexibles, de 2 y 3 vas, y 3 mtodos de recoleccin (PALMA y col., 1991): Circuito cerrado con flujo continuo Circuito cerrado con flujo discontinuo Circuito abierto con flujo discontinuo Circuito cerrado con flujo continuo Con este mtodo (ELSDEN, 1976; GREVE y col. 1977) se emplean catteres de 3 vas, rgidos (CASSOU, 1984, Foto 1) o flexibles (BRAND y col., 1978). Una va, destinada a la inyeccin del medio de lavaje, se conecta al frasco que contiene la solucin por medio de una tubuladura de goma ltex o silicona. La solucin puede inyectarse por gravedad, colocando el frasco con el medio a aproximadamente 1 m por encima del frasco recolector o con una jeringa, con el mismo procedimiento que el mtodo de flujo discontinuo (Fig. 2 y 3). Por la segunda va se inyecta aire o medio para llenar el baln y por medio de una tercera va se recolecta la solucin de lavaje, sin interrumpir la descarga.
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Fig. 2: Esquema del circuito cerrado con flujo continuo adaptado de ELSDEN (1976) Circuito cerrado con flujo dicontinuo Con este mtodo se usa el catter de 2 vas (Foto 3, Fig. 3a), una jeringa de 50-60 ml (Fig. 3b), una vlvula automtica o manual (Fig. 3c), una unin de vidrio o plstico en forma de T o Y (Fig. 3d) y las tubuladuras (Fig. 3 I y II). La vlvula, que se coloca a la salida del frasco (Fig 3 c), permite extraer el medio e inyectarlo en el interior del cuerno uterino. Luego de la inyeccin de un volumen variable de medio (30-50 ml) se interrumpe el flujo de llenado para proceder a la segunda maniobra; el cuerno es vaciado por la misma va. Al ocluir la tubuladura de inyeccin (Fig. 3) la unin de vidrio en Y desva el medio a la segunda tubuladura (Fig. 3 II) que lo conduce al frasco recolector.
Fig. 3: Esquema de circuito cerrado con flujo discontinuo (adaptado de BRAND y HOOGEKAMP, 1986)
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Circuito abierto con flujo discontinuo Inyeccin y recoleccin con una jeringa. Esta tcnica se emplea con los catteres flexibles de 2 vas (Fotos 3, 4, 5 y 7) y no requiere de tubuladuras (Fig. 4). El medio se inyecta y recolecta por la misma va y con la misma jeringa (50 ml). Con sta se descarga un volumen de medio fijado por el operador (Fotos 1 y 2) quien, como en el caso anterior, debe palpar el cuerno uterino determinando y controlando su llenado a fin de evitar lesiones de la pared uterina por exceso de medio. Las maniobras siguientes variarn de acuerdo al tipo de tcnica de lavaje que se aplique. Algunos operadores fijan y masajean el tero durante la inyeccin del medio. Esta operacin es particularmente importante cuando el animal no est fijado con una elevacin del tren anterior, que facilite el retorno del lquido de lavaje. Las dimensiones y peso del tero requieren que ste sea elevado por el operador. Cuando la donante es fijada con una elevacin anterior algunos operadores no manipulan los cuernos uterinos, slo verifican una vez el llenado. Luego retiran el brazo del recto y continan con la inyeccin de medio hasta completar el volumen preestablecido de lquido. La recoleccin de los embriones en esta posicin facilita el lavaje en animales con pariciones mltiples, aun cuando se emplee adems el masaje de tero. Esta forma es aplicada en los Centros de TE donde ya se cuenta con la infraestructura necesaria. Presenta la ventaja que la manipulacin no irrita al animal y facilita la operacin. Mientras se descarga la jeringa en el frasco recolector el catter es ocluido con una pinza hemosttica o un clamp.
Fig. 4: Esquema del circuito abierto con flujo discontinuo. Inyeccin y recoleccin con una jeringa
Foto 1: Recoleccin por medio del sistema del sistema abierto. El operador inyecta el medio de lavaje regulando el volumen de inyeccin y masajeando suavemente el cuerno uterino
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Foto 2: La recoleccin del medio inyectado se lleva a cabo aspirando el medio con ligera presin negativa y elevando simultneamente el cuerno uterino por su pared ventral
Ventajas y desventajas de tres mtodos de recoleccin Todas las tcnicas, con sus diferentes modificaciones, como as tambin los catteres mencionados se emplean en la prctica con el mismo xito. Por lo tanto, las diferencias entre ellos, como as tambin las ventajas y desventajas observadas, no constituyen elementos de juicio excluyentes de uno u otro. El operador ser el que determine, en funcin de su experiencia, medios e infraestructura disponible, qu tcnica es la ms adecuada para su modus operandi. Independientemente de esos factores, su destreza es el factor ms importante en la tarea de obtener los embriones. El sistema de circuito cerrado con flujo continuo (fig. 5) permite, en su concepcin terica, un lavaje ms asptico frente al mtodo de inyeccin y extraccin con jeringa, ya que el medio es conducido desde el tero hasta el filtro o el frasco de recoleccin sin solucin de continuidad. Ello es particularmente importante cuando los lavajes se llevan a cabo en lugares abiertos. Sin embargo la tubuladura no es fcil de lavar y secar, lo que puede provocar en la prctica, contaminaciones bacterianas, como consecuencia de un lavado insuficiente o qumicas, provocadas por un mal enjuagado o por la deposicin de sustancias esterilizantes (dixido de etileno) en los restos de humedad.
Fig. 5: Circuito cerrado de 3 vas (Cassou, IMV, Francia)
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El sistema de circuito abierto con jeringa no emplea tubuladuras y las jeringas son descartables o de fcil lavado y esterilizacin, razn por la cual el riesgo de falta de limpieza e insuficiente secado es mnimo. Con este sistema se debe tener siempre la precaucin de obturar el catter a fin de no perder el lquido que pueda quedar en el tero mientras la jeringa con el medio recolectado es descargada en el frasco recolector. Esta maniobra es sencilla y rpida si la donante es un animal manso y/o est bien preparado (anestesia epidural, tranquilizante etc.). Sin embargo debe repetirse entre 14 y 20 veces por animal, de acuerdo al volumen de lavaje empleado. Ello, en una vaca indcil o intranquila puede conducir a complicaciones con prdida de medio. Los programas de TE ambulantes constituyen una limitante adicional para este mtodo, dado que la infraestructura disponible en condiciones extensivas es muy variable y en muchos casos inadecuada para la recoleccin de los embriones. El sistema de circuito cerrado con flujo continuo, como ya fue mencionado, facilita el lavaje por que la entrada y salida del medio se realiza en forma automtica y continua, disminuyendo el tiempo de lavaje. El riesgo de prdida de medio como consecuencia de movimientos bruscos de la donante es considerablemente menor. El sistema de circuito cerrado con catteres rgidos (3 vas) es tan costoso que no se emplea uno por animal sino el mismo para varios lavajes sucesivos. Ello aumenta el riesgo de contaminacin bacteriana siendo esa, posiblemente, la razn por la cual su uso no est extendido. Por otra parte el catter es de acero y permanece en el cuerno uterino durante el lavaje. Su empleo es especialmente riesgoso en animales indciles o intranquilos por peligro de lesiones de la pared uterina. La va destinada al retorno del medio posee orificios de reducida dimensin. Para evitar que sta pueda taparse con el mucus cervical se recomienda inyectar 10-20 ml de medio cuando el catter atraves la crvix. Otra forma que adems evita el pasaje del mucus cervical al tero es aspirando el mucus con una pipeta de inseminacin por medio de una jeringa antes de introducir el catter de recoleccin. La sonda puede tambin taparse con cogulos de sangre o restos de mucosa, como consecuencia de la laceracin del endometrio, lo que impide el retorno del medio. En ese caso se deber conectar una jeringa a la tubuladura de esa va para destaparla mediante la inyeccin del lquido de lavaje. El circuito cerrado con flujo discontinuo tiene menos riesgos de taparse al disponer de una va comn de inyeccin y recoleccin. El catter de doble va que se emplea para ello dispone adems de orificios considerablemente mayores. Si stos se taparan con mucus o cogulos, la siguiente inyeccin de medio los liberar. Los catteres, disponibles en el mercado, constituyen tambin un tema per se en cuanto a sus precios. El catter de 3 vas de acero es el ms costoso. Su precio pone en duda su empleo si el profesional destina un catter por donante como lo dispone la Asociacin Internacional de Transferencia de Embriones. Los catteres flexibles de 2 vas, que se ofrecen especficamente para TE (Foto 3), son ms accesibles que los primeros, pero constituyen una inversin de importancia de acuerdo a la cantidad que se disponga. El catter armado a partir de una sonda Foley (Foto 4) reduce los costos sensiblemente sin disminuir el xito de recoleccin con respecto a los anteriores. SUBRAMANIAN y DEVARAJAN (1991) presentaron un mtodo "vagino-cornual" de recoleccin para las vaquillonas donantes cruza Bos indicus x Bos taurus. El mismo tiene como objeto mejorar la recoleccin de los embriones de donantes que por la edad o la raza (Bos indicus) permiten obtener tasas de xito menores que vacas adultas y razas europeas. La colocacin del catter se lleva a cabo por medio de un by-pass a travs de la pared antero-lateral de la vagina (fornix) a los cuernos uterinos (antes de la bifurcacin), con una vaina rgida, que permite atravesar las paredes vaginal y uterina segn el mtodo de TERSTARD y GODARD-SIUR. La recoleccin se lleva a cabo con un catter flexible. Los autores concluyen en la aplicabilidad de la tcnica para el tipo de donantes descrito, acentuando la ausencia de un efecto negativo sobre la fertilidad de las mismas. Sin embargo recomiendan el entrenamiento en la prctica de la tcnica antes de aplicarla en animales de valor. Queda por establecer la repetibilidad de la misma teniendo en cuenta las perforaciones de la pared uterina.
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Foto 3: Catter flexible de 2 vas, modelo Minitb, Alemania
Foto 4: Catter flexible de 2 vas, armado a partir de una sonda Foley (LAMPETER, 1977)
Foto 5: Punta metlica (segn LAMPETER) de un catter flexible. Antes del lavaje debe controlarse la integridad del baln
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Preparacin de la donante, anestesia epidural La preparacin del animal depender de varios factores, entre los que se encuentran la infraestructura disponible de acuerdo al tipo de establecimiento ganadero (produccin intensiva o extensiva), la docilidad del animal como as tambin la destreza y experiencia del operador. Antes de la operacin de lavaje es necesario vaciar el contenido rectal, precisar la posicin y dimensiones del tero y la respuesta ovrica al tratamiento superovulatorio (No de cuerpos lteos, presencia de folculos). El vaciado del recto y la toilette de la regin peri anal son las primeras maniobras. Usualmente se contina con la tranquilizacin y anestesia local de la donante (PETERS y BALL, 1986; MAPLETOFT, 1986). A fin de contar con una buena relajacin del recto se puede aplicar anestesia epidural baja (HALL, 1974; LUMB y JONES, 1979), administrando 4-6 ml de Lidocaina (2%), en el espacio comprendido entre la primera y segunda vrtebra coccgea. La cnula se coloca en una posicin de 90o para atravesar la piel. Luego en un ngulo de 45o desde la piel hacia craneoventral. Cuando la aguja ingresa al canal medular circula aire en su interior, que provoca, en algunos casos, un ligero zumbido. Una prueba ms segura es la aplicacin de unas gotas de anestsico en la entrada de la aguja, que sern aspiradas al interior del canal vertebral, si sta est bien colocada. Si la aguja llegase a topar una superficie sea significa que lleg al piso de la 1o vrtebra coccgea. En ese caso retirar la aguja aproximadamente 0,5 cm (WESTHUES y FRITSCH, 1960). La inyeccin debe aplicarse lentamente y sin resistencia alguna. El inicio del bloqueo sensitivo y motor se hace evidente por la flaccidez de la cola, por la falta de respuesta del esfnter anal y de la vulva al pellizco. A pesar que la relajacin de la cola es inmediata, la accin anestsica sobre el recto y el esfnter del ano requiere 10 minutos aproximadamente. Por otra parte puede producirse un efecto anestsico incompleto, con una buena anestesia de la cola (flaccidez) pero insuficiente anestesia de los rganos de inters, causado por lo general por una incorrecta administracin. En ese caso deber suplementarse o repetirse la dosis. Es importante destacar que una insuficiente anestesia epidural puede ocasionar el fracaso del lavaje en animales indciles. Al levantar la cola para inmovilizarla, despus de la administracin del anestsico, ocurre -en algunos casos- el ingreso de aire al recto. Ello constituye una seria complicacin por que el mismo pierde sensibilidad y capacidad de expulsar el aire. Si este fuera el caso se recomienda hacer caminar al animal a fin de que la prensa abdominal ejerza presin sobre el recto y expulse el aire retenido. Otra alternativa es eliminar el aire por medio de aspiracin con un tubo flexible (RUBIN, 1991), para lo cual se emplean una bomba aspirante de pequeo poder. Levantar y fijar la cola slo despus que el operador introdujo el brazo en el recto. La vulva y la regin que la rodea debern ser lavadas, desinfectadas (iodo povidona, alcohol 70%) y secadas. Cuando se trabaja con hembras indciles es conveniente emplear una combinacin tranquilizante y relajante de 100-200 mg de clorhidrato de ketamina y 0,5-1,5 ml de xilazina (0,1%) totales, segn el peso del animal. Tambin es posible la administracin de slo uno de ambos productos. Despus de su aplicacin es importante dejar a la vaca tranquila durante 10-20 minutos, a fin de que los ruidos y el contacto con el animal no perjudiquen el efecto de los medicamentos. Por esta razn el tranquilizante se aplica en general despus de la rectalizacin y antes del resto de los preparativos (toilette perianal, anestesia epidural, materiales etc.) Previo a la introduccin del catter de lavaje se puede aspirar el mucus cervical con una pipeta de inseminacin y una jeringa de 20 ml y aumentar la luz cervical con ayuda de un dilatador de acero inoxidable (foto 6). Este instrumento es, adems, de utilidad para determinar el dimetro de la luz cervical a travs del grado de dificultad para atravesar la crvix. Los operadores, que adecuan diferentes modelos y/o tamaos de catteres segn el dimetro del cuello del tero, podrn determinar
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con ayuda del dilatador cual ser el instrumento ms adecuado para el lavaje. Si la crvix present resistencia al pasaje, el dilatador se deja colocado en la luz cervical -no en el cuerpo del tero - durante 2-5 minutos. Mientras tanto se puede llevar a cabo la palpacin diagnstica del tero y los ovarios, a fin de determinar dimensin, forma, y respuesta superovulatoria (No de cuerpos lteos y folculos), datos de importancia para el protocolo de cada donante. Algunos operadores no emplean el dilatador y otros lo hacen cuando el grado de oclusin cervical es tal que no permite la introduccin del catter de lavaje. La desventaja de esta forma de trabajo es la extraccin del catter de la vagina con el riesgo de arrastrar impurezas en el segundo intento. No es necesario esterilizar el dilatador ni el mandril, bastar con un buen lavado y posterior tratamiento con un desinfectante de superficie (alcohol etlico 70%, isoproplico 70%, etc.).
Foto 6: Dilatador cervical Colocacin del catter y lavaje del tero Antes de colocar el instrumento, ste debe ser enjuagado con la misma solucin destinada el lavaje (PBS + 1% SFB). Ello contribuir a lubricar y eliminar las impurezas que pudieran haber quedado despus de una esterilizacin con gas (xido de etileno). El catter es introducido en el vestbulo de la vulva, separando sus labios. Los catteres de goma o silicona, a diferencia de los de acero, requieren para ello un mandril. Para atravesar la crvix el operador debe fijarlo por delante de la punta del catter modificando su posicin hacia arriba y abajo como as tambin en forma lateral sucesivamente, empujando suavemente el instrumento hacia craneal simultneamente. Al llegar al ltimo anillo se deber presentar el cuerno uterino, ligeramente elevado, frente a la punta del catter. En este momento es imprescindible tener especial precaucin de controlar la fuerza que se ejerce sobre el catter, a fin de no atravesar bruscamente la crvix y perforar la pared uterina. Cuando el instrumento alcanz el cuerno del tero, ste ltimo se endereza levantndolo de su cara ventral mientras se avanza el catter muy suavemente hasta el 1/3 medio del rgano. No deber existir resistencia alguna, si as ocurriera se debe retroceder el instrumento, presentar el cuerno uterino (estirarlo suavemente) y avanzar nuevamente. El ligamento intercornual, la curvatura uterina y el extremo anterior del cuerno deben ser puntos de referencia permanente del grado de avance del catter. Una vez alcanzada la posicin prxima a la deseada (por ejemplo borde del ligamento intercornual) se libera el catter del mandril, se desplaza este ltimo unos centmetros hacia caudal y se deslizan ambos suavemente hacia craneal, unos 5 cm. Repetir la operacin un par de veces hasta comprobar una ptima colocacin del catter en el cuerno uterino. De esta forma es posible colocar el catter sin manipular excesivamente los cuernos. Despus de esta maniobra se procede a inyectar con aire el baln del catter. El volumen de inyeccin vara en funcin del dimetro de esa porcin del tero y esto depende de la edad y tamao del animal, como as tambin de las pariciones previas. En general el volumen vara entre 15 y 20 ml. El operador es el que determinar, por medio de la palpacin, el volumen a inyectar. Se debe tener en cuenta que su exceso produce aplastamiento de la mucosa endometrial con hemorragias, y en casos ms graves, desgarro de la pared uterina. Con el catter ya fijado, el operador deber comprobar la correcta posicin del instrumento. Si fuera necesario se retirar el aire del baln de goma y se avanzar ms hacia craneal. Suele ocurrir que el operador inexperto cree fijar el catter en un cuerno y no recolecta medio con las sucesivas inyecciones de medio. Ello ocurre cuando el instrumento fue fijado en el cuerpo del tero y el lquido fluye a ambos cuernos o si el baln desgarr la pared uterina. En ambos casos se podr comprobar por palpacin la
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ubicacin del baln de goma o de la punta del catter (si sta es de acero, modelo LAMPETER, 1977a y b). Si el baln se encuentra en el extremo anterior del cuerno uterino y ste no se ingurgita al inyectar la solucin significa que el exceso de aire del baln desgarr la pared uterina o que sta fue perforada con la punta del catter. El medio es expulsado en direccin a la cavidad abdominal, en algunos casos slo un reducido volumen sanguinolento es recuperado. La presencia de la herida no significa que se deba renunciar al lavaje del cuerno, particularmente si se trata de embriones de gran valor. Resolver este problema requiere, sin embargo, destreza y sobre todo mucha delicadeza para trabajar con el tero perforado y no agravar la lesin. Ello constituye una seria limitante sobre todo si se tiene en cuenta que esos problemas son producto de la inexperiencia. El operador deber decidir de acuerdo a su criterio cual ser la actitud a tomar. El catter debe ser colocado delante de la lesin, si es que su ubicacin lo permite. Ello requiere buena sincronizacin entre el operador y su asistente. Dado que la lesin slo puede ser determinada por crepitacin en el momento de la inyeccin del medio de lavaje, junto con la baja o nula recuperacin del lquido ya mencionadas, no es posible fijar su posicin despus que el baln fue desinflado. En consecuencia el operador deber estar preparado para avanzar con el catter cuando el asistente vace el baln. El instrumento deber ser colocado por lo menos 5 cm por delante de la lesin (de acuerdo al tipo de catter), para evitar el aumento de la lesin de la pared del tero al inflar el baln. En los casos en que el catter no pueda avanzar ms (genital muy largo o posicin anterior de la lesin provocada por el extremo anterior del catter) se recomienda renunciar a ese cuerno para evitar complicaciones de gravedad. Si la rpida evaluacin indica que el catter est bien colocado se procede a inyectar el medio de lavaje. El volumen de lquido a inyectar vara de acuerdo a la dimensin del cuerno y en funcin con la proximidad del catter a la unin tero-tubrica. En consecuencia, la cantidad de medio debe ser regulada cuidadosamente por el operador, a fin de inyectar la suficiente cantidad para producir en el interior del cuerno uterino, la presin de retorno sin que su exceso provoque dolor, que intranquiliza al animal, o lesiones. El volumen a inyectar vara entonces entre 30-50 ml. El volumen total empleado para cada cuerno uterino variar segn el criterio del operador entre 500, 700 (MUNAR y col., 1989) y 1000 ml (KNIG y ROMMEL, 1987). Este puede ser recolectado en diferentes tipos de recipientes y filtrado durante o despus de la recoleccin. La recuperacin ptima no es inferior al 90% del volumen inyectado. Algunos autores sostienen que la mayor parte de los embriones y ovocitos se obtienen despus de haber recuperado 200 ml. La temperatura del medio de lavaje debe ser de 37-39o C, los frascos a tal fin deben mantenerse en bao Mara (foto 10). Una vez terminado el lavaje se repite la misma operacin en el otro cuerno uterino. De acuerdo al grado de flexibilidad del catter es posible cambiarlo de cuerno uterino sin sacarlo del tracto genital. Para ello es conveniente retirar el catter flexible hasta la crvix e introducir lentamente el mandril. El modelo LAMPETER (1977, foto 4 y 7), con punta metlica (foto 5), se adecua muy bien a esta operacin, por que cuando el mandril llega a la punta se produce un chasquido (LAMPETER, 1978). Catteres muy flexibles (goma ltex) son deformados por los anillos de la crvix, lo que impide la colocacin del mandril, razn por la cual es necesario sacarlos del tracto genital, al menos hasta el segundo anillo de la crvix, para introducirles el mandril. Una exitosa maniobra de lavaje no garantiza siempre la recoleccin del nmero esperado de embriones/ovocitos en funcin de la cantidad de CL palpados. Las razones que motivan estas diferencias cuantitativas pueden ser variadas y no se conocen con exactitud. No siempre es posible explicarse este fenmeno a travs de un mayor nmero de ovocitos no fertilizados, embriones retardados o degenerados que pueden quedar atrapados en el oviducto o ser reabsorbidos. La falta de experiencia puede ser una razn vlida, como as tambin problemas de lavaje an en grupos experimentados. La repeticin del lavaje el mismo da (6-12 h despus) o al da siguiente (LANDSVERK
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y col., 1991) ha dado, en algunos casos, buenos resultados para aumentar la tasa de recoleccin, razn por la cual debe tenerse en cuenta un segundo lavado.
Foto 7:
Catter de 2 vas con punta metlica segn Lampeter, Minitub, Alemania
Formas de obtencin y bsqueda de los embriones Luego del lavaje por medio de las tcnicas no quirrgicas, la aislacin de los embriones de los grandes volmenes de medio se puede hacer por medio de sedimentacin o filtracin del medio recuperado. Para la sedimentacin de los embriones se emplean recipientes con forma de embudo y un cierre hermtico en su fondo, probetas o frascos de 0,5-1,0 l. Los recipientes deben estar a una temperatura constante de 37 C 20 C (bao Mara, foto 11, o temperatura ambiente) y protegidos de la luz solar directa. La sedimentacin de los embriones requiere 20-30 minutos. Cumplido este tiempo se elimina el sobrenadante por medio de un tubo flexible (tipo sondas peditricas nasogstricas) que, por capilaridad elimina lenta y progresivamente (de arriba hacia abajo) el volumen recolectado, a fin de evitar turbulencias que hagan ascender a los embriones. El tiempo necesario para eliminar el sobrenadante vara, en funcin de su volumen y del tamao de la sonda, entre 15-25 minutos. La forma y velocidad de eliminacin del medio de lavaje es por goteo rpido. Para acortar el tiempo que demandan las 2 operaciones mencionadas se emplean actualmente filtros estriles con malla de acero inoxidable o plstico de 60-90 m de dimetro de poro. Estos se pueden presentar en recipientes con forma de embudo (foto 8) donde se vuelca el medio recolectado del frasco (despus del lavaje) o directamente del catter (durante el lavaje). Por medio de este ltimo procedimiento el filtro se va vaciando por su parte inferior a medida que se llena con el medio recolectado, ahorrando de esta forma el tiempo de sedimentacin, dado que los embriones quedan contenidos en el recipiente filtrante. Otros dispositivos de filtracin estn unidos a un tubo de silicona, se colocan en el recipiente con el medio recuperado (probetas) y eliminan el sobrenadante por capilaridad (foto 9). Los embriones quedan, de esta forma, retenidos en la probeta por medio de su malla filtrante intercambiable. La firma que los comercializa recomienda sin embargo un tiempo de sedimentacin de 20 minutos. Recientemente fue presentado un nuevo filtro (Genetro, Mxico, foto 10) que presenta la particularidad de recolectar el medio de lavaje, la filtracin y la bsqueda de los embriones sin pasos intermedios. Su base plana y transparente permite retirar los embriones bajo observacin microscpica con el ahorro consecuente de tiempo. El volumen de solucin conteniendo los embriones (40-50 ml) se vuelca en 4-5 vidrios de reloj o en 2-3 placas de Petri (de 130 mm de dimetro) con divisiones. Para garantizar una completa observacin visual de la superficie total de la placa, la bsqueda deber hacerse en forma de guarda griega, tanto en el sentido de las abscisas como de las ordenadas (orientndose de acuerdo a la disposicin de los
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cuadrados, Fig. 6). Para ello existen en el mercado placas cuadriculadas como la de la figura. El cuadriculado puede trazarse, adems, en las placas plsticas con un marcador fino indeleble o una aguja hipodrmica, en la parte externa del piso como tambin en la tapa, colocando sta bajo la placa durante la bsqueda.
Foto 8: Filtro plstico en forma de embudo, Em-com EE.UU. Los embriones encontrados debern ser transportados a una placa de Petri ms pequea (3 mm) o a una placa de cuatro celdas Nunc, con medio enriquecido con suero. Esta operacin deber repetirse a fin de "lavar" los embriones antes de la transferencia o de la congelacin, segn lo establecido en el reglamento de la IETS.
Foto 9: Filtro plstico con malla intercambiable (Minitb, Alemania), combinado con una probeta
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Foto 10: Filtro Malinche I (Genetro, Mxico)
Fig. 6: Procedimiento de bsqueda de los embriones El pasaje de los embriones entre las placas se realiza con distintos tipos de tubos v capilares. Algunos microcapilares (50 l, Unopette) se emplean con jeringas de 1 ml (Foto 12), otros (5-20 l) con micropipetas especiales (Transferpettor, Foto 13) o simplemente tubos de vidrio estirados con el fuego de un mechero Bunsen. En todos los casos se deber tomar la precaucin de redondear, con la llama de un mechero, los bordes del tubo que toman contacto con el embrin, a fin de evitar lesiones de la zona pelcida o de su masa celular. Una vez que los embriones fueron lavados se puede llevar a cabo la evaluacin morfolgica de los mismos.
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Foto 11: Bao Mara transportable
Foto 12: Capilar hecho con ayuda de un mechero Bunsen (1) y Unopette (2) combinado con una jeringa de 1 ml
Foto 13: Transferpettor de 5 l, Brand, Alemania
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Palma
Foto 14: La bsqueda y evaluacin de los embriones no slo requiere de microscopios con buenas pticas sino tambin con una buena superficie de apoyo, a fin de evitar accidentes con las placas. Microscopio Zeiss con mesa diseada por Palma y Hoffmann (1992)
Material necesario para efectuar un lavado y seis transferencias Lavaje Dilatador cervical Catter recoleccin de embriones Mandril Jeringa 60 ml 20 ml Clamps Botella para el medio de recoleccin Tubo de recoleccin del medio, con peso y adaptador Filtro Recipiente de vidrio 500 ml Lubricante PBS Suero fetal bovino Toallas de papel Agujas 18 descartables x 11/2 Bao de agua con temperatura controlada porttil Incubadora porttil Procana al 2% Maleato de acepromacina Clorhidrato de xilaxina 1 2 2 2 2 2 3 2 2 3 1l 2l
6 1 1 10 ml 2 ml 1 ml
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Agua destilada Frasco estril con tapn de goma, 20 m Prostaglandina F2 Alcohol Algodn Tijera Balde y fuentn de material plstico Etiquetas Marcadores Aislacin de los embriones Lupa estereoscpica Pipetas para manipulacin de embriones (Capilar, Unopette o Transferpettor) Filtros 0,22 m de poro, tamao: 26 mm Cajas de Petri 130 mm dimetro, 35 mm " o vidrios de reloj Jeringas descartables: 1 ml 5 ml 10 ml Marcadores Etiquetas
20 ml 1 1 dosis
2 6 5 6 2 3 2
Transferencia Catteres de transferencia Vaina protectora Minipajuelas (pajillas) 0,25 ml Guantes de tacto Procana al 2% Tijera Lubricante Toallas de papel Desinfectante 6
Bibliografa BRAND, A. und HOOGEKAMP, P. 1982. Embryotransfer. En: GRUNERT, E. und BERCHTOLD. Fertilittstrungen beim weiblichen Rind. Verlag Paul Parey. Berlin - Hamburg 463-475. BETTERIDGE, K.J. 1980. Procedures and results obtainable in cattle. En: Morrow, A.D. Current Therapy in Theriogenology. Saunders W.B. Company 74-88. CASSOU, R., 1984. Instruments used in the techniques for embryo transfer. 10th international Congress on animal reproduction and artificial insemination. June 10-14 Illinios, U.S.A. Proceedings. ELSDEN, R. P., HASLER, J. F. and SEIDEL, Jr. G.E. 1976. Non surgical recovery of bovine eggs. Theriogenology 6: 523-532.
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EVALUACION MORFOLOGICA DE LOS EMBRIONES G. A. Palma Desarrollo embrionario. Nomenclatura Despus de su liberacin, el ovocito es "atrapado" por las fimbrias del infundibulum y dirigido al interior del oviducto a travs de la actividad ciliar. El ovocito bovino, fertilizado o no, es una clula de 150-190 m de dimetro (LINDNER y col. 1983), incluyendo a la zona o membrana pelcida, una capa acelular glicoproteica (NODEN y NAHUNTA, 1985) de 12 a 15 m de espesor producida por el ovocito (DIETL, 1986). En la ampolla del oviducto la fecundacin desencadena el comienzo del desarrollo previo a la nidacin del embrin. Pocas horas despus de la fusin nuclear el cigoto comienza a dividirse. La divisin nuclear es mittica y las nuevas clulas se denominan blastmeros. El desarrollo del embrin hasta los 8 das ocurre dentro de la zona pelcida. En los primeros 6 das de desarrollo no se manifiesta aumento de tamao, slo el incremento del nmero de blastmeros. La edad del embrin es establecida a partir del da del estro (d0). Al d1 le corresponde la ovulacin. De esta forma entre 24 y 36 h despus de la fertilizacin el cigoto de una clula se divide en 2 clulas ovales (d2, Fig. 1); 24 h ms tarde (d3) el embrin cuenta ya con 4 clulas. La divisin de los blastmeros puede cumplirse en forma asincrnica, razn por la cual es posible observar en estadios tempranos un nmero impar de clulas. El intervalo entre la divisin ms temprana y la ms tarda es de alrededor de 4h (PEDERSEN, 1988). Hasta el estadio de 8 clulas (d4) el cigoto es transportado a travs del oviducto. El da 5 -aproximadamente- se produce el ingreso al cuerno uterino en estadio de 16 clulas, momento a partir del cual es posible obtener el embrin en forma no quirrgica y evaluarlo de acuerdo a su estadio y calidad. Dentro del 5o dia el cigoto contina su desarrollo a 32 blastmeros y su forma es similar a la de una mora, razn por la cual se lo denomina mrula temprana (Foto 1), en la cual es posible distinguir individualmente a los blastmeros. Su masa celular ocupa casi todo el espacio perivitelino. Mrula compacta Mc, d 5-6, aprox. 32-64 blastmeros. Sus blastmeros estn unidos y constituyen una masa compacta que ocupa slo el 60-70% del espacio perivitelino (Foto 2). La compactacin es considerada como uno de los signos de diferenciacin embrionaria (PEDERSEN, 1988), aunque los blastmeros conserven su capacidad totipotente. Blastocisto temprano Bt, d7 100-200 clulas. Se caracteriza por el comienzo del transporte de fluido en las clulas trofoectodrmicas y por la formacin de una cavidad (blastocele) en el interior del embrin, dando la apariencia de un anillo de sello (LEIBO, 1985). El Bt ocupa 70-80% del espacio perivitelino. Es posible diferenciar el trofoblasto de la masa celular interna (Foto 3). Blastocisto B, d 7-8, 100-200 clulas. Existe una marcada diferenciacin entre las clulas del trofoblasto, que constituyen una pared -que se adosa a la zona pelcida- y la masa celular interna (o disco embrionario) ms oscura (Foto 4). Blastocisto expandido Be, d 7-8, ms de 200 clulas. El dimetro aumenta considerablemente (1,2 a 1,5x), con el consecuente adelgazamiento de la zona pelcida a 1/3 de su espesor original (Foto 5). La presin creciente del blastocisto en crecimiento provoca la ruptura de la zona pelcida, a travs de la cual comienza su protrusin (foto 5, 6, y 7). Los embriones recuperados en este estadio se pueden colapsar temporalmente, esto se caracteriza por una prdida completa o parcial del blastocele. Blastocisto protruido Bp, d 8-9, 200-800 clulas. Los embriones han abandonado la zona pelcida. Su forma puede ser esfrica, con un blastocele bien definido ("burbuja") o colapsado. La identificacin en este estadio puede ser dificultosa para el operador inexperto (Foto 8). Los Bp pueden ser igualmente
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Evaluacin morfolgica de los embriones
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transferidos, sin embargo, los embriones desprovistos de la zona pelcida son extremadamente frgiles y pegajosos, razn por la cual se acostumbra a transferir estadios de Mt a Be. En condiciones naturales, el ovocito liberado y fertilizado sigue el desarrollo mencionado anteriormente. Sin embargo, los ovocitos producidos por hembras superovuladas, en muchos casos, no son liberados simultneamente sino en un perodo de varias horas (LINDNER, 1983, ver tabla 3), CALLENSEN y col. (1986) observaron que vacas superovuladas comenzaban a ovular 24h despus del pico de LH prolongndose la ovulacin an 33h despus del mismo. En consecuencia, los ovocitos liberados no son fertilizados en el mismo momento. Tambin puede ocurrir que el desarrollo de los ovocitos, fertilizados al mismo tiempo, no sea sincrnico. La consecuencia prctica de estos fenmenos es que los embriones obtenidos de una vaca donante se encuentren en diferentes estadios de su desarrollo (mrulas y blastocistos). Estas diferencias pueden ser encontradas en una donante como tambin entre donantes, son dependientes del tipo de tratamiento hormonal y no son consideradas como anmalas siempre que la asincrona no exceda los valores preestablecidos (ver Tablas 1, 2 y 3). Las donantes difieren en su respuesta superovulatoria por factores que dependen de sus cualidades genticas, edad, estado fisiolgico y salud reproductiva. Todos estos factores se traducen en diferencias cuanti- y cualitativas. Las ltimas son importantes de reconocer para determinar qu embriones estn en condiciones de desarrollar y concluir en un ternero vivo, qu embriones estn degenerados y cules presentan anormalidades que permiten tener solo reducidas expectativas de sobrevida (SHEA y col., 1976).
Tabla 1: Cronograma normal del desarrollo de los embriones d6-9 despus de un tratamiento superovulatorio con PMSG (eCG), KAUFFOLD y col. (1985)
Estadios de desarrollo Tipo de desarrollo d6 Mt d7 Mc d8 B Bt Be Mc Bt Retardado (48 h) 8 blastmeros 16 blastmeros Mt d9 Bp Be B B Be Bt
Normal
Ligeramente retrasado (24 h)
16 blastmeros
Mt
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Fig. 1: Desarrollo y trnsito embrionario en el tracto genital
Evaluacin morfolgica Criterios La evaluacin morfolgica de un embrin considera los siguientes criterios sobre las estructuras y cualidades de un embrin de excelente calidad: Forma esferoide Simetra de los blastmeros Apariencia clara y neta de los blastmeros. Tonalidad oscura y uniforme Uniformidad de la membrana celular Proporcionalidad entre el embrin y el espacio perivitelino. Integridad de la zona pelcida Ausencia de vacuolas en el embrin y bridas celulares en el espacio perivitelino Ausencia de detritus celulares adheridos a la zona pelcida Compactacin de los blastmeros entre si
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Foto 1: Mrula temprana d 5 (Mt GII)
Foto 2: Mrulas compactas d 6 (Mc GI-II)
Foto 3: Blastocistos tempranos d 7 (Bt G I)
Foto 4: Blastocistos d 7 (B GI)
Foto 5: Blastocistos expandidos protruyendo d8 Foto 6: Blastocisto expandido protruyendo d 8 (Be (Be GI) GI)
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Foto 7: Blastocistos expandidos d 8-9 (Be GI-II)
Foto 8: Blastocisto protruido y zona pelcida 8-9 (Bp GI)
Foto 9: Blastocistos protruido d 8-9 (Bp GI y III), 16x
Foto 10: Blastocisto protruido (Bp GI) d 9-10 y embrin degenerado (GIV)
Grados de calidad La determinacin del grado de calidad del embrin permite caracterizar en trminos (ms o menos) cuantitativos las posibilidades de desarrollo y posterior nacimiento de un ternero a partir del embrin obtenido (tabla 4). Los diferentes grados de calidad son determinados por medio de la observacin microscpica de la morfologa con ayuda de una lupa estereoscpica (0,7-6,4x). Existen distintas escalas de calidad embrionaria, desarrolladas por distintos equipos de trabajo. Tanto la observacin per se, como la diferenciacin entre un grado y otro es subjetiva y depende, en gran parte, de la experiencia del operador. G I: Excelente, el desarrollo corresponde al da de la recoleccin. No existen defectos visibles. Los blastmeros son claramente visibles, de color y estructura uniformes, simtricos, de forma esferoide y la zona pelcida est intacta (Fotos 2, 5-8 y 10) G II: Bueno, el embrin tiene muy pocos blastmeros desprendidos de la masa celular y/o posee una pequea cantidad de detritus celulares. Su forma puede ser ligeramente irregular (Foto 2, 9). G III: Regular, el embrin posee varios defectos: detritus celulares, forma irregular, de color muy oscuro o muy claro y/o ligero agrietamiento de la zona pelcida (Foto 11). G IV: Malo, el embrin posee muchos defectos: los correspondientes al G III ms desarrollo retardado, seria ruptura de la zona pelcida -el embrin puede encontrarse parcialmente fuera de ella-, forma muy asimtrica, tendencia a la desintegracin como granulacin o vacuolizacin de los
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blastmeros. Incluye tambin a los estadios hasta 8 clulas y la clara degeneracin. Esta categora es considerada como no transferible (Foto 12). Ovocito sin fertilizar (Foto 13) KUZAN (1988) califica a los embriones en 6 categoras. Las primeras 3 coinciden con las del cuadro superior. La 4. caracteriza a los embriones de baja calidad que an son considerados transferibles, la 5. a los degenerados y la 6. a los ovocitos sin fertilizar o a las zonas pelcidas vacas. Un bajo nmero de blastmeros libres no afecta la capacidad de desarrollo del embrin, sin embargo ms de 5 blastmeros separados de la masa celular o degenerados disminuyen su capacidad de sobrevivencia (KUZAN, 1988).
Foto 11: M G III
Foto 12: M G IV
Foto 13: Ovocito sin fertilizar
Foto 14: Existen, como en este caso embriones, sobre los cuales el criterio y experiencia determinarn si son transferibles. Las necesidades y disponibilidad de receptoras, sin embargo, s se transferirn
El xito de la TE depende, entre otros factores, de una intensa experiencia en la evaluacin y manipulacin del embrin. Embriones clasificados como excelentes o buenos tienen una alta probabilidad de alcanzar la preez (60-70%). Embriones calificados como dudosos pueden ser cultivados durante unas horas (2-4) -para evaluar su desarrollo- o transferidos, segn el criterio del operador y los medios disponibles (No de embriones obtenidos, No de receptoras, etc.). No obstante la correcta evaluacin de los embriones obtenidos, es importante tener en cuenta que existen casos en los cuales embriones calificados excelentes luego de una perfecta transferencia no concluyen en una
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preez mientras que embriones de muy baja calidad y transferidos con dificultad, concluyeron en preeces y nacimientos normales (ELSDEN y SEIDEL, 1990). Tabla 2: Cronograma de desarrollo embrionario (%) en varios momentos despus del celo con PMSG (n = 3301 embriones, KAUFFOLD y col., 1985) Estadio 6 2-8 clulas 16 clulas Mt Mc 29,9 11,0 42,6 15,8 7 9,8 2,0 8,5 32,9 Dias despus del celo 8 8,0 0,7 6,2 9,5 ligeramente subnormal retardado Desarrollo
Bt B Be Bp
0,3
26,4 19,1
16,6 45,4 0,8 12,4 normal
0,4
0,9 0,4
Tabla 3: Estadios de desarrollo de embriones recolectados en distintos momentos despus del estro (LINDNER y col., 1983). Estadio de desarrollo embrionario (% del total de embriones recuperados) n= 1043 embriones 16 clulas 10 5 M 55 20 3 Mc 35 67 37 14 Bt 8 30 21 7 B 23 24 22 Be 6 36 4 Bp 1 5 28 total embriones 20 79 274 499 171
Das despus del estro
5 6 7 8 9
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Tabla 4:
Tasas de preez (n) obtenidas en 5 estudios diferentes con embriones clasificados morfolgicamente en distintas categoras. Revisin de BETTERIDGE y col. (1989) ELSDEN & col., 1978 63 (173/275) 58 (88/152) 31 (13/42) 12 (5/42) SHEA, 1981 71 (5/7) 56 (576/672) 44 (57/130) LINDNER & WRIGTH, 1983 45 (130/292) 44 (128/292) 27 (40/149) 20 (10/50) HASLER & col., 1987 73 (4073/5521) 60 (181/304) 41 (31/76) HASLER & col., 1987 83 (451/542) 75 (307/408) 63 (135/214) 46 (6/13)
Calidad* A B
* Las clasificaciones varan entre autores. A es excelente y D malo
La evaluacin morfolgica de los embriones es uno de los pasos ms importantes para el xito de un programa de transferencia de embriones. Determinar la transferencia de un embrin exclusivamente a travs de sus cualidades morfolgicas es, sin embargo, una equivocacin. Otros factores como el valor del embrin en particular y tambin la disponibilidad de receptoras son importantes en la decisin. Es conveniente adems acentuar que una estricta seleccin de los embriones por medio de su evaluacin morfolgica aumenta la tasa de gestaciones por transferencia pero, al mismo tiempo, disminuye la tasa de preez por cada donante (BETTERIDGE y col., 1989).
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Transferencia de los embriones
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TRANSFERENCIA DE LOS EMBRIONES G.A. Palma Introduccin El desarrollo de la transferencia de embriones fue paralelo al de la recoleccin. Cuando los embriones fueron recolectados 5-7 das despus del estro por medio de ciruga y bajo anestesia general, las receptoras fueron preparadas para la transferencia bajo las mismas condiciones que las donantes. En un esfuerzo por eliminar los problemas asociados con la anestesia general, sin alterar la eficacia de la recoleccin quirrgica, algunos grupos cambiaron hacia el uso de la anestesia local. Esta variante fue aplicada inmediatamente a las receptoras. Su empleo exitoso permiti que se siga utilizando en la prctica. Los resultados obtenidos empleando la transferencia no quirrgica se aproximan a los obtenidos con el mtodo quirrgico, razn por la cual esta ltima tcnica tiene actualmente pocos usuarios.
Transferencia quirrgica La primera transferencia quirrgica con xito en bovinos fue lograda por WILLET y col. en 1951. Los autores practicaron la ciruga bajo anestesia general, con el animal en posicin decbito dorsal y por la lnea media. El cuerno uterino ipsilateral al ovario con cuerpo lteo era presentado para ser punzado. Una pipeta -conteniendo el embrin- era introducida a travs del punto de puncin y el embrin era expulsado en la luz uterina en un volumen mnimo de medio (0,2 ml). AVERY y col. (1962) simplificaron la tcnica quirrgica transfiriendo los embriones a la receptora en pie y por el flanco. A fin de determinar a priori qu cuerno era el ipsilateral a la ovulacin, se procedi a palpar previamente a las receptoras. La eleccin del flanco a incidir lo determina el ovario ovulado. Esta laparotoma lateral es adoptada en la actualidad para una parte de las transferencias de embriones. La anestesia local puede ser complementada con una paravertebral (60 ml de Procaina 2% en plano). La transferencia es practicada a travs del borde dorsal en el tercio anterior del cuerno. Los problemas de esta tcnica lo constituyen: la dificultad de exteriorizar el cuerno uterino sin causar traumas en el tracto genital, especialmente en vaquillonas, vacas muy grandes y gordas (ELSDEN y SEIDEL, 1990) El embrin puede ser transferido con una pipeta Pasteur o pajuela plstica (0,25 -0,50 ml). La sutura se hace segn los mtodos de rutina. La preez con esta tcnica vara entre 70-80%, con embriones frescos (BAKER y col., 1984; TAKEDA y col. 1986) y aproximadamente 10% menos con embriones congelados. Una variante quirrgica posible es la extraccin del cuerno por el fondo de la vagina. Se practica una incisin con un bistur oculto en la pared dorsal del fondo de la vagina entre su pared dorsal y la crvix. Esta zona tiene escasa irrigacin. Se debe empujar la crvix hacia abajo antes de punzar para evitar lesionar el recto. A travs de la incisin se extrae el cuerno uterino llevndose a cabo la deposicin del embrin.
Transferencia no quirrgica Es la tcnica de eleccin en la actualidad. La primera transferencia no quirrgica con xito en bovinos fue lograda por MUTTER y col. en 1964, atravesando la crvix con una pipeta de inseminacin. El xito fue precedido, sin embargo, de muchos fracasos como consecuencia, aparentemente, de infecciones y contracciones uterinas provocadas en el intento. Los envases para los embriones y los instrumentos
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empleados en la transferencia son de diverso material y tamao. En la actualidad los catteres de transferencia estn adaptados a las pajuelas de 0,25 ml (Foto 1), que sirven como envases para los embriones. Los catteres son metlicos o de material plstico. El catter metlico es de acero inoxidable (Foto 2), su punta atraumtica posee un orificio lateral, por donde es expulsado el embrin. El tubo del catter est dividido en dos partes unidas a rosca, a fin de introducir la pajuela en su interior. La rigidez de este catter permite introducirlo ms fcilmente a travs de la crvix de vaquillonas que los de plstico. Estos ltimos son ms finos que los metlicos, debido a su flexibilidad de eleccin para vacas multparas, se presentan estriles y son descartables.
Foto 1: Pajuelas de 0,25 ml empleadas para la transferencia
Foto 2: Cateter de transferencia metlico MT con punta metlica destornillable, Minitb, Alemania
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Foto 3: Cateter metlico con puntas metlicas, plsticas, estriles y descartables. Minitb, Alemania Al comienzo de la dcada del '80 se estableci como el lugar ptimo para la transferencia quirrgica del embrin el tercio anterior del cuerno uterino (NEWCOMB y ROWSON, 1980), basado en que los embriones d7-8 se localizan en el tero a 5-6 cm de la unin tero-tubrica (STRABERGER, 1982). Esto no es posible en la transferencia no quirrgica con un catter rgido, como consecuencia de la curvatura uterina (NEWCOMB, 1982). Trabajos posteriores no encontraron diferencias en el xito de la transferencia comparando el tercio anterior con el medio y estimaron que el intento de transferir los embriones por delante del tercio medio con un catter rgido poda conducir a traumatismos de la mucosa uterina con muerte embrionaria (SREENAN y DISKIN, 1987). El lugar de eleccin para obtener resultados aceptables es por delante del ligamento intercornual (MITCHELL WEST y DONALDSON, 1984). El procedimiento de la transferencia no quirrgica tiene la desventaja frente al quirrgico de requerir destreza, experiencia y particularmente mucho cuidado en la manipulacin del catter en el cuerno y el cuerpo del tero. El trauma provocado, especialmente en el endometrio, puede provocar la liberacin de prostaglandinas. Estas pueden causar respuesta inflamatoria, disminucin de los niveles de progesterona y aumento de la contractilidad uterina, que interfieren con la vida media del cuerpo lteo y en consecuencia con la sobrevida del embrin. Con el aumento del tiempo de manipulacin tambin se incrementa el efecto traumtico de la transferencia, cuando la maniobra de transferencia dura ms de 3 minutos (GORDON, 1976) o si es llevada a cabo con torpeza se provoca irritacin del endometrio, que puede conducir a una disminucin del xito de la transferencia (BOLAND, 1976). TERVIT y col. (1980) observaron que la preez tendi a ser afectada linealmente por el tiempo necesario para la transferencia entre 0.7 a 6.3 minutos con un promedio de 1.8 minutos. La diferencia fue significativa (p< 0,10). Aunque algunos autores sostienen que la crvix no es susceptible a los efectos traumticos (CHUPIN, 1988), es conveniente, sin embargo, no subestimar su insensibilidad con una brusca manipulacin. Las lesiones pueden provocar la interrupcin de la fase luteal con el acortamiento consiguiente del ciclo a menos de 16 das como consecuencia de la liberacin de PGf2alfa (TERVIT, 1980). Un trauma mecnico puede provocar, adems, ingreso bacteriano en la luz uterina, causando endometritis subclnica -favorecida por el nivel de progesterona de la fase diestral-, que interfiere tambin con la vida del embrin. La receptora retorna al celo entre 24-39 das despus de la transferencia.
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Para evitar el efecto traumtico de la manipulacin sobre el endometrio se pusieron a prueba drogas para inducir la relajacin de la musculatura lisa del tero (relajantes uterinos) y/o anestsicos locales (anestesia epidural, captulo V). Los relajantes uterinos se emplearon por primera vez en la estacin de inseminacin artificial y transferencia de embriones de Neustadt a.d. Aisch, Alemania (HAHN y col. 1975) y son empleados en la actualidad por algunos grupos de trabajo (HAHN, 1990). Los resultados obtenidos por otros grupos de trabajo no apoyan los obtenidos por HAHN y col. (1975) y HAHN (1990). Por el contrario otros autores encontraron que el empleo de Clenbuterol (Planipart, Bohringer) no increment la tasa de preez de las receptoras (tabla 1). WENKOFF (1986) observ, en un ensayo realizado con 4796 receptoras, una disminucin del 10% de preez cuando aplic una dosis de 10 ml i.m. de Clenbuterol 60-90 minutos antes de la transferencia. Esa diferencia no fue significativa pero s fue considerada como una tendencia importante (WENKOFF, 1986). Las posibles causas de la menor tasa de gestacin fueron asociadas a la dilatacin de la vagina y recto como consecuencia del ingreso de aire y la distencin de la vejiga con orina, que dificultaron los procedimientos de la transferencia. Ello estara apoyado por el efecto positivo del tratamiento, aplicado 30-180 minutos previo a la transferencia quirrgica (MAPLETOFT y col. 1986). En la actualidad se aplica el relajante uterino aproximadamente 5 minutos antes de la transferencia (LEIDING, 1991), a fin de evitar dichos efectos negativos. Sin embargo ese tiempo es reducido para que la droga tenga efecto. El componente psicolgico de xito o fracaso establece una presin considerable sobre el operador principiante y en consecuencia puede actuar negativamente sobre las posibilidades de xito. Una medida preventiva es realizar las transferencias slo si existen buenas condiciones para ello. Particularmente tranquilidad de los animales (uso de tranquilizantes si fuera necesario) y una buena anestesia epidural. Estas medidas son ms importantes si se trabaja con animales nerviosos y/o indciles.
Foto 4: Quicklock ET de acero inoxidable, soporte de las vainas descartables estriles Transfit. Minutb, Alemania
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Tabla 1: Efecto del Clenbuterol sobre la preez (%) de receptoras con diferentes dosis y tiempos de efecto en minutos (min) en 5 estudios diferentes P r e e z* clenbuterol control 166/262 87/149 (63) (58) 13/28 12/22 (46) (55) 104/189 99/185 (53) (53) 108/213 150/307 (49) (51) 13/34 15/38 (38) (39)
dosis 5 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml *( ) = %
min 20 30 5 30 a 180 5
Autor
COULTHARD (1982) SREENAN (1983) BARNES y FIRST (1985) MAPLETOF y col. (1986) GREGORY y RODRIGUES (1986)
Procedimiento El embrin se carga en la pajuela de 0,25 ml. La pajuela es cargada en primer lugar con medio de cultivo (aprox. 3,5 cm de su longitud), se deja un espacio con aire (1,0 cm) y luego se carga el embrin contenido en el medio. Posteriormente la segunda columna de aire y la ltima nuevamente con medio. La columna con medio de cultivo (PBSS), ubicada en el extremo abierto de la pajuela, limpia a sta en el momento de la descarga. La presencia de las columnas con aire impiden el desplazamiento de la columna central que contiene el embrin. La ltima garantiza la descarga del embrin por efecto de arrastre (Fig. 2). La pajuela es colocada en el catter de transferencia estril o conservada en un termo seco con temperatura constante a 20o-37oC. El catter de transferencia ser cubierto por una envoltura plstica (camisa sanitaria), vaina plstica rgida o por su envoltura original. Las dos primeras son adecuadas para la transferencia. La camisa sanitaria (IMV, Francia) permite, dada su finura y elasticidad (foto 5), introducir el catter en el interior de la crvix. La vaina plstica rgida (Minitb, Alemania, foto 6) se puede introducir slo hasta la porcin cervical de la vagina. Ello representa una ventaja para la camisa sanitaria que permite mantener el catter libre del contacto con las secreciones y exudados vaginales, como es el caso de las receptores tratadas con el espiral PRID. Hasta la transferencia el catter puede ser conservado a temperatura ambiente (20C). El traslado al lugar de transferencia debe hacerse evitando cambios de temperatura y en posicin horizontal.
Foto 6: Vaina protectora plstica estril, Minitb, Alemania
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Aire Medio
Aire Medio
Embrin en medio
Figura 2: Cargado de la pajuela
Antes de la transferencia deber ser evaluada la presencia de un cuerpo lteo. Parece razonable considerar la calidad del CL, a partir de su tamao y consistencia, como un factor asociado al xito en la seleccin de receptoras (DONALSON, 1985; HASLER y col., 1987), cuadro 1. Cuadro 1: Criterios de clasificacin de un CL normal de 7 das - Su tamao equivale a 1/3 a 1/2 del volumen ovrico - Su masa es elstica - Su fijacin no es fuerte, son fcilmente enucleables - Si el cuerpo lteo se encuentra en el interior del ovario: comparar el tamao del ovario con el contralateral. La diferencia deber corresponder a la relacin mencionada
Los criterios de evaluacin de la calidad de los cuerpos lteos son variables, sin embargo los esfuerzos por aumentar de esta manera el xito de la transferencia no arrojaron los resultados esperados. No fue posible establecer una relacin entre la calidad del cuerpo lteo y la preez de una recepetora (DONALSON, 1985; HASLER y col., 1987, tabla 2; LIEBRICH, 1991; tabla 3).
Foto 4: Camisa sanitaria IMV, Francia
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Tabla 2: Efecto de la calidad del CL sobre la tasa de preez despus de la transferencia de embriones (HASLER y col., 1987). Transferencias n 1193 348 58 Preez n 911 251 46 % 76 72 79
Calidad del CL 1 2 3
Una explicacin para ello es que la apariencia del CL a la palpacin no indica su capacidad de producir progesterona ni predice su comportamiento futuro. Tabla 3: Relacin entre la calidad del cuerpo lteo y la preez de las receptoras despus de la transferencia de embriones producidos in vitro (LIEBRICH, 1991) Calidad del CL Animales n Muy buena Buena Regular y mala 155 78 98 331 Preez (d 35 % 76 40 51 167 n 49 51 52 50
La relacin entre los niveles sanguneos de progesterona y la tasa de sobrevida embrionaria tampoco pudo ser definida con xito (SREENAN y DISKIN, 1987) por que no pudieron observarse diferencias entre la concentracin srica de progesterona previa a la transferencia de las receptoras que posteriormente permanecan preadas de las que no lo hacan (HAHN y col., 1977; HASLER y col., 1980; ELLINGTON y col, 1992). LIEBRICH (1991) no pudo establecer relaciones vlidas entre la calidad del cuerpo lteo y los niveles de progesterona (tabla 4). Tabla 4: Relacin entre la calidad del cuerpo lteo y los niveles de progesterona de las receptoras 2 das antes de la transferencia (LIEBRICH, 1991) Receptoras n 150 75 88 Nivel de progesterona ng/ml 1,37 1,30 1,15 1,02 0,85 0,90
Calidad del CL Muy buena Buena Regular a mala n.s
Los intentos por establecer una terapia suplementaria de progesterona, como as tambin incrementar el efecto luteotrfico con HCG (CHRISTIE y col., 1979) como medidas profilticas no lograron mejorar la probabilidad de gestacin. Estudios realizados con HCG indicaron la formacin de cuerpos lteos
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accesorios, que sin embargo no tuvieron un efecto diferente sobre la tasa de preez ni sobrevida del embrin (CHRISTIE y col., 1980; DE LOS SANTOS-VALADEZ y col., 1982; GREVE y col., 1982; LOONEY y col., 1984; HEYMAN, 1985). No obstante las reiteradas referencias VESELINOVIC (1990) logr aumentar hasta un 14% la tasa de preez administrando 1500 UI de HCG despus de la transferencia, lo que indica la contradiccin de las experiencias realizadas. ELLINGTON y col. (1992) evaluaron el efecto de la Buserelina, un anlogo sinttico de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH). Los autores no encontraron un efecto luteotrfico de la hormona que mejorara la tasa de preez del grupo tratado frente al control (tabla 5). De forma similar que con el CL no se conoce an con exactitud un nivel circulante de progesterona prximo o en el momento de la transferencia (d6-8) que caracterice a una buena receptora (SREENAN y DISKIN, 1987). Tabla 5: Tasa de preez asociada con la aplicacin de Buserelina (Receptal, Hoechst) en distintos momentos de la transferencia (ELLINGTON y col., 1992) Buserelina Control Receptoras (n) n.s Introduccin del catter de transferencia Una vez realizada la palpacin genital y el vaciado del recto un asistente deber lavar y secar la vulva y la zona perineal. Para los animales indciles se recomienda la administracin de anestesia epidural (Lidocaina 2%, 4-7 ml) para impedir las contracciones rectales y poder manipular el tero eficazmente. Para introducir el catter en la vagina se deben separar los labios de la vulva a fin de colocar ste directamente en el vestbulo. A veces es necesario empujar el instrumento en direccin crneo-dorsal. Si los pliegues de la mucosa vaginal impiden el avance del catter es posible evitarlos estirando la crvix hacia craneal. Cuando la punta del catter est frente a la crvix (sto es verificable palpndola con el dedo meique) es importante que el asistente tome los bordes de la camisa sanitaria y tire sta hacia atrs para liberar el catter. Si se emplea la vaina protectora plstica (Minitb), el procedimiento es similar, slo que puede realizarlo el mismo operador. El catter es introducido en la crvix, su penetracin debe hacerse manipulando el rgano siempre por delante del instrumento. Los movimientos son similares a los de la inseminacin artificial, de dorsal a ventral y viceversa y a ambos lados mientras se empuja, simultneamente, el catter. La presin debe ser suave y sobre todo controlable. Un exceso puede provocar que, al presentar correctamente el ltimo anillo cervical, el catter penetre con tanto impulso que perfore el cuerpo del tero. Antes de atravesar el ltimo anillo es importante que el operador incline su atencin al tero, estableciendo nuevamente su posicin, tamao y grado de curvatura para determinar con mayor precisin la longitud a recorrer y su grado de complejidad (curvatura). Con los cuernos en la posicin adecuada, el operador podr atravesar el ltimo anillo cervical e ingresar al cuerno uterino ipsilateral a la ovulacin. Para ello se deber tomar suavemente el cuerno y presentarlo frente a la punta del instrumento, algo ms levantado que la crvix. Si la mano que fija la crvix es la opuesta al cuerno a transferir, el rgano contralateral puede ser usado para facilitar la penetracin. Sosteniendo a ste en su segmento medio-ventral se fija el cuerno uterino, estirndolo y empujando ligeramente el catter hacia craneal. La operacin debe repetirse introduciendo el catter en 68% (175/258) a la transferencia 72% (183/154) 4-7 das despus de la transferencia 66% (167/252)
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el cuerno lo necesario para superar la lnea transversal que establece el ligamento ancho y tan profundamente como sea posible sin resistencia alguna. Si la mano es la del mismo lado que la del cuerno ipsilateral, la fijacin se puede realizar tambin en el ligamento lateral, operando de igual forma que en el caso anterior. Es importante tener en cuenta que la manipulacin del cuerno uterino deber hacerse con cuidado Resultados de la transferencia Existen tantas formas de interpretar los resultados de un Programa de transferencia de embriones como factores que lo afectan. En ese sentido es interesante recordar lo afirmado por ELSDEN y SEIDEL (1990): "El xito es una manifestacin estadstica, sta permite resumir los resultados de un grupo de donantes pero no puede ser extrapolada a una sola vaca. El siguiente ejemplo representa una situacin tpica de 12 donantes que fueron superovuladas. El lavaje uterino fue llevado a cabo en 10 donantes porque una no tuvo respuesta en un ovario y la segunda no present celo. Despus de la recoleccin se obtuvieron embriones de buena calidad de slo 8 vacas y a la palpacin rectal de las recipientes slo 7 donantes produjeron embriones que terminaron en una preez. De 30 gestaciones los resultados de la transferencia de embriones pueden ser representados de la siguiente manera: 1) 2,50 preeces/donante, considerando las 12 donantes; 2) 3,00 preeces/donante, considerando los 10 lavajes realizados; 3) 3,75 preeces/donante, considerando las 8 donantes de buenos embriones y finalmente 4) 4,29 preeces/ donante, considerando las 7 vacas que condujeron a una preez". Ello conducira a pensar que los altos resultados presentados por algunas empresas comerciales no necesariamente son mejores que los bajos resultados obtenidos en general por centros de investigacin sin fines de lucro.
Tasa de preez Actualmente la tasa de preez con esta tcnica vara entre 60-70% con embriones frescos y de buena calidad (SCHNEIDER y col., 1980; McEVOY y SREENAN, 1990), 50-60% con embriones producidos in vitro (LIEBRICH, 1991) y obtenidos in vivo congelados/descongelados. La diferencia de preez del 1020%, entre esta tcnica y la quirrgica, podra ser explicada por las infecciones provocadas al introducir el catter de transferencia, va vagina, en el tero, particularmente susceptible de infecciones entre el da 6-8 del ciclo (WRIGHT, 1981). El grado de sincronizacin que se establece entre la donante y las receptoras se sum a la lista de factores que condicionan el xito de una transferencia. Cuando el intervalo entre la ovulacin y el lavaje de la donante es igual al comprendido entre la ovulacin y la transferencia de la receptora, se habla de una transferencia sincrnica. Este se mide en trminos positivos (+) o negativos (-). Si, por ejemplo, el intervalo ovulacin-transferencia en la receptora es un da mayor que el intervalo ovulacin-lavaje de la donante, se habla de un asincronismo de +24 h. Por el contrario -24 h significa que el intervalo de la receptora es un da ms corto que el de la donante. Para la transferencia de embriones LINDNER y WRIGHT (1983) toleraron hasta 48 h de asincronismo, actualmente el grado de asincronismo no debe superar las 24 h. Sincronicidad donante/receptora y embrin/receptora La sincronicidad entre el momento del ciclo de la receptora y el estadio en que se encuentra el embrin parece constituir un ndice ms vlido de las posibilidades de xito de la transferencia (LINDNER y WRIGHT, 1983, Tablas 6 y 7), razn por la cual deber ser tenido en cuenta al hacer la transferencia.
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Tabla 6: Cdigo de desarrollo embrionario segn LINDNER y WRIGTH (1983) Estadio Mt Mc Bt B Be Bp Cdigo de desarrollo (estimado en das) 5 6 7 7 8 9
Tabla 7: Efecto de la sincronicidad del ciclo de la donante con la receptora y de la receptora con el estadio de desarrollo embrionario sobre la tasa de preeza (LINDNER y WRIGTH, 1983) Sincronicidad donante/receptora preeces n n % 27 87 158 l75 137 11 41 64 86 56 (41) (47) (41) (49) (41) Sincronicidad receptora/embrin preeces n n % 76 148 204 98 58 20 73 107 45 13 (26)c (49)d (52)d (46)d (22)c
Sincronicidad das +2 +1 0 -1 -2
a: c,d:
Slo fueron incluidos embriones de excelente y buena calidad Porcentajes en la misma columna con diferente letra difieren estadsticamente (p<0,001)
La probabilidad de gestacin depende tambin del estadio en que se encuentra el embrin en el momento de la recoleccin. La transferencia de mrulas tempranas, por ejemplo, alcanz una tasa de preez significativamente inferior (p<0,05) frente a otros estadios ms desarrollados (tabla 8, SCHNEIDER y col., 1980). Incluso se observ una tendencia creciente en la tasa de gestacin a medida que avanza el desarrollo del embrin. Una posible explicacin para ello sera que las mrulas tempranas se encontraron retardadas en su desarrollo de acuerdo al momento de la recoleccin al 6o8o das de la recoleccin (ELSDEN y col., 1978; HASLER y col., 1987). Una segunda explicacin posible es que los defectos morfolgicos son ms fciles de observar en estadios embrionarios avanzados (HALLEY y col., 1979). Tabla 8: Efecto del estadio del embrin sobre la tasa de preez (SCHNEIDER y col., 1980) Embriones transferidos 586 1178 600 139 Preez n 359 792 402 99 % 61a 67b 67b 71c
Estadio Mt Mc Bt Be
a,b tasas de preez con diferente letra son significativamente diferentes (p<0,05)
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Estas observaciones se repiten en el desarrollo de los embriones producidos in vitro. El hecho que un embrin haya alcanzado el estadio de morula temprana no significa que est en condiciones de alcanzar el estadio inmediato superior. Un estadio ms avanzado significa una posibilidad mayor de prosperar en una gestacin. La presencia de grandes blastmeros y la falta de otras estructuras diferenciadas en una morula temprana dificultan una evaluacin eficaz, comparada con la que se lleva a cabo con los otros estadios superiores, por falta de ms puntos de referencia. Los criterios y particularmente las grados de calidad en la evaluacin morfolgica son subjetivos y varan entre grupos de trabajo. Si bien dichos criterios muestran en muchos casos diferencias significativas en el xito de la transferencia (HASLER y col., 1987; tabla 9) se ha observado en el cultivo de embriones recolectados in vivo que aproximadamente el 60% de los embriones calificados como aparentemente degenerados continuaban su desarrollo (SREENAN y DISKIN, 1987). Estas observaciones se verifican en el cultivo de los embriones producidos in vitro, clonados o microinyectados con genes, cuya apariencia morfolgica est afectada por su origen o los tratamientos. Particularmente en los primeros, con los cuales ya existe experiencia en la prctica, se acenta la necesidad de adecuar los criterios de evaluacin morfolgica al tipo de embrin, producto de la fecundacin y cultivo in vitro, a fin de no eliminar los embriones que pueden continuar con una gestacin. La tasa de preez de los embriones producidos in vitro es similar a la de los obtenidos in vivo (LIEBRICH, 1991, tabla 10) aunque la apariencia morfolgica de los primeros dista de responder a los criterios establecidos para los segundos. La transferencia de un slo embrin se lleva a cabo en el cuerno ipsilateral de acuerdo a la relacin establecida entre el cuerpo lteo y el cuerno uterino adyacente. La transferencia de ms de un embrin es posible llevarla a cabo en forma bilateral. Esto significa que un embrin deber ser colocado siempre en el cuerno ipsilateral a la ovulacin. La transferencia de un solo embrin en el cuerno contralateral provoca una alta mortalidad embrionaria dado que las seales luteotrficas y antiluteolticas del embrin fallan en alcanzar el CL del lado opuesto a la transferencia (SREENAN y DISKIN, 1987). Tabla 9:
Efecto del tipo de calificacin y calidad del embrin sobre la preez despus de la transferencia (HASLER y col., 1987) Calidad del embrin Aos 1980-1983 Buena Regular Mala Aos 1985-1986 1 2 3 4 542 408 214 13 451 307 135 6 83a 75b 63c 46c Transferencia n 5521 304 76 Receptoras preadas n % 4037 73a 181 31 60b 41c
a,b,c calidad de los embriones con diferentes letras comprendidas en el mismo grupo de aos difieren estadsticamente (p<0,01)
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Tabla 10: Preez obtenida despus de la transferencia de embriones de diferentes calidades producidos in vitro (LIEBRICH, 1991) Transferencias n Muy buena Buena Regular y mala 61 41 27 129
a,b diferentes estadsticamente, p<0,05 (t-test)
Calidad
Preez (d 35) n 33 21 7 61 % 54a 51 26b 47
El empleo reiterado de receptoras abre el interrogante sobre cuntas veces puede repetirse la transferencia a una misma receptora. LIEBRICH (1991) no encontr diferencias estadsticas entre receptoras que quedaron preadas despus de la primera transferencia de las que lo hicieron despus de la tercera (tabla 11) empleando embriones producidos in vitro. La tasa de preez tendi, sin embargo, a disminuir con el aumento del nmero de transferencias en la misma receptora. Tabla 11: Tasas de preez (n) despus de la 1o, 2o y 3o transferencia de embriones producidos in vitro a la misma receptora (LIEBRIECH, 1991) Transferencia 1o 2o 3o Receptoras n 183 108 40 Preez n 102 50 15 % 56 46 37
La transferencia de los embriones obtenidos o producidos constituye el ltimo paso de la tcnica, su xito depender del grado de idoneidad y experiencia, requeridos tambin para el resto de las actividades. La tasa de preez obtenida no ser slo el producto de la transferencia per se sino de la suma de los actividades realizadas hasta el momento y de los factores dependientes de la donante, el semen, el embrin y la receptora. La competencia profesional en ejecutar con xito cada uno de los diferentes pasos permitir alcanzar resultados ptimos y repetibles.
Bibliografa BAKER, R.D., EBERHARD, B.K., LEFFEL, R.E., RHODE, R.F. and HENSCHEN, T.J. 1984. Pregnancy rates following surgical transfer of bovine demiembryos. En: 10th international Congress on animal reproduction and artificial insemination. Illinois, U.S.A. 220. BARNES, F. and FIRST, N.L. 1985. The effect of clenbuterol on producing pregnancy from bovine embryo transfer. Theriogenology, 23: 172. BOLAND, M.P., CROSBY, T.T. and GORDON, I. 1976. Unpublished data cited by GORDON, I. Cattle twinning by the egg transfer aproach. In: Egg transfer in cattle, ROWSON, L.E.A. (ed), Commission of the European Communities, Luxemburg 305-319. BRAND, A. y HOOGENKAMP, H. 1982. Embryotransfer. En: Fertilittsstrungen beim weiblichen Rind. Grunert, E., M. Berchtold (eds.). Paul Parey 463-475. CHUPIN, D. 1988. Comunicacin personal.
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Conservacin de embriones
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CONSERVACION DE LOS EMBRIONES J. Cabodevila Introduccin Los embriones bovinos son recolectados en una solucin salina buffer fosfato (PBS Dulbecco) suplementada con 1% de suero o 0,1% de albmina srica (PBSS). A medida que los embriones son localizados bajo la lupa estereoscpica, se los coloca en PBSS con un porcentaje mayor de suero (10 20%) o albmina 4%. Permanecen en este medio, a la temperatura del laboratorio 20-25C hasta que se realiza la transferencia o se lleva a cabo otra manipulacin. La manipulacin de los embriones in vitro se lleva a cabo siguiendo las disposiciones establecidas por la Sociedad Internacional de Transferencia Embrionaria (IETS) a fin de prevenir la transmisin de enfermedades (Manual de la Soc. Int. de Transferencia Embrionaria, cap. XVI) Una evaluacin morfolgica detallada, a mayor aumento, considerando estadios de desarrollo y cualidades estructurales permite determinar que embriones estn en condiciones de ser transferidos (LINDNER y col., 1983). La transferencia en fresco debe ser realizada dentro de las 3-4 hs postrecoleccin (GARCIA y col., 1986). Los embriones pueden ser conservados in vitro para su posterior transferencia mediante: Cultivo a 37o C, refrigeracin entre 0o C y 4o C o congelacin a -196oC (TROUNSON y col., 1976). A continuacin, se analiza en detalle cada una de estas tcnicas: Cultivo a 37oC Los embriones bovinos pre-implantados generalmente son recolectados entre el sexto y octavo da de vida, empleando el mtodo no quirrgico. El cultivo es utilizado para evaluar el resultado de distintas manipulaciones (congelacin, micromanipulacin, etc.) que se efectan con los embriones pero no como un paso previo a la transferencia. Esto obedece a dos razones principales: En primer lugar, a que los embriones continan desarrollando durante el cultivo, por lo tanto, esta tcnica no puede ser utilizada para conservar un embrin hasta que una receptora asincrnica alcance el sincronismo ptimo (WRIGHT, 1976). Por otra parte, se ha observado que los porcentajes de preez disminuyen cuando se transfieren embriones que han sido cultivados (WHITTINGHAM, 1975 y 1976; HEYMAN, 1984). ELSDEN (1984), sostiene que la viabilidad embrionaria se ve seriamente disminuida cuando la extensin del cultivo es mayor de 24 horas. El cultivo de embriones se realiza en medios cuyo pH oscila entre el 7,2 y 7,6 y cuya osmolaridad vara entre 270 y 310 mOsm. El PBSS modificado por WHITTINGHAM (1971) es el medio utilizado comnmente cuando el cultivo no se extiende por ms de 24 horas. Los medios conteniendo bicarbonato, tal es el caso del Ham F-10 y del B2 de Menezo, son ms apropiados para el cultivo de embriones pero requieren una atmsfera controlada, con presencia de CO2 para mantener el pH fisiolgico. Estos medios son utilizados en cultivos cuya duracin es mayor de 24 horas (RAJAMAHENDRAN y col, 1985). Al medio de cultivo, al igual que al de recoleccin, se le incorpora una fuente de protenas. Esta se efecta con la suplementacin del medio de cultivo con 10% de suero 0,4% de albmina. La suplementacin proteica tiene distintos fines, los ms importantes son:
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- Reducir la tensin superficial para favorecer la sedimentacin de los embriones y evitar que estos se adhieran a algn elemento utilizado para su manipulacin. - Incorporar sustancias promotoras del crecimiento que favorecen el desarrollo embrionario. - Absorber e inhibir metales pesados txicos que pueden estar presentes en el medio. El medio de cultivo se esteriliza por medio de filtracin a travs de membranas de 0,22m de dimetro de poro. Adems, se le adicionan antibiticos, generalmente penicilina, estreptomicina y kanamicina. La temperatura corporal de la especie embrionaria en cuestin es la ideal para el desarrollo de los embriones in vitro. Sin embargo, cuando las condiciones de cultivo dejan de ser ideales -ocurre fcilmente cuando se utilizan soluciones salinas balanceadas- es conveniente que la temperatura del cultivo est debajo de la corporal (no ms de 4C). De esta manera, los efectos txicos del medio son menos pronunciados y tambin es menor la evaporacin (HEATH, 1990). Refrigeracin 0-4oC La refrigeracin se efecta vehiculizando los embriones en PBSS envasados en pajuelas de 0,25 ml y colocadas en un refrigerador (comn o porttil) Se utiliza hielo y agua para regular el descenso de la temperatura, de manera similar a como se realiza la estabilizacin durante la congelacin de semen. En los ltimos aos, con la transferencia no quirrgica de embriones refrigerados durante uno a tres das, se han obtenido porcentajes de preez que oscilan entre el 44 y el 50% (Tabla 1). Estos resultados superan claramente a los obtenidos previamente (BON DURANT y col., 1982; BOUYSSOU y CHUPIN, 1982; LIDNER y col., 1982). A partir de los avances registrados, la refrigeracin de embriones puede ser considerada como una alternativa interesante cuando no sea posible recurrir a la congelacin. Por ejemplo, puede ser utilizada para enviar embriones a ser transferidos en lugares distantes de donde se encuentran las donantes (LEIBO y WINNINGER, 1986, REFSDAL y col., 1988). Tambin puede emplearse esta tcnica para conservar embriones hasta que receptoras asincrnicas alcancen la sincronizacin adecuada. Tabla 1: Resultados obtenidos con la transferencia no quirrgica de embriones refrigerados. Duracin de la refrigeracin 24h 48h Embriones transferidos 19 16 Receptoras preadas 9 (47) 8 (50)
Autor/res REFSDAL y col. (1988) BEZUGLY y col. (1988)
hasta 72h 222* 98 (44) LINDNER (1985) *De 227 embriones refrigerados, 5 fueron descartados en la evaluacin morfolgica realizada antes de la transferencia.
Congelacin a -196C Es la tcnica de eleccin para conservar embriones in vitro. Se considera que los embriones pueden ser mantenidos a -196C durante doscientos aos o ms, sin afectar sus viabilidad y sin causarles cambios genticos (SCHNEIDER y MAZUR, 1986). Este hecho, convierte a la congelacin de embriones en una herramienta insustituible para el comercio internacional de reproductores.
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El empleo de los embriones congelados, entre otras cosas, posibilita: - Utilizar eficientemente donante y receptoras. - Incorporar progreso gentico a bajo costo, comparando los valores del embrin y el de su transporte frente a los animales en pie. - Transferir algunos embriones y conservar el resto hasta poder analizar los registros de produccin de la descendencia. - Controlar enfermedades exticas, reemplazando la importacin de animales en pie por la de embriones congelados libres de ellas. - Conservar razas en vas de extincin. - Crear bancos de germoplasma de valor pecuario LEIBO (1989) resume la congelacin de embriones en cuatro etapas fundamentales comunes a los distintos mtodos utilizados. Ellas son: - Exposicin de los embriones a agentes crioprotectores. - Enfriamiento desde temperaturas fisiolgicas hasta temperaturas lo suficientemente bajas como para causar un virtual cese de todas las reacciones qumicas inducidas trmicamente. - Calentamiento desde la temperatura de conservacin (-196oC) a temperaturas fisiolgicas. Si bien el resultado de la congelacin depende fundamentalmente de la forma en que se llevan a cabo estos procedimientos, est condicionado previamente por dos factores. Ellos son: la calidad del embrin y el tiempo que transcurre desde la recoleccin hasta que comienza la congelacin. Cuando se congelan embriones de calidades muy buena y buena (grado I y II) se obtienen mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad regular (grado III) (KENNEDY y col., 1983; LEIBO, 1984; HUMBLOT y col., 1987). Por su parte, los porcentajes de preez resultantes de la transferencia de embriones congelados son inversamente proporcionales al tiempo transcurrido desde la recoleccin hasta el comienzo de la congelacin (WRIGHT, 1985). La viabilidad embrionaria disminuye significativamente cuando dicho perodo es mayor de 3 h (PETIT, 1985). Los embriones pueden ser conservados a -196oC utilizando el mtodo de congelacin standard, la vitrificacin o el mtodo de congelacin rpida. La principal diferencia que tiene el mtodo de congelacin standard con respecto a los otros es que en l, el descenso de temperatura se efecta de manera controlada utilizando equipos programables (fotos 1 y 2). A continuacin, se analiza ms detalladamente cada uno de estos mtodos:
Mtodo de congelacin standard Este mtodo posibilit a WILMUT y ROWSON (1973) obtener el primer ternero nacido de la transferencia de un embrin congelado. Al mtodo standard se le han efectuado desde entonces distintas modificaciones tendientes a su simplificacin (CABODEVILA y col., 1991). En la actualidad, los embriones son congelados y descongelados de manera rpida. Esto hace necesario deshidratarlos parcialmente antes de la congelacin a fin de evitar la formacin de cristales que lesionan los blastmeros (MAZUR, 1977). La deshidratacin parcial de los embriones se logra incorporando un agente crioprotector al medio de congelacin (SCHNEIDER y MAZUR, 1986). En la congelacin de embriones se utilizan dos tipos de crioprotectores: 1. Permeables: glicerol, dimetilsulfxido (DMSO), 1-2 propanodiol, etanol y otros alcoholes.
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2. Impermeables: polivinilpirrolidona (PVP), sucrosa, glucosa, y otros azcares. El glicerol, en una concentracin 1,4M (10%), es el ms utilizado en la congelacin de embriones bovinos. La exposicin de los embriones al medio de congelacin (PBSS + glicerol) debe realizarse a la temperatura del laboratorio (25o C), en un slo paso, de 10 a 30 minutos de duracin (CHUPIN y PROCURER, 1984; NIEMANN, 1985). Este perodo incluye el envasado de los embriones, generalmente en pajuelas plsticas. Las pajuelas o pajillas de 0,25 ml constituyen el envase de eleccin porque tienen menor tamao, paredes ms delgadas y menor volumen que las ampollas y los tubos. Estas propiedades permiten realizar ms rpidamente y con mayor precisin la induccin de la cristalizacin o "seeding". Es sta, una maniobra clave para evitar que la viabilidad embrionaria sea afectada durante la congelacin (MAURER, 1978). Pueden ser colocadas en el equipo de congelacin a la temperatura a la que se efecta el seeding (aproximadamente -7o C). Es conveniente en este caso que transcurran cinco minutos para que se equilibre la temperatura de las pajuelas con la del equipo de congelacin. Algunos equipos de congelacin utilizan nitrgeno lquido como agente refrigerante. En otros ms econmicos, el refrigerante es etanol u otro alcohol enfriado por medio de un compresor (foto 1). NIEMANN (1985) efectu un estudio comparativo entre ambos sistemas obteniendo porcentaje de preez similar.
Foto 1: Equipo de congelacin por medio de bao de alcohol HAAKE Mess-Technik GmbH u. Co., Kalsruhe, Alemania Una vez efectuado el seeding, se mantiene la temperatura estable durante 10 minutos (perodo de estabilizacin) y luego se la desciende a una velocidad que oscila entre 0,3 y 0,5o C hasta -30 -35o C. En ese momento, las pajuelas pueden ser retiradas del equipo de congelacin y sumergidas en nitrgeno lquido (LEHN-JENSEN y GREVE, 1982). Se considera que entre -30 y -35 C se establece un adecuado balance entre deshidratacin y formacin de hielo intracelular (NIEMANN, 1985). No obstante ello, PETIT (1985) recomend reducir la velocidad de congelacin a 0,1 C/min entre -35 y 38C antes de retirar las pajuelas del equipo. WRIGHT (1985) por su parte, prefiere detener la congelacin a -30 -35 C y mantener la temperatura constante durante quince minutos antes de sumergir las pajuelas en nitrgeno. La descongelacin se efecta de manera rpida, sumergiendo las pajuelas en un bao Mara a 30-35 C durante 20-30 segundos. RALL y MAYER (1989) informaron que exponiendo las pajuelas al aire a 20
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C durante 10 segundos antes de colocarlas en el bao Mara, disminuye el nmero de embriones que sufren rotura de la zona pelcida. La extraccin del glicerol puede efectuarse luego de retirar el embrin de la pajuela o dentro de la misma. En el primer caso, se la lleva a cabo en una sola etapa utilizando sucrosa o en forma escalonada, empleando concentraciones decrecientes de glicerol o una mezcla de glicerol y sucrosa en PBSS (HEATH, 1990). En la eleccin de una de estas opciones generalmente priva el criterio personal dado que cada una de ellas tiene ventajas relativas. El embrin descongelado es evaluado morfolgicamente para eliminar aquellos con daos provocados por los procedimientos utilizados. Con esta tcnica de extraccin del glicerol se obtienen porcentajes de preez que generalmente superan el 50% (NIEMANN, 1985). LEIBO (1982) y RENARD y col. (1982) desarrollaron dos tcnicas similares que permiten extraer el glicerol dentro de la pajuela. Esta modificacin es conocida como mtodo "one step", en realidad no se trata de un mtodo distinto del standard sino de una modificacin introducida en la tcnica de extraccin del crioprotector. Para utilizar esta tcnica, es necesario envasar los embriones tal como se indica en la Figura 1.
embrin
Compartimiento
Superior
Medio
Inferior
Extraccin del crio-protector fuera de la pajuela
1,4 M glicerol en PBSS
Extraccin del crio-protector dentro de la pajuela (LEIBO, 1982)
0,24 M sucrosa en PBSS Medio B2 de Menezo
0,25 M sucrosa en PBSS
Extraccin del crioprotector dentro de la pajuela (RENARD, 1982)
1,4 glicerol en PBSS
0,25 M sucrosa en PBSS
Figura 1: Disposicin de las distintas soluciones en la pajuela, segn la tcnica de extraccin del crioprotector utilizada Una vez efectuada la descongelacin, la pajuela debe ser agitada vigorosamente para desplazar el aire hacia los extremos y permitir que las soluciones se mezclen. La solucin de sucrosa isoosmolar con el medio de congelacin, provoca que el glicerol salga del embrin. Esta tcnica permite transferir embriones congelados a campo sin necesidad de equipos y laboratorios costosos (MUNAR y col., 1988). Se obtienen tasas de preez que oscilan entre el 30 y el 50% (NIEMANN, 1985). Al prescindirse de la evaluacin morfolgica, es lgico que los porcentajes de preez resulten inferiores a los que se obtienen con el mtodo standard convencional. El medio B2 de Menezo es ms nutritivo que el PBSS. RENARD y col. (1982, 1983) lo utilizan para extraer algn resto de glicerol que pudiese haber quedado en el embrin, una vez que este se encuentra en el tero de la receptora. A pesar de que las diferencias no fueron significativas, CHUPIN y col. (1984) obtuvieron con esta tcnica un mayor porcentaje de preez que con la propuesta por LEIBO.
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Cuando el glicerol es extrado dentro de la pajuela, la viabilidad embrionaria puede ser afectada si no se logra mezclar homogneamente las distintas soluciones (NIEMANN, 1985). Para evitar tener que realizar esta maniobra, MASSIP y col. (1987) utilizaron como medio de congelacin una solucin mixta de glicerol y sucrosa en PBSS. A pesar de haberse obtenido porcentajes de preez aceptables, esta tcnica no ha alcanzado difusin an.
Protocolo de congelacin y descongelacin (segn Niemann) Congelacin 1. Preparar la solucin de glicerol (1,4 M), colocar 3-4 ml de la solucin, esterilizada por medio de filtracin, en una placa de Petri pequea (35 mm) y conducir a la misma temperatura de los embriones. 2. Los embriones deben ser clasificados estrictamente y lavados por lo menos 5 veces (para la exportacin 10 veces) y finalmente en una solucin de tripsina 0,25%. 3. Los embriones son colocados a posteriori directamente en la solucin 1,4 molar de glicerol. Se deja un tiempo de equilibracin de 20' aproximada-mente sobre una platina trmica. 4. Durante ese tiempo identificar las pajuelas con marcador indeleble. 5. Cargado de los embriones en las pajuelas con la solucin de glicerol. 6. Conducir las pajuelas al bao de alcohol a -5 C. Esperar 1-2 minutos. Efectuar luego el seeding e iniciar el programa de congelacin a una velocidad de 0,5 C/min hasta -35 C. 7. Colocar las pajuelas en el contenedor con nitrgeno lquido. Descongelacin 1. Mezclar partes iguales (p.e. 2 ml + 2 ml) de las soluciones de glicerol (1,4 M) y sucrosa (1,4 M). De ello resulta una concentracin de 0,7 M de ambas soluciones. Esterilizar por medio de filtracin y conducir a temperatura ambiente. 2. Preparar una solucin de sucrosa 0,7 M. 3. Preparar una solucin de cultivo con 1% de BSA. 4. Descongelacin de las pajuelas a temperatura ambiente (demora aprox. 60-90 segundos). 5. Secar la pajuela, separar el stick y colocar el embrin, con ayuda de una jeringa de tuberculina con unin de goma, en la solucin de glicerina y sucrosa (0,7 M). 6. Esperar 5 min y colocar los embriones en la solucin de cultivo durante 10 min para su reexpansin. 7. Evaluacin morfolgica, colocacin en el catter de transferencia y transfe-rencia a una receptora. Sustancias necesarias: PBS + antibiticos (p.e. gentaminicina 80mg/l) y 1% BSA. Glicerol para anlisis, puro (98-100%) libre de agua. Sucrosa para anlisis Albmina bovina (BSA), fraccin V (96-99% de albmina)
Vitrificacin Es un proceso fsico de solidificacin utilizado para conservar rganos y tejidos y ms recientemente embriones (FAHY y col., 1984; RALL y FAHY, 1985). El medio de vitrificacin lleva incorporado crioprotectores en alta concentracin. Al ser enfriado no cristaliza sino que se torna viscoso y pasa del estado lquido a un estado slido no estructurado similar a un vidrio, de ah toma este mtodo la denominacin de vitrificacin.
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La solucin de vitrificacin debe tener alta concentracin de uno o ms crioprotectores permeables. Para vitrificar embriones bovinos, se ha utilizado una solucin mixta de glicerol y 1-2 propanodiol en PBSS. La eleccin del 1-2 propanodiol se debi fundamentalmente a que es estable y a que tiene poca tendencia a cristalizar durante el enfriamiento (BOUTRON y KAUFMANN, 1979). En primera instancia, los embriones son expuestos al medio de vitrificacin intracelular (10% glicerol + 20% 1-2 propanodiol) durante 10 minutos. Luego, se los envasa en el medio de vitrificacin extracelular (25% glicerol + 25% 1-2 propanodiol). Si la pajuela se completa con una solucin 1M de sucrosa en PBSS, posibilita transferir los embriones a campo de manera similar a lo que ocurre en el denominado mtodo one step. Inmediatamente despus de cerrada, la pajuela debe ser introducida lenta y progresivamente en el nitrgeno para que se produzca simultneamente la vitrificacin de los compartimientos extra e intracelular. Utilizando las soluciones anteriormente descriptas, se han vitrificado con xito mrulas, obtenindose porcentajes de preez de alrededor del 50% (MASSIP y col. 1987; DOUCHI y col., 1990). Para vitrificar blastocistos y obtener un porcentaje aceptable de supervivencia fue necesario agregar sucrosa al medio de vitrificacin (VAN DER ZWALMEN y col., 1989). Recientemente, KASAI y col. (1990) han utilizado un medio de vitrificacin que lleva incorporado ficoll en su formulacin. Este medio es menos txico que el anterior, si se repiten en otras especies los resultados obtenidos con embriones de ratn, su aplicacin resultar de sumo inters.
Mtodo de congelacin rpida Este mtodo fue desarrollado por CHUPIN en el ao 1986. A diferencia de lo que ocurre en la vitrificacin, en la congelacin rpida se produce la cristalizacin del agua intra- y extracelular. Los embriones son deshidratados parcialmente tal cual ocurre en el mtodo standard. Luego, se los deshidrata nuevamente colocndolos en una solucin mixta de glicerol y sucrosa en PBSS. Esta segunda deshidratacin, deja a los embriones en condiciones de ser enfriados rpidamente. Las pajuelas son colocadas en el cuello del contenedor de nitrgeno lquido. Existe un lugar ptimo para colocar la pajuela segn el nivel de nitrgeno existente en el contenedor, para que la cristalizacin ocurra espontneamente sin producirse la elevacin de temperatura relacionada con el cambio de fase. Las pajuelas, luego de permanecer cinco minutos en el cuello del termo, son sumergidas en el nitrgeno. El mtodo de congelacin rpida ha sido utilizado con xito para congelar embriones de animales de laboratorio (TAKAHASHIA y KANAGAWA, 1990; ZUH y col., 1990). En bovinos, se lo ha evaluado nicamente cultivando los embriones descongelados in vitro, los resultados obtenidos fueron dispares segn el estadio de desarrollo del embrin congelado (CHUPIN, 1986). Para unificar los resultados, fue necesario modificar el tiempo de exposicin a la segunda solucin deshidratante o variar la temperatura a la que sta ocurra (CHUPIN, 1987). Conclusiones Cuando se hace la evaluacin morfolgica, puede ocurrir que sea difcil definir si algunos embriones son o no transferibles. En ese caso, puede resultar til cultivarlos por algunas horas para observar su evolucin. Es sta, la nica aplicacin prctica que tiene el cultivo en los programas de TE que se desarrollan en la actualidad. En algunos pases, se han montado recientemente centros de produccin de embriones en gran escala, utilizando la fecundacin in vitro (GORDON, 1990). El desarrollo de esta tcnica, fue acompaado por el de sistemas de cultivo que permiten que el embrin producido por esta va alcance los estadios de
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mrula o blastocisto in vitro. De esta manera, es posible transferirlos utilizando el mtodo no quirrgico, que resulta simple y prctico, ver captulo XI. Teniendo en cuenta que en los centros de TE es difcil poder alojar el lote de receptoras, la refrigeracin puede resultar til para transportar los embriones hasta donde stas se encuentren, especialmente si se trata de lugares distantes. Antes de refrigerar embriones hasta que receptoras asincrnicas alcancen el sincronismo ptimo, ser necesario comparar la prdida de viabilidad que ocasiona la transferencia asincrnica con respecto a la que causa la refrigeracin. Los embriones bovinos, en los estadios de mrula y blastocisto, son congelados exitosamente utilizando el mtodo standard obtenindose un porcentaje de preez promedio del 50%. La vitrificacin y el mtodo de congelacin rpida no han alcanzado an un grado de desarrollo que permita utilizarlos en programas comerciales de transferencia de embriones. El advenimiento de tcnicas tales como: la produccin in vitro, el clonado y el diagnstico del sexo de embriones, la transferencia de genes, etc., hace necesario centralizar esfuerzos para lograr la congelacin de estadios tempranos de desarrollo como as tambin de embriones micromanipulados, con un xito similar al obtenido con las mrulas y los blastocistos.
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Produccin de mellizos idnticos
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PRODUCCION DE MELLIZOS IDENTICOS POR MEDIO DE MICROCIRUGIA G.A. Palma & G. Brem Introduccin La transferencia de embriones constituye para la hembra un progreso reproductivo equivalente a la inseminacin artificial para el macho. Per se permite aumentar el progreso gentico a travs del incremento de la capacidad reproductiva de la hembra bovina. El desarrollo biotecnolgico posterior, a partir de la manipulacin de los embriones recolectados, convirti a esta tcnica en una valiosa herramienta para la produccin de una cantidad supernumeraria de embriones y su retorno al ambiente uterino. A partir de la dcada de 1980 se inici en Cambridge (WILLADSEN, 1981) una nueva fase con el desarrollo de la microciruga de embriones (MC) con la produccin de mellizos idnticos. Esta comprende la micromanipulacin de embriones en estadio de mrula o blastocisto, obtenidos por lavajes no quirrgicos, con la divisin en 2 partes iguales (hemi-embriones). Sus particularidades la convierten en una tcnica interesante no solamente por aumentar la eficiencia reproductiva de un individuo o factor determinado (por ejemplo, ausencia de cuernos en la raza Fleckvieh), sino tambin por permitir la disponibilidad de animales idnticos en un programa de TE como as tambin para ser empleados como modelo de investigacin (BREM, 1986), cuadro 1, captulo XX. Esta tcnica fue rpidamente adoptada y es aplicada actualmente en los programas convencionales de TE en pases con alta disponibilidad tecnolgica (GRAY y col., 1991, KIPPAX y col., 1991; LANGE y col., 1991). Existe sin embargo escasa informacin sobre la aplicabilidad de esta tcnica en pases bajo condiciones extensivas de produccin y con el empleo de receptoras de razas productoras de carne o sus cruzas, cuya rusticidad las hace ms adecuadas a esos sistemas de produccin que las razas lecheras, pero cuya capacidad de gestar y criar dos individuos constituye un interrogante. En el presente captulo se presentarn, junto con los resultados obtenidos en la micromanipulacin (rendimiento embrionario) y sobrevivencia de las mitades producidas, aquellos logrados a partir de embriones bovinos de raza para produccin de carne (Aberdeen Angus): tasa de paricin despus de una transferencia uni- o bilateral de los hemi-embriones producidos (HE) a receptoras cruza Aberdeen Angus x Criollo como as tambin el efecto de una gestacin doble sobre la supervivencia y desarrollo corporal de los terneros producidos. Cuadro 1: Particularidades de los mellizos homocigotas producidos por medio de microciruga frente a los mellizos naturales (BREM, 1986). Particularidades segn el modelo de aplicacin
- Disminucin de la varianza - Aumento del progreso gentico en la lnea madre-hija - Aumento de la exactitud del valor gentico - Aumento de la eficacia de los ncleos de produccin (MOET) - Aumento del nmero de terneros (30-50%) producidos en un programa de TE - Disminucin de los costos de la TE
Particularidades metodolgicas Ventajas Desventajas - Libre eleccin de los padres

- No requiere estudios diagnsticos - Permite planear el momento de la produccin de los mellizos - El xito de la manipulacin no puede ser previsto individualmente - Requiere de personal calificado en micromanipulacin y transferencia - La organizacin es compleja
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Tcnicas microquirrgicas Existen diversas tcnicas para dividir los embriones. La mayora de ellas emplean micromanipuladores (WILLIAMS y col., 1983; BREM y col., 1983; MASSIP y col., 1985; STEINMEYER, 1986; SEIKE y col., 1989), otras no los requieren (PINTER y col., 1986). Los micromanipuladores se emplean en un nmero que vara entre 2 (WILLIAMS y col., 1982; 1983) y 4 (BREM y col., 1983; 1987) y se colocan a ambos lados de la lupa estereoscpica o del microscopio, foto 1. Con un manipulador (foto 1, 5) es posible, con ayuda de una micropipeta de vidrio, fijar el embrin por aspiracin de la zona pelcida. El micromanipulador del lado opuesto (foto 1, 3) est provisto del instrumento cortante que puede ser una micropipeta de vidrio, un trozo de hoja de afeitar o un escalpelo para ciruga ocular. Los manipuladores suplementarios (LEITZ, fotos 1, 2) pueden estar equipados con microinstrumentos adicionales que permiten diferentes manipulaciones del embrin y las mitades como as tambin su desplazamiento en la placa. Una microaguja permite seccionar o separar aquellas mitades que no fueron divididas en su totalidad por el microescalpelo. Un brazo de mortero permite desplazar los embriones denudados sin provocar traumatismos. Una micropipeta, en forma de gancho permite abrir la zona pelcida para extrar el embrin de su interior, fig. 1. Los instrumentos, con excepcin del microescalpelo, deben ser confeccionados a partir de finos tubos de vidrio con ayuda de un estirador de pipetas (foto 5), este instrumento permite producir micropipetas con dimetro interno deseado. La microfragua (foto 6) posibilita el corte exacto como as tambin las curvaturas de las pipetas puede, adems, redondear los bordes de las pipetas (de sostn) a fin de hacerlas atraumticas. La lijadora (foto 8) permite pulir los bordes de la pipeta en los ngulos deseados. A pesar que la unidad de micromanipulacin con un nmero de 4 micromanipuladores y 5 microinstrumentos (BREM, 1983) simplifica las maniobras operativas, su uso no se ha difundido porque su costo aumenta de la misma forma con el creciente nmero de micromanipuladores sin mejorar los resultados obtenidos con el empleo de dos micromanipuladores con dos microinstrumentos. Adems es ms engorroso transportar y armar esta unidad de micromanipulacin en un laboratorio ambulante de TE. El xito de la tcnica depender fundamentalmente de la pericia del operador, razn por la cual no existe un modelo, nmero de manipuladores o tcnica de eleccin. Divisin La divisin de los embriones se lleva a cabo con una lupa estereoscpica (120 x, foto 1) o un microscopio invertido. Los embriones pueden seccionarse fijados con la pipeta de sostn (foto 2) o adheridos al fondo de la placa. Para ello se coloca, en primer lugar, el embrin en un medio conteniendo suero (20% SFB) y luego en el medio de micromanipulacin sin suero. La carga elctrica del embrin, producida por las protenas sricas, lo fijarn al fondo de la placa. En este caso se requiere de mayor destreza que con la ayuda de una pipeta de sostn. Sin embargo no requiere del uso de micropipetas. La microciruga del embrin, fijado con la pipeta de sostn, con un microescalpelo de ciruga ocular o un trozo de hoja de afeitar se lleva a cabo conformando un ngulo de 90 entre la pipeta y el microescalpelo. En el caso de dividir el embrin con una micropipeta esta se dipone en el mismo sentido que la pipeta de sostn (foto 3a). Una vez abierta la zona se extrae el embrin con ayuda de la microaguja o del brazo de mortero. De esta forma el embrin puede ser dividido fuera de la zona pelcida (foto 3b). Una forma ms simple es la divisin del embrin y de la zona pelcida simultneamente. Esta variante se practica en aquellos casos en los que el embrin se adhiere al fondo de la placa de Petri. La manipulacin de los embriones puede llevarse a cabo en PBS + 20% de SVE. De la misma forma puede emplearse el mismo medio para el posterior cultivo de los embriones durante algunas horas, a fin de evaluar la evolucin de los mismos y establecer si son transferibles.
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Figura 1: Tipo y distribucin de los microinstrumentos segn BREM (1986) 1= pipeta de sujecin, 2= microescalpelo, 3= punta, 4= brazo de mortero, 5= gancho 1. Pipeta de sostn: los bordes de la punta son redondeados con ayuda de la microfragua (Fonbrune), externo 110 m, interno 25-30 m 2. Microescalpelo: escalpelo para ciruga ocular o fragmento de hoja de afeitar con la punta afinada por medio de lijado, en la punta 1-2 m aproximadamente 3. Pipeta tipo estilete: 2 m 4. Brazo de mortero: varilla de vidrio con una bolilla de vidrio en su extremo. Radio de la bolilla 20 m aproximadamente. 5. Gancho: micropipeta de vidrio doblada, radio de 40 m Los microinstrumentos se confeccionan con fraguas, piedras de lijar y estiradores ad hoc (fotos 5,6 y 8). Sin embargo es posible tambin hacerlas a mano (BREM, 1986), aspecto que debe ser considerado particularmente en la aplicacin de la tcnica en razas cuyo valor agregado no compensen los costos.
Foto 1: Unidad de micromanipulacin transportable con 4 micromanipuladores. 1: lupa estereoscpica Wild M8, 2 = micromanipulador Leitz, 3: micromanipulador a control remoto AM3M, 4: control remoto ST1, 5: micromanipulador mecnico, 6: jeringa con tubo de goma para la pipeta de sostn (BREM, 1986).
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Foto 2: Mrula fijada con la pipeta de sostn. La zona pelcida es abierta con un microcapilar recto
Foto 3a: Divisin de la mrula fuera de la zona pelcida
Foto 3b: Divisin de la mrula fuera de la zona pelcida
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Foto 4: Hemi-embriones despus de la divisin. La prdida de algunos blastmeros es inevitable Factores que afectan el xito de la divisin La calidad de los embriones influye sobre el xito de la divisin. Embriones de buena y muy buena calidad alcanzan el 80% de sobrevivencia y el 25% de mellizos idnticos. Embriones de calidad media y regular 43% y 15% respectivamente. De la misma forma se observ una sobrevivencia superior de los HE de muy buena y buena calidad frente a los de calidad media y regular (tablas 1 y 2).
Foto 5: Estirador automtico de pipetas, Bachofer, Alemania
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Tabla 1: Influencia de la calidad de los embriones de raza Fleckvieh sobre la gestacin y produccin de mellizos (BREM, 1986) Calidad del embrin muy buena buena mediana regular Embriones (n) 26 78 45 5 154 (n) 23 67 21 2 113 Fetos (%) 88,5 85,9 46,7 40,0 73,4 (n) 5 21 7 33 Pares (%) 19,2 26,9 15,6 21,4
Tabla 2: Influencia de la calidad de hemi-embriones de raza Fleckvieh sobre la taza de preez (BREM, 1986) Calidad de las mitades muy buena buena mediana regular HE (n) 21 116 98 73 308 Fetos (n) 16 45 34 18 113 (%) 76,2 38,8 34,7 24,7 36,7
Estos resultados indican la necesidad de destinar a la micromanipulacin slo aquellos embriones de buena a excelente calidad. La seccin de los embriones provoca una prdida celular embrionaria de aproximadamente 10%, que segura-mente compromete la sobrevivencia de los embriones de calidad inferior (McEVOY and SREENAN, 1990). El rendimiento de un tratamiento superovulatorio, expresado en la relacin de embriones dividibles/recolectados es variable y depende de la calidad de la reaccin superovulatoria. En buenas respuestas superovulatorias es posible destinar ms de la mitad de los embriones a la micromanipulacin (tabla 3). En este caso 64% de los embriones obtenidos fueron calificados como dividibles. Slo 39% conserv una calidad apropiada para ser transferido (13/33). Es interesante sealar, sin embargo, que la divisin hubiese permitido aumentar la eficiencia de la TE, realizando 34 transferencias (26 HE + 8 E transferibles pero no divisibles), sin tener en cuenta los HE de calidad III, que por razones experimentales no fueron incluidos en el ensayo. Tabla 3: Nmero de cuerpos lteos (CL), Embriones (E) y hemi-embriones (HE) producidos de raza Aberdeen Angus (PALMA y col., 1991) n 5 36 33 29 13 % 100 91,6 80,5 36,1 100 87,9 61,9 %
Vacas superovuladas CL palpados E obtenidos E divididos Pares de E producidos
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Las tasas de preez obtenidas con la transferencia de HE variaron con el desarrollo de la tcnica y los autores desde 16,6% (LAMBETH y col., 1983) hasta 79% (WILLADSEN y col., 1981). En general la tasa media de preez con la transferencia de HE vara entre 50-60% (LEIBO y RALL, 1987; TAKEDA y col., 1987) y es necesario dividir 3-4 embriones para producir un par de mellizos idnticos (BREM, 1986). Es decir que entre 25 y 30% de los pares de h-embriones transferidos darn lugar a mellizos idnticos. La exactitud en la divisin microquirrgica se verifica a travs de la relacin entre el tamao de las mitades obtenidas. Por esa razn fueron puestos a prueba diferentes microinstrumentos para dividir a los embriones. Los resultados obtenidos con la microaguja no difirieron con los obtenidos con el microescalpelo cuando fueron divididos embriones en estadio de mrula, (BREM, 1986; AGRAWALA, 1987). En el caso particular de los blastocistos no se observaron diferencias significativas entre ambos microinstrumentos, pero si mayor simplicidad en la operacin con el uso del microescalpelo y una tendencia a obtener mayores tasas de preez particularmente con blastocistos tempranos y medianos (BREM, 1986, tabla 4). Las posibles razones seran que en los blastocistos (temprano y mediano) las estructuras celulares (trofoblasto y masa celular) se pueden diferenciar con ayuda del microscopio. La unin celular de las clulas de los blastocistos, mantiene a las mitades compactas despus de la divisin. Por ltimo el microescalpelo es ms filoso que la micropipeta, y permitira un corte ms preciso del botn embrionario de los blastocistos. Cuando la diferencia de tamao, entre las mitades obtenidas, no existe (relacin 50-50%) o sta es muy pequea (relacin 55-45%) es de esperar una ptima tasa de preez (80%). Si la relacin se desva en 20% la preez disminuye consecuente-mente (60-18%). Tabla 4: Resultados obtenidos con la divisin de embriones por medio de microescalpelo (BREM, 1986) Estadio M Bt B Be Embriones n 102 27 19 6 154 Fetos n 62 28 19 4 113 % 61 104 100 67 73 n 12 13 7 1 33 Pares % 12 48 37 17 21
La ausencia de zona pelcida de los hemi-embriones no afecta la gestacin (tabla 5, Agrawala, 1987). Esta particularidad contribuy a simplificar la tcnica, de forma tal que en la actualidad stos pueden ser transferidos sin membrana pelcida. Los 2 h-embriones obtenidos pueden ser transferidos en forma bilateral y no quirrgica a una receptora o separados: cada mitad al cuerno ipsilateral al ovario c/cuerpo lteo de una receptora. WILLADSEN y col. (1981) lograron una preez de 79,0% despus de la transferencia bilateral de las 2 mitades de un embrin dividido, BREM (1986) alcanz 96,3% con la misma tcnica. OZIL (1983) y LAMBETH y col. (1983) obtuvieron una marcada diferencia con la transferencia de una mitad (45,4 y 16,6% respectivamente) y 2 mitades (72,7% y 62,5% respectivamente) a una receptora.
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Foto 6: Microfragua de Fonbrune, Alemania Tabla 5: Tasa de preez obtenida con hemi-embriones transferidos con y sin zona pelcida Transferencia de las mitades Con zona pelcida Sin zona pelcida Sin zona pelcida Con zona pelcida 46 Sin zona pelcida 23 23 57 Embriones divididos n 19 10 21 Receptoras n 36 20 21 23 Receptoras n 18 8 10 13 preadas % 50 40 48 57 Autor AGRAWALA, 1987 McEVOY y SREENAN, 1990 KIPPAX y col., 1991
Luego de la transferencia de los HE de raza Aberdeen Angus a receptoras Aberdeen Angus x Criolla parieron 9 de 17 receptores (52,9%), de las cuales 7 fueron simples y 2 dobles (tabla 6). No se encontraron diferencias en la paricin entre diferentes estadios de los embriones divididos (Mc 7/8, 87,5%; B 4/5, 80.0%) Tabla 6: Preez despus de la transferencia de HE de raza Aberdeen Angus a receptoras Aberdeen Angus x Criolla (PALMA y col., 1991) HE transferidos (pares) 13 Receptoras paridas (n) 9 (52,9%) Nacimientos simples dobles (n) (n) 7 2 (77,9%) (22,2%)
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Teniendo en cuenta el tipo de transferencia, se observ una mayor tasa de preez con la transferencia bilateral (66,6%) frente a la unilateral (37,5%) aunque no fueron encontradas diferencias significativas
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(tabla 7). No se registraron nacimientos de mellizos despus de la transferencia unilateral, posiblemente debido al reducido nmero de pares transferidos. De los HE transferidos en forma bilateral el 22,2% fueron mellizos homicigotas. En este trabajo no se alcanzaron los resultados logrados por WILLIAMS y col. (1984); BREM (1986); AGRAWALA (1987); SEIKE (1989); quienes alcanzaron una tasa prxima al 30%. Se determin, sin embargo, la presencia de 3 gestaciones dobles (33,3%), en la palpacin rectal realizada a los 70 das post transferencia. Por razones no determinadas una de ellas no lleg a trmino, lo que motiv los resultados de paricin mencionados. Tabla 7: Tasa de parto con transferencia uni- o bilateral de HE de raza Aberdeen Angus a receptoras Aberdeen Angus x Criollo (PALMA y col., 1991) Tipo de transferencia Unilateral Bilateral Receptoras total paridas (n) 3 (37%) 6 (67%) Pares de mellizos (n) 0 2 (22%)
(n) 8 9
El rendimiento de la divisin microquirrgica, expresado a travs de los terneros nacidos por embrin empleado fue prximo a 1,0 (tabla 8). Tabla 8: Eficacia de la produccin de mellizos idnticos de raza Aberdeen Angus con receptoras Aberdeen Angus x Criollo (PALMA y col, 1991) Tipo de transferencia Embriones transferidos (n) 4 9 13 Terneros obtenidos (n) ET/tn1 3 8 11 0,75 0,88 0,86
Unilateral Bilateral Total
1 ET/Tn= relacin embrin empleado ternero nacido
LAROCCA y col. (1992) observaron un aumento significativo de la muerte embrionaria cuando las dos mitades fueron transferidas en un solo cuerno uterino. Nacimientos simples y dobles No hubo problemas de parto ni retencin de placenta en las receptoras AA x Criollo que parieron mellizos (foto 7). El anlisis de los pesos fue realizado en los terneros del mismo sexo, para no introducir ese factor de variacin en el bajo nmero de animales estudiados. Se estudi el peso inicial y su evolucin en 5 terneras nacidas de gestaciones simples y 4 productos de gestaciones dobles. El peso al nacimiento fue de 263,9 Kg para las primeras y de 211 Kg para las segundas (p>0,05). La falta de una diferencia estadstica significativa entre los pesos medidos pudo estar dada por la variacin observada en los pesos de los animales nacidos de gestaciones simples. Por el contrario, la ganancia de peso observada durante los primeros 5 meses de vida fue diferente (0,7580,07 kg y 0,637 0,025 kg/da para los nacimientos simples y dobles respectivamente, (p<0,01). Los pesos a una edad prxima
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Palma & Brem
al destete tendieron a ser diferentes (13512,5 kg los simples y 118 3,3 Kg los dobles) a favor de las gestaciones simples, sin embargo se obtuvo una mayor cantidad total de Kg de ternero destetado (236 Kg. vs. 135) con las receptoras melliceras. Por otra parte, con respecto al peso individual, es de esperar una recuperacin del peso de los mellizos despus del destete suficiente como para alcanzar a los simples antes del ao de edad (MAULEON y col., 1970).
Foto 7: Dos pares de mellizos idnticos de la raza Aberdeen Angus producidos por medio de microciruga (PALMA y col. 1991)
Foto 8: Piedra de lijar micropipetas y microescalpelos Conclusiones La produccin de mellizos idnticos por medio de micromanipulacin permite aumentar de 0,6-0,7 a 1,01,1 terneros por embrin obtenido, incrementando la eficacia de un programa de TE entre 30-40%, disminuyendo sus costos y posibilitando la obtencin de mellizos idnticos. En la actualidad, la transferencia doble de embriones se efecta en receptoras de gran tamao (razas lecheras y de doble propsito) que cuentan con mayor capacidad uterina para albergar dos gestaciones. Las receptoras Aberdeen Angus x Criollo no respondieron de la misma forma a las caractersticas mencionadas, pudiendo este hecho haber afectado los resultados obtenidos. Es necesario, en consecuencia, realizar ms estudios para aclarar la importancia de la receptora en el xito de esta tcnica. Las receptoras para produccin de carne, por otra parte, no incorporan problemas adicionales al no presentarse dificultades de parto ni alterarse la crianza de los terneros.
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Berg & Reichenbach
PRODUCCION IN VITRO DE EMBRIONES U. Berg & H. D. Reichenbach Introduccin Los primeros trabajos sobre maduracin in vitro de ovocitos bovinos fueron publicados por EDWARDS en el ao 1965. El primer ternero producto de la FIV naci en el ao 1981. De esta forma BRACKETT y col. (1982) comprobaron el xito de la fertilizacin in vitro con ovocitos madurados in vivo. El cultivo in vitro de los ovocitos fecundados constituy un problema metodolgico, con los medios de cultivo habituales se desarrollan los cigotos hasta un determinado "block", que vara segn las especies. En la especie bovina el desarrollo se interrumpa en el estadio de 8-16 clulas. Para superar el desarrollo temprano insuficiente se emplearon medios de cultivo in vivo, en los cuales los cigotos o embriones de 2 clulas fueron cultivados en oviductos de oveja (CRISTER y col., 1986; EYESTONE y col., 1987; LU y col., 1988a), de coneja (BOLAND, 1984; SIRARD y col., 1985; FUKUI y ONO, 1988) o de vaquillona (XU y col., 1987) durante 4-6 das. La desventaja de ese mtodo, adems de la complejidad de la tcnica, es la prdida de hasta un tercio de los embriones transferidos. Un nuevo camino para superar la interrupcin del desarrollo embrionario fue encontrado con el empleo de cultivos celulares. A travs del co-cultivo con determinadas clulas somticas es posible alcanzar las condiciones adecuadas para lograr un desarrollo embrionario normal. La produccin in vitro de embriones comprende 3 etapas: - Maduracin in vitro de los ovocitos obtenidos de ovarios por medio de puncin folicular - Fecundacin in vitro de los ovocitos madurados - Cultivo in vitro de los embriones Recoleccin de los ovarios y maduracin in vitro de los ovocitos Los ovocitos son en general obtenidos en el matadero a partir de ovarios de vacas y vaquillonas no preadas aunque hasta el momento no existe evidencia que la produccin de ovocitos a partir de ovarios con un CL de gestacin sea diferente. Los ovarios contienen un gran nmero de ovocitos en diferentes estadios de desarrollo. El transporte hasta el laboratorio se lleva a cabo en una solucin PBS a temperatura ambiente. YANG y col. (1990) sealaron la posibilidad de conservar los ovarios a 24-25o C durante 11 h sin disminuir la capacidad fecundante o el desarrollo posterior de los embriones. Ello significa para su aplicacin prctica, que un prolongado tiempo de transporte desde el matadero hasta el laboratorio no afecta negativamente los resultados esperados. Temperaturas de 37o y 4o C son, sin embargo, inadecuadas para una larga conservacin de los ovarios. Despus de lavar los ovarios 3 veces en medio de transporte se procede a la obtencin de los ovocitos por medio de un aparato de puncin, que opera con una presin negativa de 100mm Hg. En caso de no contar con un aparato de estas caractersticas es posible tambin aspirar los ovocitos con una jeringa. La aguja en ambos casos es de 0,9 mm . Se puncionan todos los folculos terciarios visibles que posean un tamao comprendido entre 2-6 mm de . El lquido folicular con los ovocitos se deja sedimentar aproximadamente 15 minutos antes de aislar los complejos cumulus-ovocito. Luego de lavarlos 2 veces es posible clasificar a los ovocitos morfolgicamente en 3 categoras. Se destinan a la maduracin aquellos ovocitos que posean un cumulus oophorus denso que cubra la totalidad del ovocito y un citoplasma uniformente granulado y oscuro (SSS y STRANZINGER, 1987; foto 2). El
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Produccin in vitro de embriones
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segundo grupo lo constituyen los ovocitos cubiertos slo parcialmente con el cmulus algo distendido (foto 2) y el tercero carece de clulas del cmulus. La presencia de un cmulus completo con un mnimo de 5 capas tiene importancia en el desarrollo de los ovocitos inmaduros, que se contactan con las clulas somticas por medio de prolongaciones citoplasmticas de las clulas de la granulosa o "gap junctions" (foto 1). Esas uniones le permiten al ovocito ingresar aminocidos y otros nutrientes, que en forma pasiva no atraviesan la zona pelcida (MOOR, 1983). Los resultados obtenidos por varios grupos de trabajo indican que slo los ovocitos que cuentan con un cumulus completo y compacto poseen la capacidad de completar la maduracin in vitro (LEIBFRIED y FIRST, 1979; SSS y MADISON, 1983) y alcanzar el completo desarrollo esperado (STAIGMILLER y MOOR, 1984).
Foto 1: Zona pelcida atravesada por largas prolongaciones citoplasmticas (ZA) de las clulas de la granulosa (Gap-junctions), en ntimo contacto con la membrana ovocitaria, corte semi fino Con el aumento del tamao folicular disminuye el nmero de complejos cumulus-ovocitos. Al mismo tiempo aumentan los signos de degeneracin en el ovocito como as tambin cambios en la estructura del cumulus, que se asemejan a los observados in vivo, provienen en su mayora de folculos terciarios atrsicos (SSS, 1990). Por animal se obtienen en promedio entre 15 (PALMA y col., 1993) y 18 ovocitos, de los cuales entre 57% (BERG y col., 1991a) y 70% (PALMA y col., 1993) responden a los criterios morfolgicos para una exitosa maduracin in vitro. Un medio de maduracin adecuado es el medio de cultivo celular 199, el cual fue modificado (PAVLOK, 1988, comunicacin personal) a travs del agregado de piruvato de sodio (2 mM), lactato de calcio (2,92), FSH (10 g/ml; Burns Biotec), gentamicina (50 g/ml) y una combinacin de buffers Hepescarbonato (33,9mM carbonato de sodio, 4,43mM Hepes). Como fuente proteica se emplea suero de vaca en celo inactivado por medio de calor. En comparacin con otros sueros ste posee altas concentraciones de LH y prolactina (YOUNIS y col., 1989). El efecto de las gonadotrofinas durante la maduracin de los ovocitos es variado. Bajo su influencia se produce la expansin de las clulas del cumulus tanto in vivo como in vitro (foto 4) cuyo significado en la especie bovina podra ser interpretado como la mayor facilidad con que las fimbrias de la ampolla del oviducto pueden atrapar el ovocito cuyo cumulus se encuentra expandido y adherente (EYESTONE y FIRST, 1990).
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Foto 2: Ovocito con un cumulus oophorus Foto 3: Ovocito con cumulus oophorus incompleto denso y compacto
Foto 4: Ovocito con cumulus oophorus expandido despus de 24h de la maduracin Un cumulus no expandido constituye una barrera impenetrable para los espermatozoides durante la fecundacin. La FSH y LH posibilitan al mismo tiempo una cada del AMPc en el ovocito y con ello cambios en la sntesis proteica completando la meiosis. Las gonadotrofinas participan paralelamente en la maduracin del citoplasma, que desempea un rol de importancia en la fecundidad del ovocito. De esta forma, la presencia de cumulus expandidos y pegajosos, permite estimar la presencia de un citoplasma maduro. La maduracin se lleva a cabo a 39oC con 5% CO2 durante 24h con mxima humedad ambiente. Alrededor del 80% de los ovocitos que se encontraban en el momento de la puncin folicular en estadio vesicular, reinician la meiosis y alcanzan el estadio de metafase II al cabo de 24h, lo que corresponde al momento de la ovulacin (fig 1).
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AG CG
0h
M
REL
21-22 h
9-12 h
REL
19 h
15 h
Fig 2: Esquema de las fases de maduracin nuclear y citoplsmica de ovocitos bovinos, segn HYTTEL y col. (1989): Los eventos se describen cronolgicamente a partir del comienzo del cultivo: 0 h ovocito inmaduro antes del cultivo: clulas del cumulus oophorus compactadas, el ncleo redondeado con condensaciones dispersas de la cromatina, mitocondrias (M), aparatos de Golgi (G) y los cumulos de grnulos corticales (GC) localizados en la periferia. ~9-12 h El contacto entre las proyecciones citoplasmticas de las clulas de la granulosa y el ovocito se encuentra casi totalmente interrumpido. El ncleo del ovocito adopta una forma convolutada y la cubierta nuclear se diferencia en retculo endoplsmico liso (REL). En el ncleo la cromatina est condensada y adyacente al mismo aparecen densas reas y microtbulos. ~15 h El cumulus est expandido y sus proyecciones citoplasmticas estn completamente interrumpidas. En el ovocito se inicia la metafase de la primera divisin meitica en una densa rea del ooplasma. Las mitocondrias migraron en todo el citoplasma con una distribucin ms o menos uniforme. ~19 El primer cuerpo polar es expulsado y se inicia la segunda divisin meitica en forma similar a lo descrito. ~21-22 h Los grnulos corticales migraron a la periferia a lo largo del
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oolema. Los aparatos de Golgi se encuentran dispersos en todo el ooplasma y el REL forma conglomerados. En este momento el ovocito madur e ingresa en un estado de quiescencia. Seleccin y capacitacin espermtica (swim-up) De la misma forma que el ovocito, los espermatozoides llevan a cabo con la capacitacin su maduracin, que in vivo se desencadena a travs de las secreciones del tracto genital femenino. Aunque el mecanismo exacto de la capacitacin no es claro an, se conoce que conduce a cambios en la composicin lipoproteica de la membrana espermtica, a un aumento del metabolismo y de la motilidad del espermatozoide (hipermotilidad). La unin de los espermatozoides a los receptores de la membrana pelcida ocurre gracias a la presencia de protenas de unin, que permiten una fecundacin especfica para cada especie. Antes y despus que la clula espermtica toma contacto con la membrana pelcida se desencadena la reaccin acrosmica (fig. 3). Durante la reaccin se funden dos tercios de la membrana plasmtica con la membrana externa del acrosoma formando vesculas, de esta forma se liberan las enzimas acrosomales. Esas enzimas lticas abren el camino al espermatozoide a travs de la zona pelcida (WASSARMAN, 1990).
Fig 3: Esquema de la reaccin acrosmica segn HYTTEL y col. (1989): 1. cabeza espermtica antes de la reaccin acrosmica (N) ncleo, (A) acrosoma, (MAI) membrana acrosmica interna, (MAE) membrana acrosmica externa y (MP) membrana plasmtica. Ntese la posicin del segmento ecuatorial (SE). 2. cabeza espermtica durante la reaccin acrosmica sobre la membrana pelcida (MP). La fusin de la membrana plasmtica con la membrana acrosmica externa resulta en la formacin de vesculas. El segmento ecuatorial no fue afectado por la reaccin acrosmica.
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La importancia de una completa capacitacin para la reaccin acrosmica y la fecundacin se observ en los primeros ensayos de fecundacin in vitro, que condujeron a muy bajas tasas de penetracin. Recin despus del descubrimiento y aplicacin de glicosaminoglicano, cuyo ms activo representante es la heparina, se lograron mejoras en los resultados. El origen cervical y uterino de la heparina fue el primer punto de partida para concluir que su presencia juega un rol de importancia en la preparacin de los espermatozoides para la fecundacin. Hoy se sabe que la heparina a travs de la reaccin acrosmica permite el ingreso del espermatozoide en el ovocito (PARRISH y col., 1986). De forma similar ocurre con la catecolamina adrenalina (1 M) y el aminocido hipotaurina (10 M), los cuales a travs de la activacin de la capacitacin conducen a una mayor tasa de penetracin (BALL y col., 1983; GREVE y col., 1987; LEIBFRIED-RUTLEDGE y col., 1987). La fecundacin in vitro en la especie bovina se puede llevar a cabo con semen fresco o congelado/descongelado despus que es llevado a cabo el swim-up (PARRISH y col., 1986). Este tratamiento permite establecer condiciones similares a las fisiolgicas. El semen a tratar es colocado en el fondo de un tubo cnico conteniendo 1 ml de medio de capacitacin y sometido a bao Mara a 39oC durante 1h. En la actualidad se conoce que durante este tiempo la capacitacin slo se inicia. El proceso concluye en el medio de fecundacin durante el co-cultivo de los espermatozoides con los ovocitos. Durante el swim-up los espermatozoides mtiles migran en el medio de capacitacin, liberndose del plasma seminal que queda en el fondo del tubo cnico. Despus de 60 minutos de incubacin son retirados 850l del medio de capacitacin sobrenadante con los espermatozoides mtiles y centrifugado a 200 g durante 10 minutos. Despus de la centrifugacin el sobrenadante es retirado y el "pellet" resuspendido. Despus de una segunda centrifugacin se retira el sobrenadante hasta un volumen de 100l y se evala la concentracin espermtica a fin de colocar una concentracin de 1 milln de espermatozoides por ml de medio donde se encuentran los ovocitos. Fecundacin in vitro La fecundacin comprende una serie de procesos cuyo punto final est representado por la fusin de los ncleos de ambas gametas y la formacin del genoma del nuevo individuo. El medio de fecundacin es un medio Tirodes-Lactato modificado, al que se le agregan heparina (30 l de la solucin final), adrenalina e hipotaurina, 15 l de la solucin final, (BALL y col., 1983). El tiempo de fecundacin es de 20-24h bajo las mismas condiciones de cultivo que durante la maduracin de los ovocitos. La penetracin del espermatozoide (fig 4) desencadena la segunda parte de la divisin meitica con la expulsin del segundo corpsculo polar. Simultneamente se cumple la descondensacin de la cabeza espermtica y la formacin del proncleo masculino. Este proceso es dependiente de la presencia de factores de crecimiento del proncleo masculino en el citoplasma del ovocito (BALL y col., 1984). Para la sntesis de esos factores de crecimiento es necesaria la presencia de esteroides y catecolaminas durante la maduracin del ovocito.
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Fig 4: Esquema de la penetracin del espermatozoide en el ovocito segn HYTTEL y col. (1989): 1) espermatozoide despus de la reaccin acrosmica, (N) ncleo, (MAI) membrana acrosmica interna, (MA) membrana acrosmica externa y la membrana nuclear (MN) en el espacio perivitelino sobre la superficie del ovocito. Las microvellosidades contactan el segmento ecuatorial, que no es afectado por la reaccin acrosmica. Obsrvese la distribucin de los grnulos corticales localizados a lo largo del oolema. 2) La fusin de las membranas ocurre entre las microvellosidades y el segmento ecuatorial. 3) La zona ecuatorial est extendida abarcando la totalidad del segmento ecuatorial y parte de la regin acrosmica posterior. Los grnulos corticales comienzan a liberarse. 4) El espermatozoide comenz a penetrar en el ooplasma. Para evaluar la fecundacin los ovocitos pueden ser fijados y coloreados con una solucin de orcena. La fecundacin es considerada por la presencia de los dos proncleos y, en estadios tempranos, la cola del espermatozoide. La tasa de penetracin y la tasa de polispermia tambin pueden ser determinadas en el marco de la evaluacin de la fecundacin. En estudios propios la tasa de fecundacin con un toro seleccionado para la PIV fue 68% y 74% de penetracin, esto es, 6% de los ovocitos sufrieron polispermia (BERG y BREM, 1989). Este ltimo valor, alto comparado con las tasas de polispermia observadas in vivo, podra ser explicado a travs de una incompleta o demorada reaccin de la zona de los ovocitos madurados in vitro. En condiciones normales despus que el espermatozoide penetr en el ovocito se unen los grnulos corticales con la membrana y vuelcan el material enzimtico en el espacio perivitelino. En los ovocitos madurados y fertilizados in vitro la secrecin de los grnulos corticales se observa frecuentemente como estructuras no dispersas en invaginaciones del oolema, posiblemente como consecuencia de una demorada migracin a la periferia (HYTTEL y col., 1989; fig. 6). Los cambios posteriores del lado interno de la membrana pelcida actan como bloque a la polispermia (WASSARMAN y col., 1990). Una concentracin espermtica elevada, por encima de los valores establecidos puede conducir igualmente a los mismos problemas de polispermia. El xito de un programa de PIV depende adems de la calidad de los ovocitos del toro empleado (LEIBFIED-
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RUTLEDGE y col., 1989) y no tiene relacin conocida con los resultados obtenidos con el mismo toro in vivo, como por ejemplo el ndice de no retorno.
Fig 6: Esquema de los fenmenos asociados con la migracin perifrica y liberacin de los grnulos corticales in vivo e in vitro segn HYTTEL y col. (1989) Cultivo in vitro. Tasas de desarrollo Despus que el desarrollo de los embriones cultivados en los medios convencionales se detenan en estadios especficos segn las especies, se intent aproximar el cultivo in vitro a las condiciones fisiolgicas con el empleo de clulas denominadas "colaboradoras". Los co-cultivos celulares ms empleados son aquellos con clulas del oviducto (FUKUI y ONO, 1988; LU y col., 1988b; EYESTONE y FIRST, 1989), clulas granulosas (GOTO y col., 1988; BERG y BREM, 1989) y fibroblastos uterinos (VOEKEL y col., 1985; WIEMER y col., 1987) como as tambin el co-cultivo con vesculas trofoblsticas (CAMOUS y col., 1984; HEYMAN y col., 1987). En ensayos propios se emple el mtodo de co-cultivo con clulas del oviducto, con el cual se haban logrado buenos resultados en el cultivo in vitro de embriones ovinos (GANDOLFI y MOOR, 1987; REXROAD y POWELL, 1988). Para ello se lavan oviductos con PBSS. Las clulas que forman el sedimento se resuspenden en el medio Ham's F 10 con el agregado de 10% de suero de vaca o en el medio 199 modificado que se emple para la maduracin de los ovocitos. Despus de un corto tiempo se forma una capa de clulas que cubren al cabo de 10-14 das, el fondo de la placa. Una alternativa para el co-cultivo con clulas somticas lo constituye el empleo de las clulas granulosas a partir del cumulus de los ovocitos fecundados. Como medio de cultivo se emplea el medio 199 modificado con el agregado de 20% de suero de vaca (BERG y BREM, 1989). A travs de la disminucin de la concentracin de O2 a un 5% se observa una mayor tasa de desarrollo y una mejor calidad de los embriones producidos. La explicacin para ello sera que una atmsfera reducida de oxgeno impedira la formacin de perxido que afecta negativamente al embrin en desarrollo. Resultados comparativos indicaron que la presencia de clulas granulosas ofrece mejores condiciones para el desarrollo de los embriones frente al co-cultivo con clulas del oviducto. El desarrollo de mrulas y blastocistos empleando las clulas del cumulus es el doble. Aproximadamente un tercio de los ovocitos cultivados pueden transformarse en embriones transferibles (BERG y BREM, 1990a; tablas 1 y 4; PALMA y col., 1992, tabla 2 y figura 9).
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Tabla 1: Tasas de desarrollo de ovocitos madurados y fertilizados in vitro en 3 sistemas de cultivo diferentes (BERG y BREM, 1990a) Co-cultivo con: Medio de cultivo Condiciones Desarrollo 162 h despus de FIV Mrulas Blastocistos a:b = p <0,01 ( Test de 2) clulas del oviducto Ham's F10 + 10% FKS 5% CO2/aire n 112a 10 (8,9%) 3 (2,7%) 13 (11,6%) clulas del oviducto MPM + 20% SVE 5%CO2/5%O2/ 90%N2 n 157a 21 (13,4%) 6 (3,8%) 27 (17,2%) clulas de la granulosa MPM + 20% SVE 5%CO2/5%O2/90% N2 n 160b 35 (21,9%) 16 (10,0%) 51 (31,9%)
La primera evaluacin morfolgica puede llevarse a cabo 90h despus de la FIV, coincidiendo con la liberacin de los embriones del exceso de clulas del cumulus. En ese momento se encuentran 43% de los embriones en estadio de 6-12 clulas (foto 5). Comparando esa tasa de divisin con el desarrollo posterior de los embriones se puede comprobar que 3/4 del total de ovocitos fertilizados pueden superar el "block" de 8-16 clulas (foto 6). Otra alternativa exitosa para el cultivo de los embriones es la aplicacin de medios condicionados. El empleo de medios libres de clulas cobra importancia en el cultivo de embriones, cuya zona pelcida fue abierta por medio de manipulacin. En nuestros ensayos fue evaluado un medio, producido a partir de clulas del cumulus obtenidas de ovocitos fecundados despus de 7 das de cultivo en medio 199 modificado. En ensayos conducidos a evaluar la congelabilidad del medio, como un aspecto de implementacin prctica, no se observaron diferencias en las tasas de desarrollo. Aparentemente la actividad embriotrofa del medio condicionado permanece estable despus de la congelacin/descongelacin (BERG y BREM, 1990b). Estos resultados coinciden con los obtenidos por EYESTONE y FIRST (1989) con medio condicionado a partir de clulas del oviducto.
Foto 4: Embriones en estadio de 6-12 clulas 90h Foto 5: Mrulas y blastocistos 7 das despus de despus de la FIV la FIV
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Foto 6: Blastocistos expandido y protruido 9 das despus de la FIV En la mayora de los trabajos experimentales descriptos en la produccin in vitro de embriones bovinos se trabaj con ovarios de numerosas vacas en forma de pool. Para el empleo de esta tcnica con determinados objetivos productivos, es de inters producir embriones de reproductoras en forma individual. Dado que es conocido que el xito de la fecundacin depende del semen que se emplee (LEIBFRIED-RUTLEDGE y col., 1989) quedaba por responder en que medida es posible prever la produccin de embriones transferibles a partir de los ovocitos de un animal. Los resultados indican que la tasa de desarrollo vara ampliamente entre animales (tabla 3). En 22 casos se produjeron un promedio de 2 (1,9) mrulas y 1,9 ( 2,6) blastocistos, esto es, 28% ( 21%) de los ovocitos empleados se desarrollaron hasta estadios viables para la transferencia. Los valores extremos en las tasas de desarrollo se encontraron entre 0% y 75%. El mayor nmero de embriones obtenidos de un animal fueron 12 mrulas y blastocistos. Tabla 2: Desarrollo de embriones producidos in vitro en dos sistemas de cultivo (PALMA y col., 1992b) Ovocitos Co-cultivos CO CG n 135 190 Mrulas 12,5 (17) 5,2 (10) % de embriones producidos (n) Blastocistos 0,7a (1) 17,8b (34) Total 13,2 (18) 23,0 (44)
CO: Clulas del oviducto, CG: clulas de la capa granulosa, a,b: p<0,05
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Tabla 3: Tasas de desarrollo (TD) de ovocitos inmaduros a los estadios de mrula (M) y blastocisto (B) 162h despus de la fecundacin in vitro (BERG y BREM, 1991)
Animal No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 x DS
Ovocitos n 13 16 25 19 10 20 10 11 12 12 11 15 9 15 8 16 15 13 24 14 9 12 309 145
M n 2 2 3 5 1 5 0 1 0 0 0 2 1 5 0 6 0 3 2 4 1 2 45 22
B n 4 10 0 0 0 0 1 4 5 6 0 2 2 1 0 1 0 2 0 4 0 0 42 22
M+B/ animal 6 12 0 5 1 5 1 5 5 6 0 4 3 6 o 7 0 5 2 8 1 2 87 4+/-3
TD 46 75 12 26 10 25 10 45 42 50 0 27 33 40 0 44 0 38 8 57 11 17
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El co-cultivo con clulas del oviducto proporcion una tasa desarrollo de blastocistos significativamente menor que con clulas de la granulosa. PALMA y col. (1992) concluyeron que el efecto positivo del cocultivo con las clulas del oviducto de vaca con los embriones clonados no se verifica en el cultivo de embriones producidos in vitro y que ello podra estar provocado por el mayor nmero de embriones cultivados por microgota comparado al nmero reducido de embriones clonados cultivados en el mismo
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volumen y/o requerimientos diferentes de ambos tipos de embriones. Por otra parte los autores son de la opinin que la obtencin y produccin de suspensiones de clulas del oviducto requiere de destreza, a fin de obtener un cultivo estril con alto porcentaje de clulas vivas. Ello convierte al cultivo en CO en una tcnica engorrosa en su desarrollo. La produccin de embriones en forma individual comparada con aquella en pool no fue diferente estadsticamente (tabla 4). Tabla 4: Produccin in vitro individual y en pool de mrulas (M) y blastocistos (B), BERG y BREM, 1991b Produccin Individual Pool (control) Pool (total) Ovocitos 309 332 1702 M 45 47 295 B 42 66 262 % M+B 28 34 33
Trabajos realizados por otros autores sealaron una sensible disminucin en la produccin de embriones cuando los ovocitos empleados eran madurados, fecundados y cultivados en pequeos grupos (n= 5, SSS y col., 1990). Para evaluar el efecto del cultivo en pequeos grupos sobre la produccin y el desarrollo de embriones bovinos, se dividieron los ovocitos madurados y fecundados (n = 710) en grupos de 30 COCsf/400 l para su cultivo en 3 grupos con un nmero decreciente de embriones por gota (PALMA y col., 1992). Al 7o da de cumplida la fecundacin la tasa de blastocistos y mrulas producidos se redujo significativamente con la disminucin del nmero de COCsf cultivados (p<0,01) como consecuencia de una significativa disminucin del nmero de blastocistos producidos (p<0,01). El desarrollo hasta el estadio de mrula no mostr diferencias significativas. Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio coinciden con los obtenidos por SSS y col. (1990) y FERRY y col. (1992) y explicaran la tendencia a obtener menos embriones cuando el nmero de complejos cumulus-ovocitos fecundados cultivados, vara entre 10-25 (tablas 2 y 3). Los mismos indicaran adems que el nmero de embriones cultivados tiene un efecto per se sobre el desarrollo de los ovocitos fertilizados. Aspecto que deber tenerse en cuenta en los programas individuales de PIV, clonado o embriones transgnicos, en los cuales el nmero de embriones a cultivar excepcionalmente alcanza el ptimo. FERRY y col. (1992) recomiendan una relacin de 1 embrin/l de medio de cultivo, como una va adecuada para adaptar el medio de cultivo al nmero de COCsf cultivados. Sin embargo sus resultados ptimos no superan aquellos que se obtienen en nuestro laboratorio (26-32% de blastocistos, PALMA y col. (resultados no publicados) con una relacin 1 embrin/1l de medio de cultivo. Tasas de desarrollo embrionario empleando ovocitos de hembras impberes No existe suficiente informacin que describa el grado de xito de la produccin in vitro de embriones empleando ovocitos de hembras impberes. Sin embargo este aspecto gana particular importancia debido a su trascendencia en el mejoramiento gentico (ver captulo XIX). KAJIHARA y col. (1991) obtuvieron ovocitos de terneras Holstein de 4 meses de edad (n= 509), despus de la faena o quirrgica-mente luego de una tratamiento con FSH, con el objeto de evaluar el efecto del tiempo de maduracin sobre el desarrollo de los embriones producidos. Los autores obtuvieron 8-12% de blastocistos (Bt, B y Be) y 1-4% de blastocistos protruidos, concluyendo en la factibilidad de producir mrulas y blastocistos in vitro con ovarios de terneras. Lamentablemente los autores no contaron con
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un grupo control de ovocitos de animales pberes a fin de comparar sus resultados. Coincidentemente con ello se observ en nuestro laboratorio una marcada disminucin de las tasas de recoleccin, maduracin y desarrollo embrionario con el empleo de estos ovocitos comparado con los obtenidos de hembras pberes (PALMA y col., 1993). Los resultados obtenidos fueron ineficaces (tabla 5) pero superiores a los alcanzados por KAJIHARA y col., hecho que despertara expectativas en el uso de esta categora de animales. PALMA y col. suponen que los ovocitos obtenidos de los animales impberes estudiados (raza Fleckvieh, 90-130 Kg p.v) requieren otras condiciones para su obtencin y especialmente maduracin. El uso de 20 g/ml de FSH logr mejorar significativa-mente la tasa de produccin de blastocistos protruidos frente al grupo control tratado con la mitad de la concentracin (PALMA y col., 1993 resultados no publicados). Ser necesario llevar a cabo ms estudios para optimizar los resultados de un programa de PIV con material de animales impberes. Tabla 5: Rendimiento individual de terneras y vacas en un programa de PIV de embriones (PALMA y col., 1993) Categora de animal Terneras (42) Vacas (202) Recolecci n Oo./anim. 13 15 aptos para IVF Oo./anim. 8 (63)a 10 (67)b Maduracin Oo./anim. 3 (37)c 6 (65)d Embriones* /animal 2 (16)e 3 (34)f B/animal 1 (16)g 2 (22)h
2; *Embriones = mrulas y blastocistos; ( ) = % a, b p< 0,05; c, d p< 0,001; e,f p< 0,001; g, h p< 0,001 Sistemas, medios y condiciones de cultivo Frente a los numerosos sistemas, medios y condiciones de cultivo - algunos de ellos presentados en este punto- se hace dificultosa una comparacin de los resultados de los diferentes grupos de trabajo. Nosotros consideramos, en funcin de los resultados presentados, al sistema de co-cultivo con clulas de la capa granulosa como el ms simple y exitoso en la produccin in vitro de embriones. El nacimiento de 120 terneros y una tasa de preez similar a la obtenida con la transferencia de embriones, producto de la superovulacin, son considerados como una prueba de la calidad de los embriones producidos con este sistema. Tasas de preez El objetivo de nuestro trabajo fue determinar qu tasas de preez son esperables con la transferencia de embriones producidos in vitro, como as tambin evaluar el grado de sincronicidad ms adecuado para obtener ptimas tasas de gestacin. Las transferencias se llevaron a cabo a vacas sincronizadas con una sola aplicacin de 500g de cloprostenol (Estrumate, Coopers), en presencia de un CL, o inducido con un dispositivo intravaginal impregnado con progesterona (PRID, Ceva) durante 12 das. Los embriones fueron transferidos entre los das 5 y 8 de desarrollo (estro = da 0). La tasa de preez obtenida con una asincrona embrin/receptora de -1 da fue significativamente mayor a la obtenida con una relacin de +1 (REICHENBACH y col., 1991, tabla 6).
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Tabla 6: Tasas de preez con transferencia sincrnica y asincrnica de embriones producidos in vitro (REICHENBACH y col., 1992) Sincronicidad Embrin/Recipiente +1 0 -1 -2 Transferencias n 30 47 52 4 133 Preeces n 9 22 31 2 64 Preez % 30a 47 60b 50 48
Valores con distintas letras difieren significativamente (p< 0,01) Los resultados obtenidos combinando el grado de sincronicidad embrin/receptora con la calidad del embrin transferido indican que la preez esperable con embriones de calidad inferior es significativamente ms baja (REICHENBACH y col., 1992; tabla 7). Estos resultados son similares a los que se encuentran con la transferencia de embriones obtenidos in vivo. Tabla 7: Tasa de preez con embriones producidos in vitro segn su calidad y sincronicidad con la receptora (REICHENBACH y col., 1992) Sincronicidad embrin/receptora Calidad del Embrin Muy buena Media Mala 2, a,b: p< 0,05 Con el objeto de producir gestaciones melliceras se compararon las tasas de preez obtenidas con la transferencia de 2 embriones en forma uni- y bilateral (BERG y col., 1991b). El celo de las receptoras (vaquillonas) fue sincronizado con una sola aplicacin de 500g de cloprostenol (Estrumate, Coopers) en presencia de un CL o inducido con un dispositivo intravaginal impregnado con progesterona (PRID, Ceva) durante 12 das. Mrulas y blastocistos fueron transferidos el da 6 7 no quirrgicamente en forma unilateral (n = 55) o bilateral (n = 94). No fueron encontradas diferencias entre las dos formas de transferencia posiblemente por que uno de los dos embriones empleados para la transferencia doble fue siempre de inferior calidad, con la intencin de mejorar sus posibilidades de gestacin (Tabla 8). En el grupo transferido en forma unilateral se observ una mayor tasa de aborto (p<0,05). Tabla 8: Tasas de preez despus de la doble transferencia uni- y bilateral de embriones producidos in vitro (BERG y col., 1991b) -1 % 63 (19/30) 65 (11/17) 20 (1/5) 0 % 47 (9/19) 50 (7/14) 38 (3/8) +1 % 38 (3/8) 30 (3/10) 25 (3/12) 53 (33/61)a 51 (21/41) 26 (7/27)b
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Transferencias n Unilateral Bilateral 55 94
P4>1,4ng/ml D21 % 55 (33)* 62 (58)
Preeces D35 % 49 (27) 53 (50)
Abortos D36-250 % 33 (9) 14 (7)
Gestaciones dobles % 33 (9) 42 (21)
*( ) = nmero de animales Congelacin de los embriones producidos in vitro. Tasas de preez La congelacin de los embriones producidos in vitro no parece arrojar los mismos resultados de preez que cuando se emplean embriones producidos in vivo (LIEBRICH, 1991; tabla 9). Tabla 9: Preez obtenida despus de la transferencia de embriones congelados/descongelados con dos mtodos (LIEBRICH, 1991) Embriones descongelados d6-7 n 109 139 transferidos d7 n % 36 29 52 33 21 producidos in vitro
Receptoras preadas (d35) n 16 12 31 % 44 41 60
Tratamiento A B Embriones frescos
El grupo A fue sometido directamente a una solucin de PBS, suplementada con 0,4% de BSA y conteniendo 1,37M de glicerina. Despus de 20 minutos de equilibracin a temperatura ambiente los embriones fueron envasados en pajuelas (0,25 ml) y stas colocadas en un bao de alcohol a -7o C, momento en que se llev a cabo el seeding. La curva de congelacin se describi a 0,3o/min. hasta 32o C. La descongelacin se llev a cabo por medio de exposicin de la pajuela al aire durante 5 seg., sta fue sumergida posteriormente en bao Mara a 25o C durante 10 seg. ms. En el grupo B la adicin del crioprotector se hizo en 3 pasos: 0,34M, 0,69M y 1,37M de glicerina en PBS-BSA. Los procedimientos de congelacin y descongelacin fueron los mismos que para el grupo A con la diferencia que la glicerina fue extrada en 3 pasos: 0,90M glicerina + 0,30M sucrosa, 0,45M glicerina + 0,30M sucrosa y 0,30M sucrosa en PBS-BSA. La viabilidad obtenida en ambos grupos fue baja (2030%), sin embargo con los embriones descongelados, que fueron seleccionados para la transferencia, se alcanzaron tasas de preez satisfactorias (40-44%).
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Conclusiones El mtodo descrito de produccin in vitro de embriones permite disponer de un gran nmero de embriones bovinos en diferentes estadios de desarrollo, como lo indican los resultados en gran escala publicados actualmente (PALMA y col., 1993b). Los embriones producidos pueden ser destinados a la investigacin, comercializacin o ser sometidos a modernas tcnicas de inters productivo como la produccin de animales transgnicos y/o clonados. Frente a la obtencin de embriones bovinos in vivo, por medio de superovulacin, el mtodo in vitro permite la estandarizacin de la produccin, disminuyendo sensiblemente las variaciones en la produccin de embriones. Posibilita la reduccin del nmero de animales de experimentacin y una permanente observacin del proceso de desarrollo embrionario. El mtodo abre adems la posibilidad de producir embriones de vacas de alto valor gentico, que por diversas razones son enviadas al matadero. En combinacin con las exitosas tcnicas de congelacin se presentan nuevos aspectos en la conservacin de reservas genticas de razas de alto valor gentico o en vas de extincin (captulo XIX). Los primeros ensayos llevados a cabo por ARMSTRONG y col. (1991) y en nuestro laboratorio indican que es posible obtener ovocitos de vacas y terneras con ayuda de laparoscopia y producir a partir de ellos embriones transferibles. De esta forma es posible acortar el intervalo generacional considerablemente. La tcnica de puncin de los folculos con ayuda de sonografa o endoscopa transvaginal permite, desde hace poco tiempo, obtener ovocitos inmaduros de vacas con ciclos normales con intervalos de varios das. PIETERSE y col. (1991) lograron llevar a cabo hasta 3 punciones durante un ciclo estral. Ello indicara la posibilidad de reducir el intervalo de obtencin de embriones de manera considerable. REICHENBACH y col., (1993) reportaron la recoleccin de ovocitos por medio de aspiracin folicular endoscpica. Los autores obtuvieron un promedio de 5-6 ovocitos por vaca y 3-4 por vaquillona semanalmente y una eficacia en el xito de la recoleccin de 60-70% y 50-65% para vacas y vaquillonas respectivamente. De los ovocitos recolectados se obtuvo 20% de mrulas y blastocistos (PALMA y col., 1993, resultados no publicados), una tasa considerablemente menor comparada a la obtenida con ovocitos obtenidos de ovarios de vacas faenadas. La diferencia radica en que los ovocitos obtenidos in vivo no son seleccionados de acuerdo a su apariencia morfolgica como en los programas convencionales de PIV. La repetibilidad con xito y eficacia de la tcnica de puncin como as tambin una eficaz produccin de embriones con los ovocitos recolectados aumentara el nmero de embriones producidos (van der SCHANS y col. 1991) y se constituira en un interesante complemento de los programas convencionales de ncleos de produccin. Bibliografa AOYAGI, Y., FUKUI, Y. IWAZUMI, Y. URAKAWA, M., MINEGISHI, Y. and ONO, H. 1989. Effects of culture system on development of in-vitro fertilized bovine ova into blastocysts. Theriogenology, 31: 168. AOYAGI, Y., FUKUI, Y. IWAZUMI, Y. URAKAWA, M. and ONO, H. 1990. Effects of culture systems on development of in-vitro fertilized bovine ova into blastocysts. Theriogenology , 34: 749-759. ARMSTRONG, D.T., HOLM, P., IRVINE, B., PETERSEN, B.A., STUBBINGS, R.B., McLEAN, D., STEVENS, G.F. and SEAMARK, R.F. 1991. Laparoscopic aspiration and in vitro maturation of oocytes from calves. Theriogenology, 35: 182. BALL, G.D., LEIBFRIED, M.L., LENZ, R.W., AX, R.L., BAVISTER, B.D. andFIRST, N.L. 1983. Factors affecting successful in vitro fertilization of bovine follicular oocytes. Biol. Reprod., 28: 717-725. BALL, G.D., LEIBFRIED, M.L., AX, R.L. and FIRST, N.L. 1984. Maturation and fertilization of bovine oocytes in vitro. J. Dairy Sci. 67: 2775-2785. BAVISTER, B.D. and YANAGIMACHI, R. 1977. The effects of sperm extracts and energy sources on the motility and acrosome reaction of hamster spermatozoa in vitro. Biol. Reprod. 16: 228-237.
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Clement-Sengewald
CLONADO DE EMBRIONES A. Clement-Sengewald Introduccin En microbiologa y biologa celular un clon es una poblacin de organismos con una unidad gentica. En ingeniera gentica se define como vector clon, aquellos vectores que portan un gen extrao. Es importante destacar que en el origen y replicacin de un clon no ocurren variaciones genticas (v.G. mutaciones somticas) y que slo se establecen replicaciones del ADN y divisiones nucleares mitticas. En organismos multicelulares se emplea el trmino "clon" cuando stos son genticamente idnticos. Particularmente en el reino vegetal los clones son un fenmeno difundido, la papa es un ejemplo actual de una poblacin clon. En el campo de la zoologa se encuentran clones en forma natural tanto en organismos inferiores como en especies altamente desarrolladas como los mamferos, aunque con limitaciones, dado que el nmero de individuos idnticos en estos casos es en general relativamente pequeo (mellizos o trillizos monocigotas, entre otros). En las especies vegetales los clones se originan a travs de reproduccin vegetativa. En las plantas, p. e. a travs de los tallos, las yemas o regeneracin de sus partes. En los mamferos no existe esa via, slo estadios embrionarios pueden constituir el punto de partida de los individuos monocigotas. De acuerdo a lo definido para el trmino clon se entiende el concepto clonar como: - En biologa celular la unificacin de las clulas con la posterior produccin de cultivos celulares a partir de una sola clula. - En ingeniera gentica la incorporacin de un fragmento de ADN (gen) en un vector-clon y su reproduccin clonada en una clula receptora adecuada. - En embriologa la produccin de embriones con idntico genotipo. En el ltimo caso y para los mtodos empleados en los animales domsticos es preciso diferenciar entre: - Divisin microquirrgica de estadios embrionarios tempranos y el posterior desarrollo de las mitades obtenidas en fetos o individuos. - Combinacin por medio de micromanipulacin de estadios embrionarios asincrnicos, con el objeto de respaldar el desarrollo de blastmeros de estadios ms avanzados con blastmeros de estadios ms tempranos. A travs de esta va se pretende aumentar la produccin de cuatrillizos hasta 5-8 individuos idnticos (quimera-clon). - Transferencia de ncleos y clulas embrionarias nucleadas (blastmeros) en clulas enucleadas para producir con un reclonado exitoso, en teora, un nmero ilimitado de embriones e individuos idnticos (clonado embrionario). Experimentos en el campo del clonado se realizan hace ms de 35 a os. La motivacin en desarrollar esta lnea de investigacin bsica resulta de la fascinacin ante la posibilidad de lograr la llave de los conocimientos sobre la totipotencia celular y los procesos de desarrollo embrionario como as tambin el significado de esos factores sobre los efectos recprocos entre el genotipo y el ambiente. Junto con ese interrogante bsico de las ciencias genticas y biolgicas se encuentra tambin, desde la dcada del 80, el creciente inters de la gentica animal en aquellos mtodos y aplicaciones del clonado en los animales. Una de las razones del por qu los genetistas incluyen el clonado en sus proyectos se apoya en el problema que la evaluacin gentica, especialmente en rodeos bovinos, se
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Clonado de embriones
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lleva a cabo con varios aos de intervalo generacional y un nmero relativamente reducido de descendientes hembras. La variabilidad de la descendencia, a travs de la recombinacin gnica, como producto de la reproduccin sexuada, conduce en muchos casos a un potencial de seleccin heterogneo y til. La reproduccin clonada permitira sin embargo, variar los genotipos seleccionados como sobresalientes en forma directa y sin modificaciones.
Tcnicas de clonado Divisin de los embriones Cuando estadios embrionarios tempranos son divididos, se desarrollan las mitades producidas con un determinado porcentaje de nacimientos. Las mitades que se desarrollan presentan, sin embargo, en estadio de blastocisto claramente menos clulas que aquellos embriones no divididos. Ello significa que la prdida de masa celular no puede ser compensada, dado que no se contina con un crecimiento compensatorio. La razn para ello es que a partir del momento de la fertilizacin de un ovocito se establece el plan de desarrollo, en el cual el nmero de divisiones celulares es establecido hasta alcanzar el estadio de blastocisto. Un embrin dividido tendr en consecuencia tantas divisiones como las que hubiese tenido en su estado original. Si h-embriones son divididos para producir 4 embriones idnticos, el posterior desarrollo embrionario hasta el nacimiento se verificar slo en casos excepcionales como consecuencia de la prdida de masa celular. Parece evidente la existencia, en desarrollos embrionarios tempranos, de la conocida como masa celular crtica y que sta no debe ser superada. Un blastocisto funcional puede continuar su desarrollo cuando esa caracterstica est presente en su masa celular. Si esto no es as se originan vesculas trofoblsticas que se asemejan a los blastocistos, pero que carecen de la capacidad de desarrollarse, como consecuencia de una falla en la MCI. A travs de la divisin de los embriones se logr producir en muchos casos descendencias con xito. Sin embargo el nmero de individuos idnticos, a partir de un embrin, se mantiene limitado por las razones ya mencionadas, a 2 y en casos aislados a 4 como mximo. Por esa razn el mtodo de divisin de embriones no es adecuado para producir un mayor nmero de embriones (BREM, 1986). El aislamiento y cultivo de blastmeros obtenidos de embriones en estadios tempranos puede tambin conducir al desarrollo de individuos idnticos. La tasa de desarrollo es sin embargo menor cuanto ms avanzado es el estadio del embrin utilizado (MOORE y col., 1968), dado que el nmero de clulas del embrin producido es muy reducido. Clonado quimrico Para contrarrestar la reduccin de la masa celular en el clonado se llevaron a cabo ensayos experimentales en las especies murina y ovina agregando un blastmero temprano a uno en estadio avanzado de desarrollo (blastmeros asincrnicos). Los blastmeros se desarrollan juntos en un blastocisto normal. Con la asincrona se pretendi formar el embrioblasto a partir del blastmero ms desarrollado. Los blastocistos producidos de esa forma implantaron y se desarrollaron en forma normal (STERN y WILSON, 1972; FEHILLY y col., 1984; WILLADSEN, 1985). WILLADSEN y FEHILLY (1983) lograron producir quintillizos con ayuda del clonado quimrico en la especie ovina. Transferencia de ncleos en embriones La transferencia de ncleos celulares a partir de un embrin multicelular, a varias clulas receptoras posibilita la produccin de embriones unicelulares que poseen el mismo genoma. Una condicin para ello es que esa informacin gentica sea empleada en la clula receptora (activacin) y la divisin se inicie como en un ovocito fertilizado. Esta fase se denomina reprogramacin. De esta forma, la divisin
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celular no contina en el punto en que se detuvo el embrin donante sino nuevamente en el mismo nivel de un ovocito fertilizado. Ncleos de embriones tetraploides fusionados fueron obtenidos para producir embriones diploides y luego transferirlos a clulas receptoras. Los resultados mostraron una capacidad de desarrollo inferior de los embriones producidos, caracterizando ese tipo de clonado como ineficiente (CLEMENT-SENGEWALD y BREM, 1990). BRIGGS y KING llevaron a cabo en 1952 los primeros experimentos de transferencia nuclear en organismos multicelulares (anfibios) y observaron que una reprogramacin de ncleos celulares de blstula, a travs de ovocitos, es posible. Estudios posteriores indicaron que por medio de procesos de diferenciacin avanzados del ncleo celular la reprogramacin se pierde (GURDON y col., 1975). Como clulas receptoras de los ncleos celulares embrionarias en los mamferos se adecuan ovocitos sin fertilizar -madurados in vivo o in vitro- que hayan alcanzado la metafase II de la 2. divisin meitica separando el cmulus que los rodea. En esas clulas, contrariamente a lo que ocurre con ovocitos fertilizados, pueden ser reprogramados ncleos indiferenciados de estadios embrionarios ms tardos. Para los trabajos experimentales en clonado de embriones bovinos se adecuan tanto los ovocitos madurados in vivo como in vitro. Por otra parte el empleo de ovocitos madurados in vitro es tcnicamente ms simple y econmico, dado que los mismos son obtenidos de ovarios de matadero. La aplicacin de diferentes clases de ovocitos madurados in vitro, uniformemente oscuros o uniformemente claros result en las mismas tasas de fusin y desarrollo embrionario (CLEMENTSENGEWALD y col., 1992a, tabla 1). Tabla 1: Resultados de fusin, activacin y cultivo en 3 clases de ovocitos (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1992a) clase 1 2 3 pulsados 262 63 89 fusionados n % 194 546 76 74,0 73,0 85,3 cultivados n 187 45 74 activados n % 74 22 33 39,5 a 48,8 b 44,5 m.+b. 14 4 4 %/C 7,4 8,8 5,4 %/A 18,9 18,1 12,1
C: cultivados; A: activados; m. + b.: mrulas y blastocistos; a,b p<0,05
Dado que el ovocito no fertilizado cuenta con un nmero haploide de cromosomas, ste podra conducir, en interaccin con el nmero diploide de cromosomas del ncleo, a la formacin de embriones triploides. En consecuencia el genoma del ovocito debe ser separado del plasma celular. El mismo puede ser conducido junto con una mitad de la masa citoplsmica al interior de una zona pelcida vaca (WILLADSEN, 1986). Los ovocitos resultantes, con o sin el ADN se emplean como clulas receptoras. Con este mtodo se pueden desarrollar, sin embargo, slo la mitad de los ovocitos como mximo, como consecuencia de la imposibilidad del desarrollo posterior del embrin triploide. Por otra parte la gran prdida de citoplasma puede tener un efecto negativo sobre la continuidad del desarrollo del embrin producido (BONDIOLI y col., 1990). La particularidad que el ADN del ovocito madurado se encuentra prximo al corpsculo polar, permite a travs de un mtodo de extraccin mecnico, eliminar el genoma citoplsmico. El mismo se lleva a cabo aumentando, en primero lugar, la elasticidad celular con citocalasina B y aspirando el corpsculo polar y el citoplasma contiguo (fotos 2 y 3) con una micropipeta. A travs de esta operacin es eliminado el ADN endgeno en la mayor parte de los ovocitos (92%, STICE y ROBL, 1988). La tabla 2 presenta los resultados obtenidos con la transferencia nuclear por medio de micromanipulacin con ovocitos madurados in vitro. Tabla 2: Resultados de la manipulacin de los ovocitos (CLEMENT-SENGEWALD y col. 1991)
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Ovocitos metafase II n (%) 597 100
Enucleacin Intactos Degenerados 585 98,0 12 2,0
Transferencia nuclear Intactos Degenerados 582 99,5 3 0,5
A travs de la coloracin del ovocito con el colorante para ADN (HOECHST 33342) es posible, bajo observacin visual, controlar la enucleacin y lograr una eficacia del 100% (PRATHER, 1989). Como donantes de blastmeros se emplean embriones con estadios de 4 clulas hasta mrulas. Junto con el empleo de embriones ex-vivo (obtenidos de un lavaje uterino) se emplean tambin ovocitos madurados in vitro (MI) en forma creciente como donantes de blastmeros (CLEMENT-SENGEWALD y col. 1990; SIMS y col., 1991). Hasta el momento se obtienen tasas similares de fusin y activacin empleando ovocitos obtenidos in vivo o madurados in vitro. Sin embargo las tasas de desarrollo de los embriones clonados con ovocitos madurados in vitro es an inferior a los ex vivo (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1992b, tabla 3). En los ensayos de WHITESELL y col. (1992) fue posible producir embriones in vitro de dos vacas sacrificadas. Los embriones producidos fueron empleados como donantes de blastmeros. Los autores pudieron producir 8 embriones de una vaca y de esos, 8 preeces despus de la transferencia nuclear. El clonado de 9 embriones de la segunda vaca result en 21 preeces. Tabla 3: Comparacin entre ovocitos madurados in vitro y obtenidos in vivo para su empleo en el clonado (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1992b) Embrin donante in vitro in vivo COBs a 182 112 fusionados b b/a 130 (71) 81 (72) cultivados c 102 81 divididos d d/c 60 (59) 37 (46) m+b e e/c 10 (10) 16 (20)
c/d (16,6)a (43,2)b
a,b p<0,01 COBs: complejos ovocitos/blastmeros, m+b: mrulas y blastocistos
La aislacin de los blastmeros, conteniendo un ncleo cada uno, puede llevarse a cabo por medio de disgregacin del embrin con un medio libre de Ca2+y Mg2+ (STICE y ROBL, 1988), con la previa separacin de la zona pelcida por medios qumicos o mecnicos. La aislacin de los blastmeros se realiza sin dificultades por medio de aspiracin con una pipeta. Adems es posible aspirar el ncleo de un blastmero sin lesionar la membrana celular. De esta forma se obtiene una vescula, rodeada por una membrana celular (carioplasto), conteniendo un ncleo (Mc GRATH y SOLTER, 1983a). En la actualidad el mtodo de obtencin del ncleo ms empleado es la aspiracin de un blastmero completo de un embrin multicelular (fotos 4 y 5). Para ello se emplea una pipeta con punta afilada a fin de atravesar la zona pelcida (PRATHER y col., 1987). El empleo de pipetas de punta roma es posible si se practica una incisin en la zona a fin de facilitar el paso de la pipeta en el interior del espacio perivitelino hasta el blastmero (TSUNODA y col., 1986). La pipeta conteniendo el carioplasto es introducida en el espacio perivitelino de un ovocito previamente enucleado (fotos 6-7). Con ayuda de una ligera presin positiva se deposita el blastmero. En nuestros ensayos la transferencia de ncleos fue exitosa en 582 de 585 casos (99,5%). Despus de la transferencia se provoca la fusin de las membranas. A travs de la fusin se induce la formacin de poros en las membranas celulares, de tal forma que se establecen pequeos canales entre el ovocito y el blastmero. A travs de stos puede circular el contenido de ambas clulas. Luego de la fusin de ambas membranas en contacto se incorpora el ncleo transferido en el citoplasma del ovocito receptor (fotos 10-12). La fusin puede ser
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provocada tambin por el virus Sendai inactivado (OKADA y col., 1957), que se inyecta en el espacio perivitelino junto con el blastmero. Este mtodo fue utilizado hasta el momento en experimentos de transferencia de ncleos celulares en ratn (Mc GRATH y SOLTER, 1983b), ovino (WILLADSEN, 1986) y bovino (ROBL y col., 1987). La tasa de fusin en animales domsticos fue muy reducida. Otro mtodo de fusin del blastmero con el ovocito es la electrofusin. Con pulsos elctricos muy cortos e idnticos se provoca la desintegracin de pequeas porciones de la membrana celular en la zona de contacto entre el ovocito y el blastmero y en consecuencia la fusin de ambas membranas (ZIMMERMANN y VIENKEN, 1982; CLEMENT-SENGEWALD y BREM, 1989). En comparacin con el mtodo de fusin con el virus Sendai, la electrofusin se presenta como un mtodo ms efectivo, con una tasa de fusin de 90% frente a 50% en la especie ovina y 80% frente a 8% en la bovina. Nuestros ensayos de electrofusin indicaron que las tasas de fusin de los blastmeros obtenidos de embriones producidos in vitro son iguales a las obtenidas con blastmeros de embriones obtenidos in vivo (tabla 4). Tabla 4: Resultados de la fusin de blastmeros con ovocitos receptores por medio de pulsos elctricos (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1991) Donantes de ncleos In vitro In vivo Suma COB n 312 249 561 Fusionados n % 230 189 419 73,7 75,9 74,6 No fusionados n % 38 38 76 12,2 15,3 13,6 Degenerados 44 22 66 14,1 8,8 11,8
Otra ventaja de la electrofusin es la activacin del ovocito, mediante la cual se inicia la divisin celular. El mecanismo de esa activacin es hasta el momento desconocido. Se supone, sin embargo, que la despolarizacin de la membrana del ovocito es similar a la que ocurre durante la fertilizacin normal y que la concentracin intracelular de calcio es alterada como consecuencia de la formacin de poros en las membranas plasmticas (COLLAS y col., 1989). La tasa de activacin es altamente dependiente de la edad del ovocito y del nmero, intensidad y duracin del pulso elctrico empleado, como as tambin del intervalo entre pulsos (COLLAS y col., 1989; KONO y col., 1989; WARE y col., 1989). Los embriones producidos luego de la micromanipulacin son cultivados in vitro o in vivo hasta el estadio de M o B, para ser transferidos a hembras receptoras. El cultivo in vitro permite controlar el desarrollo del embrin. Para el cultivo in vivo se emplean hembras de la misma o diferente especie (conejo, ovino). Para el cultivo de embriones ovinos se emplean con frecuencia hembras de la misma especie. Los embriones recubiertos con agar son colocados en el oviducto (ROBL y col., 1987) y despus de 5-6 d de cultivo son recuperados. Con el cultivo de los embriones bovinos en oviducto de coneja se obtienen los mismos resultados (WESTHUSIN y col., 1989). Dado que ese mtodo es engorroso y caro los esfuerzos se concentran en el cultivo exclusivamente in vitro de los embriones producidos (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1990; SIMS y col., 1991). Para el cultivo in vitro se emplean sistemas de co-cultivo con clulas del oviducto (CO, CLEMENT-SENGEWALD y col., 1990; SIMS y col., 1991), clulas de la granulosa (CG) o medios condicionados con clulas de la granulosa (MCCG, CLEMENTSENGEWALD y col., 1991; tabla 5). Los resultados indican que hasta el momento, el co-cultivo con clulas del oviducto parece ser el ms adecuado. De los embriones cultivados 7% alcanzaron los estadios de mrula y blastocisto, cuando embriones producidos in vitro fueron empleados como
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donantes de blastmeros. Cuando fueron empleados blastocistos de embriones obtenidos in vivo se alcanzaron tasas de 16%. Tabla 5: Resultados del cultivo de embriones producto de la electrofusin con diferentes medios (CLEMENT-SENGEWALD y col., 1991) Donante de blastmeros In vitro Sistema de cultivo CCO CCG MCCG In vivo CCO CCG Cultivados n 149 73 298 113 79 Activados n % 70a 28 99b 51c 19d 46,9 38,3 33,2 45,1 24,0 M+B n % 11e 2 19 18f 5g 7,3 2,7 6,3 15,9 6,3
McLAUGHLIN y col,. (1992) alcanzaron 20% de mrulas y blastocistos (28/128) cultivando los embriones clonados en un medio sinttico (SOFM) sin sistema de co-cultivo. Despus de la transferencia naci un ternero. Coincidentemente informaron NORTHEY y col., (1992) similares tasas de desarrollo de embriones clonados a las obtenidas con el co-cultivo con clulas de oviducto (20% y 28% respectivamente). El desarrollo de los embriones despus de la transferencia nuclear permite emplearlos como donantes estableciendo un reclonado. A travs del reclonado es posible en consecuencia, disponer tericamente de un nmero ilimitado de ncleos celulares idnticos, si los embriones obtenidos son siempre empleados como donantes. En la prctica debe considerarse, sin embargo, que la tasa de desarrollo de los embriones producidos disminuye con el aumento creciente del reclonado (BONDIOLI y col., 1990; STICE y col., 1991). La razn de esto es desconocida, aunque posiblemente el motivo sea la falta de una ptima manipulacin y de adecuadas condiciones en los cultivos.
Fotos 1: pipetas de sostn (PS) y de inyeccin (PI)
Foto 2: fijacin del ovocito
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Foto 3: Extraccin del corpsculo polar y del Foto 4: Aspiracin del blastmero citoplasma adyacente
Foto 5: Aspiracin del blastmero
Foto 6: Colocacin de blastmero en el ovocito receptor
Foto 7: Colocacin de blastmero en el ovocito Foto 8: Bastmero del embrin donante en el receptor esapacio perivitelino
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Experimentos de clonado en animales de inters zootcnico Conejo BROMHALL inform en el ao 1975 por primera vez sobre los ensayos de transferencia nuclear llevados a cabo en embriones de conejo. El genoma de los ovocitos receptores no fue extrado, produciendo embriones triploides. Los embriones donantes fueron mrulas. Slo el 2,6% de los embriones producidos continuaron su desarrollo hasta el estadio de mrula. STICE y ROBL (1988) informaron el nacimiento de 6 conejos a partir de la transferencia de ncleos de embriones de 8 clulas a 164 ovocitos receptores enucleados. La tasa de sobrevivencia de los embriones logrados fue de 3,7%. Los 6 animales fueron gestados en 6 diferentes hembras. HEYMANN y col. (1990) informaron el nacimiento de 6 clones, en ese ensayo la tasa de sobevivencia fue de 3,9%, comparable con los resultados de STICE y ROBL (1988). Un ao despus COLLAS y ROBL lograron producir un clon sxtuplo con una tasa de sobrevivencia de los embriones de 7,2%. Porcino PRATHER y col. (1988) informaron sobre la primera gestacin despus de la transferencia de embriones producidos por medio de transferencia nuclear. A pesar que la gestacin fue comprobada, hasta el da 59 no hubo nacimientos en ese ensayo. Un ao despus fue publicado el nacimiento de un lechn a partir de un embrin donante de 4 clulas (PRATHER y col. 1989) La tasa de sobrevivencia de los embriones manipulados fue muy baja (1,1%), 1 lechn vivo de 88 embriones transferidos. PROCHAZKA y col. (1990) emplearon ovocitos de cerdo madurados in vivo como receptores de blastmeros de embriones de 2 a 8 clulas. Los autores comprobaron que una parte de los ovocitos tuvo una buena capacidad de regular el normal desarrollo de los ncleos transferidos, la otra careci de esa capacidad. En las primeras 24 a 30h de cultivo in vitro se dividieron 12 de 16 embriones producidos, 1 embrin se dividi hasta el estadio de blastocisto (d 7). Recientes investigaciones indicaron que ovocitos porcinos madurados in vitro pueden ser utilizados como receptores de blastmeros (NAGASHIMA y col., 1992). Despus del cultivo in vitro pudieron desarrollarse 11,9% de mrulas y blastocistos (TERLOUW y col., 1992). Ovino y caprino WILLADSEN inform en el ao 1986 el nacimiento de 3 corderos, producto de la fusin de blastmeros de embriones de 8 clulas con ovocitos enucleados. Dos de 3 animales se originaron del mismo embrin (mellizos homocigotas). Ello llam la atencin en el mundo cientfico y desencaden numerosos ensayos que sirvieron para el posterior desarrollo y transferencia de la tcnica a otras especies domsticas. SMITH y WILMUT (1989) informaron el nacimiento de 4 corderos, producto de la transferencia de blastmeros de 16 clulas y de la MCI de un blastocisto en mitades de ovocitos enucleados. A travs de este experimento los autores comprobaron que los ncleos pueden reprogramar una clula y regular el desarrollo normal del embrin producido. McLAUGHLIN y col. (1990) lograron comprobar el desarrollo de 4 hermanos clones el da 45 de la preez a travs de la tcnica de ultrasonido. Los mismos fueron producidos transfiriendo blastmeros de embriones de 8 y 16 clulas. Actualmente es posible cultivar los embriones clonados hasta el estadio de mrula (PUGH y col., 1992). YONG y col. (1991) produjeron 2 cabras idnticas despus de la transferencia de los blastmeros de un embrin de 32 clulas. La tasa de sobrevivencia en ese experimento fue de 21%. Bovino Las primeras transferencias de ncleos en esta especie fueron descriptas por ROBL y col. (1987). Los autores utilizaron ovocitos fertilizados como clulas receptoras, a las cuales se les extrajeron los proncleos con ayuda de centrifugacin. Despus de la transferencia de los blastmeros extraos en
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las clulas receptoras se desarrollaron 5 de los 38 embriones recuperados (17%) del oviducto de oveja hasta el estadio de M y B. Despus de la transferencia de 2 blastocistos a hembras receptores se produjo el nacimiento de 2 terneros. La transferencia de ncleos de blastmeros de embriones de 2, 4 y 8 clulas a ovocitos receptores, fertilizados y enucleados result en la divisin hasta 2 y 4 clulas. Ese ao el mismo grupo de investigacin (PRATHER y col., 1987) inform el nacimiento de 2 terneros, resultado de la transferencia de ncleos de mrulas en ovocitos fertilizados y enucleados. En total fueron transferidos 19 M y B a 13 receptoras despus de un cultivo previo en oviducto de oveja durante 4-5 das. En este trabajo llam la atencin que los ovocitos madurados in vitro mostraron un desarrollo significativamente menor hasta M y B que los ovocitos receptores obtenidos frescos 36h despus del celo (BARNES y col., 1987). El cultivo in vivo de los embriones producidos a partir de la transferencia nuclear, en oviducto de oveja fue superior al cultivo in vitro en medio Tyrode con 3mg/ml de BSA, en el cual se obtuvieron como mximo estadios de 6 clulas despus de un cultivo de 3 das. MAREK y col. (1990) observaron que el estadio del embrin donante de blastmeros (d 5, 5,5 y 6) no afecta la tasa de electrofusin. Sin embargo, despus de la transferencia de los blastmeros de embriones de 6 das se desarrollaron ms embriones a estadios de M y B (34,5%, despus de un cultivo in vivo) que con embriones donantes de 5 das. STICE y col. (1991) observaron que con el reclonado tanto las tasas de fusin (66%, 60%, 52% y 54%) como las tasas de desarrollo hasta los estadios de mrula y blastocisto (20, 10, 19 y 12%) disminuan con el aumento del reciclaje desde el primer clonado al tercer reclonado respectivamente. Mientras se llevaban a cabo los ensayos con embriones donantes de blastmeros, obtenidos in vivo, de los cuales los embriones clonados eran cultivados en oviducto de oveja, CLEMENT-SENGEWALD y col. (1990) y SIMS y col. (1991) describan el empleo de embriones producidos in vitro como donantes de blastmeros y el cultivo in vitro de los embriones clonados. Con el empleo simultneo de ovocitos receptores madurados in vitro, por ambos grupos de trabajo, se comprob la posibilidad de producir embriones clonados hasta estadios transferibles in vitro. El grupo de trabajo de BONDIOLI (1990) inform sobre numerosos ensayos de transferencia de ncleos. Para ello fueron empleados slo ovocitos obtenidos in vivo despus de la extraccin y lavaje del oviducto de vacas superovuladas. Los embriones donantes fueron obtenidos entre el dia 5 y 6,5 por medios no quirrgicos (estadio de 16-64 clulas). Despus de la transferencia nuclear, los embriones producidos fueron cultivados transitoriamente en oviducto de oveja y transferidos a vacas receptores (sincrnicas) en estadios de M y B. Despus de la transferencia de 337 embriones fueron diagnosticadas, el da 42, 79 gestaciones (23,4%). Despus de la transferencia de 62 M y B, producidos con blastmeros de embriones descongelados, se diagnosticaron (d 42) 10 animales preados (16,1%). Cuando los embriones fueron congelados/descongelados y empleados para el reclonado se lograron slo 3 (13,0%) gestaciones de 23 embriones (d 42). En promedio se obtuvieron 22,5% de gestaciones (106 preeces de 463 embriones). De esas gestaciones se obtuvieron 92 terneros vivos. De un embrin donante se pudieron lograr como mximo 8 gestaciones (d 42). Siete toros fueron idnticos. Cuando los embriones producidos no fueron cultivados en oviducto de oveja sino in vitro se dividieron 13% de los embriones hasta M y B. Despus de la transferencia de esos 11 embriones se obtuvieron 3 terneros vivos. WILLADSEN y col. (1991) alcanzaron 42% de preez (d35) y 38-33% de nacimientos (100 terneros). Llam la atencin en un nmero importante de terneros el elevado peso y los problemas de parto como consecuencia de ello. Se requiri asistencia en 84% de los partos. WILLADSEN y col. (1991) produjeron 13 clones de un par de mellizos idnticos cada uno, 10 clones trillizos y 5 clones con 4 hermanos idnticos. El mayor clon bovino lo constituyen 7 toros vivos (BONDIOLI y col., 1990). Hasta el momento nacieron terneros del primer clonado y tercer reclonado (STICE y col., 1991). Se describ tambin la gestacin de clones de embriones donantes congelados/descongelados y con subsiguiente reclonaje (BONDIOLI y col., 1990). Los resultados ms importantes de los experimentos de clonaje en el bovino se resumen en la tabla 6.
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Tabla 6:
Resultados obtenidos en los experimentos de clonado in vivo in vivo 72 in vivo 24 463 92 19 7 in vivo in vivo S.r in vivo S.r. (302 transferencias) 100 (33) 4 11 33 28 in vitro in vitro 66 in vitro in vitro in vitro 80 in vitro in vitro in vitro in vitro
Origen del embrin donante Origen de los ovocitos Tasa mxima de fusin (%) Cultivo m & b obtenidos (%) Embriones transferibles (n) Terneros nacidos (n) Sobrevivencia embrionaria (%) Tamao mximo del clon Estadio del embrin donante de ncleos Fuente
16-64bl.
BONDIOLI y col. (1990)
8-64bl.
WILLADSEN y col. (1986) CLEMENTSENGEWALD y col. (1990) SIMS y col. (1991) NORTHEY y col. (1992)
S.r = Sin referencias; m & b: mrulas y blastocistos
Perspectivas No obstante que en conejos la tasa de ovocitos/blastmeros fusionados en los experimentos de HEYMAN y col. (1990) fue de 91,5%, es necesario mejorar la tasa de fusin en las otras especies, como por ejemplo en el bovino. BONDIOLI y col. (1990) informaron la fusin de cerca de 70% de los ovocitos/blastmeros sometidos a pulsos elctricos. Las tasas de fusin parecen ser ms altas empleando estadios embrionarios tempranos como donantes de blastmeros (SMITH y WILMUT, 1989). Ello puede ser consecuencia de la diferencia de tamao de los blastmeros. Un blastmero grande inyectado bajo la zona pelcida ser presionado con fuerza contra la membrana celular y la superficie de contacto ser mayor, estos aspectos facilitan el proceso de fusin despus de aplicados los pulsos elctricos. A partir de un determinado estadio del embrin donante de blastmeros parece que la diferencia de tamao no juega un rol de importancia. Las tasas de fusin de embriones de 5, 5,5 y 6 das obtenidas por MAREK y col. (1990) no presentan diferencias. El agregado de citocalasina B en el medio en el cual son colocados los complejos ovocito/blastmero despus del pulso elctrico, puede aumentar la tasa de fusin en embriones ovinos (SMITH y WILMUT, 1989). En el bovino no ha podido ser comprobado ese efecto (LEVANDUSKI y WESTHUSIN, 1990).
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Tasa de activacin La divisin de los ovocitos sin fertilizar puede provocarse por medio de diferentes estmulos. Este proceso se define como activacin partenogentica. Como estmulos pueden servir: etanol, Ca2+, Mg2+-ionforo o pulsos elctricos. La activacin partenogentica de los complejos ovocitos/ blastmeros despus de la transferencia nuclear es necesaria, porque la activacin natural del ovocito a travs del espermatozoide falta. Dado que los procesos intracelulares que se originan a travs de la activacin no son conocidos, deben establecerse estudios futuros para esclarecer estos fenmenos. Solo entonces ser posible determinar en qu momento la mayor parte de los ovocitos responder al estmulo partenogentico y de que manera deber ser modificado el estmulo para lograr mayores tasas de activacin. Estadios del embrin donante de blastmeros Para los trabajos de clonado se destinan embriones donantes en un estadio avanzado, con el fin de obtener un mayor nmero de ncleos idnticos. A partir de un estadio embrionario determinado no es posible reprogramar los ncleos. Su diferenciacin celular es irreversible. En el futuro deber precisarse el momento exacto de la diferenciacin nuclear. Los estadios ms avanzados con los cuales se pudieron lograr animales vivos se describen en la tabla 7. Los resultados de WILLADSEN en ovinos fueron superados por SMITH y WILMUT (1989) a travs de la transferencia de blastmeros de la MCI de blastocistos en ovocitos ovinos con el nacimiento de corderos. No puede ser descartado el empleo con xito de estos estadios en todas las especies animales. Cuando se aclare el mecanismo exacto de la diferenciacin nuclear existir la posibilidad de trabajar para invertirlo o diferirlo.
Estadio de los blastmeros Llama la atencin en la transferencia de ncleos, que una parte de los blastmeros del mismo embrin puede ser reprogramada por el ovocito. La otra parte no sigue ese proceso. Como consecuencia de ese comportamiento heterogneo puede concluirse que slo blastmeros de un estadio determinado son adecuados para la transferencia. Estudios futuros debern determinar cul es ese estadio, como pueden sincronizarse y mantenerse en el mismo. Tabla 7: Eficacia de los pasos metodolgicos, sobrevivencia de los embriones y tamao de los clones (nmero de animales vivos) de trabajos experimentales con embriones de animales de inters zootcnico ESPECIE leporina porcina ovina caprina Enucleacin (%) 100 74 75 s.i. Fusin (%) 91,5 82 90 51,1 E transferidos 207 88 4 48 Animales nacidos 8 1 3 10 (n) Sobrevivencia (%) 3,9 1,1 75 20,8 nmero de clulas del donante 32 4 8 2-32 Fuente s.i. = sin informacin
HEYMAN y col (1990) PRATHER y col. (1989) WILLADSEN (1986) YONG y col. (1990)
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Cultivo de los embriones clonados A travs de mejores condiciones in vitro es posible obtener una mayor tasa de M y B. Con la transferencia de estos estados avanzados es posible mejorar considerablemente las tasas de preez y con ello la eficacia de un programa de clonado. Ello permitira excluir aquellos embriones que se ven intactos despus de las primeras divisiones pero que no alcanzan los estadios de mrula o blastocisto. Con el reemplazo del cultivo temporal in vivo de los embriones clonados en receptoras intra- o nter especficas a travs del cultivo in vitro pueden evitarse las prdidas en la recoleccin de los embriones. Con la modificacin de las condiciones del cultivo toman importancia los cultivos "monolayer" (monocapa de clulas granulosas y de oviducto) o cultivos de suspensiones (clulas de oviducto) y la aplicacin de medios condicionados de clulas de granulosa u oviducto. Despus del mejoramiento de los pasos metodolgicos del clonado y del aumento del nmero de animales idnticos puede estudiarse el efecto de la unin del plasma celular del blastmero con el ovocito (Cybrid). Ello puede ser importante porque no slo existe ADN en el ncleo sino tambin en el citoplasma (mitocondrias). Ello puede hacer necesario que para la produccin de individuos matroclin homocigotas deban emplearse, junto con los blastmeros de un mismo embrin tambin ovocitos de una misma vaca. Existe la posibilidad que los blastmeros posean diferente informacin gentica como consecuencia de mutaciones numricas o estructurales de los cromosomas durante la divisin celular. El desarrollo del clonado de embriones depender en el futuro del desarrollo de los biomtodos asociados como la congelacin o vitrificacin de los embriones, la produccin de embriones como donantes potenciales de blastmeros, el desarrollo de medios de cultivo in vitro como as tambin de la transferencia de los embriones. Slo la asociacin del reclonado, congelado y transferencia no quirrgica de los embriones hace posible la intensificacin del aprovechamiento de animales de alto valor gentico.
Resumen de los pasos metodolgicos del clonado de embriones 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Maduracin in vitro de los ovocitos, obtenidos de ovarios de matadero, en MPM + 20 % de SVC + FSH durante un mnimo de 20 h. Eliminacin de las clulas del cumulus con Tripsina/EDTA (0,1/0,2%) y una pipeta fina (170 m). Montaje de la unidad de micromanipulacin. El medio de micromani-pulacin debe contener Citocalasina B (5 g/ml). Pretratamiento de 10 a 15 de los ovocitos denudados durante 10 min. en medio conteniendo Citocalasina B (5 g/ml). Transporte de los ovocitos tratados a las gotas de manipulacin. Enucleacin del ovocito, eliminando el corpsculo polar y el citoplasma adyacente. Enucleacin del primer grupo de ovocitos. Colocacin del embrin donante de ncleos en la gota de manipulacin. Despus de 5-10 min., comenzar entonces con la recoleccin de los blastmeros. Fijar el embrin donante y aspirar un blastmero con la pipeta de enucleacin. Fijar un ovocito enucleado e inyectar el blastmero en el espacio perivitelino (emplear el mismo orificio de la zona pelcida). Repetir el procedimiento con los otros ovocitos enucleados. Transportar el complejo ovocito-blastmero en medio sin Cito B. Recomenzar con un nuevo grupo a partir del punto 4. Montaje de la unidad de electrofusin. Trasladar un mximo de 10 a 15 complejos ovocitos-blastmeros al medio Zimmerman de fusin celular, esperar por lo menos 5 minutos. Colocar un mximo de 2 complejos en la cmara de fusin. Orientacin manual de los complejos (superficies de contacto blastmero/ ovocito paralelas a los electrodos).
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19. 20. 21. 22.
Descarga de los pulsos de fusin. Colocacin de los complejos tratados en MPM + 20% SVC o TL Hepes. Evaluacin del resultado de la fusin despus de 30 a 60 minutos. Cultivo de los complejos fusionados en medio condicionado o en cultivos celulares (cultivo de clulas de la granulosa u oviducto).
Bibliografia BARNES, F.L., R.S. PRATHER, J.M. ROBL y FIRST, N.L. 1987. Multiplication of bovine embryos. Theriogenology, 27: 209. BONDIOLI, K.R., M.E. WESTHUSIN y LOONEY, C.R. 1990. Production of identical bovine offspring by nuclear transfer. Theriogenology 33, 165-174 BREM, G. 1986 y 1990. Micromanipulacin en embriones bovinos y sus posibles aplicaciones en Produccin Animal, 1-181. Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aires, Argentina. BRIGGS, R. y KING, T.J. 1952. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frog eggs. Zoology 38, 455-463. BROMHALL, J.D. 1975. Nuclear transplantation in the rabbit egg. Nature, 258: 719-722. CLEMENT-SENGEWALD, A. y BREM, G. 1989. Electrofusion parameters for mouse two cell embryos. Theriogenology, 32: 159-169. CLEMENT-SENGEWALD, A. y BREM, G. 1990. Development to term of fused and partially enucleated mouse two-cell embryos. Reprod. Dom. Animals, 25: 14-21 CLEMENT-SENGEWALD, A., U. BERG y BREM, G. 1990. The use of IVM/IVF bovine embryos in nuclear transfer experiments. Proc. of the 4th Franco-Czechoslovak Meeting, 14.-15.05. 1990, Praha, CSFR. CLEMENT-SENGEWALD, A. G.A. PALMA, U. BERG and BREM. G. 1991. In vitro culture of cloned enucleated mouse two-cell embryos. Reprod. Dom. Animal, 25: 14-21. CLEMENT-SENGEWALD, A., G. A. PALMA, G. BREM 1992a. The use of in vitro production methods for embryo cloning in cattle. 43rd Reunin anual de la FEZ, Madrid, 14-17 de septiembre de 1992. CLEMENT-SENGEWALD, A. G.A. PALMA, U. BERG, and BREM. G. 1992c. Comparison between in vitro produced and in vivo flushed donor embryos for cloning experiments in cattle. Theriogenology, 32: 835-844. COLLAS, P., J.J. BALISE, G.A HOFMANN y ROBL, J.M 1989. Electrical activation of mouse oocytes. Theriogenology, 32: 835-844. COLLAS, P. y ROBL, J.M. 1991. Development of rabbit transplant embryos from morula and blastocyst stage donor embryos. Theriogenology, 35: 190 FEHILLY, C.B., S.M. WILLADSEN y TUCKER, E.M. 1984. Experimental chimaerism in sheep. J. Reprod. Fert., 70: 634-636 GURDON, J.B., R.A LASKEY y REEVES, O.R. 1975. The developmental capacity of nuclei transplanted from keratinized skin cells of adult frogs. J. Embryol. Exp. Morph. 34: 93-112. HEYMAN,Y., P. CHESNE, J.M. THUARD, V. OARNIER y RENARD, J.P. 1990. Nuclear transfer from frozen-thawed rabbit morula: In vivo and in vitro development of reconstituted eggs. 6rd Meeting of the A.E.T.E., Lyon, 07.-08.09. 1990, Abstract: 154. KONO, T., S. IWASAKI y NAKAHARA, T. 1989. Parthenogenetic activation by electric stimulus of bovine oocytes in vitro. Theriogenology, 32: 569-576. LEVANDUSKI, M.J. y WESTHUSIN, M.E. 1990. Effect of cytosceletal inhibitor on fusion and development of bovine nuclear transfer embryos. Theriogenology, 33: 273. MAREK, D.E., J.H. PRYOR, T.H. WHITESELL y LOONEY, C.R. 1990. Nuclear transplantation in the bovine: Effect of donor embryo age on subsequent embryo production. Theriogenology, 33: 283. MASSEY, J. 1990. Animal production industry in the year 2000. J. Reprod. Fert., 41: 199-208.
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Clement-Sengewald
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Animales transgnicos
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PRODUCCION DE ANIMALES TRANSGENICOS G. Brem, U. Berg & H.D. Reichenbach Introduccin En gentica molecular moderna se desarrollaron mtodos adecuados que permiten trabajar especficay repetidamente con ADN, como portador de la informacin gentica. Esas tcnicas de gentica molecular abren en la produccin animal nuevas perspectivas, dado que es posible por primera vez trabajar directamente a nivel gnico, ello significa la posibilidad de aislar, secuenciar, recombinar y transferir genes individuales. El espectro de aplicaciones de esas tcnicas no est desarrollado ampliamente. Sin embargo es posible pronosticar que el futuro de la produccin animal ser afectado directamente y que los mtodos de la produccin animal convencional sern complementados y posiblemente tambin parcialmente reemplazados (ver captulo XIX). Transferencia de genes significa transferencia e integracin del ADN recombinado in vitro y su estructura acoplada al genoma del receptor. Si la estructura de ADN se integra en el genoma del receptor, ste se denomina transgnico. El producto de ese transgen, una protena codificada por el ADN transferido, es el producto transgnico. Con la ayuda de la transferencia de genes se pretende lograr que una determinada cualidad en el organismo receptor sea modificada o una nueva sea incorporada. Adems se espera que el transgen integrado en el genoma sea transmitido a la herencia a fin de establecer una lnea transgnica. En la extensa definicin original slo se habla de animales transgnicos cuando se comprueba que el transgen se hereda en forma estable y se exprime. Pero en la actualidad se ha establecido en el lenguaje cotidiano emplear el trmino: animal transgnico a partir del momento en el cual se puede comprobar la presencia del nuevo gen en un individuo, al cual se ha practicado la transferencia gnica. Por otra parte en produccin animal la transferencia de genes es slo interesante cuando la estructura gnica es transmitida a la descendencia, de forma tal de establecer lneas transgnicas en la poblacin. El ADN recombinado en las estructuras gnicas puede tener origen en los ms variados organismos donantes, debido a la uniformidad en la estructura bsica de la doble cadena de ADN. Junto con el ADN procaritico de origen viral o bacteriano el ADN de los organismos eucariticos representa una fuente inagotable para la transferencia gnica. No debe olvidarse, sin embargo, que especialmente para la expresin de transgnicos pueden establecerse fuertes interacciones dependientes del origen y del receptor del ADN. Fue observado, por ejemplo, que la expresin de las estructuras gnicas que contienen an componentes procariticos, puede ser reducida o incluso suprimida en animales mamferos. Adems se ha observado que es de gran importancia para la expresin si los componentes estructurales del gen son de origen genmico o provienen del ADNc. De esa forma puede observarse que de los trangenes que contienen intrones se produce en promedio 10-100 veces ms ARNm que de transgenes que contienen solamente ADNc (BRINSTER y col., 1988). A continuacin se har referencia exclusivamente a la produccin de bovinos y otros animales transgnicos de inters productivo y no a la transformacin gentica de clulas procariticas o eucariticas. Con la produccin de un organismo transgnico se pretende que el transgen est presente en todas las clulas somticas y sobre todo tambin en las clulas reproductivas del animal. Dado que no existe hasta el momento mtodo alguno que permita transformar en forma completa un organismo ya formado genticamente, se practica la transferencia gnica tan temprano en el desarrollo del animal como es posible. El momento ms apropiado es el estado embrionario temprano, es decir el estadio unicelular (ovocito fecundado = cigoto), con poco nmero de clulas (blastmeros) o en los estadios de mrula o blastocisto como mximo. Ello significa que los mtodos de obtencin, manipulacin y
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Brem & col.
transferencia de esos estadios tempranos deben estar establecidos y disponibles en las especies mamferas. Se disponen en la actualidad de varios mtodos prometedores de transferencia gnica. Los tres ms importantes son: - La microinyeccin de ADN en el proncleo del cigoto - La transferencia de ADN a travs de vectores retrovirales - Produccin de quimeras transgnicas a partir de clulas y embriones transformadas genticamente. La tcnica ms empleada en la actualidad es sin dudas la microinyeccin de ADN. a pesar de que las otras dos cuentan, junto a algunas limitaciones, con una serie de ventajas no despreciables. Lamentablemente la tcnica que emplea clulas embrionales primordiales no fue desarrollada an y la aplicacin de vectores retrovirales lo es en forma muy incompleta como para ser utilizadas en los animales domsticos. El camino ms prximo para la transferencia de ADN en el ncleo celular es la microinyeccin directa de una solucin de ADN en el citoplasma del ncleo o en el proncleo (foto 1). GORDON y col. (1980) indicaron por primera vez que la microinyeccin de una solucin de ADN en el proncleo es un camino practicable para la transferencia gnica en mamferos. Despus de la microinyeccin de ADN clonado en el proncleo de ovocitos fertilizados de ratn fue posible encontrar esas secuencias virales en partes desarrolladas de los fetos. Poco tiempo despus se indic, en otros trabajos, que genes eucariticos intactos podan incorporarse a los fetos. Fue posible establecer tambin la presencia del transgen en animales adultos como as tambin la transmisin a la descendencia. En la actualidad la tcnica de produccin de ratones transgnicos fue introducida con xito en muchos laboratorios y se pusieron en prctica estudios para determinar la regulacin de la expresin gnica y el efecto biolgico del gen. Como ya fue mencionado, la microinyeccin de ADN en el proncleo de cigotos o en los ncleos de embriones bicelulares es el mtodo de eleccin para la transferencia gnica en los animales domsticos. La amplia experiencia obtenida en experimentos con ratones constituy sin duda una base adecuada para el desarrollo de la tcnica en los animales de inters zootcnico. Debe aclararse, sin embargo, que debido al desigual desarrollo embrionario temprano y especialmente a la diferente morfologa de los embriones de animales domsticos se produjeron algunos problemas. Por ejemplo, las estructuras nucleares de las especies bovina, porcina y hasta cierto grado de la ovina y caprina no pueden ser observadas con el microscopio o slo con dificultad debido a los grnulos citoplasmticos oscuros. Para la observacin del ncleo los embriones ovinos requieren un microscopio de interferencia segn NOMARSKI, los embriones bovinos y porcinos deben ser centrifugados para exponer el ncleo. Tampoco se contaba con suficientes conocimientos prcticos sobre como se deba establecer el tiempo ptimo para la obtencin, microinyeccin y transferencia de los embriones para contar con las mejores posibilidades en el xito de la transferencia gnica. La produccin de mamferos transgnicos puede dividirse bsicamente en 6 fases: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Clonado de las estructuras gnicas y produccin de la solucin inyectable de ADN. Preparacin de los animales donantes y obtencin de los ovocitos o embriones. Exposicin de los proncleos y microinyeccin del ADN. Transferencia de los embriones inyectados al oviducto o, despus de un cultivo temporal, al tero de receptoras. Comprobacin de la integracin en los animales nacidos y, si es posible, primeras evaluaciones de la expresin del transgen en los niveles de trascripcin (ARN) y translacin (protena). Produccin de descendencia transgnica por medio de mtodos convencionales y evaluacin de eventuales mutaciones presentes a travs de la formacin de lneas homocigotas (test de homocigosis).
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Hasta el momento se sabe que, en principio, toda molcula de ADN puede microinyectarse en el genoma de un mamfero. El largo del fragmento de ADN a introducir por medio de los vectores de clonado no debe superar el lmite mximo de 50 kb (clones cosmidios). En otros numerosos experimentos de transferencia gnica se demostr que es posible alcanzar fragmentos mucho ms largos. De esta forma no es raro observar, en animales transgnicos, fragmentos de varios 100 kb o an ms de 1 000 kb de largo, como consecuencia de la concatemerizacin de los fragmentos inyectados. Evidentemente la inyeccin de ADN lineal conduce a tasas superiores de integracin. En cambio molculas con forma de espiral o "supercoiled" parecen integrarse con una frecuencia significativamente menor (BRINSTER y col., 1985). Tambin es mejor cuando los fragmentos de ADN no son cortados romos ("blunt") sino cuando conservan terminales sobresalientes. Las soluciones de ADN para microinyeccin deben estar absolutamente libre de partculas contaminantes, para evitar el taponado de la pipeta de microinyeccin o la lesin de los cigotos inyectados. Ello establece que todas las soluciones deben ser filtradas (filtros de 0,2 m) y que todos los recipientes, con los cuales el ADN toma contacto deben ser enjuagados previamente con agua filtrada. Slo en casos aislados se inyecta la totalidad del vector, dado que ADN procaritico puede provocar problemas de expresin. Despus de la restriccin el vector y el ADN de insercin son separados, en la regla, por medio de electroforesis. El fragmento deseado es aislado del gel, lavado y colocado en una solucin buffer. Inmediatamente despus se establece la concentracin de ADN de tal manera que por cada pl (10-12) estn contenidos, segn la aplicacin, varios cientos de copias de la estructura gnica. En fragmentos de ADN un largo de 5-8 kb corresponde a una concentracin de 1-2 g de ADN/ml. No fue encontrada una correlacin entre cantidad del ADN inyectado y el nmero de copias integradas. La solucin preparada de ADN se fracciona y conserva por medio de congelacin (BRENIG, 1987). La frecuencia de integracin en la produccin de mamferos transgnicos es influenciada por: la pureza, la forma, el tipo de terminales, la concentracin y la solucin buffer del ADN. De ello se concluye que ya durante la preparacin de la solucin de inyeccin del gen, se establecen importantes condiciones para el xito de la transferencia gnica.
Recoleccin de los embriones Los animales donantes son tratados con gonadotrofinas, con diferentes programas de superovulacin segn la especie, inseminados o servidos dos veces. La obtencin de los cigotos se lleva a cabo a travs del lavaje del oviducto en un lapso de 12-24h despus de la inseminacin. El lavaje de oviducto puede llevarse a cabo mediante ciruga con el animal en narcosis o despus del sacrificio. Debe tenerse especial cuidado, que el oviducto sea seccionado del cuerpo del animal dentro de los 15 min de desangrado. Los oviductos son lavados con una solucin de PBS. Con ayuda de una lupa estereoscpica se aslan los ovocitos o embriones de la solucin obtenida del lavaje y se colocan en medio fresco. Las clulas del cumulus, que eventualmente pudiesen quedar adheridas, pueden eliminarse con un tratamiento de hialuronidasa o por medio de pipeteo. Los embriones son cultivados in vitro hasta el momento de la inyeccin. La eficacia de los programas de transferencia gnica con animales domsticos es, en promedio, claramente menor que con el ratn. Como se puede observar en la tabla 1 ello se debe al bajo nmero de cigotos que pueden inyectarse por donante, a las bajas tasas de preez y sobrevivencia embrionaria y a la menor frecuencia de integracin. Para la produccin de un animal transgnico se deben emplear, en general, ms donantes y receptoras de animales de inters zootcnico que con ratones o conejos.
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Brem & col.
Microinyeccin de ADN Para la microinyeccin es necesario contar con una mesa de trabajo estable. El lugar de trabajo comprende un microscopio invertido, dos micromanipuladores para las pipetas de sostn y de inyeccin y un aparato de inyeccin. La presin de inyeccin puede ser regulada con ayuda del aparato de inyeccin accionado por medio de un pedal. Sobre la platina del microscopio se encuentra una cmara de inyeccin que contiene el medio y los embriones a tratar. Los embriones bovinos y porcinos son centrifugados 3 min a 15 000 g (WALL y col., 1985). A travs de la centrifugacin se desplazan los grnulos citoplasmticos oscuros hacia un polo, los ncleos y proncleos se hacen visibles en el medio del embrin. Tabla 1: tasas de xito en programas de transferencia gnica en diferentes animales de experimentacin e inters productivo Especie Embriones inyectados por donante (S) Nmero de receptoras por cada donante (E) % Preez % Animales nacidos/ embriones inyectados % de integracin (animales transgnicos/ animales nacidos) % Animales transgnicos/embriones inyecta-dos y transferidos Nmero de animales necesarios (S+E) por c/animal transgnico murina 15 leporina 20 porcina 20 ovina 4 bovina 7
2 60 10-20
2 50 10
2 50 5-8
1,5 40 15
1 30 10
15
10
10-15
5-10
5-10
0,5
0,5-1
0,5
10
15
20
40
40
A pesar de ese tratamiento la inyeccin de esos embriones es ms difcil que la de embriones de ratn o conejo. Para la inyeccin se fija el embrin mediante vaco a la pipeta de sostn de tal forma que el (pro-) ncleo se haga bien visible. La pipeta de inyeccin tiene un dimetro de 1 a 2 m y es llenada con la solucin de ADN. Para la inyeccin, la pipeta es introducida por medio del micromanipulador a travs de la zona pelcida, la membrana celular y (pro-) nuclear. La inyeccin con un volumen de 1-2 pl de la solucin de ADN aumenta el volumen del ncleo ms del 50%. Transferencia de los embriones Despus de un cultivo temporal, los embriones inyectados son transferidos mediante ciruga a oviductos de receptoras sincronizadas. La sincronizacin de las receptoras se lleva a cabo a travs de un
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tratamiento hormonal especfico de especie. Antes de la transferencia de los embriones tratados se controla la reaccin ovrica de la hembra receptora. Slo son empleadas aquellas receptoras que respondieron al tratamiento hormonal con el nmero adecuado de folculos, que depende de la especie tratada. En la especie bovina se procede a cultivar los embriones in vivo o in vitro durante varios das, a fin de evitar la trabajosa intervencin de la transferencia al oviducto (BERG y BREM, 1989). La finalidad es cultivar los embriones de una o dos clulas hasta el estadio de mrula y transferir stas directamente en el tero de las receptoras. Para el conejo, cerdo, oveja y cabra el cultivo intermedio no es necesario, dado que en esas especies incluso la transferencia uterina se lleva a cabo mediante ciruga.
Comprobacin de la integracin y la expresin Despus de la transferencia gnica slo es posible en casos aislados determinar la integracin del gen a travs de cambios de fenotipo en los animales nacidos. Incluso an cuando la estructura gnica empleada permita esperar algn efecto, debe llevarse a cabo la comprobacin de la integracin del gen presente independientemente del fenotipo. Ello se debe a que la estructura gnica integrada no siempre se exprime en los animales positivos. Para la comprobacin de la integracin gnica se disponen de varios mtodos. El material de evaluacin lo constituyen clulas con ncleo, que se toman de los rganos o fluidos corporales. Normalmente se toman las pruebas del tejido de la punta de la cola o de la sangre. De ellas se aisla el ADN, que no requiere que sea especialmente de alto peso molecular, como lo es en el caso de los bancos de reservas genmicas. La lisis completa del tejido se logra a travs de un tratamiento con proteinasa K-buffer a 55 C. La extraccin se logra con cloroformo fenolado. Con acetato de Na y etanol se provoca la precipitacin que aumenta con la centrifugacin. Inmediatamente despus se determina la concentracin con ayuda de un espectrofotmetro, a partir de alcuotas diluidas. La exacta y ms segura comprobacin de la integracin de las estructuras gnicas se puede llevar a cabo por medio del mtodo Southern-Blot. Aproximadamente 20-30 g de ADN genmico de alto peso molecular es hidrolizado completamente con enzimas de restriccin adecuadas. Despus de la divisin, la mezcla de fragmentos de ADN es separada electroforticamente en gel-agarosa horizontal. Un marcador aplicado al mismo tiempo permitir la determinacin del tamao de los diferentes fragmentos de ADN. Los fragmentos separados son transportados a filtros de celulosa o a membranas de Nylon segn el mtodo de SOUTHERN (1975). El ADN, separado en el gel de agarosa, es transportado despus de la desnaturalizacin alcalina- a la nitrocelulosa o membrana de nylon que se encuentran directamente sobre agar por medio de capilaridad con ayuda de un buffer de transferencia. Con ADN genmico, el Blot puede terminar al cabo de 10-16 h. El tiempo de transferencia de ADN puede reducirse a menos de una hora con aparatos de vaco o de electro-Blotting. En un mtodo rpido de evaluacin de un nmero grande de pruebas de ADN se transporta una alcuota de ADN desnaturalizado y lavado en forma grosera, a una membrana soporte bajo presin negativa e inmediatamente despus se hbrida con una prueba marcada radioactivamente. Con el mtodo descrito por BRENIG y col. (1989) puede comprobarse la estructura gnica en el ADN del animal hospedador en 25-30 h. Con el reemplazo de la marcacin radioactiva por un mtodo de luminiscencia qumica puede ahorrarse ms tiempo. Despus de la desnaturalizacin y neutralizacin se contina la transferencia de los fragmentos separados del gel al filtro de nitrocelulosa. Los fragmentos de ADN utilizados en la prueba son marcados radioactivamente. Ello puede llevarse a cabo mediante translacin "nick" u oligopriming. Los filtros de nitrocelulosa son pre-hibridizados con ADN no especfico e hibridizados posteriormente con ADN radioactivo. Despus de un lavado astringente abundante, los filtros son expuestos a un film
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radiogrfico con una pelcula reforzadora durante un tiempo determinado a 80o C. Una alternativa al uso de sustancias radioactivas es la aplicacin de dUTP biotinilado (LANGER y col., 1981) para el marcado de fragmentos. Biotina tiene una fuerte afinidad a la avidina, la cual por su parte puede acoplarse a indicadores adecuados (anticuerpos, enzimas, colorantes). De esta forma se pueden identificar tambin las cantidades ms pequeas de complejos biotina/ADN. En el mtodo Southern-Blot la eleccin de la o las enzimas y de las pruebas de hibridacin tiene una importancia definitiva. En los casos ms adecuados hay una enzima cuyos dos lugares de divisin en la estructura gnica estn separados entre si en forma suficiente para usar el fragmento ubicado entre medio como grupo de hibridacin. Si para la divisin del ADN se emplean los lugares de corte marginales, en los cuales el fragmento fue separado del vector, aparecen en el anlisis Southern-Blot, junto con el o los fragmentos esperados con el tamao correspondiente a la estructura gnica, dos fragmentos en lo general ms largos. El anlisis de patrones ("pattern") de tal naturaleza permite sacar algunas conclusiones sobre la integracin. Se sabe que, en muchos animales transgnicos, no slo se integra una copia de la estructura gnica inyectada. Varias copias son frecuentes en dependencia de los lugares marginales, concatmeros unidos al genoma en forma de "head to tail", "head to head" o "tail to tail". De la misma forma no es un fenmeno extrao que se pierdan algunas bases en terminales sobresalientes de los fragmentos, durante la integracin. De esta forma desaparecen los lugares de divisin en los terminales 5'-3'- en los fragmentos integrados de ADN. Si se divide el ADN genmico con enzimas de restriccin, que cortan al final de la estructura gnica, se separan los concatmeros del interior del fragmento de ADN en forma precisa y esperada. Sin embargo, dado que los lugares de corte en las terminales se pierden, se originan en las posiciones 5'-3'- fragmentos ms grandes. Ello es as porque en ambas copias marginales del genoma se encuentran an las secuencias hasta los prximos lugares de fragmentacin en la cadena de ADN, apropiados para las enzimas de restriccin. El largo de esas copias gnicas marginales es casual y depende de la presencia de lugares de divisin adecuados en la zona de integracin del ADN genmico. En casos relativamente escasos la integracin de la estructura gnica se produce no solamente en un lugar sino en dos o ms. En casos favorables puede comprobarse su existencia por medio de anlisis Southern-Blot. Con frecuencia esto no se logra en el primer animal receptor, pero s despus de la segregacin del transgen en la descendencia. Se supone que para la expresin de las estructuras gnicas la prdida de bases marginales en general no tiene importancia. Si se emplean en la transferencia gnica secuencias homlogas, es decir fragmentos de ADN provenientes de la misma especie, el anlisis Southern-Blot debe planearse cuidadosamente. En esos casos la comprobacin especfica de la integracin gnica slo es posible mediante la correcta seleccin de adecuadas enzimas de restriccin, de lo contrario la diferenciacin entre el ADN endgeno y el transferido es difcil. Dado que, sin embargo, slo en casos excepcionales se elige el mismo orden de regiones no trasladadas promotoras y estructurales del gen y del genoma, se adecuan especialmente los lugares entre ambos genes como pruebas de hibridacin. A pesar de ello ocurren tambin en esos casos seales a travs de la hibridacin cruzada de las pruebas con secuencias genmicas, que deben ser consideradas en el anlisis. De vez en cuando se observan en las pruebas de integracin patrones de integracin inesperados. En esos casos el complejo patrn de restriccin, que no responde al original, se puede determinar mediante un anlisis de restriccin y Southern. El nmero de estructuras gnicas integradas en el genoma se determina por medio del anlisis Dot-blot. El mismo no es una tcnica de transferencia capilar, dado que el ADN es aplicado a la membrana de soporte mediante una mscara perforada. La electroforesis no es necesaria y la calidad del ADN no necesita ser tan buena como para el anlisis de Southern-Blot. El ADN desnaturalizado es aplicado, lavado, horneado e hidrolizado. A travs de la cuantificacin densimtrica se calcula aproximadamente el nmero de copias del transgen (tamao del genoma haploide = 3 . 109 pb).
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Una tcnica desarrollada hace pocos aos, la reaccin PCR (Polymerase Chain Reaction, captulo XV), puede emplearse para evaluar si un animal es transgnico en un tiempo relativamente corto y con poco material celular. Cuando se pretende localizar el lugar de integracin en el cromosoma se puede llevar a cabo una hibridacin in situ de los cromosomas en metafase. El trmino hibridacin in situ se emplea tambin para la comprobacin directa de ADN y ARN en muestras de tejidos congelados. La especificidad para la expresin de un gen o estructura gnica en un tejido se establece, entre otros, a travs de su promotor. Por esa razn, para la evaluacin de la transcripcin correcta de una estructura gnica inyectada se aisla el ARN de los tejidos en los cuales se espera la mayor expresin. La preparacin del ARN se lleva a cabo segn los protocolos de CHIRGWIN y col. (1979) y GLISIN y col. (1974), los cuales se basan en la lisis celular y desnaturalizacin proteica con isotiocianato de guanidina. El ARN es transferido a filtros de nitrocelulosa o de nylon (THOMAS, 1980) como para el anlisis Southern-Blot o a geles desnaturalizados de agarosa/formaldehido, despus de su desnaturalizacin con glioxal o dimetilsulfxido (DMSO). Para recabar informacin sobre cantidad, estructura o porcentaje de sntesis se llevan a cabo tests con nucleasa S1 y ribonucleasa o ensayos de extensin del iniciador ("primer"). En el anlisis S1 (SHARP y col., 1980) o el test de la proteccin de la ribonucleasa (CHAMBERLIN y RYAN, 1982) se emplean pruebas de cadenas simples, complementarias con el ARN que se pretende evaluar. Con ese mtodo se pueden estudiar los puntos terminales 5'- y 3'- como as tambin la cantidad especfica de ARN. Despus que se pudo comprobar que la estructura gnica microinyectada se transcribe correctamente, se debe evaluar la translacin. Se analiza en primer lugar si la protena correspondiente se sintetiza y, de ser as, en que cantidad. Para ello se disponen de mtodos colorimtricos o electroforticos en gel con coloracin posterior (Comassie-Blue, plata) del gel o transporte a filtros de nitrocelulosa o membranas de nylon (Western-Blot). Adems pueden emplearse mtodos clnicos de diagnstico (radioinmunoensayo, ELISA), los cuales estn disponibles en parte en forma de kit. Para ms informacin sobre esos mtodos consultar la literatura siguiente: LOWRY y col., 1951; BRADFORD, 1976; PETERSON, 1977; PETERSON, 1979; OAKLEY y col., 1980 HAMES & RICKWOOD, 1981; MOEREMANS y col, 1985; DARBRE, 1986; MOEREMANS y col., 1986; SALINOVICH & MONTELARO, 1986.
Herencia del transgen Un requisito indispensable para la aplicacin de la transferencia gnica en produccin animal es que el gen transferido se transmita a la descendencia. Para ello es necesario que el animal receptor del gen (microinyectado) posea en todas o, al menos, en parte de sus clulas reproductivas el transgen. Lamentablemente se conoce poco sobre los caminos moleculares y biolgicos que se suceden en la integracin de un ADN inyectado. Por ejemplo, no se conoce exactamente cuando se lleva a cabo la integracin y si sta permanece estable en todas las clulas durante el desarrollo posterior del embrin. En ensayos de evaluacin de animales nacidos transgnicos y especialmente en aquellos de produccin de descendencia transgnica se ha observado que a pesar de la inyeccin del ADN, en el proncleo embrionario pueden originarse mosaicos. Mosaicos son animales originados por diferentes lneas, que provienen de un cigoto pero que poseen diferentes genotipos. Mosaicos transgnicos poseen clulas que contienen el transgen y otras que no lo tienen. Ello puede conducir a problemas en la formacin de descendencia transgnica cuando en las clulas gonadales de los progenitores no est presente el transgen. Segn las experiencias obtenidas se puede esperar que aproximadamente 30% de los animales receptores primarios del gen (por medio de microinyeccin) son mosaicos y que no transmitirn el transgen a su descendencia en la frecuencia esperada de 50%.
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La herencia de animales transgnicos, en los cuales la estructura gnica inyectada se integr en forma estable y se transmite a la descendencia, responde a las leyes mendelianas, dado que en general la integracin del gen se produce en un solo lugar en un cromosoma. De acuerdo a la definicin se describe a este tipo de animales como transgnicos heterocigotas. Sin embargo este trmino no es el adecuado, dado que falta el alelo correspondiente al transgnico en el cromosoma homlogo. Como es de esperar, 50% de la descendencia debe poseer el transgen. Sin embargo, si las gnadas son mosaicos de lneas transgnicas y no transgnicas, el porcentaje de descendencia transgnica variar entre 0-50% de acuerdo a la participacin cuantitativa de ambas lneas celulares. Los mosaicos se originan slo en la generacin F0. Los animales transgnicos de la generacin F1 y posteriores poseen, si son positivos, la estructura gnica en todas las partes del cuerpo y clulas de la hilera germinal. Se ha observado, no obstante, que la integracin no siempre permanece estable a travs de las generaciones. La observacin de que un transgen no permanece estable sino que puede perderse no fue aclarada en forma suficiente. An ms frecuente que la inestabilidad de la integracin es la gran variabilidad de la expresin del transgen, de forma tal, que en el curso de las generaciones, se presentan todas las formas posibles de variacin: aumento, disminucin o ausencia de expresin. An dentro de grupos de hermanos enteros se observ variabilidad de la expresin del transgen entre animales positivos. Las razones para ello no han sido aclaradas, seguramente desempea el fenmeno conocido como "imprinting" un rol de importancia. A travs de la diferente metilacin, la expresin de un gen depende de su origen materno o paterno. La comprobacin de varios lugares de integracin en el genoma de animales transgnicos ocurre con relativa poca frecuencia. Si los lugares de integracin estn tan alejados entre s, que pueden conducir a recombinaciones al azar, pueden originarse ms de 50% de descendencia transgnica. De un animal transgnico con dos tipos de integracin independientes puede esperarse que el 75% de la descendencia hereden el transgen, 25% recibir uno de ambos transgenes y otro 25% ambos tipos en su genoma. El 25% restante no ser transgnico. A travs del apareamiento de animales transgnicos heterocigotas se obtiene, en casos normales, 50% de transgenes heterocigotas, 25% de homocigotas y 25% de negativos. El azar de la integracin gnica en los animales transgnicos primarios (F0) puede conducir a la integracin en el sector de un gen de importancia para el desarrollo del feto. Mientras un alelo intacto en el cromosoma homlogo de animales heterocigotas est presente, no se producen problemas como consecuencia de esa mutacin por insercin. Una excepcin la constituyen posiblemente los efectos gnico-aditivos, cuya integracin en un lugar gnico determinado tienen como consecuencia una reducida expresin de la caracterstica endgena aditiva. Del apareamiento de animales heterocigotas que tienen una mutacin de insercin no es posible obtener descendencia transgnica homocigota. Si el gen afectado por la mutacin de insercin es esencial para el desarrollo del feto no nacern animales transgnicos homocigotas. Antes de la reproduccin de animales transgnicos debe evaluarse si los animales son libres de mutaciones de insercin, a fin de evitar un aumento de la carga letal. Dichas mutaciones de insercin pueden ser interesantes en investigacin bsica. Para la produccin animal la aparicin de mosaicos y mutantes de insercin tiene como consecuencia que para la introduccin de un gen determinado en una poblacin, un solo animal transgnico no es suficiente. Independientemente de la alta tasa de consanguinidad que se pueda generar, las posibilidades de producir una lnea transgnica con un solo animal son reducidas. Para que una lnea transgnica pueda tener xito y aplicacin en la prctica deberan cumplir las siguientes condiciones: - Transmisin estable del transgen a la descendencia.
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- Ausencia de mutaciones de insercin y la posibilidad de producir animales transgnicos homocigotas. - Expresin estable del transgen y efecto biolgico positivo sobre la caracterstica deseada. De ello se desprende que se deben producir como mnimo 5-10 animales transgnicos primarios (F0) para producir, con una probabilidad suficientemente alta, lneas que respondan a las exigencias establecidas.
Programa de transferencia gnica en el bovino Despus que se inform por primera vez, en el ao 1985 (HAMMER y col., 1985; BREM y col., 1985), sobre la exitosa aplicacin de la transferencia gnica en los animales domsticos (cerdo, oveja, conejo) se intensificaron los esfuerzos en los aos siguientes para mejorar la metodologa y los genes. Mientras que la tasa de integracin no aument sensiblemente, en algunos ensayos se pudo mejorar la expresin a travs del empleo de genes optimizados. La eficacia de un programa de transferencia gnica depende de una serie de factores, como la habilidad en la manipulacin embrionaria, el tipo y duracin del cultivo in vitro, la calidad de la transferencia de los embriones, la edad de las receptoras empleadas y la sincronicidad entre donantes y receptoras. El esquema de desarrollo de un programa de transferencia gnica se inicia con la seleccin, estimulacin e inseminacin (natural o artificial) de las donantes (fig. 1). La obtencin de los cigotos se lleva a cabo por medio de la matanza o ciruga de las donantes, 75-97 h despus del celo. Los embriones son centrifugados para exponer los proncleos (WALL, 1985). Junto con embriones de una clula se emplean para la inyeccin tambin embriones con 2 blastmeros. Una forma alternativa para la obtencin de embriones para la microinyeccin de ADN en el bovino es la produccin in vitro de embriones (ver captulo XI). En la actualidad este mtodo biotecnolgico desplaza a la obtencin in vivo de los embriones. La produccin y el cultivo in vitro presentan las ventajas de ser ms econmicos, se evita la intervencin quirrgica de las donantes y receptoras como as tambin de los animales empleados para el cultivo temporal. Otra ventaja de la produccin in vitro es la posibilidad de determinar el estadio del proncleo con mayor precisin. Ello permite la inyeccin de un mayor nmero de embriones. Despus de la microinyeccin los embriones se cultivan in vitro o in vivo en el oviducto de receptoras temporales. La desventaja del ltimo mtodo se basa en las reducidas tasas de recuperacin de los embriones como as tambin en su trabajosa ejecucin. Los problemas de falta de desarrollo de los embriones producidos in vitro, a partir de los estadios de 8 y 12 clulas, pudieron resolverse con la aplicacin del cocultivo de los embriones con clulas de la granulosa y del oviducto. Los embriones microinyectados son transferidos en los das 6-7 de desarrollo, momento en que alcanzan los estadios de mrula o blastocisto, en forma no quirrgica a receptoras sincronizadas. LOHSE y col. (1985) informaron sobre el primer ensayo de transferencia gnica en el bovino. Los autores inyectaron en ovocitos fertilizados una estructura gnica TQ (timidin quinasa) y demostraron que 30% de los embriones indicaban una actividad TQ de 2 desviaciones estndar por encima de los controles. LOSKUTOFF y col. (1986) lograron 3 preeces de la transferencia de 43 cigotos y 17 embriones de dos blastmeros inyectados. En otro estudio McEVOY y col. (1990) obtuvieron 569 ovocitos de 52 vaquillonas superovuladas (5,1 embriones de una y dos clulas por cada donante) por medio de laparotoma en la lnea media. Los proncleos fueron observados en 71% de los casos despus de 3 min y 81% despus de 5 min de centrifugacin a 13000 g, 62 y 60% de ellos se desarrollaron 24h despus del cultivo. Como consecuencia de la microinyeccin degeneraron 20% de los cigotos. Embriones de una y dos clulas (n = 108) fueron transferidos a 46 receptoras. Al da 55 fueron detectadas 20 hembras (43%) con 32 fetos, 17 de las cuales parieron (37%). Uno de los 27 terneros nacidos fue transgnico. La tasa de sobrevivencia de los embriones de uno y dos blastmeros
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fue de 22 a 36%. CHURCH y col. (1986) informaron que se desarrollaron 111 embriones de 852 cigotos bovinos inyectados con el gen de la fetoprotena alfa, de los cuales se identificaron 4 que integraron el gen. Despus de la inyeccin de 1161 cigotos con 3 diferentes estructuras gnicas y la transferencia de 641 (55%) la tasa de nacimiento fue de 10,5% (126) frente a 43% del grupo control. De los 126 embriones inyectados y transferidos integraron el ADN 7 terneros. BIERY y col. (1988) informaron sobre la tasa de deteccin de los proncleos despus de la centrifugacin de 1325 cigotos a 15000 g durante 4 min. Despus de la microinyeccin y el cultivo in vivo en oviducto de oveja durante 6 das, se recuperaron 84% de los embriones, de los cuales 21% se desarrollaron hasta los estadios de mrula y blastocisto. La integracin del ADN se registr en 4 fetos. ROSCHLAU y col. (1988) obtuvieron, luego de la castracin de las donantes, 513 cigotos de oviductos que fueron inyectados con 3 diferentes estructuras gnicas virales. En 14 de 44 embriones, de dos semanas de edad, fue posible comprobar la presencia del ADN; 5 embriones exprimieron el gen. De la transferencia de 43 embriones a 23 receptoras resultaron 14 preeces y nacimientos. La integracin del ADN bGH inyectado se comprob en 1 ternero. En ensayos propios (REICHENBACH, 1989) se compararon diferentes sistemas de cultivo in vivo con cultivos in vitro. Las tasas de desarrollo obtenidas se detallan en la tabla 2. De ello se concluye que de las 3 especies obtenidas, el cerdo fue menos y el conejo fue el ms adecuado para el cultivo de los cigotos. Lo destacable de este estudio fue que los sistemas de cultivo in vitro empleados (BERG y BREM, 1989) fueron comparables a los mejores resultados obtenidos in vitro, considerando los embriones cultivados y los transferidos. Tabla 2: Tasas de recuperacin y desarrollo de los cigotos y embriones cultivados in vivo e in vitro despus de la inyeccin gnica (REICHENBACH, 1989) Embriones transferidos de 1 y 2 clulas (a) n 183 66 79 29 82 41 123 71 Embriones desarrollados Embriones Recuperados (b) n 93 48 22 12 46 31 123 71 (b/a) % 51 73 28 41 56 76 100 100 >1 divisin (c) n 24 27 7 5 28 21 63 43 (c/b) % 26 56 7 5 28 21 63 43 mrulas/blastocistos celular (d) n 17 14 3 2 13 14 18 21 (d/b) % 18 29 14 17 28 45 15 30 (d/a) % 9 21 4 7 16 34 15 30
Cultivo temporal in vivo vaca in vivo cerda in vivo coneja in vitro 8 Mi 3K 3 Mi 1K 4 Mi 2K 5 Mi 4K
Mi = Microinyectados K = no microinyectados (controles) Tres grupos de trabajo: en Texas (U.S.A, MASSEY, 1990), en Leiden (Holanda, KRIMPENFORT y col., 1990) y en Munich (Repblica Federal de Alemania) publicaron el empleo exitoso de los embriones bovinos producidos in vitro hasta el nacimiento de terneros (tabla 3). Los primeros terneros transgnicos, producidos con el empleo de embriones producidos in vitro, nacieron en 1991 (KRIMPENFORT y col., 1991). Como se seala en la tabla 3, 1% de los ovocitos recolectados culmina en terneros despus de la fertilizacin, microinyeccin, cultivo y transferencia de los embriones tratados. A pesar de ello las ventajas de la produccin in vitro de embriones superan al sistema de produccin in
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vivo. En el futuro la produccin de animales transgnicos se desarrollar, con seguridad, apoyada en la produccin in vitro de los embriones, porque se considera que la eficacia de las diferentes etapas mejorar en los prximos aos.
Tabla 3: Microinyeccin de ADN en embriones producidos in vitro segn diferentes autores Texas, USA MASSEY, 1990 Pasos Maduracin de los ovocitos Microinyeccin de los ovocitos Embriones transferidos Gestaciones/ Terneros
* 2 terneros transgnicos
n 2408 858 49 12
% 36 6 24
Leiden, Holanda KIMPENFORT y col., 1991 n % 2297 1154 129 21* 50 11 21
Munich, Alemania resultados propios, 1989, 1991/92 n % 686 496 60 12 72 12 26
Dado que las receptoras significan el mayor costo de un programa de transferencia gnica, empleando la produccin in vitro de embriones, se trabaja intensamente en el diagnstico de la integracin del gen ya sea durante la gestacin (a travs de la recoleccin y anlisis de las clulas embrionarias) o, mejor an, en los embriones de 6-7 das de edad, por medio del diagnstico de PCR (captulo XV).
Foto 1: Microinyeccin de ADN en el proncleo de un cigoto de ratn
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Wolf & Brem
DESARROLLO Y APLICACIONES DE LAS CELULAS EMBRIONARIAS PRIMORDIALES E. Wolf & G. Brem Introduccin A partir de la exitosa produccin de lneas celulares pluripotentes de embriones de ratn a comienzos de la dcada del '80, las mismas se emplean intensamente como modelos para el estudio embrionario bsico como as tambin como vectores para la transferencia de genes. Otros objetivos en la investigacin de clulas primordiales embrionarias comprende su empleo como donantes de ncleos en experimentos de clonado como tambin la conservacin ex situ de informacin gentica. El presente captulo presenta un resumen de los resultados en la investigacin. Estos documentan el estado actual de la puesta a punto y empleo de las clulas embrionarias primordiales en animales de experimentacin y de inters productivo. Definicin y caractersticas Las clulas embrionarias primordiales son lneas celulares continuas de origen embrionario y totipotentes, a partir de las cuales se pueden desarrollar todos los rganos, incluyendo la hilera germinal. Las clulas pluripotentes de origen embrionario pueden obtenerse mediante diferentes mtodos (ROBERTSON, 1987). Un camino posible lo constituye el aislamiento de clulas pluripotentes de teratocarcinomas espontneos como tambin su produccin a partir de localizaciones embrionarias ectpicas (DAMJANOV y col., 1987). Junto con esas alternativas existe actualmente la posibilidad de aislar clulas pluripotentes directamente de los embriones. Las clulas pluripotentes aisladas de teratocarcinomas se denominan clulas-EC, las obtenidas de embriones EK (BRANDLEY y col., 1984) o ms comnmente ES. Las clulas EC no pueden diferenciarse de las morfolgicamente ES, en su comportamiento antignico de superficie como tampoco en su diferenciacin in vivo o in vitro (EVANS y KAUFMAN, 1981; MARTIN, 1981). No obstante las clulas totipotentes embrionarias cuentan con algunas ventajas frente a las del carcinoma embrionario: - Directa aislacin a travs de marcadores genticos como determinadas isoenzimas (BRADLEY y col., 1984) o mutaciones (MARTIN y col., 1987) - La conservacin de un nmero diploide de cromosomas en el cual se hayan establecido las lneas femenina (XX) y masculina (XY, NICHOLS y col., 1990) - Un porcentaje relativamente alto de quimeras despus de la inyeccin de clulas ES en blastocistos con la posibilidad de formar quimeras de la hilera germinal (BRADLEY y col., 1984) - Permite la posibilidad de obtener clulas ES de embriones partenogenticos que cuentan con una constitucin gentica homocigota diploide (ROBERTSON, 1987).
Formacin y cultivo La aislacin de lneas totipotentes de embriones se basa en las siguientes condiciones (BRADLEY, 1990): - Las clulas deben estar presentes en el estadio del embrin - Las clulas deben ser protegidas de seales que desencadenen su diferenciacin - Deben se capaces de reproducirse in vitro
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Clulas embrionarias primordiales
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Dos grupos de investigacin lograron por primera vez el aislamiento de lneas celulares totipotentes de ratn al comienzo de la dcada del 80. EVANS y col. (1981) cultivaron blastocistos de la cepa consangunea 129, cuya implantacin fue impedida a travs de una ovariectoma del animal donante en el da 2,5 despus del estro y un tratamiento simultneo con progesterona (implante). Las clulas ES se obtuvieron los das 6-8 de comenzado el estro, fueron cultivadas durante 4 das, momento en el cual los blastocistos producidos eclosionan y las clulas trofoectodrmicas se diferencian en trofoblastos gigantes (grandes). La masa celular interna (MCI), estructura con forma oval-cilndrica, ubicada en el centro del blastocisto fue aislada con un capilar de vidrio y tripsinada. Las clulas obtenidas fueron cultivadas en un medio DMDM (Dulbecco's modified Eagles medium) modificado, individualmente o en pequeos grupos sobre una lnea continua de fibroblastos de ratn (STO) inactivados con mitomicina. Las colonias con una morfologa tpica ES (colonias claras, continuas, sin limites celulares visibles, foto 1) fueron recolectadas y colocadas sobre una capa de clulas nutrientes (feederlayer).
Foto 1: Clula embrionaria primordial totipotente (ES) MARTIN (1981) aisl MCIs de blastocistos expandidos a travs de ciruga inmunolgica (foto 2). A travs de un tratamiento con Pronase (0,5%) en M2 (37o C, 3-10 min) se elimin la zona pelcida (foto 2a). Las MCIs fueron cultivadas en DMEM modificado con fibroblastos STO inactivados en su mitosis. El medio DMEM fue previamente condicionado con clulas de carcinoma de la lnea PSA-1. Una informacin ms exacta sobre el protocolo de trabajo se encuentra en el trabajo de ROBERTSON (1987). La aislacin y cultivo de clulas ES se logr originalmente slo con el empleo de clulas nutrientes (fibroblastos STO inactivados en su mitosis o fibroblastos embrionales primarios), cuyas funciones como la desintoxicacin del medio en general, la fijacin de las clulas y la inhibicin de la diferenciacin en particular fueron descriptas (ROBERTSON, 1987). La presencia de clulas nutrientes complica, sin embargo, la manipulacin gentica de las clulas ES como as tambin la caracterizacin de los factores de crecimiento y diferenciacin. SMITH y HOOPER (1987) descubrieron un factor soluble en un medio condicionado con clulas BRL (buffalo Rat liver), que poda inhibir la diferenciacin en forma reversible (differentiation inhibiting activity = DIA) an cuando es cultivado sin clulas nutrientes. En forma pura DIA es una glicoprotena con un peso molecular de 43000 e idntico al factor inhibidor de la leucemia (LIF = Leukeaemia inhibitory factor, SMITH y col., 1988; WILLIAMS y col., 1988). LIF est actualmente disponible biotecnolgicamente (GEARING y col., 1989) y se ofrece en el mercado bajo la denominacin ESGRO (Amrad, Australia).
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Foto 2: Aislacin inmunolgica de las MCIs de un blastocisto (ratn): a) eliminacin de la zona pelcida; b) Cultivo de los embriones (37oC, 20-30 min) en suero de conejo anti ratn, inactivado por medio de calor y lavado en M2; c) colocacin de los embriones en gotas con complemento de cobayo (1:10) para destruir las clulas trofoectodrmicas; d) eliminacin de las clulas lisadas con una pipeta. La flecha indica la MCI Con el agregado en el medio de cultivo de LIF se logr la formacin de lneas celulares ES diploides con o sin el empleo de clulas nutrientes (HENDYSIDE y col., 1989; NICHOLS y col., 1990). WELLS y col. (1991) pudieron establecer lneas celulares ES de embriones sometidos a un shock trmico (42o C durante 10 min) y a un tratamiento con Puromicina, con una eficiencia significativamente mayor que con embriones no tratados. Mientras que en la mayor parte de los ensayos para el desarrollo de clulas ES se emplearon embriones de la lnea consangunea 129 LEDERMAN y BURKI (1991) lograron establecer una quimera de la hilera germinal a partir de embriones de la lnea C57BL/6. En ese trabajo, el aislamiento de las clulas ES se logr por medio de clulas con mitosis inactivada de la linea 5637 (carcinoma humano), con mayor frecuencia que con los fibroblastos embrionarios murinos. El trabajo de SMITH (1991) presenta una lista completa de los mtodos disponibles y materiales necesarios para el cultivo de clulas ES. Diferenciacin in vivo e in vitro de clulas embrionales totipotentes Cuando las clulas ES alcanzan una alta concentracin en el cultivo tienden a diferenciarse espontneamente, observndose en primer lugar clulas epiteloides como endodermo primitivo. Si las clulas ES son mantenidas sin clulas nutrientes, en cultivos de suspensin sobre sustratos no adhesivos se presenta un fenmeno de diferenciacin an ms complejo (DOETSCHMAN y col., 1985). Como primer estadio se forman agregados de clulas ectodrmicas, rodeadas por una capa simple de clulas endodrmicas (= "Embryoid bodies" = cuerpos embrioides simples; foto 3a). Con un cultivo progresivo se forman estructuras qusticas que contienen tambin estructuras mesodrmicas (cuerpos embrioides complejos; foto 3b).
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Foto 3: Cuerpos embrioides simples (A) y complejos (B) Bajo las condiciones establecidas por DOETSCHMAN y col. (1985) se formaron "islas de sangre" y clulas miocrdicas en 30% de los cuerpos embrioides complejos. Si los cuerpos embrioides son colocados nuevamente sobre un substrato adhesivo se produce una amplia diferenciacin en derivados de las tres capas drmicas (por ejemplo, clulas nerviosas, musculares, pigmentarias, condrocitos, etc). Tabla 1: Produccin de quimeras por medio de la inyeccin de clulas primordiales embrionarias * en blastocistos (resultados no publicados) Blastocistos Blastocistos inyectados y transferidos Nmero de transferencias Blastocistos/transferencia Preeces Nacimientos Animales destetados Nmero de quimeras de pelaje Manifestacin del quimerismo de pelaje Quimeras apareadas Quimeras infrtiles Quimeras con ms de 10 descendientes Quimeras de la hilera germinal NMRI 225 24 9.4 10 (42%)a 33 (15%)b 28 (85%)c 9 (32%)d < 20% 9 0 9 0 C57Bl/6 520 48 10.8 25 (52%)a 87 (17%)b 54 (62%)c 24 (44%)d bis 95 % 22 7 11 6 Balb/c 56 6 9.3 3 (50%)a 6 (11%)b 4 (66%)c 4 (100%)d bis 50% 4 1 3 1
*D3 y diferentes clones homlogos recombinados (gene disruption); Valores promedio de atransferencias, bembriones transferidos, canimales nacidos y danimales destetados
El potencial de diferenciacin in vivo de las clulas ES puede ser evaluado a travs de un transplante sucutneo en ratones singnicos. EVANS y KAUFMAN (1981) observaron en ese ensayo una alta
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incidencia de tumores de rpido crecimiento. En la evaluacin histopatolgica de los mismos se observ la participacin de varios tejidos que fueron identificados como teratocarcinomas. Sin embargo el test definitivo de la totipotencia de las clulas embrionarias se lleva a cabo a travs de la inyeccin de las clulas ES en blastocistos o mrulas de otra especie con el fin de producir quimeras (fig. 1). Inyeccin de clulas ES en los blastocistos y transferencia de los embriones a receptoras seudogrvidas
Nacimiento de las quimeras
Test para comprobar el quimerismo de la hilera germinal a travs del cruzamiento de las quimeras con marcadores genticos (marcadores de color de pelaje)
Nacimiento de la descendencia, proveniente de clulas ES
Fig 1: Evaluacin in vivo de la pluripotencia de las clulas ES a travs de la inyeccin en blastocistos Una amplia exposicin de los materiales necesarios y de los diferentes pasos metodolgicos se encuentran en el trabajo de BRADLEY (1987). Por esa razn nos referiremos a los puntos ms importantes de acuerdo a nuestra experiencia. Las clulas ES se inyectan en blastocistos (d 3) recolectados de ratonas donantes superovuladas. Alternativamente se pueden utilizar mrulas (d 2). Estas deben ser tratadas, sin embargo, con citocalasina B en un medo libre de Ca++ y Mg++ para lograr un reversible aflojamiento del citoesqueleto. BRADLEY (1987) recomienda para la inyeccin una cmara enfriada (10o C), que de acuerdo a nuestra experiencia no es necesaria. De importancia es la calidad de las micropipetas de inyeccin y sujecin. Su construccin se presenta en las figuras 2 y 3. Los aparatos necesarios para ello en el captulo X (fotos 5, 6 y 8).
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Fig 2: Elaboracin de las pipetas para inyeccin de ls clulas ES en blastocistos o mrulas. Los capilares de borosilicato son estirados con un estirador de pipetas y cortados en diagonal en un dimetro de 18 a 22 m con un escalpelo sobre goma siliconada. Con cierta experiencia se obtiene el 50% de los capilares con la forma ideal (a). Pipetas muy largas (b), muy cortas (c) y con irregularidades (d) son inadecuadas para la inyeccin Ambas pipetas se manipulan a travs de micromanipuladores. El sistema de sostn es llenado con aire y controlado con la boca o una jeringa de 10 ml. El sistema de microinyeccin que contiene silicona lquida es accionado por medio de una jeringa Hamilton (fig. 4). La inyeccin se lleva a cabo como se indica en la fig. 8, siendo la mejor posicin el lmite entre 2 clulas trofoectodrmicas. Despus de la inyeccin de 8-15 clulas ES en cada blastocisto 3-4 clulas ES en cada mrula, los embriones son cultivados 30 a 60 min y posteriormente transferidos en el tero de receptoras seudogrvidas (d 2).
Fig 3: Elaboracin de una pipeta de sostn. El capilar es estirado a mano hasta un dimetro de 80-120 m y apoyado sobre la esfera de vidrio de la microfragua (a). La esfera es calentada hasta que la pared del capilar y la esfera se funden ligera-mente (b). Se interrumpe a continuacin la corriente elctrica de forma tal que el filamento que calienta la esfera se contrae y el capilar se quiebra (c). A continuacin se redondea y reduce el borde de la pipeta con ayuda de la esfera candente (d, e, f) a un dimetro final de 20 a 30 m. La eficacia de la produccin de quimeras como as tambin el porcentaje de clulas ES en los tejidos somtico y reproductivo dependen esencialmente de la calidad de las lneas celulares ES pero tambin del origen gentico de los embriones receptores. De esta forma los blastocistos de la lnea C57BI/6 se
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adecuan muy bien para la inyeccin de clulas ES de la lnea 129 (SCHARTZ-BERG y col., 1989; resultados propios no publicados; foto 5, tabla 1). NAGY y col. (1990) pudieron producir quimeras a partir de clulas ES y embriones tetraploides. En las quimeras se pudo comprobar su completo origen de clulas ES. Los animales murieron, sin embargo, poco despus del nacimiento por razones no establecidas. La colonizacin de la hilera germinal a travs de clulas ES fue observada por primera vez por BRADLEY y col. (1984). Un factor de importancia en ese sentido es el cariotipo de las clulas ES (BRADLEY, 1990). Mientras las traslocaciones y trisomas slo tienen un efecto reducido sobre el porcentaje de clulas ES en tejidos somticos, la participacin en los tejidos de la hilera germinal es muy improbable. Clulas embrionarias totipotentes de la hilera germinal A partir de las experiencias descriptas en el ratn, diferentes grupos de trabajo intentaron establecer lneas celulares totipotentes a partir de embriones bovinos, porcinos, caprinos y ovinos. Las primeras publicaciones sobre la aislacin de lneas celulares contnuas de embriones bovinos y ovinos datan del ao 1987.
Foto 4: Inyeccin de clulas primordiales embrionarias en un blastocisto, a) antes de la inyeccin; b) colocacin de la pipeta en el lmite entre dos clulas trofoectodrmicas; c) inyeccin de 8-10 clulas ES; d) el blastocisto se colapsa luego de retirar la pipeta STRINGFELLOW y col. (1987) cultivaron un embrin bovino de 11 dias, obtenido en forma no quirrgica, en medio Ham's F-20 (100 ml suplementado con 10 ml de suero fetal bovino, 11 mg Piruvato de Na, 0,5 mg insulina y 10 l EGF). Despus de 13 das se estableci una monocapa (monolayer), que fue separada con 0,4% de Tripsina en medio PBS libre de Ca2+ y Mg2+ y nuevamente cultivada. Nueve das despus 50% de las clulas mostraron confluencia. Esa lnea celular pudo ser mantenida en el medio de cultivo hasta el pasaje 38 (1:2 respectivamente). Las clulas mono- y binucleares fueron consideradas morfolgicamente similares a las trofoblsticas. Los mismos autores lograron, poco despus, establecer una lnea celular totipotente (BE12-6) bajo las mismas condiciones y con
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morfologa comparable a la anterior que ha podido mantenerse en cultivo ms de 200 pasajes y que actualmente es considerada inmortal (STRINGFELLOW y col., 1991).
Foto 5: Quimeras en la hilera germinal, producto de la inyeccin de clulas ES D3 (agut) en blastocistos Balb/c (albino) HANDYSIDE y col. (1987) trataron de establecer clulas ES de ovino. Los autores aislaron masas celulares internas (MCIs) de embriones de 6 y 8 das de la raza Welsh Mountain a travs de inmunociruga y las cultivaron intactas o desmenuza-das (3-5 min en 0,25% de Tripsina, 1 mM EDTA Na2, 1% suero de pollo en PBS libre de Ca2+ y Mg2+) con clulas fibroblsticas de la lnea STO o de la piel de ovino (TGskin) inactivadas con mitomicina en 60% de medio CM condicionado con BRL (microgotas de 20 l bajo parafina, a 37o C, 5% CO2/95% aire). Los autores emplearon en total 60 embriones (16 mrulas o blastocistos tempranos, 30 expandidos y 14 protruidos). Una evaluacin morfolgica de los embriones (cortes semifinos, microscopia electrnica) mostr diferencias entre las clulas de la MCI adyacentes al blastocele del resto de sus clulas. En las primeras los autores observaron estadios tempranos de diferenciacin endodrmica en los blastocistos con zonas intactas, mientras que en los blastocistos protruidos fue posible reconocer un endodermo claramente diferenciado. Una aislacin de la MCI a travs de ciruga inmunolgica fue ms simple de llevar a cabo en blastocistos expandidos con zona intacta. Despus de la adhesin de las clulas de la MCI (comprendiendo cerca de 43 clulas) se produce un aplanamiento de la colonia celular y no un cilindro oval como en el ratn. La divisin celular fue reducida en extremo comparada con el ratn. Algunos grupos de clulas, semejantes en un inicio a las clulas ES de ratn fueron cubiertas enteramente por clulas de apariencia endodrmica que formaron estructuras qusticas. Despus del primer pasaje no se encontraron colonias semejantes a las clulas ES presentes. REXROAD (1990) cultiv embriones ovinos (d 7-9) y MCIs, obtenidas a travs de ciruga inmunolgica sobre fibroblastos STO o fibroblastos embrionarios ovinos. A partir de las MCIs se originaron con mayor eficacia colonias primarias que a partir de embriones intactos, independientemente de la edad de los embriones y del tipo de clulas nutrientes que se emplearon. PIEDRAHITA y col. (1988) llevaron a cabo ensayos orientados a aislar del cerdo clulas semejantes a las ES. Los autores cultivaron embriones de 7 a 8 dias (dia 0 = primer da del celo) en DMEM sobre fibroblastos STO inactivados por medio de rayos x. El medio fue suplementado con 10% SFB, 0,1 mmol/l 2-mercapto-etanol, 2mml/l L-glutamina y antibiticos. Colonias similares morfolgicamente a las colonias ES fueron cambiadas de medio cada 7-10 das. De 118 MCIs 84 sobrevivieron las manipulaciones y 3 lneas pudieron ser mantenidas hasta el 10o pasaje. Una de las 3 lneas tena morfologa de las clulas ES, las otras 2 estaban compuestas de clulas similares a las ES y epiteliales. De 25 embriones cultivados se establecieron 8. Se pudieron establecer 2 lneas que sobrevivieron 10
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pasajes. Ambas lneas contenan clulas trofoblsticas como as tambin una pequea parte de clulas similares a las ES. STROJEK y col. (1990) evaluaron el efecto de la edad de los embriones y diferentes medio de cultivo sobre la formacin de clulas ES. Mientras que con embriones de 9 das no se obtuvieron resultados positivos se desarrollaron 14 colonias a partir de 69 embriones de 10 das de edad. Estas colonias provenan, segn los autores, de la MCI. El cultivo de los embriones y su adherencia se lograron sobre fibroblastos de tero de cerdo y no sobre fibroblastos STO. Los autores sospecharon en una interaccin qumica no definida an como la razn de ese fenmeno. Los pasajes posteriores pudieron llevarse a cabo, sin embargo, sobre fibroblastos STO. El medio de cultivo ms adecuado fue el DMEM suplementado con 10% de SFB, 10% de suero de cerdo, 0,2 mg/ml de insulina bovina y 0,1 mM 2-mercaptoetanol. En total se pudieron expandir 7 colonias mediante 3 a 5 pasajes y las lneas resultantes pudieron ser congeladas. EVANS y col. (1990) y NOTARIANNI y col (1991) emplearon blastocistos expandidos de la raza Large British White para producir clulas embrionarias totipotentes. Fueron cultivados los embriones intactos o las MCIs despus de su aislacin mecnica en medio DMEM modificado (+ 10% de suero de ternero + 5% de SFB + 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol + antibiticos) sobre fibroblastos STO inactivados con mitomicina. Los autores observaron el crecimiento de los embriones y de las MCIs aisladas sobre las clulas nutrientes (fibroblastos STO), contrariamente a lo encontado por STROJEK y col. (1990). Al principio se observ el desarrollo de clulas epiteloides (grandes, aplanadas, translcidas), mientras que despus del primer pasaje (7-14 dias despus del comienzo del cultivo) se observaron colonias de dos tipos. El primer grupo, formado por pequeas colonias, se caracteriz por clulas grandes indiferenciadas de las cuales surgan clulas gigantes similares a las trofoblsticas. Las clulas del segundo grupo fueron caracterizadas de acuerdo a los criterios morfolgicos (clulas con un ncleo translcido claro, nuclolo visible y poco citoplasma) como clulas similares a las ES. Estas formaron grandes colonias. Como criterio bioqumico del estatus indiferenciado de esas clulas se demostr la falta del filamento intermediario Vimentin a travs de una prueba de fluorescencia. Esas clulas pudieron ser mantenidas en cultivo cerca de un ao, sin alteraciones morfolgicas, con pasajes semanales. Los ensayos de diferenciacin in vitro indicaron diferencias claras con respecto a la morfologa de las cuerpos embrioides en relacin con el ratn. Sin embargo las clulas se diferenciaron en las 3 capas embrionarias (epitelio, endotelio, clulas musculares y nerviosas) sobre un substrato adhesivo. La comprobacin de la totipotencia in vivo de las clulas similares a las ES, a travs de la produccin de quimeras, no fue publicada hasta el momento. NOTARIANNI y col. (1990) lograron establecer, en la especie ovina, una lnea similar a la ES empleando las mismas condiciones de cultivo. PIEDRAHITA y col. (1990a) estudiaron el efecto de diferentes clulas nutrientes sobre la eficiencia de la produccin de lneas celulares embrionarias de cerdo. En ese experimento se emplearon fibroblastos STO, clulas BRL, combinacin de esos cultivos (9:1 y 1:1), fibroblastos embrionarios primarios de cerdo (PEF) y ratn (MEF), PEF en combinacin con clulas BRL, clulas epiteliales uterinas de cerdo y clulas epiteloides aisladas de embriones porcinos. Los fibroblastos STO fueron evaluados en combinacin con medio condicionado con clulas BRL. La aislacin de clulas epiteloides como tambin de lneas celulares similares a la ES se logr exclusivamente sobre clulas fibroblsticas STO con y sin medio condicionado con clulas BRL. Los autores no pudieron mejorar las condiciones de cultivo establecidas por EVANS y col. (1990). Mientras PIEDRAHITA y col. (1990a) confirmaban la aparicin de diferentes tipos celulares despus de la desagregacin de MCIs proliferadas y adheridas, resultaron divergencias en el potencial de diferenciacin de las lneas celulares de tipo epitelial y similares a ES. En las primeras se formaron estructuras en cultivos de suspensin que fueron consideradas anlogas de los cuerpos embrioides de ratn. Las lneas celulares similares a la ES, por el contrario, no mostraron diferenciacin in vitro alguna. En un estudio posterior PIEDRAHITA y col. (1990b) pudieron comprobar el status indiferenciado de las clulas similares a las ES dado que stas no exprimieron Vimentina ni Citoqueratina 18. El intento de establecer paralelamente en el mismo trabajo lneas celulares ovinas fue menos exitoso, las clulas
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pudieron mantenerse vivas slo 3 pasajes como mximo. El estudio de MEINECKE-TILLMAN y MEINECKE (1991) con el objeto de establecer lneas celulares pluripotentes a partir de embriones ovinos, caprinos y porcinos compar diferentes clulas nutritivas (fibroblastos de hgado, rin y testculo fetales de bovino; clulas granulosas de porcino y bovino; clulas epiteliales de tero y oviducto de oveja, cabra y cerda como as tambin fibroblastos STO). Principalmente con el empleo de fibroblastos embrionarios de hgado de bovino los autores pudieron establecer lneas embrionarias totipotentes de las tres especies estudiadas e incluso mantenerlas por varios meses en cultivo. El trabajo no contiene, sin embargo, informacin ms detallada de la caracterizacin de esas lneas celulares. STROJEK y col. (1991) emplearon embriones obtenidos el da 7 in vivo o producidos in vitro para la produccin de clulas totipotentes. Los autores evaluaron el efecto de diferentes medios (DMEM y BME/Ham's F 10 (1:1), cada uno suplementado con 5 y 20% de SFB, 10% de suero de ternero neonato y 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol), clulas nutrientes (fibroblastos embrionarios primarios de ratn y clulas primarias de la granulosa de vaca) y diferentes presiones de oxgeno (5 y 20%) sobre la protrusin, fijacin y diferenciacin de los blastocistos. Los mejores resultados de protrusin se obtuvieron sin clulas nutrientes en BME/Ham's F 10 con 5% de CO2 en atmsfera de aire a una temperatura de 39o C. Por otro lado el empleo de clulas nutrientes tuvo un efecto positivo sobre la fijacin de los blastocistos protruidos. En ese sentido los autores diferencian 2 tipos de fijaciones: el tipo A caracterizado por un crecimiento radial de las clulas trofoectodrmicas (fig. 10), el tipo B mostr la fijacin de la MCI con degeneracin de las clulas trofoectodrmicas. Aunque bajo particulares condiciones de cultivo se produjo una fuerte proliferacin de las clulas trofoectodrmicas, en ningn caso se observ una proliferacin de la MCI. No se observaron diferencias entre los embriones producidos in vivo o in vitro. La falta de proliferacin de las masas celulares internas de embriones bovinos fue publicada anteriormente por SCHELLANDER y col. (1989), quienes trabajaron bajo condiciones similares. En un ensayo posterior los autores observaron el efecto positivo de LIF sobre la proliferacin de MCIs de blastocistos bovinos cuando stos fueron cultivados sin clulas nutrientes en medio DMEM modificado. Sin embargo, el intento de establecer lneas celulares no tuvo xito (HASSAN-HAUSER y col., 1990).
Foto 6: Blastocisto bovino despus de 10 das de cultivo (tipo de fijacin A: clulas trofoectodrmicas de crecimiento radial, MCI en posicin central) STRELCHENKO y colaboradores lograron, por otra parte, aislar lneas celulares similares a las ES a partir de MCI de embriones bovinos (SRELCHENKO y col., 1991; SAITO y col., 1992). Los autores cultivaron 11 hemi-embriones, resultado de la divisin de 6 embriones de 7 das obtenidos por medios no quirrgicos, en TCM 199 suplementado con 10% de suero de ternero neonato sobre fibroblastos embrionarios primarios de ratn, inactivados con mitomicina. Tres embriones se fijaron de acuerdo al tipo A, en los cuales no slo se observ la proliferacin de las clulas del trofoectodermo sino tambin un crecimiento de la MCI. Esta fue disociada con tripsina a los 7 das y colocada sobre clulas
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nutrientes frescas. Los autores emplearon, a partir de ese momento, medio MEM modificado con 10% SFB, 10-4 mol/l 2-mercaptoetanol como tambin 4,5 g/l de glucosa. Un 30% del volumen de ese medio fue condicionado sobre clulas LIF de la lnea 5637 en proliferacin. Despus de 5 das las primeras colonias similares a las ES fueron visibles. A partir de ellas se pudieron producir 2 lneas que sobrevivieron 4 pasajes. Una serie txica de SFB elimin las clulas producidas sin que se pudiese comprobar su totipotencia in vitro e in vivo. En la tabla 2 se presentan los diferentes medios de cultivo empleados exitosamente en la produccin de lneas celulares similares a las ES a partir de embriones de animales de inters productivo. Es importante destacar, sin embargo, que los resultados alcanzados en la especie murina an no han podido ser alcanzados por las especies domsticas. Como razn de esa diferencia se discute el diferente desarrollo despus de la implantacin entre el ratn y los ungulados. Mientras en el embrin de ratn ocurre una rpida proliferacin de la MCI despus de la implantacin, el disco embrionario de las especies unguladas se mantiene inicialmente en inactividad mittica (NOTARIANNI y col., 1990).
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Clulas primordiales
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Tabla 2: Ensayos exitosos para producir lneas celulares similares a la ES de animales domsticos Autor Especie Material empleado Clulas nutrientes Medios de cultivo Medio base L-Gln [mmol/l] 2-ME [mmol/l] Antibitico Otros agregados Temperatura [ C] CO2 [%] O2 [%] 0,1 Si S. i. S. i. S. i. 2 0,1 Si Medio cond. BRL S. i. S. i. S. i. 0,1 Si 0,2 g/l Insulina, Nucletidos, aminoci-dos no esenciales S. i. S. i. S. i.
EVANS Y COL. (1990) NOTARIANI Y COL. (1990/1991) PIEDRAHITA y col. (1990a,b) STROJEK Y COL.(1990) STRECHELKO y col. (1991)
Porcina, ovina, bovina Blastocistos y MCIs d 7-9 Fibroblastos STO DMEM
Porcina MCIs de embriones d 7-8 Fibroblastos STO DMEM
Porcina Embriones d 10 Fibroblastos de tero porcino (FUP) DMEM
Bovina Embriones divididos d 7 Fibroblastos embrionarios murinos (FEM) TCM 199 (Para el cultivo inicial MEM-Alfa (Cultivos posteriores) 0,1 S. i. 4,5 g/l Glucosa Medio 5673-condionado S. i. S. i. S. i.
S.i.: sin informacin; L-Gln= L=-Glutamina; 2-ME= 2-Mercaptoetanol; SF = suero de ternero; SFB = suero fetal bovino; SP = suero porcino
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Aplicaciones de las clulas embrionarias totipotentes Las clulas ES del ratn se emplean en la actualidad casi en forma de rutina como vectores en la transferencia de genes para la produccin de modelos animales con modificaciones gnicas determinadas. Dado que la integracin del gen en las clulas de los mamferos se produce al azar, la tasa de recombinacin homloga/integracin al azar es de alrededor de 13-3 (FROHMAN y MARTIN, 1989; MELTON, 1990). Esa frecuencia de recombinaciones homlogas es muy baja para llevar a cabo la alteracin del genoma a travs de la microinyeccin del gen en el proncleo. Por esa razn se opta por el empleo de las clulas embrionarias totipotentes, a las que se les ha transfeccionado el gen deseado y se evala la integracin en el lugar adecuado. En esos ensayos se emplearon, en la mayora de los casos, lneas ES con cariotipo masculino (por ejemplo: B. E14TG2a, CCE, D3, CC1.2). Para lo cual existe una serie de razones (MANSUR, 1990): - Las lneas celulares masculinas ES parecen ser ms estables en cultivo que las femeninas. - Solamente a partir de clulas ES masculinas pueden originarse espermatozoides funcionales. Dado que la descendencia es ms numerosa es ms fcil detectar quimeras masculinas que femeninas, respecto a la presencia de clulas ES en la hilera germinal. - Cuando clulas ES masculinas son inyectadas en un blastocisto femenino y las clulas totipotentes forman una parte importante del organismo se produce una conversin del sexo. Esto significa que se produce un macho. En ese caso la hilera germinal es formada en un 100% por clulas ES. La electroporacin es el mtodo de eleccin para la transfeccin de clulas ES, dado que en condiciones experimentales ptimas se integra slo una copia del vector de ADN (THOMAS y CAPECCHI, 1987). Los vectores deben estar acompaados de un gen marcador, dada la baja frecuencia de integraciones estables (10-5-10-2), a partir de la cual puedan ser seleccionadas las clulas. En la mayora de los casos se emplea el gen bacteriano de la Neomicina fosfotransferasa (neo). El medio de seleccin contiene G418. Como forma alternativa a la electroporacin se emple la microinyeccin de ADN (ZIMMER y GRUSS, 1989). Ese mtodo permite producir un alto porcentaje de clulas transformadas estables (10-20%), sin embargo la ejecucin es muy complicada. THOMAS y CAPECCHI (1987) desarrollaron 2 diferentes tipos de vectores, que emplearon para la disrupcin del gen HPRT (fig. 5).
A
6
Neo
B
6 9 7 9 Neo
2 3
4 5 hprt
6 78
2 3 hprt
4 5
6 78
reemplazo de secuencia 1 2 3 4 5 hprt- G 4 1 6 7 Neo 9 1 2 3
insercin de secuencia 4 5 6 7 8Neo 9 6 78 9
hprt- G 4 1
Fig 5: Vector para un transferencia gnica con un objetivo determinado (segn CAPECCHI, 1989)
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Los denominados genes de insercin tienen una fractura en la doble hlice en el lugar correspondiente a la secuencia homloga del gen endgeno. Si se produce cross over en el momento de la yuxtaposicin del gen endgeno, se integrar todo el vector en el gen endgeno y las secuencias de ambos se presentan en forma doble. Por otra parte existen vectores complementarios, co-lineales a la secuencia endgena, que contienen una determinada mutacin y que reemplazan al gen endgeno a travs de un cross-over doble. La frecuencia de clones homlogos recombinados puede ser aumentada en genes que ya son exprimidos en las clulas ES si se renuncia a las secuencias promotoras tanto en zona homloga del vector como tambin del Gen neo. Si se produce la recombinacin las secuencias en el vector entran bajo el control del promotor del gen endgeno el gen neo se exprimir. De otra forma se logra la expresin con una integracin al azar y gran parte de las clulas mueren durante la seleccin con G418 (MASOUR, 1990). Con genes que no se exprimen en las clulas ES se emplea otra estrategia conocida como seleccin positiva-negativa (SPN). Ese mtodo propuesto por MASOUR y col. (1988) se basa en dos supuestos: la integracin al azar de un una estructura gnica lineal ocurre al final de la estructura, mientras la recombinacin homloga tiene lugar dentro de la zona homloga a travs de cross-over. Estructuras gnicas lineales que no contienen al final secuencias homlogas estn en condiciones de recombinarse en forma homloga eficientemente
Un vector SPN contiene adems del gen neo como secuencia selectiva positiva dentro de la zona homloga, un marcador contra el cual se puede seleccionar en forma negativa. Un ejemplo de ello es el gen de la Timidinquinasa (VHS-tq) del virus Herpes simplex que est ubicado distal a la regin homloga (fig. 6). Si se lleva a cabo la recombinacin se pierde la zona que incluye el gen VHS-tq. En el caso de una integracin al azar permanece esa regin y las clulas que expresan el gen VHS-tq mueren mediante seleccin con Ganciclovir. Con ese mtodo se pudo aumentar los clones recombinantes por el factor 10 hasta 12500 (MASOUR, 1990). Clones positivos se identifican con ayuda de la sonda de ADN (polimerase-chain reaction, PCR) como as tambin por medio del anlisis Southern-Blot. Luego se reproducen para ser inyectados a blastocistos y producir quimeras transgnicas. Si las clulas embrionarias totipotentes en esos animales colonizan tambin la hilera germinal se produce descendencia heterocigota, despus del apareamiento con animales no transgnicos. Esta puede ser empleada para producir animales y lneas transgnicas homocigotas. Cambios fenotpicos en portadores homocigotas de cambios genticos inducidos permiten hacer deducciones sobre la funcin del gen en estudio y sus productos. Con ese mtodo fueron inactivados y caracteriza-dos interesantes genes de importancia biolgica y evolutiva en el ratn (tabla 3). Clulas ES fueron empleadas tambin para buscar importantes genes o secuencias regulatorias de ADN, hasta el momento desconocidos, para la diferenciacin durante la ontognesis (GOSSER y col., 1989; FIEDRICH y SORIANO, 1991). Con ese objetivo se transfeccionaron clulas ES con construcciones (estructuras) gnicas, las cuales junto a un marcador selectivo positivo (en el mayor de los casos neo) contienen el gen de la -galactosidasa bacteriana (lacZ) con una zona promotora mnima (enhacer trap) o bien sin promotor (promotor trap, fig 13). Los clones que integran esa estructura gnica se emplean en la produccin de quimeras. La expresin del gen lac Z puede hacerse visible por medio del cronogen X-gal, cuyo fraccionamiento provoca una coloracin azul. De esta forma el gen puede ser determinado en diferentes estadios embrionarios. En el caso que se establezca un modelo de expresin interesante, es posible clonar las zonas responsables a partir del gen lac Z. En las estructuras del promotor Trap se produce la expresin del gen lac Z slo si stas se integran en la zona
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de influencia del promotor endgeno y con ello interrumpen el gen endgeno correspondiente. Si se logran producir quimeras de la hilera germinal con esa lnea puede caracterizarse, entonces, el gen endgeno interrumpido a travs de la reproduccin y evaluacin del fenotipo de los portadores hetero- y homocigotas, no slo estructural sino funcionalmente.
Gene targeting neor Pint-2-N/TK
HSV-tk
int-2+ neor Int-2- neor HSV - tk- (G4 1 8r, GANCr )
Integracin al azar neor HSV-tk
neor
HSV-tk
Int - 2+ neor HSV - tk+ (G4 1 8r, GANCS)
Fig 6: Vector para una CAPECCHI, 1989)
seleccin
positiva-negativa
(segn
Las aplicaciones descriptas de las clulas embrionarias totipotentes pueden llevarse a cabo en principio en las especies animales de inters zootcnico, si se logran establecer lneas celulares funcionales. La fig 8 describe un modelo de produccin de bovinos transgnicos aplicando lneas celulares pluripotentes (BREM, 1986). Adems surge la interesante posibilidad de evaluar la expresin de transgenes integrados al azar en las clulas ES o en sus derivados diferenciados para emplear slo clones adecuados para producir quimeras transgnicas. Este es el punto decisivo considerando la baja eficiencia de la produccin de individuos transgnicos a travs de la microinyeccin de ADN en el proncleo de los animales de inters productivo frente a los ratones (BREM, 1988). Contrariamente a la obtencin de embriones uni- o bicelulares, los embriones requeridos para obtener clulas totipotentes para la transferencia gnica pueden ser obtenidos en la especie bovina en forma no quirrgica. EVANS y col. (1990) adems someten a discusin a las clulas ES frente a la posibilidad de llevar a cabo intervenciones complejas en el genoma con el fin de variar caractersticas controladas por varios genes. Tabla 3: Ejemplos de la produccin de ratones con cambios genticos establecidos con el empleo de clulas ES como vectores para la transferencia gnica
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Gen
Linea celular ES D3 CC1.2 D3 D3
Donante de blastocistos C57Bl/6 C57Bl/6 C57Bl/6 CD1 C57Bl/6
Quimera de la hilera germinal
Literatura
Hox-1.1 Hox-1.5 Hox-1.6 En-2
ZIMMER & GRUSS, 1989 3 3 6 ZIJLSTRA y col., 1989/90 CHISAKA & CAPECCHI, 1991 LUFKIN Y col., 1991 JOYNER Y col., 1989
2-microglobulina N-myc HPRT HPRT HPRT-
D3
C57Bl/6
D3 E14TG2a CCE E14TG2a
C57Bl/6 C57Bl/6JLac x CBA/CaLac MF1 C57Bl/6/Ola x CBA/Ca/Ola C57Bl/6 C57Bl/6
4 19 11 1
STANTON y col., 1990 HOOPER y col., 1987 KUEHN y col., 1987 THOMPSON y col., 1989
HPRTWnt-1 (int-1) IGF II
ES98-12 AB-1
2 19
KOLLER y col., 1989 McMAHON & BRADLEY, 1990
CCE.33
CD-1 MF1 C57Bl/6
3 4 si 0 0 6 1 3 14
DeCHIARA y col., 1990/91
MHC Class II c-abl
D3 CCE
C57Bl/6 CD-1 MF1 C57Bl/6
COSGROVE y col., 1991 SCHWARTZBERG y col., 1989/91
c-abl IL-2 c-src
CCE E14 AB2.1
C57Bl/6 C57Bl/6 C57Bl/6
TYBULEWICZ y col., 1991 SCHORLE y col., 1991 SORIANO y col., 1991
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Enhancer trap neo
neo
Transcripcin
gene x
Lac Z protein
neo protein
Translacin
Promotor trap S P neo
Integracin en el interior del gen x en la orientacin y marco de lectura correctas ATG
P gene x
neo
Lac Z fusion protein
neo protein
Fig 7: Vectores "Enhacer trap" y "promoter trap" segn ROSSANT y JOYNER (1989). Los mismos contienen como marcador de seleccin el gen neo y un gen lacz (zona negra) para el reconocimiento de las regiones inductoras de trascripcin con una zona promotora mnima o reducida El primer paso es la produccin de clulas pluripotentes. Como donantes de embriones se eligen madres de toros (MT), apareadas con padres de toros (PT) para alcanzar un nivel gentico equivalente al de los toros de prueba. Las clulas plirupotentes son transfeccionadas in vitro, la integracin y expresin analizadas y finalmente son empleadas para la produccin de quimeras. Las mrulas y blastocistos receptores se obtienen de las madres de madres apareadas con padres de madres. Los
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terneros nacidos son evaluados en su capacidad de transmitir las nuevas cualidades genticas. La descendencia de la lnea celular son medio hermanos paternos, que poseen la mitad de los genes del apareamiento programado y heterocigotas con respecto al gen transferido. Plasmidio BB KB ADN clonante (homlogo-heterlogo)
Bacteria transforma Implantacin ectpica Transferencia de genes en cultivos celulares ADN clonado
Lneas celulares () Teratoma
BK
Quimera
KK
Poblacin
Quimera
Medio-hermanos paternos transgnicos

Fig 8: Modelo para la produccin de animales transgnicos a travs de la produccin de quimeras a partir de embriones y clulas de teratocarcinoma (BREM, 1986): SIMS y FIRST (1993) informaron por primera vez sobre gestaciones producidas con clulas germinales totipotentes. De 12 lneas celulares (tabla 4), los autores obtuvieron 10 por medio de ciruga inmunolgica de la masa celular interna de 3 blastocistos producidos in vitro. Se logr establecer 3050% de lneas celulares, no fueron observadas diferencias en la habilidad de las MCIs en establecer esas lneas. Despus del cultivo de los complejos fusionados en medio CRaa+selenio, insulina y transferrina + 5% de SFB se obtuvieron 109 (24%) blastocistos.
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Tabla 4: Blastocistos (d7) producidos con la transferencia nuclear de clulas germinales totipotentes (ES) Das despus de la inmunociruga No. de lneas celulares Blastocistos/ complejos fusionados Blastocistos %
0-14 15-28 29-42 42-56 57-70 71-84 99-112
4a,b,c, 5a,b,c 2a,b,c 1* 1* 1 1a
26/102 47/213 14/55 6/21 8/36 4/18 4/15
26 22 25 29 22 22 27
1 dias despus de la inmunociruga a partir de la transferencia nuclear * de un blastocisto a,b,c, lneas celulares con (a) transferencia de embriones, (b) preeces, (c) fetos de 220 dias
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LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA (PCR, Polimerase Chain Reaction) APLICADA EN PROGRAMAS DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES P. Dovc Introduccin En los programas de transferencia de embriones es deseable contar, antes de la transferencia, con informacin confiable sobre el genotipo del embrin. Sobre todo sera importante diagnosticar su sexo. De la misma forma sera interesante obtener informacin sobre la eventual presencia de predisposiciones a enfermedades hereditarias y la constitucin gnica en algunos loci, importantes para las caractersticas de valor productivo. La reaccin en cadena de polimerasa brinda la oportunidad de amplificar especficamente un reducido nmero de copias de ADN genmico para fines analticos. La ejecucin de estos tests, aunque sensible a perturbaciones, es relativamente simple y puede brindar la informacin deseada al cabo de pocas horas. Por ello el diagnstico gnico mediante la reaccin PCR es un mtodo de eleccin para los programas de TE. La historia de la biologa molecular muestra que a menudo el desarrollo y la puesta a punto de nuevas tcnicas tienen una marcada influencia sobre el modus procedere para resolver problemas bsicos y aplicativos. De esta forma la reaccin de PCR marc un importante cambio en la estrategia para resolver problemas en un amplio campo de la biologa molecular. La reaccin PCR en la forma actual fue establecida por MULLIS y FALOONA en 1987 y fue intensamente automatizada mediante la aplicacin de modernos instrumentos. Por un lado la reaccin PCR puede reemplazar parcialmente algunos mtodos antiguos y complicados (determinacin del genotipo de loci individuales). Por otro lado permite el desarrollo de nuevas estrategias (p.e. "gen linkage", anlisis a nivel molecular, caracterizacin del genotipo de determinadas clulas en forma individual). La reaccin PCR representa una eficiente tcnica para la replicacin de segmentos especficos de ADN in vitro e impulsa el desarrollo del rea de anlisis de ADN y ARN. La idntica duplicacin del material hereditario y su transmisin a la prxima generacin es una caracterstica de todo ser vivo. La reproduccin de la masa hereditaria (replicacin del ADN) sucede en forma semi conservadora: en la doble hlice de ADN una es la cadena original, mientras que la otra es su homlogo sintetizado posteriormente. In vivo la replicacin de ADN es un proceso complejo que requiere la accin coordinada de una gran cantidad de enzimas. En primer lugar las largas molculas de ADN genmico deben ser desespiralizadas, estabilizadas en ese estado, replicadas y luego la nueva cadena doble, recin sintetizada, debe ser transformada nuevamente en la cadena de doble hlice original. Estos procesos ocurren a una velocidad de unas miles de bases por minuto con una frecuencia de error de 1x10-9. Las polimerasas de ADN juegan un rol preponderante en la replicacin in vivo de ADN como matriz (template), un final 3'OH de un fragmento corto de una cadena doble de ADN libre como oligonucletido iniciador (primer) y nucletidos trifosfato desoxigenados (dNTPD, N corresponde a adenosina, citosina, guanidina o timidina) como bases para la cadena complementaria. Normalmente las polimerasas de ADN necesitan para su actividad, la presencia de iones metlicos como cofactores. Estos componentes -matriz, oligonucletido iniciador con final 3'OH libre, dNTPs y polimerasasrepresentan tambin los elementos para la replicacin de ADN in vitro. En la concepcin de la reaccin PCR se unieron varios pasos de la sntesis, logrando una amplificacin especfica de una regin limitada por oligonucletidos iniciadores (MULLIS y col., 1987).
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Reaccin en cadena de polimerasa
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Principios de la reaccin PCR La idea de la reaccin en cadena de polimerasa (PCR) se basa en la repetida sntesis de una regin de ADN que es limitada por dos molculas iniciadoras. Para la seleccin y la sntesis del iniciador es necesario tener por lo menos la informacin sobre la secuencia en los extremos del ADN que se desean amplificar. Esto posibilita la ubicacin de dos oligoelementos iniciadores complementarios a la cadena matriz, de tal manera que demarcan la secuencia blanco. La matriz de ADN es desnaturalizada en primer lugar mediante calentamiento de 94 a 96o C, la reasociacin se impide luego por medio de un enfriamiento rpido. En presencia de iniciadores adecuados, dNTPs y polimerasas de ADN, se logra un acoplamiento de las molculas iniciadoras a la parte homloga de la matriz (primer annealing), posteriormente la polimerasa puede sintetizar la segunda cadena. De esta manera se obtienen dos cadenas dobles a partir de una. Estas pueden ser a continuacin utilizadas nuevamente como matriz. Una repetida desnaturalizacin por medio de calor conduce a la liberacin esta vez de cuatro matrices que pueden ser complementadas a continuacin formando cuatro cadenas dobles de ADN. De esta forma se puede duplicar el nmero de copias de cada ciclo y despus de n ciclos concentrar una regin especfica a un valor 2n. Es necesario destacar que durante la amplificacin se forman dos distintas amplificaciones: cortas, limitadas en ambos extremos por la del iniciador y copias largas que sobrepasan la secuencia homloga al iniciador en el final 3'OH. La amplificacin de los fragmentos cortos sucede en forma exponencial, mientras que el incremento de las copias largas se manifiesta en forma lineal. Despus de n ciclos el nmero de fragmentos cortos aument a 2n (n + 1). Una sola molcula puede ser modificada de esta manera en 20 ciclos por el millonsimo factor (220). La idea ya fue descripta en los aos '70 (KLEPPE y col., 1971). En un comienzo se utiliz una polimerasa de ADN termolbil (fragmento Klenow de la polimerasa I de E. Coli). Luego de cada desnaturalizacin fue necesario agregar la polimerasa nuevamente, lo que complicaba y encareca el procedimiento. La aplicacin de la polimerasa de ADN termoestable de thermus aquaticus, cuya actividad se mantiene durante un alto nmero de ciclos, permite incorporar la polimerasa una sola vez al comienzo de la reaccin. Diferentes pasos de la reaccin PCR (desnaturalizacin, alineamiento del iniciador-primer annealing- y extensin del iniciador) requieren cambios de temperatura relativamente rpidos. Una solucin sencilla es la instalacin de 3 baos Mara. Uno con temperatura de desnaturalizacin (94-96o C), el segundo con la temperatura adecuada para el alineamiento del iniciador a la matriz (primer annealing, 50-70oC) y el tercero con la temperatura apta para la sntesis (72o C). Dado que es muy trabajoso cambiar manualmente los tubos de ensayo se recurri rpidamente a la ayuda de brazos robots. El siguiente paso fue el desarrollo de los hoy muy comunes termocicladores, capaces de repetir cclicamente los cambios de temperatura deseados gracias a microprocesadores. Los programas de estos aparatos permiten variar sus funciones. Esto significa que es posible prolongar el tiempo de desnaturalizacin en el primer ciclo, extender la duracin de la fase de sntesis en el ciclo final y enfriar el tubo de ensayo a 4o y hasta 8o C al concluir la reaccin. La mayora de las mquinas pueden ser programadas libremente siendo posible le eleccin de temperaturas dentro del margen de 50-96o C. El cambio de temperatura al calentar o enfriar sucede a una velocidad de 1 a 2oC/min-1. Segn el equipamiento tcnico se distinguen termocicladores con un bloque metlico termorregulado para los tubos y otros con bao fluyente.
Componentes de la reaccin Los componentes de la reaccin PCR pueden ser comprados en forma de set completo ("gen-Amp.Kit", Perkn-Elmer/Cetus). Diversas firmas ofrecen tambin los componentes en forma separada. El empleo de un set es recomendable para el principiante y para los laboratorios que tienen dificultades en conseguir los reactivos de alta calidad. La combinacin individual de los componentes para la reaccin
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PCR requiere la adquisicin de polimerasa ADN, dNTPs, MgCl2, KCl, Tris, detergente no inico, gelatina o albmina de suero de vaca, iniciadores y matriz de ADN. En la mayora de los casos se utiliza la polimerasa de ADN termoestable, aislada de la bacteria termfila thermus aquaticus (polimerasa ADN-Taq). La termoestabilidad y la alta temperatura ptima hacen que esta enzima sea de eleccin para mltiples aplicaciones. La misma es ofrecida ya por varias firmas. Aparte de la polimerasa ADN-Taq hay otras polimerasas termoestables en el mercado (polimerasa ADN-Tth de thermus thermophilus, polimerasa ADN-Bst de Bacillus stereo-thermophilus, polimerasa ADN-Vent der thermococcus litoralis). La mayora de las polimerasas de ADN termoestables tienen una actividad ptima a temperaturas entre 70-78o C y sintetizan la cadena homloga a una velocidad de ms de 1000 bases por minuto. Para esa actividad ptima se requiere un pH de 8,2 a 9,5 en 10mM de solucin tampn Tris. Los nucletidos trifosfticos desoxigenados (dNTP) son ofrecidos liofilizados o en soluciones acuosas de 100 mM. Es conveniente preparar soluciones de 2mM de cada dNTP y congelarlas en pequeas porciones (100 a 200 l). Bajo estas condiciones son estables durante varias semanas. Las soluciones tampn son usualmente producidas y almacenadas en forma dcupla concentrada. La composicin comn es de 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% gelatina, 0,01% NPO4 y 0,01 Tween 20 (SAIKI y col., 1988). Detergentes no inicos pueden ser reemplazados por Tritn x-100 aunque la presencia de un detergente es decisiva para el procesamiento de la enzima. Se debe recordar que altas concentraciones de dNTPs forman complejos MgCl2, lo que reduce la disponibilidad del mismo. Por ello es necesario aumentar la concentracin de MgCl2 en dicho caso. Los oligonucletidos iniciadores sintticos con 18 a 30 nucletidos mostraron ser adecuados para la amplia gama de aplicaciones. Iniciadores cortos de 18 nucletidos son suficientes para la ampificaciones de matriz-ADN poco complejas (p.e. plasmidios). Los iniciadores universales con lectura hacia adelante y atrs (Forward y Reverse-Primer) son adecuados para la amplificacin de sectores clonados. A menudo la calidad y pureza de los iniciadores sintticos es satisfactoria y pueden ser utilizados sin purificacin accesoria. En caso contrario se ofrece la purificacin HPLC en una columna cromatogrfica o la limpieza a travs de poliacrilamida. Al disear un iniciador se debe tener en cuenta que los iniciadores tengan semejante cantidad de guanidina y citosina, que no formen estructuras secundarias estables y que tengan poca homologa entre s. Sobre todo es importante que no exista homologa en la regin 3'- entre los iniciadores. Ya se ofrecen a la venta programas de computacin que facilitan decisivamente la seleccin de los iniciadores. Como matriz (template) puede ser utilizado ADN del ms variado origen. Para una amplificacin exitosa es de decisiva importancia que la preparacin del ADN no contenga impurezas que puedan interferir la misma negativamente. Sobre todo la presencia de fenol, detergentes y EDTA tiene un efecto perturbador. Dado que el largo de las amplificaciones excede en raros casos 1-2 Kb, el ADN-matriz no requiere tener alto peso molecular. Sectores cortos pueden ser amplificados exitosa-mente an a partir de matrices ADN degradadas como por ejemplo en material arqueolgico (PBO y col., 1988). Para la amplificacin es importante una buena desnaturalizacin de la matriz-ADN. Se recomienda una desnaturalizacin de por lo menos 5 min antes de la aplicacin de la enzima. Las condiciones de reaccin dependen sobre todo de la temperatura de fusin del iniciador (temperatura de alineamiento, "annealing temperature") y del largo de la amplificacin (tiempo de sntesis). Es necesario establecer experimentalmente el tiempo de reaccin ptima para cada par de iniciadores. El volumen de reaccin vara de 25 a 100l dependiendo de la cantidad de amplificaciones que se requiere para los estudios posteriores. Por razones econmicas es propicio reducir al mnimo el volumen de reaccin en anlisis de rutina. La concentracin del iniciador oscila entre 25 y 100 pmol. Para la mayora de las amplificaciones son suficientes 25 a 30 ciclos de amplificacin. Se requieren ms ciclos si la matriz-ADN que se quiere copiar se presenta en un reducido nmero de muestras (p. e. ADN de clulas aisladas).
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Anlisis de los productos de la reaccin PCR La concentracin especfica de la secuencia entre los iniciadores permite amplificar una cantidad suficiente de ADN para un anlisis electrofortico a partir de un grupo pequeo de copias de la matrizADN. En la mayora de los casos es posible separar las amplificaciones en gel de agarosa de 0,8 a 2,0% y observarlas bajo luz ultravioleta despus de una coloracin con etidio bromado (Ethidium Bromid). Si se trabaja con fragmentos muy cortos, que deben ser divididos con enzimas de restriccin despus de la amplificacin (fragmentos ms cortos que 50 pB), algunas veces es necesario utilizar geles de poliacrilamida (PAA) para alcanzar una separacin suficiente. Para los geles PAA se puede utilizar la coloracin con etidio bromado o la coloracin con plata. Esta ltima, a pesar de ser ms complicada, es ms apropiada para fragmentos muy cortos y cantidades pequeas de ADN debido a su sensibilidad. Particularmente exigente es la separacin electrofortica de las amplificaciones de las llamadas regiones "microsatlites". Microsatlites son regiones repetidas en el genoma que se componen de muchas copias de una secuencia corta (por lo general son dinucletidos). Estas regiones se diferencian a menudo en el largo solamente por dos nucletidos. Para el anlisis de dichas amplificaciones es importante un sistema electrofortico de alto poder resolutivo. En estos casos se utilizan productos de la reaccin PCR marcados radioactivamante o de otra manera. Estos son separados sobre geles finos PAA (estos geles se utilizan tambin para determinar la secuencia del ADN). Para detectar mutaciones puntuales se aprovecha la distinta forma de fusin de las amplificaciones que surgen a partir de las mutaciones. Para ese fin se preparan geles con gradientes lineares del desnaturalizante ("Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - DGGE, MYERS y col., 1987). En la migracin a travs del gradiente las molculas de ADN se desnaturalizan en forma paulatina en funcin del nmero de dominios de fusin (regin topogrfica de la hlice de ADN). Esto determina el diferente modo de fluir. En este sistema no es necesario buscar lugares de restriccin polimorfos para la separacin especfica del alelo. Una sola mutacin puntual altera la temperatura de fusin de un dominio determinado (25 a varios cientos de nucletidos) hasta 1,5o C. La migracin de los fragmentos parcialmente desnaturalizados en el DGGE es ms lenta que el flujo de los fragmentos correspondientes no desnaturalizados. La separacin electrofortica de los fragmentos de cadenas simples en geles-PAA nativos brinda un mtodo alternativo para la deteccin de mutaciones puntuales en amplificaciones obtenidas mediante la reaccin PCR. Las amplificaciones desnaturalizadas con anticipacin forman estructuras secundarias en el gel PAA nativo dependientes de la secuencia. Las diferentes mutaciones puntuales influyen de manera difcilmente pronosticable sobre las estructuras secundarias de los fragmentos. No obstante lo hacen de forma tan marcada que es posible identificar mutantes que difieren por una mutacin puntual debido a la diferente movilidad entre dos amplificaciones.
Reaccin PCR mltiple (PCR Multiplex) Junto con la amplificacin especfica de una regin flanqueada por un par de iniciadores que pertenecen a una matriz compleja, la eleccin de otros pares de iniciadores posibilita la amplificacin de varios fragmentos especficos de ADN en una sola reaccin PCR. Para ello se deben cumplir algunas condiciones: cada par de iniciadores debe responder a la exigencia general para los iniciadores descripta en el punto "componentes para la reaccin", no debe existir alta homologa entre los iniciadores de una reaccin y finalmente todos deben tener similar temperatura de fusin (Tm). Reacciones PCR mltiples son reacciones concebidas con el fin de estudiar simultneamente varias localizaciones (loci) del genotipo (p.e. diagnstico gnico de enfermedades hereditarias con un amplio espectro de diferentes mutaciones, exmenes de identidad, etc.). A veces se utiliza la reaccin PCR
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mltiple como reaccin interna de control para comprobar la regin haploide existente en el genoma (regin especfica para el cromosoma Y, PEURA y col., 1991). La importancia de la reaccin PCR mltiple como reaccin de control es cuestionable sobre todo en los casos en los cuales se amplifican muy pocas matrices y especialmente se supone que las amplificaciones en las diferentes localizaciones son sucesos independientes.
Tipificacin del genotipo de espermatozoides (Single Sperm Typing) La construccin de mapas gnicos exigi hasta el momento el apareamiento selectivo, el estudio de la descendencia o la determinacin de las combinaciones gnicas en base a los datos obtenidos por el estudio del pedigree. La primera posibilidad fue aprovechada a menudo para animales. Para el estudio del genotipo humano slo es considerada la segunda estrategia. La introduccin de los marcadores RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) posibilit dividir el genoma humano en sectores mas o menos regulares de 10 cM. El anlisis del pedigree permite determinar las distancias gnicas en sectores de 1 cM (en el hombre cerca de 100 kb) en forma estadsticamente asegurada. Para la estimacin de distancias ms cortas el nmero de datos requeridos sera demasiado grande por lo que este mtodo parece ser inadecuado para estos objetivos. A partir de la introduccin de la reaccin PCR es posible amplificar el ADN de una clula en lugares especficos en forma tan abundante que las ampliaciones obtenidas son suficientes para fines analticos. Durante la meiosis el ADN de las gametas puede ser afectado por crossing-over lo que genera nuevas recombinaciones adems de las de origen materno y paterno. La frecuencia de stas es un ndice para la posibilidad de un crossing-over y la distancia entre loci investigados. Para estos estudios se adecuan individuos que son heterocigotas en ambas localizaciones examinadas. La amplificacin simultnea de ambas regiones obtenidas de espermatozoides individuales y la posterior determinacin del alelo para ambos loci permite identificar la variante de los padres como as tambin la recombinante (LI y col., 1988). En los ciclos iniciales se lleva a cabo una amplificacin simultnea de ambos loci con dos pares de iniciadores (reaccin PCR mltiple), luego se dividen los componentes para amplificar cada regin separadamente. La deteccin de las variantes del alelo se lleva a cabo mediante la hibridacin de las amplificaciones con aligonucletidos especficos para el alelo marcado radiactivamente (OEA) o no. Los resultados de la tipificacin de espermatozoides individuales demuestran que en 20% de los mismos no se produce amplificacin. Para obtener resultados confiables estadsticamente se requiere evaluar una cantidad abundante de espermatozoides. A pesar que el trabajo con las clulas espermticas individuales es relativamente complicado, este mtodo es de gran valor para la obtencin de cartas gnicas, porque brinda resultados rpidos independientes del intervalo generacional.
Determinacin del sexo El sexado confiable de los embriones en estadios preimplantatorios es un problema actual en programas de TE. Existieron diferentes intentos para determinar el sexo: mtodos inmunolgicos o citogenticos y otros mediante tcnicas de ADN. Cabe destacar que se prob intensamente como alternativa de clasificar los espermatozoides antes de la fertilizacin. Los mtodos que se fundaban en el diferente peso especfico de los cromosomas X e Y demostraron no ser adecuados por la alta variabilidad del contenido citoplasmtico. Igualmente el intento de seleccionar los espermatozoides X e Y segn su motilidad en funcin del pH produjo resultados insatisfactorios. La deteccin inmunolgica depende del reconocimiento especfico del antigen HY propio del sexo masculino (BOOMAN, 1989). Este mtodo dio resultados no confiables y mostr ser inadecuado para la aplicacin prctica. La representacin citognica de los cromosomas sexuales es relativamente exigente y requiere para la determinacin confiable del sexo un nmero alto de blastmeros. El problema principal de la determinacin del sexo mediante sondas especficas para el ADN del cromosoma Y es el largo procesamiento y la baja sensibilidad de los sistemas de hibridacin.
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Tambin en este campo de diagnstico del sexo la aplicacin de la reaccin PCR promovi una nueva estrategia en la bsqueda de una solucin. En principio una sola copia del ADN-matriz es suficiente para amplificar una regin. Como fue mencionado al tratar la amplificacin del ADN de los espermatozoides, en algunos casos, el ADN de una clula no es suficiente para una amplificacin exitosa. Por ello, para diagnosticar el sexo es conveniente disponer de 2 a 3 blastmeros para amplificar el ADN. Luego de aislar los blastmeros por medio de microciruga, las clulas deben ser lisadas con el propsito de liberar el ADN genmico para su posterior amplificacin. Para la amplificacin de las secuencias del sexo se dispone de diferentes pares de iniciadores (p.e. BRY4a, REED y col., 1989). A menudo se eligen secuencias repetidas de los cromosomas sexuales para la amplificacin. De esta forma se dispone desde un principio de un nmero mayor de copias, facilitando notablemente la obtencin de la cantidad necesaria de amplificaciones para el anlisis. En consecuencia se necesitan menos ciclos de amplificacin (20 a 25), obtenindose resultados ms rpidos. Al amplificar secuencias especficas del cromosoma Y se obtienen amplificaciones slo en embriones masculinos (HERR y col., 1990a, b). Para excluir errores durante la reaccin es conveniente amplificar una regin autosomal (GROBET y col., 1992). Esto hace necesario una reaccin PCR mltiple con 2 pares de iniciadores por lo menos. La cuestionable relevancia del control de la reaccin fue mencionada anteriormente. Una posibilidad alternativa para la amplificacin de las secuencias especficas del sexo es la amplificacin de las secuencias presentes tanto en el cromosoma X como en el Y. Estas secuencias, sin embargo, se diferencian por medio de mutaciones propias del tipo de cromosoma. Un ejemplo para dichas secuencias son los genes ZFX y ZFY (Zinc, MARDON y PAGE, 1989). Se trata de genes con una sola copia (Single Copy Gene) que existen tanto en el cromosoma Y como en el X. Ambos se diferencian, sin embargo, en un corto fragmento de la secuencia. Uno tiene un lugar de corte para la endonucleasa, el otro no. Esto conduce a un polimorfismo del largo de los fragmentos despus de la restriccin de las amplificaciones (REEP) con dicha enzima. Los iniciadores para las amplificaciones especficas de los genes ZFX y ZFY son aptos para un amplio espectro de especies. Ambos iniciadores son 25-meros, el iniciador 5-'P1-5EZ tiene la secuencia: 5'ATAATCACATGGAGAGCCACAACT-3. El iniciador 3'- tiene la secuencia: 5'GCATTTCTTTTGGTTATCTGACAAAGT-3' Los RFLPs de las ampliaciones fueron observados en las especies humana, bovina, ovina y caprina (AASEN y MEDRANO, 1990). La tabla 1 presenta los RFLPs observados en las esas especies. Tabla 1: Largo de los fragmentos y enzimas de restriccin para la demostracin del RFLP de los genes ZFX (445pb) y ZFY (447 pb) Largo de fragmento (pb) ZFX ZFY 400+45 445 272+173 272+173 317+84+46 344+103 447 447
Especie Humana Bovina Ovina Caprina
Enzima HaeIII PstI SacI SacI
Las amplificaciones tratadas con la correspondiente enzima de restriccin o las amplificaciones especficas del cromosoma Y con sus correspondientes pruebas de control son separadas en gel de agarosa y coloreadas con bromuro de etidio.
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Foto 1: Amplificacin de la secuencia especfica repetida del cromosoma Y y RFLP de las amplificaciones especficas de los cromosomas X e Y. Las columnas 1 y 8: 100 pb marcador, columna 2: amplificacin del ADN femenino con un iniciador especfico del cromosoma Y. Columna 4 y 5: amplificacin de los ADN masculino y femenino con iniciador P1-5EZ/P2-3EZ. Columna 6 y 7: divisin enzimtica de los amplificadores de los ADN masculinos y femeninos con los iniciadores P1-5EZ/P2-3EZ Caracterizacin del genotipo Las caractersticas cuantitativas son de importancia para la zootecnia prctica. Estas son determinadas en forma polignica y hasta el momento poco accesibles a los anlisis de gentica molecular. Pero hay algunos ejemplos que ilustran la importancia de algunos genes individuales para la produccin animal. Las protenas de la leche representan una familia de genes sumamente polimorfa. Las distintas variantes se distinguen en mutaciones puntuales y pequeas prdidas en el genoma. Existe especial inters en caracterizar la caseina y la lactoglobulina . Ambas enzimas tienen influencia sobre las cualidades de la leche (GRAML y col., 1987). Con la eleccin de iniciadores adecuados se pueden amplificar regiones polimorfas e identificar mutaciones puntuales mediante el RFLP. La principal ventaja de este mtodo es la independencia de la expresin gnica (el sistema es aplicable tambin en animales machos) y su rapidez (LIN y col., 1992).
Control de la descendencia Para el control de la descendencia se aplican comnmente secuencias altamente polimorfas y repetidas las cuales forman, en combinacin con diferentes sondas, un sistema de alto poder de resolucin. Con ste se pueden hacer afirmaciones estadsticamente seguras sobre la descendencia. Frecuentemente se utilizan regiones microsatlites (denominadas tambin VNTR, variable number of tandem repeat). Algunos alelos se distinguen en el largo de las repeticiones tndem (tandem repeat). Despus de la amplificacin con iniciadores que flanquean estas regiones se puede, luego de separar las amplificaciones en gel secuencial, identificar los polimorfismos. Con la combinacin de varios loci aumenta el poder resolutivo de este mtodo (GEORGES y col., 1991). Con fines forenses se emplean regiones con repeticiones de Tri- o Tetranucletidos junto con los VNTRs. Para la aclaracin de la descendencia materna se dispone del anlisis de la secuencia de la regin hipervariable (D-loop). En las especies mamferas el ADNmt es de herencia materna y est presente en numerosas copias por clula.
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Diagnstico de enfermedades hereditarias Las enfermedades hereditarias dependientes de un solo gen, con mutaciones bien definidas y que causan el desarrollo de los sntomas clnicos, son apropiadas para el diagnstico por medio de la reaccin PCR. El mtodo se basa en la ampliacin de la regin que puede estar afectada por la mutacin. En principio puede tratarse de mutaciones puntuales o prdidas (deletions) en el genoma. Para el diagnstico se disponen bsicamente de 3 alternativas: hibridacin de las amplificaciones con oligonucletidos especficos para el alelo (OEA), anlisis de restriccin de las amplificaciones y determinacin directa de la secuencia de la regin amplificada. Con el surtido de endonucleasas disponibles actualmente en el mercado, es posible encontrar para casi todas las secuencias una enzima apropiada. Para la determinacin directa de la secuencia de los productos de la reaccin PCR se ofrecen varias alternativas. Una posibilidad es la concepcin de una reaccin PCR en la cual solo en los primeros ciclos ambas cadenas son sintetizadas. A continuacin predomina la sntesis de una cadena. El incremento del producto de la reaccin PCR es lineal en lugar de exponencial). Finalmente el producto es una cadena simple de ADN, la cual puede ser utilizada directamente como matriz para la secuencia a determinar. Otra posibilidad es la determinacin directa de la secuencia del producto de cadena doble de la reaccin PCR. Esto, sin embargo, parece ser difcil sobre todo con amplificaciones cortas. Una ltima posibilidad la presenta, por supuesto, el clonado de las amplificaciones y el posterior anlisis de los clones recombinantes. Un ejemplo para el anlisis de restriccin de las amplificaciones es la deteccin de la anemia falciforme del hombre (SAIKI y col., 1985). Para ese fin se amplifica una regin con un largo de 725 pb del gen de la -globulina y luego se divide la amplificacin mediante la enzima CvnI. Con ello se obtienen dos fragmentos constantes (256 y 88 pb) y un fragmento de 381 pb de largo. Este puede ser dividido en dos subfragmentos (201 y 180 pb) si proviene de un individuo sano. En cambio en individuos con anemia falciforme una mutacin puntual causa la prdida del lugar de reconocimiento para la enzima (KAZAZZIAN, 1989). La identificacin directa de la mutacin es posible despus del anlisis electrofortico de las ampliaciones tratadas enzimaticamente. La citrulinemia es una enfermedad hereditaria del bovino provocada por una mutacin puntual en el gen de la enzima argininasuccinato sintetasa. En los animales que padecen esta enfermedad, el codn 86, que normalmente codifica para arginina, se transforma en un codn stop. La consecuencia es un producto gnico corto en el locus que impide el normal desenvolvimiento del ciclo metablico de la urea provocando un aumento de la concentracin de citrulina con alteraciones patolgicas. La mutacin modifica tambin el lugar de reconocimiento de la endonucleasa AvaII, presente en animales sanos, de forma tal que en los animales con esa deficiencia gentica el lugar con AvaII no se puede separar. Con la eleccin de una iniciador adecuado es posible amplificar una fragmento de 176 pb de largo, que produce dos fragmentos (98 bp + 78 pb) cuando los animales sanos son tratados con AvaII. En los animales enfermos falta el lugar de reconocimiento para AvaII (FRSTER, 1991). Diagnsticos de rutina para la talasemia- se basan en la hibridacin especfica del ADN amplificado con oligonucletidos especficos para el alelo en combinacin con el anlisis de restriccin. Aproximadamente la mitad de los ms de 60 mutantes de la talasemia son identificables mediante el anlisis de restriccin. Las mutantes restantes son diagnosticables mediante el anlisis de restriccin. El resto de las mutantes es diagnosticable por medio de la hibridacin Dot-blot con oligonucletidos especficos para el alelo. La precisin del lavado debe ser establecida de tal manera que la diferencia entre las fuerzas de la seal de hibridacin entre homocigotas y heterocigotas sea detectable con claridad. La secuenciacin de las regiones amplificadas cobra particular importancia en la identificacin de nuevas mutantes (WONG y col., 1987). Defectos ocasionados por prdidas pequeas pueden ser diagnosticados mediante la seleccin de iniciadores apropiados para ambos lados del lugar presumible de la prdida. Un ejemplo de ello es el
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diagnstico de la distrofia muscular Duchenne. En una reaccin PCR se emplean 18 iniciadores, que limitan 9 regiones ms comnmente afectadas por prdidas del gen distrofin. La falta de las amplificaciones de la regin determinada indica la mutacin. En general este mtodo es limitado por el largo de la amplificacin en individuos sin prdidas, dado que la amplificacin de regiones que superan 2 kB es problemtica y poco adecuada para el diagnstico de rutina.
Comprobacin del transgen Como ocurri en otras reas de la gentica molecular, la reaccin PCR encontr rpidamente su aplicacin en el diagnstico de transgnesis. En la concepcin del sistema de comprobacin se hace uso, sobre todo, de las particularidades de la secuencia transferida. Se intenta amplificar los fragmentos del transgen no presentes en el ADN genmico endgeno o aquellos diferentes de la secuencia endgena (p.e. mutaciones puntuales que modifican las secuencias de reconocimiento para las endonucleasas, prdidas, inserciones, etc.). En algunos casos el transgen se diferencia de la secuencia endgena por la falta de secuencias vectores o por las regiones promotoras. En ambos casos la presencia de elementos heterlogos puede ser utilizada para el diseo de iniciadores. Mediante la evaluacin cuantitativa de la reaccin PCR se puede deducir el nmero de copias del transgen. Con ese fin se lleva a cabo a menudo una co-amplificacin en un locus endgeno para estimar la cantidad de la amplificacin del transgen en funcin de la produccin estandarizada de amplificaciones del locus de referencia. De singular importancia es la evaluacin de la reaccin PCR en la fase logartmica dado que las diferencias causadas por la distinta cantidad original de ADN matriz son evidentes sobre todo en ese momento. El mejoramiento de la cuantificacin significa una marcacin estandarizada, covalente de las amplificaciones (iniciadores marcados en forma fluorescente).
Diagnstico de enfermedades infecciosas La reaccin de PCR se ofrece como mtodo diagnstico para detectar infecciones, sobre todo las subclnicas porque su sensibilidad permite la deteccin de cantidades mnimas de ADN (tericamente una sola copia de la molcula matriz es suficiente). Es posible comprobar secuencias integradas en el genoma (p.e. infecciones retrovirales) como tambin la presencia de secuencias episomales y extracelulares propias de las infecciones. La reaccin de PCR facilit un progreso importante en la investigacin HIV. Se posibilit el diagnstico de secuencias provirales HIV-I de las clulas mononucleares de la sangre perifrica, obtenida de pacientes sero-positivos; a pesar que no fue posible confirmar la infeccin a travs del cultivo del virus (OU y col., 1988). De especial importancia es la aplicacin de la PCR en el diagnstico de infecciones subclnicas provocadas por agentes difcilmente cultivables in vitro. La eleccin del iniciador especfico de especie garantiza la identificacin del agente infeccioso. El polimorfismo en las regiones especficas de especie permite la identificacin de las distintos tipos (DOVC y col., 1992). De esta forma se dispone, en el estudio etiolgico de las infecciones, de un mtodo eficaz que puede aclarar tambin los interrogantes forenses.
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Apndice Protocolo de laboratorio para la amplificacin de la regin ZFX y ZFY de blastmeros. 1. Los blastmeros obtenidos por medio de microciruga son suspendidos en 5l de medio y transferidos a un tubo de ensayo Eppendorf. Se aaden 20 l de agua bidestilada a fin de alcanzar un volumen final de 25l. Posteriormente los blastmeros (3-5) son congelados cclicamente 10 veces en hielo seco y descongelados a 96o C en un termociclador. En el ltimo ciclo el tratamiento trmico es prolongado a 10 minutos. Luego las pruebas son mantenidas en hielo. Para la reaccin PCR se prepara la siguiente solucin "Master-mix" (expresada en l): H2O 8,5 10 x buffer 5,0 dNTPs 5,0 Iniciador 3,0 + 3,0 Polimerasa Taq 0,5 25l de Master-mix son incorporados a la solucin con los blastmeros lisados. Todo se cubre con 60l de parafina. La reaccin de PCR se lleva a cabo en el termociclador: 1 min: 94o C 1 min: 60o C 1 min: 72o C 25 ciclos En el primer ciclo se prolonga el primer paso a 5 min y en el ltimo ciclo el ltimo paso a 4 min. 6. 7. Despus de 25 ciclos se aade 0,5 ml de polimerasa Taq, posteriormente se sigue con otros 25 ciclos. Despus de 50 ciclos se produce la divisin enzimtica de las amplificaciones. Luego la electroforesis en gel.
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ASPECTOS SANITARIOS DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES R. Alberio Introduccin El embrin como transmisor de enfermedades En el intercambio internacional de genotipos, actualmente es posible afirmar que el semen es una forma ms segura desde el punto de vista sanitario para llevarlo a cabo que el animal vivo. Como se ver a continuacin, la transmisin potencial de enfermedades por medio del embrin es inferior a la del animal vivo y a la del semen. Por otro parte, el embrin constituye un genotipo por s mismo lo cual representa otra ventaja (gentica) con respecto al semen que slo representa una parte del genotipo deseado. La transmisin de enfermedades por el embrin puede deberse a agentes patgenos presentes en el embrin o en el lquido en que es vehiculizado. Teniendo en cuenta ambas posibilidades, existen 6 tipos de riesgo de contaminacin va embrionaria (THIBIER, 1990). 1) En primer lugar se debe tener presente la posibilidad de la contaminacin intracelular. Si bien este es un riesgo potencial para ambas gametas (ovocito o espermatozoide) y algunos ejemplos han sido puestos en evidencia en el ratn (JAENISCH y BERNS, 1977 y MIMMS, 1966), ninguna evidencia ha sido hasta el presente demostrada en los animales domsticos de granja. 2) La penetracin de un agente patgeno en el embrin puede ocurrir tanto en el momento de la fecundacin como por accin propia del agente. En el primer caso se ha observado que al menos en dos enfermedades a virus (lengua azul y BHV-1) los espermatozoides presentaban adheridos al agente cuando se obtuvieron de toros infectados (FOSTER y col., 1980; ELHAZHARY y col., 1980). Estos tendran capacidad infectante en caso de fecundar. Sin embargo, las precauciones descriptas previamente para la aceptacin de un toro dador, hacen esto poco menos que imposible. Para el segundo caso, son slo excepciones descriptas en el ratn (GWATKIN, 1967) en que se ha mostrado capacidad de atravesar la membrana pelcida. Hasta el momento no ha sido descrito ningn agente infeccioso capaz de atravesar la membrana pelcida en los animales domsticos. 3) Un riesgo de tercer nivel es el de la presencia de agentes patgenos en el ambiente uterino. Si bien en condiciones naturales es prcticamente imposible una fecundacin o el desarrollo normal de un embrin temprano en presencia de agentes patgenos en trompas o tero, algunos de estos agentes han sido encontrados en trabajos experimentales con virus de la IBR/IPV o de la FA (SINGH y col., 1983; McVICAR y col., 1986). En el mismo sentido se sabe que algunos virus, en algunas especies, pueden estar protegidos y/o adheridos a la superficie de la membrana pelcida sin que se puedan eliminar por el lavado, como es el caso del virus IBR/IPV (SINGH y col., 1982). 4) Riesgo de contacto con agentes patgenos en el momento de la recoleccin, debido a infecciones del tracto genital externo o a maniobras inapropiadas durante el lavaje. 5) Riesgo de contaminacin durante las manipulaciones in vitro. Adems de las manipulaciones corrientes (bsqueda, evaluacin, lavado, acondicionamiento) debe recordarse que tambin pueden llevarse a cabo otras que implican una ruptura de la membrana pelcida (congelacin, biseccin, biopsiado para sexaje). Estas ltimas debern llevarse a cabo en medios controlados y esterilizados previamente. 6) Existe por ltimo el riesgo de trasmitir agentes patgenos en el momento o en las maniobras destinadas a su transferencia. Medidas elementales de manejo en esta maniobra hacen de este riesgo uno de los ms improbables. Los riesgos de la transmisin de agentes patgenos Los embriones bovinos son transferidos entre los das 6-8 de desarrollo. Este corto perodo de vida intrauterina reduce sensiblemente las posibilidades de que los embriones puedan ser contaminados,
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tanto ms por el hecho que slo estarn expuestos a aquellos agentes liberados al tracto reproductivo. El perodo de recoleccin mencionado garantiza la existencia de la membrana pelcida que como se dijo antes, es impermeable a la mayora de los agentes infecciosos. Los parsitos, bacterias y hongos son fcilmente descartados en su capacidad de penetrar, por su gran tamao. Slo los virus podran cuestionarse aunque no se han determinado penetraciones virales en el bovino. En el caso eventual de agentes patgenos en el tracto genital, el hecho de utilizar grandes volmenes de medio para la recoleccin de los embriones provoca automticamente una gran dilucin de dicho agente. El lavado del embrin as como el agregado de enzimas y/o antibiticos, reducen la posible presencia de agentes patgenos. Por ltimo, la congelacin misma ha demostrado ser eficaz en la inactivacin de muchos virus que se pueden adherir al embrin (SINGH, 1987). Numerosas investigaciones dejaron en claro, en los ltimos aos, los pocas posibilidades de transmitir agentes patgenos por va del embrin correctamente tratado
Agentes patgenos a considerar En principio, todos los tipos de microorganismos deben ser tenidos en cuenta. Sin embargo, prcticamente, slo los virus pueden constituirse en agentes de verdadero peligro, debido a sus caractersticas biolgicas. Las bacterias y otros microorganismos representan un riesgo de segundo orden. Alrededor de unos 50 agentes han sido o son investigados para determinar los riesgos que su transmisin podra tener a travs del embrin. En este estudio, realizado recientemente por el Subcomit de Investigacin de la IETS, se concluy tambin que no es posible hacer extrapolaciones entre especies para un mismo agente ni entre agentes dentro de la misma especie. Una de las razones principales es la caracterstica especfica de la membrana pelcida (CHEN SHI SONG y WRATHALL, 1989) que la hara reaccionar de forma diferente ante un mismo agente patgeno. En una reciente revisin sobre el tema realizada por SINGH (1988) se presentan resultados concernientes a embriones obtenidos de animales seropositivos o infectados con diferentes bacterias y virus y su efecto o determinacin tanto sobre los embriones (Cuadro 1) como sobre las receptoras o los productos nacidos de la transferencia.
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Cuadro 1: Determinacin de presencia de agentes patgenos sobre embriones de vacas seropositivas o infectadas (SINGH, 1988) Estado de la donante BLV sero+ BVDV sero+ BTV infectada FMDV infectada IBR sero+ IBR infectada Peste bovina infecciosa B. Abortus infecciosa C. psitaci inf. M. paratub. inf. No de ovocitos y embriones colectados 60 (26) 2 (21) 51 (14) 302 (21) 13 (18) 63* 107 160 5 7 MEBUS y col., 1987 VOEKEL y col., 1978 BOWEN y col., 1978 JORGENSEN y RASBACH (no publicado) Agentes sobre el embrin -
Referencias BOULLANT y col. 1981 SINGH y col. 1982 BOWEN y col. 1983 McVICAR y col., 1987 MEBUS Y Col., 1987 SINGH y col., 1982
* tratados con tripsina Abreviaturas ver glosario al final del captulo En ningn caso fue detectada su presencia en el embrin, seroconvertibilidad o enfermedad en receptoras o terneros nacidos (Cuadro 2). Cuadro 2: Transferencia de embriones provenientes de donantes sero-positivas o infectadas (SINGH, 1988) Estado de la donante BLV sero+ BTV sero+ BTV infectada 334 IBR infectada IBR sero+ B. Abortus sero+ 64* 1500 39 THOMAS y col., 1983 SINGH y col., 1987 THIBIER y NIBART, 1987 del CAMPO y col., 1987 No de embriones transferidos 596 1500 Serologia de donantes o hijos Referencias
EAGLESOME y col., 1982 THIBIER y NIBART, 1987
*tratadas con Tripsina Abreviaturas, ver Glosario al final del captulo.
En todos los casos sealados se utilizaron o estudiaron embriones despus de sucesivos lavados tal como se describir mas adelante. Tales lavados no garantizan "la limpieza" de la totalidad de los
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agentes como fuera demostrado en el caso de embriones expuestos a IBR y a VSV (SINGH, 1987). La adherencia de los virus a la membrana pelcida no pudo ser anulada por los simples lavados y fue necesaria una corta exposicin a la tripsina para eliminarlos (Cuadro 3). Cuadro 3: Efecto de la tripsina sobre la adherencia de virus de IBR y VS en embriones previamente expuestos a ellos (SINGH, 1987) No de embriones expuestos 80 96 % de embriones con virus 70 30 Referencias
Tratamiento Sin tripsina IBR VS Con tripsina IBR VS
SINGH y col., 1982 SINGH y THOMAS (no publicado) SINGH y col., 1982 SINGH y THOMAS (no publicado)
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Sobre esto ltimo, el tratamiento con tripsina no parece necesario ya que THIBIER y NIBART (1987) transfirieron ms de 1500 embriones provenientes de vacas IBR seropositivas sin modificar la serologa negativa de las vacas receptoras. Tal vez esto se deba a que si hubiese habido presencia de virus en tero, no hubiese habido fecundacin o desarrollo de los embriones en dicho medio (THIBIER, 1990). Con respecto a la fiebre aftosa, enfermedad endmica y de gran trascendencia en los pases de Amrica del Sur, en un reciente trabajo realizado en Argentina y supervisado por los Departamentos de Agricultura de EE.UU. y Canad, se demostr que los sucesivos lavados de los embriones son suficientes para eliminar el virus al que fueron expuestos. En el mismo trabajo se demostr que los embriones provenientes de vacas y toros que sufrieron la enfermedad y transferidos a vacas seronegativas, no modificaban tal estado en las receptoras. Tambin se verific esto en los terneros nacidos as como la ausencia de signos clnicos de la enfermedad en stos y en sus madres (VILLAR y col., 1991). En trabajos de exposicin de embriones a diferentes agentes virales se demostr que ninguno afectaba la viabilidad de los mismos. Por el contrario, la exposicin a B. abortus produca una disminucin de la viabilidad embrionaria (SINGH, 1987). En la mayora de los animales infectados o seropositivos a varios virus (BLV, BTV, FMDV, IBR) y a B. abortus, se obtuvo presencia de los agentes patgenos en los fluidos de lavajes (SINGH, 1987). De sto se puede concluir, que frente a varios agentes que pueden estar presentes en el tero los embriones desarrollan pero las manipulaciones in vitro (lavajes, tripsinado) son suficientes para corregir su infeccin. Fuera de lo mencionado, tambin algunas bacterias pueden adherirse o adsorberse a la membrana pelcida tales como el Haemophilus sommus (THOMSON y col., 1988), los ureaplasmas (BRITTON y col., 1988) y los mycoplasmas (BIELANSKY y col. 1990). Sin embargo, su sensibilidad ante los antibiticos resta importancia a estas adherencias bacterianas. Como conclusin es posible afirmar que: - Hasta el presente no se ha detectado en el bovino ningn agente patgeno capaz de atravesar la membrana pelcida por s solo. La integridad de la misma es entonces una condicin sine qua non para garantizar la salud del embrin.
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- Para todos los agentes patgenos que se encuentran en el medio de colecta o en las inmediaciones del embrin pero que no se adsorben al mismo, el correcto lavaje del embrin es suficiente para su eliminacin. El correcto lavaje significa: realizacin de diez baos sucesivos con una dilucin de 1/100 en cada pasaje cambiando la pipeta en cada bao. Al final de este proceso el medio deber permanecer estril. -En el caso de embriones con virus adsorbidos (VSV, IBR) deben complementarse los baos normales con un tratamiento adecuado con tripsina. -Debe tenerse en cuenta la posible presencia de agentes patgenos en sueros fetales o albminas bovinas utilizadas en los medios De acuerdo con lo descrito anteriormente y segn el riesgo de transmisin de enfermedades infecciosas (Anexo I) por medio de la transferencia de embriones, la IETS ha categorizado en el ao 1989 a las enfermedades en cuatro grupos (Anexo II). Tal categorizacin es incluida posteriormente por la OIE en sus recomendaciones generales sobre el tema.
Condiciones Generales de las precauciones sanitarias en la transferencia de embriones De acuerdo con lo analizado hasta este momento es posible definir claramente los dos puntos centrales donde a travs del uso de la transferencia de embriones se puede transmitir una enfermedad. Estos dos puntos son respectivamente la fase in vivo y la fase in vitro. - Fase in vivo: concierne a los animales dadores (toros y vacas) involucrados en el proceso. Es claro que los mismos pueden ser vectores de agentes patgenos hacia el embrin, pero hemos visto que existen las metodologas de laboratorio para contrarrestar la mayor parte de las situaciones estudiadas. - Fase in vitro: involucra fundamentalmente al hombre y al entorno en que se realizan las manipulaciones. La correccin en el desarrollo de estas ltimas de acuerdo con las normas actualmente existentes dan la garanta de mxima confiabilidad en la tcnica de transferencia de embriones. Cabra agregar por ltimo una tercera fase de vigilancia (nuevamente in vivo) que es la que se puede establecer a nivel de las receptoras elegidas como sanas y mantenidas luego de la TE en cuarentena el tiempo necesario para determinar que no hay seroconversin o signos clnicos. De todas formas surge como trascendente la segunda fase, ya que poniendo nfasis en la misma es posible una cierta flexibilidad en la primera, posibilitando as una mayor facilidad en la realizacin de intercambio de genotipos. A pesar de esto, la profilaxis basada en el estado sanitario de las donantes sigue siendo la norma ms corrientemente aceptada. Se parte as de la premisa que si el animal donante est sano, tambin lo estarn sus embriones. Aplicando estos criterios generales, las exigencias reglamentarias de los pases difieren desde aqullas que van de la no importacin de embriones desde pases donde existe determinada enfermedad hasta otros que slo exigen que la donante se encuentre libre de enfermedades especficas. Los niveles o criterios establecidos para la manipulacin de semen (condiciones sanitarias del pas o territorio; condiciones sanitarias del rebao o rodeo y condiciones sanitarias del animal) son entonces adoptados para los embriones. Sin embargo, las caractersticas propias del embrin en cuanto al manejo del semen as como los costos y limitaciones que se le impondran a la transferencia de embriones han provocado una evolucin inteligente de las exigencias y reglamentaciones recomendadas actualmente. Pasos dados en tal sentido por pases que marcan rumbos en esta temtica (EE.UU., CEE), permiten esperar una evolucin favorable en las normas actuales. A su vez las investigaciones sobre este tema continan por lo que tambin esto contribuir a la dinmica de tales reglamentaciones.
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Normas propuestas para el control sanitario en el intercambio internacional de embriones Como para el caso del semen, existen normas generales a seguir en cada uno de los pasos de la transferencia de embriones, destinadas al intercambio internacional de los mismos. Estas normas generales tienen luego variantes en su aplicacin por los pases y se refieren a los siguientes aspectos: 1. Caractersticas de la Unidad de Transferencia de Embriones 2. Condiciones del equipo humano y de los materiales utilizados 3. Requisitos de la donante 4. Manipulacin sanitaria de los embriones 5. Infraestructura y personal 5.1. Unidad de Transferencia de Embriones Estas unidades se encontrarn debidamente inscriptas en los Servicios Sanitarios correspondientes, estarn bajo la supervisin de un Profesional Veterinario tambin inscripto para la realizacin de estas tareas y deber contemplar las siguientes subunidades o sectores: 5.1.1. Sector de alojamiento y servicio de los animales. Ser un rea destinada a los animales incluidos en todo el programa de transferencia de embriones. Puede encontrarse en una unidad de transferencia de embriones o en una explotacin. En ambos casos estos animales estarn aislados de todo animal que no est comprendido en el programa. 5.1.2. Sector de colecta. El mismo puede ser un lugar cerrado o abierto pero en ambos casos deber contar con instalaciones apropiadas para el correcto manejo de los animales y deber permitir una buena limpieza y desinfeccin previas a cada manipulacin. Asimismo deber asegurar que las intervenciones sobre las hembras se hagan en buenas condiciones higinico-sanitarias. 5.1.3. Sector de procesamiento de embriones. Deber ser un ambiente cerrado, fijo o mvil. En l se llevarn a cabo la totalidad de las manipulaciones a que son sometidos los embriones (bsqueda, evaluacin, lavaje, acondicionamiento, congelacin, etc.). El sector deber contar con materiales (piso, paredes y techos) impermeables y que soporten los lavajes y desinfecciones repetidas. Deber tener mesada/s anticorrosivas, desages, agua fra y caliente y estar protegida de la presencia de roedores e insectos. En ella estar el material utilizado para las manipulaciones entre las cuales una lupa con aumento x 50 y equipo de congelacin. Ser lavado y desinfectado previo a cada uso. 5.1.4. Sector de almacenamiento de embriones. Se trata de un local slo destinado a almacenar embriones, con caractersticas semejantes a las descriptas en 1.3. Especialmente: que permita la limpieza y desinfeccin repetidas, protegida de roedores e insectos y lavada y desinfectada antes de ser usada para conservar embriones. Contendr los termos de nitrgeno lquido necesarios. 5.1.5. Sector de lavado, desinfeccin y esterilizacin. Ser un ambiente cerrado con caractersticas similares al descrito en 1.3 y destinado nicamente a su uso especfico. Se anexan las normas propuestas por la OIE (1986) correspondientes a las Unidades de Recoleccin (Anexo III). 5.2. Personal que participa en el programa y materiales utilizados. 5.2.1. El personal que realiza y supervisa el desarrollo del programa constituye el eje sobre el cual deber garantizarse el xito tcnico y sanitario de un programa de transferencia de embriones. Un equipo oficialmente inscripto debiera poseer las cuatro condiciones siguientes (THIBIER, 1990):
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- estar compuesto por personal competente tanto en lo tcnico como en lo higinico-sanitario y comprender al menos un profesional veterinario. - poseer un equipamiento adecuado y trabajar en instalaciones de acuerdo con lo descrito en el punto 5.1. - aceptar seguir rigurosamente todas las recomendaciones exigidas para la manipulacin de embriones, en los textos correspondientes (Normas OIE, IETS, etc.). - aceptar someterse con regularidad a un control de calidad destinado especial-mente a asegurar la ausencia de agentes infecciosos en muestras de lquidos de colecta, lavaje, y ovocitos o embriones degenerados. Condiciones como las descriptas e impuestas en muchos pases (CEE) dan a los servicios sanitarios oficiales las garantas necesarias para otorgar las correspondientes autorizaciones. 5.2.2. Los materiales utilizados en la colecta y manipulacin de embriones estarn correctamente lavados y esterilizados (Ver Anexo IV). 5.3. Requisitos de la donante Los requisitos generales exigidos para la donante son los descriptos en el Sector IV, Captulo I del Manual de la IETS. Es conveniente sin embargo discriminar algunos requisitos especficos que son los que actualmente posibilitan el intercambio internacional de embriones entre pases con determinadas enfermedades y otros libres de ellas. Al respecto parece interesante mencionar la reglamentacin actualmente propuesta por la APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service) para regular la importacin de embriones desde pases donde existe actualmente la fiebre aftosa o la peste bovina (Federal Register, 1990). Hasta el presente era imposible este tipo de intercambio y las pautas propuestas aqu, producto de los continuos avances en las investigaciones en el tema, abren nuevas y excelentes perspectivas para pases infectados con enfermedades como FA. Las normas propuestas en tal documento con respecto a las donantes incluyen: 5.3.1. Durante el ao previo a la colecta de embriones ningn caso de FA, PB, CBP, RVF, VS, BSE o cualquier enfermedad transmisible de los rumiantes deber haber ocurrido en la Unidad de Transferencia de Embriones o en el rodeo de donde proviene la donante. 5.3.2. Durante el ao previo a la colecta, ningn caso de las enfermedades mencionadas en 3.1 habr ocurrido dentro de un radio de 5 km de la Unidad de Transferencia de Embriones o del rodeo donde estuvo la donante. 5.3.3. Durante los 60 das previos a la colecta, la donante no ha sido vacunada contra FA o PB. 5.3.4. Durante los 60 das previos al ingreso a la Unidad de Transferencia de Embriones (al menos 24 horas antes a la realizacin del servicio que dar lugar a los embriones) las donantes permanecern en un mismo rodeo y ningn animal se incorporar al mismo. 5.3.5. En el da de la colecta de embriones y entre 30 y 120 das despus se tomarn muestras de suero (10 ml) que sern congeladas y enviadas al Foreign Animal Dissease Diagnostic Laboratory para su anlisis. Si alguna de las siguientes enfermedades existe en el pas de origen (FA, CBP, RVF, VS, PB) la donante ser evaluada para certificar que est libre de tales enfermedades, a partir de las muestras tomadas. Tambin podr evaluarse presencia o ausencia de brucelosis en estas muestras si la donante no proviene de un rodeo certificado como libre de la enfermedad.
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5.3.6. Si la donante no proviene de un establecimiento certificado libre de tuberculosis, se deber realizar un test de tuberculina intradrmica entre 30 y 120 das despus de la recoleccin de los embriones y despus de 60 das de cualquier aplicacin intradrmica para detectar tuberculosis previa. 5.3.7. Entre 30 y 60 das despus de la colecta la donante debe ser revisada por el veterinario oficial y estar libre de las enfermedades descriptas en 3.1, brucelosis y tuberculosis. 5.3.8. Embriones producidos por una donante que muere antes de realizados los tests dentro de los tiempos requeridos, no podrn ser aceptados. 5.3.9. Desde el momento de la colecta de embriones hasta terminar los tests mencionados, ningn animal en la unidad de transferencia de embriones ni en el rodeo de origen de la donante exhibir evidencias clnicas de algunas de las enfermedades descriptas en 3.1. En lo concerniente a la CEE y en particular con respecto a la FA, sus reglamentaciones indican que un embrin fresco proveniente de un animal que se encuentra en un pas donde se vacuna contra FA no puede entrar a otro pas donde no se vacuna. Sin embargo, un embrin congelado s puede hacerlo a condicin que no haya habido vacunacin en los 30 das previos a la colecta y que haya pasado un mnimo de 30 das entre la colecta y la expedicin del embrin. Sobre estos ejemplos se pueden encontrar versiones diversas para cada pas. Es paradojal a veces que pases de Amrica Latina donde existen la mayora de las enfermedades mencionadas, tengan en sus reglamentaciones clusulas ms estrictas que en EE.UU. y la CEE donde muchas de ellas han sido erradicadas. En la versin de 1986 del Cdigo Zoosanitario Internacional de la OIE, las normas simplificadas para el manejo de las donantes (referidas como ejemplo a FA) son las siguientes: Si la importacin es a partir de pases libres de FA, los Servicios Veterinarios debern solicitar la presentacin de un certificado internacional de salud que indique: - Las donantes estarn en un rodeo sin cambios en los 30 das previos a su partida a la Unidad de Transferencia de Embriones. - Ni la donante ni otro animal del rodeo presentar signos clnicos de FA durante las 24 horas previas a su partida a la unidad de transferencia de embriones y por los siguientes 30 das. - Las donantes sern inseminadas con semen de acuerdo a lo descrito en los captulos correspondientes. - La unidad de transferencia de embriones ser libre de FA en los 30 das siguientes a la colecta. Si la importacin es a partir de pases considerados infectados con FA, el certificado de salud exigido por los Servicios Sanitarios oficiales deber indicar: - La donante y todo otro animal en el rodeo de origen no mostrar signos clnicos de FA durante las 24 horas previas a su partida a la Unidad de Transferencia de Embriones ni en los 30 das posteriores. - La donante estuvo aislada en el establecimiento de origen por los 30 das previos a su partida a la Unidad de Transferencia de Embriones y mostr signos negativos a los tests diagnsticos de FA. - No ha sido vacunada contra FA o, - fue vacunada con vacuna cumpliendo los estndares de la OIE (el tipo y lnea de virus tambin deber consignarse en el certificado). - Fue inseminada con semen proveniente de toros de acuerdo a lo descrito en los captulos correspondientes. - Fue transportada a la Unidad de Transferencia de Embriones sin pasar a travs de una zona infectada y la Unidad de Transferencia de Embriones se mantuvo libre de FA hasta 30 das despus de la colecta.
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De los tests habitualmente realizados sobre las muestras de sangre tomadas se pueden mencionar los siguientes: a) para FA: test VIA. Tambin y como complemento para FA se puede solicitar el test de aislamiento viral a partir de hisopado farngeo (Probang Test). b) para IBR: seroneutralizacin o test de ELISA. c) para VS: fijacin de complemento o seroneutralizacin. d) para lengua azul: inmunodifusin en agar gel. e) para brucelosis: prueba de seroaglutinacin lenta en tubo (WRIGHT). Se aceptar negativa la dilucin 1/50. A las precauciones descriptas al comienzo de este captulo y propuestas por los EE.UU. en el Federal Register (1990) se debern agregar las siguientes: 5.3.1. Al menos 24 horas antes de realizar el servicio para produccin de embriones, la donante deber ser alojada en la unidad de transferencia de embriones. 5.3.1.1. La donante quedar en la unidad de transferencia de embriones hasta la colecta de embriones y durante los 30 das posteriores a la misma. 5.3.1.2. Durante el perodo en que la donante permanezca en la Unidad de Transferencia de embriones ningn animal puede estar en contacto con ella a menos que: - haya seguido los mismos pasos ya descriptos para la donante. - sea parte del rodeo de origen de la donante. - sirva como toro donante en cuyo caso habr sido evaluado como se describi previamente. 5.4. Manipulacin sanitaria de los embriones. Todo lo concerniente a los medios de colecta y lavaje, procedimiento de lavaje y/o tripsinado de los embriones y evaluacin de la integridad de la membrana pelcida de los mismos es descrito en detalle en la Secccin IV, Captulo II del Manual de la IETS. Como medida precautoria suplementaria, en estas etapas de laboratorio tambin sern tomadas muestras que permitan determinar la inexistencia de microorganismos en el embrin antes de su transferencia. Como los procedimientos a realizar destruiran al embrin si se llevaran a cabo en l, se procede a realizar pruebas indirectas tomando muestras de los fluidos de colecta y de los cuatro ltimos lavados de embriones y todos los ovocitos sin fertilizar y embriones anormales. Los procedimientos para las tomas de estas muestras se encuentran en la Seccin IV, Captulo II, del Manual de la IETS (Anexo IV). Asimismo y como complemento de lo antes descrito, se anexan las normas propuestas por la OIE (Cdigo Zoosanitario Internacional, 1986) para las elaboraciones de los correspondientes Certificados Zoosanitarios Internacionales que debern tener en cuenta las Administraciones Veterinarias. Los ejemplos que se adjuntan son los descriptos por la OIE en 1986. Conclusiones A partir del material aqu presentado se puede concluir que gracias al desarrollo de biotecnologas como la obtencin y procesamiento de semen y embriones, el intercambio internacional de genotipos es actualmente factible con muy buenas garantas de no ser al mismo tiempo vectores de enfermedades contagiosas. Si bien hasta el presente ninguna de las alternativas mencionadas da una seguridad absoluta de la no transmisibilidad de enfermedades por estas vas, las normas y reglamentaciones existentes, basadas en trabajos de investigacin intensos llevados a cabo en los ltimos aos, dan mrgenes de seguridad suficientes como para que la mayora de los pases utilicen estas metodologas. Una observacin importante es que muchas de estas normas de prevencin han ido hacindose menos rgidas a medida que nuevos trabajos demostraban que eran innecesarias. De esta manera, y para el caso particular de los embriones, las condiciones de seguridad que brinda el producto final, asociado
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con la disminucin de algunas de las trabas sanitarias han hecho que sea actualmente el material de eleccin para el intercambio de genotipos. De la misma manera, el uso de esta metodologa como base para la conservacin de genotipos (Banco de Germoplasma) dar garantas suficientes para el uso futuro de este material sin riesgos sanitarios.
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LISTA DE ENFERMEDADES SEGUN SU PELIGROSIDAD E IMPACTO ECONOMICO
LISTA A A 010 A011 A012 A013 A014 A015 A016 A017 A020 A021 A022 A030 A040 A050 A060 A070 A080 A090 Fiebre aftosa (FA) FA - Virus O FA - Virus A FA - Virus C FA - Virus SAT 1 FA - Virus SAT 2 FA - Virus SAT 3 FA - Virus Asia 1 Estomatitis vesicular (EV) EV - Virus Indiana EV - Virus New Jersey Enfermedad vesicular del cerdo Peste Bovina Peste de los pequeos rumiantes Perineumona contagiosa bovina Dermatosis nodular contagiosa Fiebre del Valle de Rift Lengua Azul
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LISTA B Enfermedades comunes a varias especies B051 B052 B053 B055 B056 B057 B058 B059 Carbunco bacteridiano Enfermedad de Aujeszky Equinococosis/Hidatidosis Cowdriosis (heartwater) Leptospirosis Fiebre O Rabia Paratuberculosis
Enfermedades de los bovinos B101 B102 B103 B104 B105 B106 B017 B018 B019 B110 B111 B112 B113 B114 Anaplasmosis Babesiasis Brucelosis bovina (B.abortus) Campilobacteriosis genital bovina Tuberculosis bovina (Mycobacterium bovis) Cisticercosis (C.bovis) Dermatofilosis Leucosis bovina enzotica Septicemia hemorrgica Rinotraquetis infecciosa bovina (IBR/IPV) Theileriasis Tricomonosis Tripanosomosis Fiebre catarral maligna
LISTA C Enfermedades comunes a varias especies C611 C612 C613 C614 C615 C616 C617 C618 C619 C620 C621 C622 Listerelosis Toxoplasmosis Melioidosis Carbunco sintomtico Botulismo Otras infecciones clostridiales Otras pasteurelosis Actinomicosis Salmonelosis intestinales Coccidiosis Distomatosis heptica Filariasis
Enfermedades de los bovinos C652 C653 C654 Enfermedad de los mucosas/Diarrea viral bovina Disenteria vibrinica Barros
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CATEGORIZACION DE LAS ENFERMEDADES DE ACUERDO CON EL RIESGO DE SU TRANSMISION POR LOS EMBRIONES SEGUN LA IETS Conclusiones de la Sociedad Internacional de Transferencia de embriones (IETS) Comit de importacin/exportacin Subcomisin de investigaciones San Diego (Estados Unidos), 15-17 de enero de 1989. Luego de la revisin, efectuada en 1988 por la Subcomisin de Investigaciones, Comit de Importacin/Exportacin de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (IETS) y de las informaciones en el terreno con relacin a las enfermedades infecciosas, estudiadas desde el punto de vista del riesgo de su transmisin por la transferencia de embriones, la IETS clasific estas enfermedades en las siguientes categoras: Categora 1 Enfermedades o agentes de enfermedades para los que se han reunido pruebas suficientes como para afirmar que el riesgo de transmisin es despreciable, a condicin de que los embriones se manipulan correctamente1 entre la recoleccin y la transferencia: -Leucosis bovina enzotica -Fiebre aftosa (bovinos) -Brucella abortus (bovinos)
Categora 2 Enfermedades para las que se han reunido pruebas que indican que el riesgo de transmisin es despreciable, a condicin de que los embriones se manipulen correctamente* entre la recoleccin y la transferencia, pero para las que hay que verificar los datos existentes mediante nuevas transferencias: - Rinotraquetis infecciosa bovina - Lengua Azul (bovinos) - Enfermedad de Aujeszky (cerdos) - Peste porcina clsica Categora 3 Enfermedades o agentes de enfermedades para los que los resultados preliminares indican que el riesgo de transmisin es despreciable, a condicin de que los embriones se manipulen correctamente** entre la recoleccin y la transferencia pero para los que dichas comprobaciones preliminares deben corroborarse con datos experimentales complementarios, in vitro e in vivo: - Peste bovina (bovinos)
1
* Manual de la IETS (Recomendaciones para la manipulacin higinica de los embriones)

**Manual
de la IETS (Recomendaciones para la manipulacin higinica de los embriones).
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- Enfermedad de la mucosa (DVB) - Lengua Azul (ovinos) - Campylobacter fetus (ovinos) - Fiebre aftosa (cerdos) - Enfermedad vesicular del cerdo - Peste porcina africana - Temblor epidrmico del carnero - Haemophilus somnus
Categora 4 Enfermedades o agentes de enfermedades que han sido o son objeto de trabajos preliminares: -Virus Akabane (bovinos) -Estomatitis vesicular (bovinos y cerdos) -Chlamydia psittaci (bovinos) -Ureaplasmas/micoplasmas (bovinos) -Maedi-visna (ovinos) -Adenomatosis pulmonar (ovinos) -Temblor epidrmico (caprinos) -Lengua Azul (caprinos) -Artritis y encefalitis caprina -Parvovirus (cerdos) -Enterovirus (cerdos) -Leptospirosis (cerdos)
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NORMAS PROPUESTAS POR LA OIE PARA LAS UNIDADES DE RECOLECCION DE EMBRIONES (Cdigo 1986) 5.2.3.: UNIDADES DE RECOLECCION Autorizacin sanitaria con miras a la exportacin Anexo 5.2.3.1. OVOCITOS/EMBRIONES BOVINOS A. Objetivos del control El objetivo del control sanitario oficial de los vulos/embriones de bovinos destinados a los intercambios internacionales es garantizar la ausencia de grmenes patgenos especficos eventualmente asociados a los vulos/ embriones y evitar todo riesgo de infeccin de las hembras receptoras y de su descendencia. Puede haber o no similitud de situacin sanitaria entre el pas exportador y el pas importador; los programas nacionales de control pueden variar considerablemente, al igual que las condiciones exigidas para las vacunaciones y las pruebas diagnsticas. Por ellos, las condiciones de autorizacin de las Unidades de recoleccin y de los laboratorios de tratamiento asociados a ellas, pueden ser diferentes en el pas exportador y en el pas importador. Por tales motivos, entre otros, el presente Anexo no abarca ms que los principales requisitos sanitarios aplicables a la recoleccin, al tratamiento y al transporte de los vulos/embriones.
B. Condiciones generales La Administracin Veterinaria debe procurar que las medidas zoosanitarias enunciadas en los prrafos siguientes sean respetadas en los intercambios internacionales de vulos/embriones.
1. Unidad de recoleccin La Unidad de recoleccin es el establecimiento donde estn alojadas y son tratadas las hembras donantes con vistas a la recoleccin. Es en general, una parte definida de la explotacin donde se mantiene el rodeo de origen de las hembras donantes, o bien, una parte especficamente definida de un establecimiento hacia el que se trasladan las hembras donantes para proceder a la recoleccin y a los exmenes de control. En ambos casos deben aplicarse las siguientes condiciones: a) La Unidad de recoleccin debe ser autorizada por un veterinario oficial y puesta bajo vigilancia veterinaria directa. b) La instalacin y el equipo de la unidad deben permitir que las intervenciones sobre las hembras donantes se hagan en buenas condiciones de higiene; deben asimismo permitir el primer procesamiento de los vulos/embriones. c) El personal que trabaja en la unidad debe tener una perfecta formacin, tanto en los aspectos tcnicos como en los fundamentos de profilaxis de las enfermedades y aplicar las ms estrictas normas de higiene, con objeto de evitar la introduccin de enfermedades en la unidad. Debe trabajar provisto de ropa y calzado de proteccin. d) El acceso a la unidad estar prohibido a toda persona no autorizada. e) La unidad no debe estar situada en una zona infectada (de peste bovina o fiebre aftosa) durante las recolecciones.
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2. Laboratorios de manipulacin de vulos/embriones El laboratorio, que puede ser mvil o fijo, se define como un sitio en donde los vulos/embriones son recogidos en el medio de recoleccin, examinados, lavados y sometidos a todos los tratamientos necesarios antes de ser congelados y puestos en cuarentena. El laboratorio fijo puede ser una parte de una Unidad de recoleccin y procesamiento especficamente definida, o bien una parte debidamente acondicionada de un establecimiento existente. Puede estar situado en el lugar de mantenimiento del rebao o de las hembras donantes. En ambos casos, las condiciones generales de autorizacin de las Unidades de recoleccin deben ser cumplidas y aplicarse adems las siguientes condiciones: a) El laboratorio debe estar bajo vigilancia directa de un veterinario oficial. b) Cuando se manipulan los vulos/embriones destinados a la exportacin y antes de su conservacin en ampollas/pajuelas, ninguna operacin deber ser efectuada sobre los vulos/embriones de nivel sanitario inferior. c) El laboratorio debe estar protegido contra roedores e insectos. d) El laboratorio mvil debe ser perfectamente desinfectado cada vez que se utiliza en las diferentes Unidades de recoleccin. e) El laboratorio no debe situarse en una zona infectada (de peste bovina) durante las recolecciones. 3. Hembras donantes a) En las 24 horas anteriores a la recoleccin, todos los bovinos, ovinos, caprinos y porcinos del rebao de origen deben ser objeto de un examen clnico realizado por un veterinario oficial y declarados libres de cualquier enfermedad contagiosa transmisible a los bovinos. b) El rebao debe estar libre de fiebre aftosa, peste bovina y perineumona contagiosa bovina, y no debe encontrarse en una zona infectada (de peste bovina o fiebre aftosa) durante los 30 das antes y despus de la recoleccin. c) El rodeo de origen de las hembras donantes debe de preferencia formar parte de los rebaos que son objeto de un programa nacional de profilaxis; debe por lo menos estar "libre" de tuberculosis y brucelosis bovina. No debe haberse producido durante los 12 meses anteriores ninguna evidencia clnica ni antecedente de infeccin de Trichomonas fetus o de Campylobacter fetus. d) Las hembras donantes deben cumplir con todos los requisitos fijados por la Administracin Veterinaria del pas exportador. e) Las hembras donantes no deben haber sido importadas de otro pas durante los 6 meses anteriores y deben haber permanecido durante por lo menos 30 das en el rebao de origen. f) Las hembras donantes y el rodeo de origen deben ser objeto de un nuevo examen clnico efectuado por un veterinario oficial por los menos 30 das despus de la recoleccin, y ser declarados libres de toda enfermedad contagiosa transmisible a los bovinos. g) El propietario de las hembras donantes debe certificar que, a su conocimiento, dichos animales no son portadores de taras genticas conocidas, ni estn emparentados con portadores de taras genticas.
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4. Examen a efectuar de las hembras donantes y los vulos/embriones Existen dos mtodos principales para asegurar que los vulos/embriones estn libres de grmenes patgenos. El mtodo tradicional consiste en exmenes realiza-dos sobre las hembras donantes; estos exmenes exigen mucho tiempo. Puede ser necesario controlar los sueros apareados y reiterar otras pruebas despus del perodo normal de incubacin de una enfermedad para determinar el estado sanitario de las hembras donantes. El otro mtodo se basa en trabajos recientes bien documentados que permiten reconocer con gran fiabilidad que los vulos/embriones estn libres de bacterias y virus especificados*** cuando han sido procesados de conformidad con el Manual de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (I.E.T.S.)****. Dicho mtodo evita los largos perodos de aislamiento y los reiterados exmenes de las hembras donantes, a condicin de que stas respondan a los criterios de base enunciados en el prrafo 3 del presente Anexo. a) Mtodo tradicional i) Exmenes realizados sobre las hembras donantes en aplicacin de un acuerdo bilateral. Conservacin de los vulos/embriones en nitrgeno lquido durante un perodo de tiempo superior a la duracin normal del perodo de incubacin de las enfermedades de las que el pas importador se quiere proteger. Esto permite someter a las hembras donantes a exmenes serolgicos en el momento de la recoleccin, o antes de sta, y nuevamente despus de la recoleccin. Los resultados negativos de dichos exmenes, asociados a las nuevas tcnicas de lavado, dan un grado de seguridad superior al que se alcanzaba anteriormente. ii) Utilizacin de semen para la inseminacin de las hembras donantes y fecundacin de los vulos que respondan a las condiciones sanitarias y a las normas enunciadas en el Anexo 5.2.1.1. Cuando el semen congelado utilizado para inseminar a las hembras donantes procede de toros que ya han muerto, o cuando el estado sanitario de los toros respecto a una o varias enfermedades infecciosas concretas no se conoca en el momento de la recoleccin, podrn exigirse exmenes complementarios de las hembras donantes inseminadas, despus de la recoleccin de los vulos/embriones, para verificar que dichas enfermedades no les fueron transmitidas. Los exmenes del semen pueden constituir otra alternativa de control. En caso de monta natural o de utilizacin de semen fresco, los sementales deben cumplir con las mismas condiciones sanitarias que las hembras donantes. b) Nuevo mtodo: lavado de vulos/embriones La zona pelcida de cada vulo/embrin debe ser examinada en toda su superficie bajo un aumento de por lo menos 50x, y debe ser garantizada intacta y exenta de cualquier material adherente. Los vulos/embriones deber ser lavados de conformidad con las recomendaciones del Manual de la I.E.T.S.; su zona pelcida debe estar intacta antes y despus del lavado. Slo deben ser lavados conjuntamente los vulos/embriones procedentes de una misma hembra donante. (Toda expedicin de
trabajos realizados sugieren que las tcnicas de lavado descriptas en el Manual de la IETS ofrecen un alto grado de seguridad frente a los siguientes agentes patgenos: Brucella y virus de la lengua azul, de la leucosis bovina enzotica (LBE), de la enfermedad de las mucosas (BVD) y de Akabane. Las tcnicas de lavado con tripsina parecen necesarias para eliminar los virus de la rinotraquetis infecciosa bovina (IBR) y de la estomatitis vesicular (Manual de la IETS, 4.16) **** Manual of the International Embryo Society 1986
***Los
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vulos/embriones deber ser acompaada de una atestacin firmada por el veterinario responsable del laboratorio de manipulacin certificando que dichos exmenes fueron realizados). 5. Recoleccin y conservacin de ovocitos/embriones a) Medio Todo producto biolgico de origen animal utilizado para la recoleccin, procesado, lavado o conservacin debe estar exento de microorganismos vivos. Los medios y las soluciones utilizados para la recoleccin, congelacin y conservacin de ovocitos/embriones deben ser esterilizados segn mtodos reconocidos, conformes a las recomendaciones del Manual de la I.E.T.S. y manipulados de forma que permanezcan estriles. Se deben agregar antibiticos en el momento de la recoleccin, lavado y conservacin, de conformidad con las recomendaciones del Manual de la I.E.T.S. b) Material Todo el material utilizado para la recoleccin, manipulacin, lavado, congelacin y conservacin de los vulos/embriones debe ser esterilizado antes de su utilizacin, de conformidad con las recomendaciones del Manual de la IETS. 6. Exmenes y tratamientos facultativos1 a) Un pas importador puede pedir el examen de los ovocitos/embriones y de los lquidos de recoleccin o de lavado. En ese caso, los exmenes sern realizados en un laboratorio autorizado y debern confirmar, en la medida de lo posible, la ausencia de grmenes patgenos. i) Ovocitos/embriones Cuando los embriones son recolectados exclusivamente para la exportacin, los vulos no fecundados y los embriones que presentan anomalas genticas, procedentes de una misma hembra donante, debern ser lavados de conformidad con las recomendaciones del Manual de la IETS. ii) Lquidos del lavaje uterino El lquido de lavaje debe colocarse en un recipiente estril, por ejemplo una probeta graduada, y dejarse en reposo durante una hora. El lquido sobrenadante deber ser retirado a continuacin y los 100 ml del fondo que contienen los residuos acumulados, decantados en un frasco estril. Si se utiliza un filtro deben ser agregados a los 100 ml del lquido conservado mediante enjuague. iii) Lquido del lavado de los embriones Los cuatro ltimos lquidos de lavado de los vulos/embriones (lavados 7, 8, 9 y 10) deben ser agrupados (manual de la I.E.T.S.). iv) Muestras Las muestras arriba descriptas deben ser conservadas a 4C y examinadas dentro de las 24 horas. De no ser posible, deben ser conservadas a una temperatura igual o inferior a -70C. b) Puede ser solicitado un tratamiento de vulos/embriones mediante la tripsina. Este tratamiento debe ser realizado de conformidad con las recomendaciones del manual de la I.E.T.S. c) Slo deben ser procesados al mismo tiempo los vulos/embriones procedentes de una misma hembra donante.
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7. Conservacin, cuarentena y transporte a) Los ovocitos/embriones deben ser conservados en ampollas/pajuelas esterilizadas y stas, a su vez, en contenedores esterilizados con nitrgeno lquido, respetando condiciones de estricta higiene, en un lugar de almacenamiento autorizado por la Administracin Veterinaria del pas exportador y que no presente ningn riesgo de contaminacin para los ovocitos/embriones. b) Slo deben colocarse en la misma ampolla/pajuela los vulos/embriones procedentes de una misma hembra donante. c) Las ampollas/pajuelas deben ser precintadas en el momento de la congelacin y etiquetadas de conformidad con las recomendaciones del Manual de la IETS. El contenedor con nitrgeno lquido debe ser precintado antes de su envo. d) Los ovocitos/embriones deben congelarse en alcohol "fresco" o en nitrgeno lquido, y conservarse en nitrgeno lquido "fresco" en contenedores esterilizados. e) Los ovocitos/embriones conservados no deben ser exportados antes de haber finalizado las operaciones objeto del certificado sanitario 1 Se prev el estudio de un anexo sobre los mtodos recomendados para las pruebas de investigacin de agentes patgenos en los lquidos de irrigacin y de lavaje, cuando el pas importador solicite esos exmenes particulares. Dados los conocimientos actuales, se puede afirmar que las tcnicas existentes para el aislamiento de bacterias y virus parecen ser eficaces.
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Alberio
CONSIDERACIONES PRACTICAS Y ASPECTOS COMERCIALES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES R.H. Alberio Introduccin Se trata sta de una tecnologa reciente donde no slo se han tenido que desarrollar sus aspectos tcnicos sino tambin los sistemas de aplicacin en forma comercial. La biologa de la transferencia de embriones es muy compleja y por ello las tcnicas que componen un programa de TE tienen diferentes grados de imperfeccin lo que debe ser tenido en cuenta al desarrollar su aplicacin prctica desde el punto de vista comercial. Desde otro punto de vista, en esta era de la tecnologa, los productores no quieren quedar fuera de los cambios que se producen en su medio. Una de las nuevas adquisiciones tecnolgicas para reproducir los genotipos superiores es la TE. El potencial est indicado por su uso en programas de mejora gentica, por lo que la pregunta es cmo hacer para que la tcnica tenga su mejor aprovechamiento. La demanda de los productores ya no slo es por los animales registrados sino por aquellos que producen ms en las evaluaciones con parmetros objetivos de calidad, o simplemente con el tipo de animal que an sin evaluaciones objetivas de produccin tiene en un momento dado mayor demanda en el mercado. Las caractersticas de la tcnica permiten una adaptacin rpida a las necesidades del mercado, objetiva o subjetivamente determinado. La TE ha modificado en buena medida el comercio tradicional de los reproductores. En lugar de elegir solamente al mejor toro, la atencin est dirigida tambin a la obtencin de las mejores vacas. De esta manera, ciertas reproductoras comienzan a ser valoradas actualmente tanto como lo es el toro. As, algunos cabaeros comienzan a producir vacas donantes como antes producan toros para IA. Algunos programas alternativos a considerar en la TE -La vaca permanece como donante permanente Esto tiene sentido cuando el propietario puede vender con provecho ms embriones o terneros de esa vaca de los que se pueden producir. Los embriones pueden ser transferidos frescos o congelados para abastecer la demanda fuera de la temporada de produccin de terneros. La congelacin ha abierto enormes perspectivas en los programas genticos y comerciales ya que los embriones pueden ser mantenidos indefinidamente en el termo, a un bajo costo y pueden ser vendidos en cualquier momento y lugar. Una de las formas de venta es sobre preez confirmada lo que en general es deseable para el comprador. Una variante es congelar embriones todo el ao y luego transferirlos durante la temporada de servicios. De esta manera, si bien la tasa de xito es algo menor con embriones congelados, es posible reducir los costos totales al no tener que disponer permanentemente de receptoras lo que suele ser uno de los aspectos ms costosos del proceso. Si se adopta la variante de congelar los embriones, es conveniente recordar que aproximadamente un 25% de ellos no son congelables pero si transferibles en fresco por lo que siempre hay que prever para ello un nmero de receptoras. -La donante es superovulada slo una vez y vuelve al servicio Esta variante permite al productor realizar una superovulacin y recoleccin entre paricin y nuevo servicio, multiplicando as por 2 3 el nmero de terneros a obtener en un ao. Si bien sta no es la modalidad ms aconsejada, muchos productores desean comenzar de esta forma no slo para ver el grado de xito de la misma sino para aproximarse a la tcnica de una forma no muy complicada ni costosa. En este caso se considera recomendable no trabajar con menos de 3 a 4 vacas para disminuir as la posibilidad de caer sobre un animal que no produce embriones.
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Consideraciones prcticas y aspectos comerciales
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-Donantes en el Centro de TE Los embriones se producen, transfieren, gestan y los terneros se cran hasta el destete en el Centro de TE. En ese momento son entregados al propietario. Una alternativa ms econmica y ms frecuente es entregar la receptora al propietario cuando se hizo el diagnstico de gestacin (2 a 3 meses). Estos sistemas tienen la ventaja de liberar al propietario de todos los problemas y responsabilidades inherentes al programa y tambin benefician al tcnico, ya que de esa manera tendr el conjunto del problema en sus manos, pudiendo controlar ms estrechamente y con mayores recursos cada una de las etapas. Por otra parte, el centro en general estar dotado de una infraestructura destinada especficamente a esta actividad. -Programa en el establecimiento de origen de las donantes Ello exige de manejos, cuidados y procedimientos ms intensos a los que, en general, se acostumbra en el campo. En consecuencia se requiere de personal entrenado y de la supervisin del propietario y/o encargado. La parte ms compleja y costosa de este sistema lo constituye la provisin de receptoras en el nmero necesario, y de buena calidad en el momento apropiado. Tambin requiere la atencin permanente de los partos a lo largo de todo el ao. -Venta de receptoras preadas Esta ha sido una de las formas comerciales ms importantes en TE que tiende actualmente a ser reemplazada por la venta de embriones congelados. -Venta de la produccin de un tratamiento superovulatorio Es otra de las formas contractuales que ha adquirido cierta popularidad en nuestro pas a partir de hembras compradas en concursos o exposiciones y con ellas se procede a la comercializacin de uno o varios lavajes en forma equivalente a lo que ocurre con el semen congelado de toros.
Algunos aspectos del negocio de la TE La TE es clasificada en general en el rea de negocios conocidos como biotecnolgicos. La biotecnologa ha atrado en los ltimos aos la atencin de capitales de riesgo interesados en invertir en la misma. Sin embargo, a menudo la gente experimentada en biotecnologa no lo es en los negocios y a menudo es difcil unir un negocio seguro con un sistema biolgico como la TE. En consecuencia ha tomado mucho tiempo, trabajo y comisin de errores desarrollar el negocio de la TE. La demanda de la TE ya est establecida por lo que, como en todo negocio de riesgo, el profesional que entra en el mismo deber poner un precio en el servicio que proveer. Esto se logra por diferentes vas pero en todos los casos se debern considerar los costos fijos y los variables. Como en general los costos son altos y frecuentemente el negocio financiero es muy rentable, se deber tener en cuenta cul puede ser el futuro del negocio antes de introducir a alguien en el mismo con expectativas irreales. Los costos fijos, bsicamente la infraestructura y equipos, suelen ser altos y por lo tanto requieren una gran inversin inicial. Un centro de TE debe tener buena presentacin, estar ubicado en un lugar con clima favorable y de fcil acceso. Un laboratorio mvil es ms verstil pero sus costos de mantenimiento suelen ser muy altos. El rodeo de receptoras es una gran inversin con alto costo de mantenimiento y manejo as como un importante capital con gran proporcin de lucro cesante.
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Tambin el costo de mantenimiento de las donantes es alto y si bien su nmero es bajo, hay que considerar que el mantenimiento de vacas no recolectadas aumenta los costos por donante. El equipamiento mnimo necesario suele no ser de gran magnitud pero s de costo alto. Por el contrario, el material de consumo es importante en los costos tanto por su cantidad como por su precio ya que en gran parte es importado. Una vez establecidos los costos fijos y variables, el precio final del producto a vender ser determinado en funcin de su competitividad. La TE es un negocio donde cada da hay ms competencia y donde la calidad y precio del trabajo son elementos fundamentales para el logro de nuevos clientes. Estructura de costos y algunas formas de cobro del trabajo de TE (en dlares americanos) Costos 1 vaca (2 gestaciones) 10 70 20 70 30 200 4 vacas (8 gestaciones) 40 280 80 70 120 590
Prostaglandinas FSH Medios y material descartable Suplemento a personal y gastos de transporte Transferencia (4/donante) TOTAL
Estimando que en da de trabajo se pueden recolectar y congelar o transferir lo producido por 4 vacas, el costo por vaca recolectada variar entre 200 dlares (si se recolecta una) a alrededor de 74 dlares si se recolectan 4. Lo descrito es el costo de funcionamiento, pero no tiene en cuenta amortizacin de entrenamiento, equipos, etc. Esto deber evaluarlo el profesional. Cul es el precio de este servicio? Existen mltiples formas de arreglo para cobrar este tipo de trabajo, uno de los ms corrientes es el siguiente: 1 vaca 4 vacas Prima/gestacin* (2 gestaciones) (8 gestaciones) (100/gestacin) 200 800
* Esta prima en algunos casos puede elevarse hasta 200 o 300 dlares por gestacin. Sin embargo, el actual incremento de la oferta de profesionales capacitados en TE y la menor demanda pueden inducir acuerdos que bajan el nivel de la prima original. De acuerdo con esto, el lavaje de 4 donantes y la obtencin de 8 gestaciones se cobrara alrededor de 1400 dlares con un costo de 600 dlares. El resto (800 dlares) ser destinado a amortizacin, ganancia neta, etc. Una recoleccin con dos gestaciones obtenidas se cobraran 400 dlares con un costo de 200 dlares. Como se puede apreciar, se deber adecuar el tipo de cobro a cada situacin.
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Aplicaciones de la transferencia de embriones
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APLICACIONES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES G. Brem Introduccin Debido a las limitaciones biolgicas, los mtodos biotecnolgicos aplicados actualmente para incrementar la tasa reproductiva de la hembra no tienen el efecto multiplicador conocido en los animales machos. Mientras que es posible incrementar el nmero de la descendencia de un toro por el factor 1000 o an mayor a travs de la inseminacin artificial, en la hembra no siempre es posible aumentar siquiera por el factor 10 el nmero de terneros nacidos a travs de la transferencia de embriones. No obstante ello existe una serie interesante de aplicaciones de esta tcnica en la produccin e investigacin. Los aspectos ms importantes del aumento de la tasa reproductiva de la hembra bovina son los siguientes (BREM, 1986, 1990): 1. Aumento del progreso gentico en la produccin de leche y carne a travs del aumento de la intensidad de seleccin de las madres de toros. 2. Aumento del progreso gentico en rodeos cerrados de produccin de leche y carne. 3. Aumento de la eficiencia de los programas de ncleos de produccin (captulo XXII). 4. Rpida multiplicacin de razas o mutaciones exticas de valor productivo. 5. Aumento de la tasa de mellizos. 6. Rpidas y mejores posibilidades para llevar a cabo programas de cruzamiento con razas lecheras y carniceras. 7. Posibilidad de llevar a cabo la prueba de la descendencia de vacas y la prueba de hermanas enteras en las familias de las vacas. 8. Acortamiento del intervalo generacional. 9. Determinacin y control del sexo. 10. Estimacin del efecto materno. 11. Facilidad de la importacin y exportacin de material gentico. 12 Desarrollo de las condiciones adecuadas para otras tcnicas reproductivas en marco de la micromanipulacin de embriones. Particularmente el aspecto mencionado en el ltimo punto (12) ha ganado en los ltimos aos particular importancia. La divisin microquirrgica (captulo X), la produccin in vitro y el clonado de embriones (captulo XII) como as tambin la produccin de animales transgnicos le han dado a la transferencia de embriones una nueva dinmica. Por ello, en las siguientes descripciones de las diferentes aplicaciones de la TE convencional, no es siempre posible evitar algunas superposiciones con los captulos siguientes. Se presentarn adems algunas reas que, a travs de la manipulacin de los embriones, aumentan la eficiencia de la TE.
Aumento del progreso gentico en la produccin de leche y carne a travs del aumento de la intensidad de seleccin de las madres de toros Para la mayor parte de las razas bovinas productoras de leche existen programas de mejoramiento gentico por medio de la inseminacin artificial. En ellos, como p.e. en el programa de mejoramiento en Bavaria, los toros obtenidos de cruzas programadas son seleccionados a travs de 6 niveles. Posteriormente los reproductores probados, con una edad de 5 a 6 aos, estn disponibles para la inseminacin artificial (ver captulo XXII). En principio se puede afirmar que el xito adicional de la TE aplicada en programas de IA es ms reducido cuanto ms eficiente sea este ltimo, es decir cuanto mayor sea la intensidad de seleccin de las madres de toros. Por otro lado el empleo de la TE slo es recomendado en un estricto programa de seleccin. En programas de mejoramiento subptimos es
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conveniente aumentar el progreso gentico, en primer lugar a travs de una mejora de los programas convencionales de IA. La TE requiere altos capitales de inversin y tecnologa lo que la convierten en una tcnica ms costosa que un programa de mejoramiento por medio de IA. De la misma forma un programa de TE tendr xito slo si se establece un trabajo conjunto entre un equipo altamente calificado y productores informados e interesados en el progreso gentico del ganado. SKJERWOLD (1974) disminuy la tasa de reposicin de las madres de toros de 2% al 0,4% en un clculo modelo. A travs de la reduccin del nmero de madres de toros se increment 20% el xito de la seleccin sobre la lnea madre-hijo. Dado que la lnea madre-hijo participa en slo 1/4 del progreso gentico (G) total, el incremento de G es de slo 5%. En otro clculo LAND y HILL (1975) seleccionaron 1-1,3% de las vacas como madres de toros, en lugar del 2% original. De esta forma aumenta el progreso gentico sobre la lnea madre-hijo en una relacin 100:110:125, lo que representa un incremento del xito de la seleccin de 2,5 a 6%. Partiendo de una tasa de reposicin de 3% y aumentando la tasa de reproduccin por el valor 10, se incrementa 9% el G (CUNNINGHAM, 1976). En un modelo empleado en el estudio del efecto de la TE sobre el progreso gentico en un rodeo lechero PIRCHNER y DEMPFLE (1977) evaluaron entre otros factores las siguientes variantes: 1. Aumento anual de la tasa reproductiva a 4 y 80 veces por medio de TE. 2. Aplicacin de TE solamente en madres de toros o en la poblacin total. Los resultados de ese modelo de clculo se resumen en la tabla 1. A travs de la aplicacin de la lnea madre-hijo es posible incrementar el progreso gentico entre 5 y 10%, con la produccin complementaria de 4 a 8 terneros ms por ao y vaca. con la transferencia de 80 embriones por vaca donante aumentara 17% la eficiencia de la seleccin. La experiencia prctica indica, sin embargo, que no es posible alcanzar un aumento de la tasa reproductiva de esa magnitud. Tabla 1: Progreso gentico de la produccin de leche (PIRCHNER y DEMPFLE, 1977) h2= 0,25 Edad a la primera paricin = 2,5 aos N de hijas/toro = 50 1/3 de las vacas se insemina con toros en prueba Toros: Toros de toros reposicin Vacas de toros " Re % 80 A1 A2 B1 B2 80 80 20 1 i 0,35 0,35 0,35 1,4 2,66 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 t 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 5%; i= 2,06; = 0,88; t= 7 aos 20%; i= 0,93; = 0,88; t= 5,3 aos Re % 3 0,75 0,04 0,75 0,04 i 2,27 2,76 3,61 2,76 3,61 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 t 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 G t A 0,185 0,196 0,196 0,221 0,271 aumento % 6 17 19 46
A1 = Aplicacin en ncleos de produccin, 4 embriones transferidos con xito. A2 = " " " , 80 embriones transferidos con xito. B1 = " en la poblacin, 4 embriones transferidos con xito. B1 = " " , 80 embriones transferidos con xito. Re% = tasa de reposicin i = intensidad de la seleccin = exactitud de la estimacin del valor gentico.
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t = intervalo generacional A= desviacin standard gentica aditiva G= progreso gentico El incremento del progreso gentico por ao depende de la tasa reproductiva y de la exactitud de la estimacin del valor gentico. Para los modelos de clculo en las tablas 2 y 3 (BREM, 1979) se establecieron los siguientes valores iniciales: VIA PT MT PV MV 0,88 0,5 0,88 0,5 i 2,06 2,27 0,93 0,35 t 7,0 5,0 5,3 4,0
PT: padres de toros; MT: madres de toros; PV: padres de vacas; MV: madres de vacas En la tabla 2 se resumen los valores absolutos y relativos para el incremento del progreso gentico por ao y desviacin estndar. Se observa que la influencia del aumento de la tasa reproductiva es mayor cuanto mayor sea la tasa de reposicin en la poblacin inicial. Si se selecciona 2% de las vacas como madres de toros y se aumenta 8 veces la tasa reproductiva el aumento del progreso gentico, para una exactitud de la estimacin del valor gentico de 0,5, ser de 9%. Si por el contrario se seleccionan 15% de las vacas, la aplicacin de TE permitir un aumento de 12%. Si la exactitud original de la estimacin del valor gentico es de 0,3 el aumento oscilar en ambos casos entre 6 y 8%. El intervalo generacional puede ser acortado mediante el empleo de la TE, porque de las madres de toros seleccionadas ser posible obtener con seguridad un ternero macho por ao. Con una tasa de reposicin de 2% y una reproduccin aumentada 8 veces (con rIA= 0,5) el progreso gentico puede ser mayor de 14% a travs de la reduccin del intervalo generacional de las madres de toros de 5 a 4 aos (tabla 3). A travs de la aplicacin de la transferencia de embriones en rodeos aislados se influye la lnea madre-hija. CUNNINGHAM (1976) compar la superioridad gentica de la descendencia en sistemas convencionales y de transferencia de embriones. Si se emplea 59% de las vacas para la produccin de hembras reproductoras la descendencia alcanzar una superioridad de 2,2% despus de la seleccin por produccin de leche. Con un nmero de la descendencia de 2 a 10 veces superior por vaca puede aumentar la superioridad gentica a 3,8 y 6,1%. Si se llevara a cabo TE en toda la poblacin (tabla 1) el progreso gentico aumentara 20% con un incremento de la tasa reproductiva por el factor 4. Con una descendencia de 80 animales por vaca el progreso gentico podra aumentar 46% (PIRCHNER y DEMPFLE, 1977).
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Tabla 2: Aumento del progreso gentico a travs del incremento de la tasa reproductiva de la lnea madre-hijo aplicando la TE en dependencia de la exactitud de la estimacin del valor gentico (rIA) y de la tasa de reposicin de la poblacin inicial (TR) Ternero / vaca / ao TR % 1 rIA 0,3 0,4 0,5 0,4 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,5 abs. 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,16 0,17 0,15 0,16 0,17 0,15 0,17 0,17 0,15 0,15 0,16 1 abs. 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,16 0,18 0,19 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,17 0,16 0,16 0,17 % 2 2 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 4 3 3 4 3 3 4 3 4 5 3 4 5 4 5 6 abs. 0,17 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,21 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,16 0,18 0,19 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 2 % 4 4 5 4 5 6 4 5 6 4 6 7 4 5 6 5 6 7 5 7 8 6 7 9 6 8 9 7 9 11 abs. 0,18 0,19 0,21 0,17 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,20 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,16 0,18 0,19 0,16 0,17 0,18 4 % 5 7 8 6 7 8 6 8 9 6 8 9 7 8 10 7 9 10 7 9 11 8 10 12 9 11 13 10 12 15
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Tabla 3: Aumento del progreso gentico a travs del incremento de la tasa reproductiva y disminucin del intervalo generacional en la lnea madres de toros de 5 a 4 aos Terneros / vaca / ao TR % 1 rIA 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,5 abs. 0,18 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,17 0,15 0,16 0,17 % 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 abs. 0,18 0,19 0,21 0,18 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,20 0,17 0,18 0,20 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 1 % 7 7 8 7 8 8 7 8 8 7 8 8 7 8 9 8 8 9 8 9 9 8 9 10 8 9 10 9 10 11 abs. 0,18 0,20 0,21 0,18 0,19 0,21 0,18 0,19 0,20 0,18 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,20 0,17 0,18 0,19 0,17 0,18 0,19 0,17 0,17 0,18 2 % 9 10 10 9 10 11 9 10 11 10 11 12 9 10 11 10 11 13 10 12 13 11 13 14 11 13 15 12 14 16 abs. 0,19 0,20 0,22 0,18 0,20 0,21 0,18 0,20 0,21 0,18 0,19 0,21 0,18 0,19 0,21 0,18 0,19 0,20 0,18 0,19 0,20 0,17 0,19 0,20 0,17 0,18 0,20 0,17 0,18 0,19 4 % 10 12 13 11 12 14 11 13 14 12 13 15 12 14 15 12 14 16 13 15 17 13 16 18 14 17 19 15 18 21
10 15
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KRULICH (1978) caracteriz la futura aplicacin tcnico-productiva de la TE en un rodeo de 100 vacas, bajo las premisas que la tasa de preez de la transferencia no quirrgica sea de 50%, que se transfieran 4 embriones/donante y se practique el sexado. Las 20 donantes sern inseminadas con toros elite de la misma raza, 2/3 de de las restantes inseminaciones se har con toros de razas productoras de carne. La relacin del sexo ser 1:0,89, nacern 18% ms de terneros. Como progreso gentico adicional se espera una produccin de 40-50 kg de leche.
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Mejoramiento del rendimiento lechero y de produccin de carne La razas de doble propsito son seleccionadas segn sus caractersticas productoras para leche y carne. El xito de la seleccin por cada caracterstica es menor que en los casos de seleccin de razas de un solo propsito productivo. KRULICH (1976) estim el progreso gentico anual para un programa convencional de TE. El porcentaje de reposicin de las madres de toros en los sistemas convencionales es de 1,3%, en el modelo de TE 0,2%. En el clculo son tenidos en cuenta los siguientes valores: h2 leche= 0,25; h2 pdf= 0,40; P leche= 700 kg; pc= 45 kg. En un esquema de seleccin, en el cual se selecciona mediante la prueba de produccin propia en una relacin 1:5, el programa de TE permite un progreso gentico adicional de 5,5 kg/ao de leche y 0,23 kg/ao en peso de faena (pdf). El mejoramiento relativo es de aproximadamente 14% frente a un programa convencional. PIRCHNER y DEMPFLE (1977) estimaron que sera posible alcanzar aumentos del 5%, considerando una caracterstica para leche y una para carne de igual significado. El clculo de las tablas 2 y 3 se basa en los mismos parmetros de una poblacin. La transferencia se aplicar slo en las madres de toros y por lavaje se transferirn 4 embriones. Con la extensin a la poblacin total se esperan aumentos del 20%. Mejoramiento del rendimiento de produccin de carne SKJERVOLD (1974) estudi la aplicacin de la prueba de la descendencia en razas productoras de carne. Las terneras deben ser seleccionadas despus de la prueba de campo, de manera tal que se incorporar 1/3 de las donantes al programa. La calidad de la res se estimar a travs de la faena de la descendencia. Dado que la descendencia se faenar al ao de edad, el intervalo generacional de los padres se prolongar slo un poco. De esta forma es posible un incremento del xito de la seleccin entre 20 y 25%. Los efectos de la seleccin, en un programa de TE, segn el rendimiento propio antes de la edad reproductiva fueron destacados por HILL y LAND (1975). Al ao de edad las terneras sern seleccionadas, superovuladas, inseminadas con toros jvenes y los embriones obtenidos sern transferidos a receptoras. El intervalo generacional es de 2-2,5 aos. El progreso gentico estimado en peso a los 400 das aumentar de 9 a 16 kg/ao. PIRCHNER y DEMPFLE (1977) estimaron el progreso gentico en un rodeo bovino productor de carne de 2 000 cabezas, cuando toda la descendencia es evaluada en su crecimiento (test de rendimiento propio). Con una heredabilidad de 0,36, la primera paricin a los 2 aos y un porcentaje de reposicin de toros del 0,5% se obtendr un aumento del progreso gentico en produccin de carne del 33%, disminuyendo el porcentaje de reposicin al 66% por medio de TE.
Aumento de la tasa de mellizos Transferencia de dos embriones La transferencia de 2 embriones en un cuerno uterino permite alcanzar una elevada tasa de preez pero un reducido porcentaje de mellizos. ROWSON y col. (1971) compararon los resultados obtenidos despus de la transferencia de 2 embriones en uno o ambos cuernos uterinos. Los grupos contaban con 11 vaquillonas. Despus de la transferencia de 2 embriones en un cuerno uterino la tasa de preez, determinada a la faena (60 dias), fue de 73% pero slo 45% de los animales tenan mellizos. La tasa de gestacin de los animales faenados a los 90 das, fue de 72% cuando los 2 embriones fueron transferidos en ambos cuernos y la de preeces melliceras 73%. SREENAN y col. (1975) informa-ron sobre una tasa de preez de 82% en
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un grupo de 72 receptoras luego de la transferencia quirrgica y bilateral de 2 embriones. De las receptoras preadas se detect 74% de gestaciones melliceras. La sobrevivencia de los embriones transferidos fue de 71%. En promedio se obtienen 77% de preez, de las vacas preadas 67% presentan gestaciones melliceras y 65% de los embriones transferidos sobreviven. Con la transferencia de 2 embriones en un cuerno uterino se observan menores tasas de gestaciones dobles (ROWSON y col., 1971).
Aumento de la frecuencia de partos melliceros de origen gentico La tasa de partos melliceros tiene una heredabilidad muy baja de 4% y una repetibilidad de 6%. A travs de laparoscopia deben ser observadas las ovulaciones espontneas de aquellos animales que parieron mellizos. Los animales con varias ovulaciones dobles son incorporados al programa de TE. Si la tasa de mellizos en la poblacin es de 4%, es posible, segn las estimaciones de LAND y HILL (1975), aumentar ese valor en 0,5% anualmente por medio de la TE. Si se alcanza en la poblacin una tasa de mellizos de 16%, aumentar la frecuencia en algo ms de 1% aplicando la TE. Resumiendo es posible afirmar, desde el punto de vista de la intensidad de seleccin como as tambin de otras consideraciones productivas, que la transferencia de embriones ofrece una buena posibilidad de alcanzar objetivos productivos determinados con mayor rapidez que con la inseminacin artificial. Una condicin para ello es que se lleven a cabo estudios para la optimizacin de la produccin y estructura de la poblacin, a fin de establecer una base slida para la aplicacin de la TE. De la misma forma debe garantizarse un exitoso programa tcnico de TE, a fin de llevar a cabo los objetivos genticos propuestos.
Rpida reproduccin de individuos y razas exticos Muchas poblaciones bovinas no son originarias de las zonas que actualmente habitan. La migracin es un factor de gran importancia en los cambios de la composicin gentica de las poblaciones. Ello se refleja con claridad en el siguiente ejemplo: En el siglo pasado se exportaron animales de las razas Schwarzbunte y Braunvieh de Europa a Estados Unidos, donde fueron sometidos a una intensa seleccin para produccin de leche. Durante los ltimos 20 aos animales de las razas HolsteinFriesian y Brown-Swiss fueron reimportados a Europa e incorporados a las poblaciones. Mientras en el siglo pasado la exportacin se llev a cabo con animales, la reimportacin del material gentico se cumpli al principio y en gran medida con semen congelado. Hace algunos aos se importan tambin embriones congelados. Las razas, denominadas exticas en EE.UU., Simmental y Charolais fueron consideradas interesantes en Norteamrica para la produccin de carne en las dcadas del 60 y 70. La reducida cantidad de animales disponibles y las serias limitaciones sanitarias para la importacin de ms animales condujo a la reproduccin de los mismos por medio de la transferencia de embriones. La aplicacin de la TE en esa rea obviamente contribuy con el surgimiento biotecnolgico de esta tcnica. Su uso con fines productivos se cumpli recin en una segunda fase de su aplicacin, despus que la reproduccin de las razas exticas haba alcanzado dimensiones poblacionales suficientes como para desistir de la TE. El costo de la comercializacin internacional de reproductores es en general muy elevado y con frecuencia difcil de llevar a cabo como consecuencia de las estrictas medidas sanitarias de importacin. En ese sentido la transferencia de embriones cobra particular importancia al aumentar el nmero de la descendencia de animales de alto valor gentico ya existentes. De esta forma es posible, segn CUNNINGHAM (1976) incrementar 500% la tasa reproductiva de un animal importado. Otra rea interesante para la aplicacin de la TE la constituyen individuos de importancia gentica particular, como por ejemplo los animales sin cuernos. HAUSSMANN (1978) desarroll una ecuacin, con la cual es posible calcular el nmero de descendientes a obtener de una donante con la aplicacin de la superovulacin (tabla 4).
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Nj = a (v . g . q)j/T Nj = donantes por ao j a = nmero de donantes hembras v = terneros/donante g = relacin de sexos (normalmente 50:50) j = aos desde el comienzo del programa T = intervalo generacional Considerando que actualmente la exportacin de material gentico se lleva a cabo en gran medida con embriones congelados y no exclusivamente con semen, se presenta la excelente posibilidad de reproducir los animales importados como embriones, renunciando as a una permanente importacin. Como la experiencia lo demuestra esta alternativa constituye una importante aplicacin de la transferencia de embriones. Reproduccin de una hembra por medio de la transferencia de embriones en funcin del nmero de descendientes hembra por donante (HAUSMAN, 1978) Embriones /donante Aos 4 8 12 4 16 64 2 3 Animales/donante 25 625 15 625 100 10 000 1 000 000 10
Tabla 4:
Bibliografa BREM, G. 1986. Mikromanipulation an Rinderembryonen und deren Anwendungs-mglichkeiten in der Tierzucht, 1-208. Ferdinand Enke Verlag Stuttgart. BREM, G. 1990. Micromanipulacin en embriones bovinos y sus posibles aplicaciones en produccin animal, 1181. Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aires, Argentina. CUNNINGHAM, E.P. 1976. The use of egg transfer techniques in genetic improvement. Agricultural Research Seminar: Egg transfer in cattle, 345-353. Jansen, EUR 5491, Luxembourg. HAUSSMANN, H. 1978. Verbreitung seltener Anlagen oder seltener Populationen mit Hilfe des Embryotransfers. DGfZ-Ausschu f. genet.-statist. Methoden in der Tierzucht, Husum, Polykopie. HILL, W.G. and LAND, R.B. 1976. Superovulation and egg transplantation in A.I breeding programmes for dual purpose cattle. Agricultural Research Seminar: Egg transfer in cattle, 333-342. Jonsson, EUR 5491, Luxembourg. KRULICH, H. 1978. Produktionstechnische Auswirkungen des Embryotransfers. DGfZ-Ausschu fr genet.statist. Methoden in der Tierzucht, Aachen, Polykopie. LAND, R.B. and HILL, W.G. 1975. The possible use of superovulation and embryotransfer in cattle to increase response to selection. Anim. Prod. 21:1-12. PIRCHNER, F. und DEMPFLE, L. 1977. Zchterische Auswirkungen des Embryotransfers. DGfZ-Ausschu fr genet.-statist.Methoden in der Tierzucht, Aachen, Polykopie. ROWSON, L.E.A., R.A.S. LAWSON and MOOR, R.M. 1971. Production of twins in cattle by egg transfer. J. Repr. Fert., 25: 261-268. SKJERVOLD, H. 1974. Breeding aspects in case of practical application of egg transplantation. Report No. 75 des SHS, Aallsta, 87-102. Sweden.
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APLICACIONES DE LA PRODUCCION IN VITRO DE EMBRIONES G. Brem Introduccin Para la produccin in vitro de embriones (PIV) existe una serie de aplicaciones que corresponden en parte a aquellas de la transferencia de embriones, como por ejemplo su empleo en la reproduccin de razas en peligro de extincin, de genotipos exticos o en el aumento del nmero de terneros en un rodeo. Por otra parte la PIV tiene aplicaciones que son particulares de ese mtodo biotecnolgico. Un ejemplo de ello es la produccin de terneros a partir de animales faenados y sometidos a pruebas de rendimiento propio. En el presente captulo se presentar un panorama de las principales aplicaciones de la PIV de embriones bovinos desde el punto de vista productivo y tcnico. Generalmente los programas de PIV pueden dividirse en proyectos de acuerdo al origen de los ovarios y de los ovocitos. En ellos se pueden desarrollar los trabajos con un pool de ovarios de terneras o vacas. En otros casos se pueden seleccionar determinadas hembras, las cuales en forma individual o en determinados grupos son consideradas para un programa de PIV despus de la faena.
Produccin in vitro de embriones en programas de investigacin y como tcnicas reproductivas Para el estudio de los fenmenos vinculados con el desarrollo de estadios embrionarios tempranos es necesario en la regla un gran nmero (p.e.: el desarrollo de una biblioteca de ADN) de embriones desarrollados en forma sincrnica. Para cumplir con esos objetivos se presentan, particularmente en la especie bovina, dos problemas: es extremadamente dificultoso (en promedio slo 8 embriones/ donante) recolectar esos estadios (a travs del lavaje de oviducto o despus de la matanza) de la donante. En segundo lugar debe esperarse una divergencia del estadio de los embriones de hasta 24h, en funcin del momento de la fecundacin. La PIV tiene la ventaja de producir embriones en un nmero suficientemente grande y sincrnico en el desarrollo. Es posible, adems, llevar a cabo estudios con los ovocitos recolectados durante la maduracin y la fertilizacin. Para llevar a cabo los mtodos de clonado y la transferencia de genes en el bovino se requiere de un gran nmero de ovocitos, cigotos y en parte tambin embriones. Su realizacin con embriones recolectados in vivo sera dificultosa e imposible de continuar a largo plazo. La PIV constituye el mtodo de eleccin, demostrado en las primeras experiencias en la produccin de animales clonados y transgnicos. Los resultados obtenidos con esos programas son an insatisfactorios, sin embargo constituyen una buena alternativa, comparada con la aplicacin de embriones obtenidos in vivo. En los programas de investigacin y manipulacin mencionados se puede emplear en la regla un pool no seleccionado de ovarios. Los embriones, donantes de blastmeros, requeridos para un programa de clonado constituyen una excepcin. De la misma forma puede ser necesario en un programa de transferencia gnica, dependiendo de la estructura gnica a transferir (captulo XIII), emplear animales de razas lecheras o con una constelacin gentica especial.
Vacas de inters productivo como donantes de ovocitos Al contrario de la recoleccin de ovocitos de un pool de ovarios para diversos programas, obtener ovocitos de una vaca es interesante desde el punto de vista productivo. Particularmente animales con una larga y eficiente vida productiva constituyen un potencial prometedor para la PIV. A pesar que esas vacas tienen ms descendencia que la media de la poblacin, persiste an una gran demanda por sus descendientes. Esas vacas, de acuerdo a la experiencia, no responden satisfactoriamente a un programa de superovulacin como los animales jvenes, de forma tal que un programa de TE no brinda
Aplicaciones de la produccin in vitro de embriones
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el xito esperado. En el momento de la faena o la matanza de esos animales la PIV ofrece la ltima posibilidad de aprovechar su potencial gentico. Como demostracin del significado que puede tener ese programa es interesante el ejemplo de la raza Holstein-Friesian alemana (HFa). De las 23 000 vacas elite hay ms de 120 que tienen un rendimiento en su vida de 100 000 kg de leche. En promedio se faenan alrededor de 5000 vacas por ao. Con un empleo consecuente de la PIV podran producirse anualmente 10 000 terneros adicionales con muy buenos valores productivos estimados. Ello sera especialmente interesante por que adems se necesitara menos semen por embrin producido comparado al requerido en el servicio con IA. Las porciones de semen de toros HFa se disponen en general en cantidades insuficientes y son adems caras. En muchos casos el uso eficiente del semen cubre los costos del programa de PIV e incluso posiblemente de la transferencia de los embriones producidos. En una segunda etapa se podra extender la PIV a toda la poblacin Herdbook (HB). Si se eligen para el programa de PIV 50 000 vacas HB, lo que constituye 30% de las vacas faenadas, se podran producir alrededor de 100 000 terneros. Esos terneros podran reemplazar a los animales descendientes de animales de bajo valor productivo y aumentar de esa forma el progreso gentico de la poblacin. Desde el punto de vista reproductivo la consecuencia sera que alrededor de 10% de las inseminaciones seran reemplazadas con la transferencia de embriones producidos in vitro. Genticamente el empleo de las vacas HB en la PIV significara una mejora del progreso gentico sobre la lnea madre-hija (captulo XXI). Convencional: tasa de reposicin madre de vaca= 80% => i= 0,35 rIA = 0,5 G = .35. .5 sA = .175 sA madre de vaca= 60% => i = 0,64 rIA = 0,5 G = .64 . .5 . sA = .32 sA
PIV:
tasa de reposicin
Segn ello el aumento del progreso gentico sobre la lnea madre-hija sera del 83%. A pesar que la lnea madre-hija contribuye solamente en un 10% del progreso gentico total, la casi duplicacin del G sobre esa lnea es ventajosa porque aumentara el significado de la lnea ms dbil en el mejoramiento gentico. A travs del empleo ms intensivo de las vacas del Herdbook es de esperar, adems, ventajas adicionales en los componentes maternos.
Produccin in vitro de embriones de razas bovinas en peligro de extincin La formacin de reservas genticas de razas en peligro de extincin gana creciente significado. Existen estimaciones que de las 500 razas que existen en la actualidad slo 20 mantendrn significado en la produccin a fines de este siglo. Sin embargo existen esfuerzos por evitar la prdida total del potencial gentico de esas razas a travs de la congelacin y conservacin de semen y embriones. En ese sentido la PIV de embriones es particularmente interesante porque las pocas hembras an existentes son relativamente viejas y no pueden ser incluidas en un programa de transferencia de embriones o lo son sin xito. Nosotros hemos observado en vacas viejas que los ovarios carecan de folculos, lo que haca imposible el programa de PIV. En la mayora de las vacas es posible obtener los ovocitos, producir embriones, congelarlos y conservarlos en nitrgeno lquido durante dcadas. En el momento de reestablecer la raza en peligro de extincin o para superar las depresiones consanguneas los embriones producidos pueden ser descongelados e incorporados en la pequea poblacin existente.
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Terneras o fetos como donantes de ovocitos Tambin de los ovarios de terneras y fetos pueden obtenerse ovocitos para la PIV. A pesar que el nmero de folculos existentes es mayor que en ovarios de vacas adultas, la produccin de embriones de terneras es menor, como consecuencia de la menor tasa de desarrollo de los ovocitos (ver captulo XI). A pesar de ello la PIV es posible y encuentra aplicacin en algunas reas especficas. Un aspecto de importancia es el acortamiento del intervalo generacional. Ello sera interesante cuando la obtencin de los ovocitos de esas terneras sea repetible. Hasta el momento existe informacin insuficiente sobre ese aspecto. La PIV de embriones de terneras, despus del sacrificio en el matadero, puede ser interesante tambin bajo determinadas condiciones. Por ejemplo cuando es necesaria una determinada constelacin gentica, diagnosticable genticamente y que puede ser producida a travs de la recombinacin de la meiosis. Como ejemplo se encuentran haplotipos MHC o individuos homocigotas sin cuernos. Si la ternera no representa el genotipo deseado, puede provocarse 4 meses despus la siguiente ronda recombinante por medio de la PIV. El intervalo generacional puede acortarse de esta manera de 3 a 1,1 aos. Ello aumentar las posibilidades de seleccionar el genotipo deseado. Los animales producidos sern recriados, destinados a otras pruebas o a la produccin. Otra alternativa de aplicacin es la de terneros de engorde. En Bavaria la carne de ternero se produce a partir de las terneras, dado que los machos son engordados como toros. Las terneras alcanzan 170 kg a los 4 meses. Si se logra producir 4 embriones y con ello 2 terneros con la aplicacin de la PIV, sera posible alcanzar un 50% de reposicin. La seleccin posibilitada de esta forma (tabla 1) podra concentrarse en parmetros de rendimiento crneo como engorde diario o cualidades a la faena (p.e.: componente crneo, partes de valor carnicero, etc.). Como ejemplo de la ganancia diaria el progreso gentico podra corresponder a 25 g por ao (G= 0,8 . 0,7 . 50 g/1.1 = 25 g). Produccin de razas productoras de carne en rodeos lecheros La produccin in vitro y la transferencia de embriones de razas productoras de carne o de doble propsito a vacas lecheras, no afectadas a la reposicin, es una alternativa ms de la aplicacin de la PIV. Esa alternativa es interesante econmicamente cuando existe una mayor diferencia entre el valor de los terneros de las donantes y las receptoras frente a los costos producidos por la PIV y la transferencia. Una condicin importante es que la obtencin se lleve a cabo sin problemas, esto es, que se disponga en el matadero de un nmero suficiente de hembras.
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Tabla 1: Intensidad de seleccin en funcin del nmero de animales seleccionados Animales seleccionados (%) 80 60 40 20 10 5 3 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0,1 0,01 G = rAI . i . sA G= Progreso gentico rIA= Exactitud de la estimacin del valor gentico i = Intensidad de seleccin SA = Desviacin estndar gentica aditiva Un efecto positivo de la produccin de embriones de razas crneas en vientres de vacas lecheras se produce cuando se emplea semen de toros seleccionados por sus atributos en su rendimiento crneo, ganancia de peso o facilidad de parto. Con ello se posibilita tambin obtener rendimientos ptimos con toros puros o con embriones cruzas, como consecuencia del efecto de heterosis. A travs de la transferencia bilateral de los embriones a una receptora se posibilita adems aumentar hasta 40% el nmero de terneros por vaca. Ello podra ser otra razn para aplicar la PIV en razas crneas. Adems de la transferencia bilateral es posible aumentar la tasa de mellizos hasta 50% mediante la transferencia contra lateral de embriones a vacas servidas o inseminadas. La aplicacin de la PIV es simple y econmicamente aceptable si la transferencia de embriones congelados/descongelados tiene valores de sobrevivencia de 50% aproximadamente. De esta forma ser posible conservar los embriones en el contenedor de nitrgeno lquido y transferirlos dentro de los programas de rutina sobre celo inducido o natural. Los costos del ternero producido corresponderan al 20% del precio de venta. La PIV de embriones constituye un mtodo biotecnolgico prometedor en el aumento de la eficiencia de la produccin bovina intensiva. Intensidad de seleccin i 0,35 0,64 0,97 1,4 1,76 2,06 2,27 2,67 2,74 2,83 3,96 3,17 3,37 3,96
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Prueba de rendimiento a la faena y de los parmetros de calidad de carne Un aspecto especialmente innovador de la PIV de embriones lo constituye la particularidad de la obtencin de ovocitos que los animales pueden ser selecciona-dos despus de la faena segn sus particularidades crneas. En programas convencionales de seleccin esas caractersticas pueden evaluarse mediante engorrosas pruebas de progenie. Esas pruebas de la descendencia pueden llevarse a cabo slo en una parte de los toros. Para un programa de IVP es posible emplear semen de toros que cuenten con buenos valores en esas particularidades. En los toros jvenes es posible llevar a cabo una prueba de rendimiento a la faena despus del perodo de recoleccin de semen. La condicin para una consecuente prueba de rendimiento propio de las vacas faenadas es que se puedan tomar datos fehacientes a la faena como tambin identificar los ovarios en forma individual. A partir de los datos del matadero deber ser posible la toma de una decisin selectiva y llevar a cabo la PIV. A partir de algunos clculos se demostrar qu progreso gentico anual es posible alcanzar (desviaciones estndar) con este mtodo en funcin del porcentaje de animales seleccionados y de la heredabilidad (tabla 2). Los valores de la tabla 2 tienen validez slo si toda la descendencia en el rodeo es producida de esa forma. Si slo se incluye una parte de la poblacin, el progreso gentico corresponder slo a esa parte de la poblacin o a los terneros originarios de ese programa. Para determinar el progreso gentico en toda la poblacin se deber considerar qu porcentaje de la descendencia total tiene origen en ese programa y el progreso gentico de los parmetros correspondientes en la descendencia originaria de un programa convencional. Tabla 2: Progreso gentico anual (en desviaciones estndar sA) en funcin del porcentaje de las vacas seleccionadas mediante prueba de rendimiento propio y de la heredabilidad (h2) Vacas faenadas seleccionadas (%) Intensidad de seleccin ik h2 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 .14 .17 .20 .22 .25 .27 .28 .30 .17 .20 .23 .26 .29 .31 .33 .35 .18 .22 .25 .28 .31 .33 .36 .38 .19 .24 .27 .30 .33 .36 .39 .41 .23 .28 .32 .36 .39 .43 .46 .48 .26 .31 .36 .41 .45 .48 .51 .55 .28 .34 .40 .44 .49 .53 .56 .60 80 .35 60 .64 50 .8 40 .97 20 1.4 10 2.06 5 2.06
TB = 2,5 aos; TK = 3 aos; iB = 1.4; Fertilidad 100% (iB + iK) . h G -------------------. sA = T b + TK

(1,4 + iK) . h -------------------------- . sA 5,5

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Dado que las caractersticas corporales a la faena tienen una heredabilidad e importancia econmica altas, es de esperar que este programa pueda llevarse a cabo exitosamente. Las caractersticas de calidad de la carne que generalmente tambin encuentran consideracin tienen la dificultad que hasta el momento no se dispone en el lugar de mtodos simples, rpidos y valederos de evaluacin. En la eleccin de las caractersticas a seleccionar debe evaluarse detalladamente qu parmetros sern considerados. La consideracin simultnea de varias caractersticas determina, por un lado, un trabajo ms complejo en la seleccin de las vacas en el matadero. Por el otro, naturalmente un reducido progreso gentico de las caractersticas individuales. Cuando las correlaciones entre las caractersticas son suficientemente positivas y altas, se llegar a un considerable mejoramiento correlacionado con la seleccin de una caracterstica. Por ltimo debe acentuarse una vez ms que a travs de la combinacin de la seleccin de vacas faenadas y posterior produccin in vitro de embriones, se cuenta por primera vez con un mtodo aplicable en la prctica para alcanzar el mejoramiento gentico de las caractersticas a la faena de la hembra bovina. Ello cobra particular importancia en los tiempos actuales, en los que se le atribuye a la calidad de los productos una importancia creciente. Un significativo progreso, alcanzable a travs de la aplicacin de nuevas biotecnologas.
Obtencin de los ovocitos de animales vivos La puncin de ovarios de animales vivos constituye una continuacin prometedora del desarrollo y aplicacin de la PIV. A travs de las tcnicas de ultrasonido es posible puncionar los folculos y obtener los ovocitos en forma repetida, lo que posibilita aumentar el nmero de ovocitos recolectados. En el caso de que esa forma de recoleccin de ovocitos continuada se pueda llevar a cabo y que se puedan producir embriones con la misma eficiencia que con ovarios de animales sacrificados, podra esperarse en teora la produccin de 100 embriones transferibles por vaca y ao. Ello aportara una considerable mejora de la aplicacin de la TE porque aumentara el nmero de la descendencia y disminuira la tasa de descarte de los animales seleccionados. La aplicacin consecuente de la PIV de embriones con los ovocitos obtenidos de animales vivos puede constituir una alternativa de los programas de superovulacin en el mediano y largo plazo. La ventaja de esa tcnica es que permitira obtener ovocitos de vacas de alto valor gentico, que no responden a los tratamientos hormonales de los programas de TE. El nmero de embriones por donante y ao puede aumentar e incluso sera posible continuar el programa de PIV en animales preados sin peligro de afectar la continuidad de la gestacin. Condiciones para ello son la optimizacin de la eficiencia de las tcnicas de recoleccin, un nmero suficiente de ovocitos vitales en condiciones de madurar y ser fertilizados con una metodologa econmica.
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Aplicaciones de los mellizos homocigotas y clones
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APLICACIONES DE LA PRODUCCION DE MELLIZOS IDENTICOS Y DEL CLONADO DE EMBRIONES G. Brem & A. Clement-Sengewald Introduccin Las aplicaciones de los mellizos idnticos y los hermanos clones, como productos de la microciruga han dejado de ser slo modelos de investigacin y encuentran en la actualidad aplicacin en los programas de produccin por medio de la IA y en ncleos de produccin. La divisin microquirrgica de los embriones es una tcnica menos compleja que el clonado. Los embriones a dividir son recolectados por mtodos no quirrgicos. Luego de la micromanipulacin las mitades obtenidas son transferidas a las vacas receptoras (cap. X). El clonado requiere, por el contrario, la obtencin de ovocitos madurados in vivo, mediante lavaje o castracin, o in vitro a partir de ovarios obtenidos del matadero. Los embriones en estadio unicelular demandan el cultivo temporal antes de su transferencia definitiva, ya sea in vivo o in vitro. Por esas razones el clonado de embriones se lleva a cabo en pocos laboratorios especializa-dos y equipados para ello. En este captulo se describirn las consecuencias genticas que tiene el espectro de aplicaciones de la produccin de mellizos homocigotas (cuadro 1) y de terneros a partir de embriones clonados (cuadro 2). Cuadro 1: Aplicaciones de la divisin de embriones Investigacin bsica: Estudio del efecto materno durante la gestacin Estudio de los efectos genticos y ambientales sobre el fenotipo
Produccin animal: Aumento del nmero de terneros por vaca donante Disminucin de los costos en un programa de TE Reduccin del nmero de toros en espera Aumento de la eficacia en la formacin de reservas genmicas Aumento del progreso gentico
Cuadro 2:
Aplicaciones del clonado en produccin animal
Investigacin bsica: Estudio de la interaccin ncleo-citoplasma Delimitacin de la (de) diferenciacin del ncleo celular
Produccin animal Limitacin de la variabilidad gentica Estudio de las influencias genticas y ambientales en el animal Disminucin del nmero de animales de experimentacin Aceleracin del progreso gentico Seleccin del sexo
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Brem & Clement-Sengewald
Investigacin bsica El empleo de animales genticamente idnticos conduce, en experimentos que no son repetidos, a una consecuente disminucin de la varianza. Con la distribucin de animales idnticos en diferentes alternativas de tratamientos, el efecto de los mismos es posible de medir con mayor exactitud que con el empleo convencional de animales experimentales. Esa superioridad de los mellizos idnticos puede definirse como el "valor de la eficiencia de los mellizos" (VEM). El mismo establece cuntos animales, en cada uno de los 2 grupos estudiados, pueden reemplazarse por mellizos idnticos sin que el ensayo pierda su validez estadstica. La eficacia de los experimentos con mellizos idnticos o clones es mayor an con el aumento de la heredabilidad. Una ventaja particular del empleo de animales idnticos producidos por medio de microciruga la constituye el hecho que ya se pueden llevar a cabo estudios durante la gestacin, la perinatalidad y en las primeras semanas de cra. Los animales genticamente idnticos son adecuados tambin para el estudio de la interaccin genotipo-ambiente. Los genotipos idnticos pueden ser distribuidos en diferentes ambientes y al mismo tiempo es posible alcanzar en cada grupo, una divisin de los componentes de la varianza, por medio de los valores de medicin y de la varianza dentro de los clones. La distribucin de clones de razas europeas en regiones tropicales y subtropicales son un ejemplo de tales estudios. A travs de los mismos es posible establecer si los valores de rendimiento son los mismos para condiciones extremas o si deben establecerse nuevos criterios de seleccin para la eleccin de los reproductores ms adecuados. Otro componente de investigacin es la interaccin genotipo-ao, a travs de la conservacin y la transferencia distribuida en el tiempo de embriones divididos o clonados. Con un empleo consecuente de este mtodo es posible tambin establecer valores genticos estimativos de G. Los animales originados de la microciruga y transferencia nuclear son tambin adecuados para el estudio y medicin de los efectos maternos. Estos efectos se caracterizan por aquellas caractersticas de la descendencia afectadas no solo por el genotipo sino tambin por el fenotipo materno, que contiene a su vez componentes genticos y ambientales. Los componentes genticos de la madre pueden tener origen en el ncleo o en factores citoplasmticos. En los animales mamferos la herencia extracromosomal tiene lugar exclusivamente en el ADN mitocondrial. Los mellizos idnticos no solo tienen el mismo genotipo sino tambin el mismo ADN extracromosmico. Por el contrario los clones se diferencian en su ADN citoplasmtico, dado que el ovocito receptor de los ncleos puede originarse de diferentes vacas. El estudio de las interacciones ncleo-plasma puede, en consecuencia, aclarar la pregunta no respondida an sobre el rol que desempea el ADN no contenido en el ncleo. Esto es, establecer la funcin del ADN de las mitocondrias o los centrmeros (herencia matroclin). A travs de la transferencia de ncleos celulares de una edad definida, es posible establecer el momento conocido como "diferenciacin nuclear", en el cual la capacidad de la clula de poder diferenciarse en cualquier rgano (totipotencia) se pierde. A partir de ese momento no es posible provocar un nuevo comienzo de divisin celular. En consecuencia una rediferenciacin es imposible. Ello significa que en el interior del ncleo celular se manifiestan procesos de envejecimiento y cambios que hasta el momento no han sido estudiados suficientemente (STICE y ROBL, 1989). El ambiente pre- y post-natal es separado de la propia madre por medio del empleo obligado de la transferencia de embriones. Los efectos maternos se pueden dividir principalmente en las siguientes reas: 1. 2. 3. 4. Genticas, extracromosomales, ambiente uterino, y ambiente post-parto durante el perodo de amamantamiento.
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La varianza genotpica total para una caracterstica cuantitativa determinada se compone, sin considerar el efecto gnico episttico, de componentes directos, maternos, aditivos y de aquellos condicionados por la dominancia, los efectos mitocondriales y las influencias ambientales: Vp = VGa(d) + VGa(m) + VGd(d) + VGd(m) + VMi(m) + VUt(m) + VU(d) Ga Gd Mi Ut U (d) (m) = efectos gnicos aditivos = efectos gnicos dominantes = efectos mitocondriales = Influencias uterinas = Influencias ambientales = efectos directos = efectos maternos
Los componentes genticos causales pueden estimarse individualmente de las covarianzas entre animales emparentados (tabla 1). Es posible estimar la influencia uterina, el ambiente materno como as tambin los factores ambientales directos por medio de la transferencia de embriones (1 2 embriones en 1 2 receptoras). Tabla 1: Coeficientes de los componentes de la covarianza gentica entre animales emparentados (segn Brem 1986, 1990) Covarianzas entre Varianza Cov MH Cov HC Cov HE Cov M D Cov M mH Cov P D Cov P mH MH HC HE mH P M D = mellizos homocigotas = hermanos clon = hermanos enteros = medio hermanos = padre = madre = descendencia 1 1 1/2 1/2 1/4 1/2 1/4 Componentes causales VGa(d) VGa(d) 1 1 1 1/2 1 0 0 VGa(m) 1 1 1/4 0 0 0 0 VGd(m) 1 1 1 0 1 0 0 VMi(m) 1 0 1 1 1 0 0
Los estudios sobre predisposicin a enfermar y de enfermedades hereditarias con mellizos idnticos tienen una larga tradicin en el hombre y animal. Predisposicin a enfermedades se define a la disposicin individual para sufrir alteraciones de los procesos metablicos como consecuencia de carencias particulares. La resistencia es la desensibilidad o la exitosa resistencia pasiva contra agentes patgenos. Resistencia y predisposicin son dos trminos recprocos. La mayor parte de las enfermedades hereditarias y anomalas morfolgicas congnitas son de naturaleza polignica. La
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estimacin de la heredabilidad tiene gran importancia en la patognesis. Su determinacin se dificulta porque la mayor parte de las malformaciones y enfermedades no presentan una variacin continua sino que se presentan como caractersticas umbrales. Esto significa que slo se manifiestan superando determinado umbral. El empleo de la concordancia de mellizos homocigotas o hermanos clon en la estimacin de la heredabilidad de la disposicin a una enfermedad evita la desviacin provocada cuando se incluye toda la poblacin. Ello se cumple si se garantiza la ausencia de influencias familiaambiente. A travs de la eleccin del material animal adecuado (animales idnticos genticamente o emparentados) y del ambiente uterino y post-natal puede aclararse si la expresin del defecto o la disposicin estn afectados y en que intensidad por uno o varios loci, componentes genticos aditivos, dominantes y/o epistticos, uterinos, ambientales, penetrancia o expresividad. La realizacin de este tipo de estudios est limitada por la complejidad de producir el material animal adecuado, sin embargo los mismos constituyen el nico modelo experimental adecuado para responder a las preguntas sobre la disposicin a enfermedades y a su patognesis.
Produccin animal Como ya fue mencionado los animales idnticos se adecuan bien para estimar la varianza gentica y las influencias ambientales. Con el material animal adecuado es posible obtener tambin los valores estimados de heredabilidad. Otro parmetro que influye sobre la intensidad del progreso gentico es la exactitud de la estimacin del valor gentico. Aumentos de su exactitud tienen efecto directo en el incremento del xito de la seleccin. En los programas de mejoramiento por medio de la inseminacin artificial los valores genticos de los machos pueden ser estimados con seguridad en base a la informacin obtenida de la descendencia. En cambio la exactitud de la estimacin del valor gentico de las hembras es considerablemente menor. Con la informacin obtenida de dos pruebas de rendimiento propio de mellizos idnticos es posible aumentar la exactitud de la estimacin del valor gentico en 40% para valores de baja heredabilidad (p< 0,1) y para heredabilidades de valor medio (0,2 hasta 0,4) hasta 30%. La produccin de mellizos homocigotas en un programa de mejoramiento por medio de IA tiene efecto sobre la lnea madre-hijo con un aumento de la intensidad de seleccin anual, dado que el nmero de terneros machos por madre de toro aumenta. En programas convencionales de mejoramiento, el progreso gentico absoluto es de 0,173; 0,2 0,21 desviaciones estndar para una reposicin de 10, 1 0,1% respectivamente. Con la aplicacin de la TE y la MC puede provocarse un aumento de 20-25% en la lnea madre-hijo con una reposicin de 1%. Con una tasa de reposicin de 10% los valores ascienden a 40-50% aproximadamente (fig. 1). En razas productoras de carne los mayores aumentos del progreso gentico en un programa de TE podran ser alcanzados por medio de la microciruga. Ese mtodo no cubre, sin embargo, los costos de la tcnica, a pesar del mayor precio de los terneros. Este mtodo es interesante para empresas elite, cuyos ingresos principales no provienen de la comercializacin de ganado destinado a la faena sino a travs de la venta de reproductores de alto valor gentico, los cuales pueden alcanzar altos precios. La produccin de mellizos idnticos tiene aspectos muy interesantes cuando se aplican en la produccin de toros. Animales idnticos pueden ser sometidos, por ejemplo, a una prueba de rendimiento propio y al final pueden ser faenados a fin de recabar la informacin sobre la composicin y calidad de la carne. A partir de esos datos pueden ser seleccionados sus hermanos idnticos. Precisamente, la informacin de las caractersticas con alta heredabilidad tiene un significado de importancia. Por medio de la congelacin de los embriones divididos o clonados es posible reducir el tiempo de espera de los toros en seleccin. Los toros sometidos a la seleccin durante 3 aos son mantenidos como "toros de espera" hasta que se dispone de la informacin de la descendencia y se lleve a cabo la seleccin. La espera no solo ocasiona altos costos sino tambin prdidas de animales (20%). Cumplidos los plazos no todos los toros seleccionados estn en las condiciones ptimas para la
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reproduccin. A travs de la transferencia de los embriones y la congelacin de los embriones idnticos es posible, despus del nacimiento, recra y evaluacin de los animales producidos, llevar a cabo la seleccin y recin entonces recurrir a los genotipos congelados. En la evaluacin de las consecuencias genticas de los programas de clonado debe diferenciarse entre el valor gentico general y el valor clon. Bajo la denominacin valor gentico general se entiende la suma de los efectos gnicos aditivos que el animal a seleccionar transmite a la descendencia, al ser cruzado con animales elegidos por azar. Ese valor se refiere a una determinada poblacin. El valor clon es la suma de todos los efectos gnicos (aditivos, dominantes, epistticos) que conducen al mismo rendimiento en los hermanos clon bajo las mismas condiciones ambientales. Dado que el parmetro ms importante es el valor gentico general, la seleccin de toros y vacas se lleva a cabo segn ese principio.
Figura 1: Resultados de la seleccin de una caracterstica en programas de mejoramiento (progreso gentico en desviaciones estndar) En la aplicacin de rutina del clonado de embriones la seleccin clonada juega un rol decisivo junto con la seleccin gentica condicionante del progreso gentico. De la comparacin entre valor clonado y gentico resulta que el clonado no conduce a priori a un mejoramiento del progreso gentico. Recin la combinacin de la seleccin clonada y gentica junto con la ptima aplicacin de la capacidad de evaluacin conduce a un xito acumulativo (fig. 2). Por ello es importante aprovechar simultneamente las selecciones clonal y gentica (cuadro 1). El xito de ambas selecciones depender, en primer lugar, de la exactitud de la estimacin del valor gentico, del valor clonado y de la intensidad de seleccin. El intervalo generacional en la prueba de las hermanas puede llevarse a cabo segn el modelo del programa MOET para adultos en 4 aos (captulo XIX). Con una gran similitud entre hermanos clon, 1 2 animales alcanzan para seleccionar el mejor clon (tabla 2).
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Ao
Seleccin
Segn el valor gentico: Padre de toro y Madre de toro Segn el valor clon: a) Los mejores clones para la seleccin a travs de la clonacin b) Clones elite para su reproduccin
Medidas
Recoleccin y clonado de embriones test Descongelacin de embriones y: a) Reproduccin por medio de clonado b) Cruzamientos entre los animales evaluados, clones superiores y descendientes de clones hembras con toros elite
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Ventas de los animales de lo clones seleccionados
Fig. 2: Combinacin de las selecciones gentica y por medio de clonacin Tabla 2: Exactitud de la estimacin del valor gentico (A) y del valor clon (C) con una h2 = 0,25 (TEEPKER and SMITH, 1989) Correlacin entre hermanos clon 0,25 A 0,50 0,80 0,25 C 0,50 0,80 1 0,50 0,50 0,50 0,50 0,71 0,89 Nmero de hermanos probados 2 5 0,63 0,58 0,53 0,63 0,82 0,94 0,79 0,65 0,55 0,79 0,91 0,98 10 0,88 0,67 0,55 0,88 0,95 0,99
Otra situacin se cumple con la determinacin de los valores genticos de los clones. Con un aumento de la diferenciacin entre heredabilidad y similitud entre los hermanos clon disminuye la estimacin del valor gentico. En un ensayo modelo con mellizos idnticos se llevaron a cabo los siguientes puntos: Prueba de rendimiento propio de engorde de 4 mellizos idnticos. Empleo de los toros mellizos en la inseminacin. Destino de 12 hijos machos por toro a las estaciones de prueba de descendencia para ser evaluados en su engorde y rendimiento a la faena. Destino de 12 hijas por toro para ser evaluadas en su engorde y rendimiento a la faena. Faena y anlisis completo de los toros despus de los tests.
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Los anlisis llevados a cabo concluyeron, como era esperable, en la existencia de una alta similitud entre los mellizos homocigotas en el engorde. La similitud vari entre 65 y 80%, lo que significa que el test de un mellizo permite obtener buena informacin sobre la predisposicin gentica del hermano y eventualmente tambin de los hermanos clones. Las diferencias entre los grupos de descendientes machos y hembras fueron extremadamente reducidas para los valores de engorde y faena. La prueba estadstica indic que esas diferencias entre la descendencia de los pares de mellizos son casuales y pueden aclararse por medio de la variacin de la toma de muestra. En consecuencia, las relaciones entre la descendencia de los mellizos idnticos son altas. Como es de esperar no tiene importancia qu mellizos se empleen en el programa de mejoramiento, dado que los valores genticos producto de la evaluacin de la descendencia deben arrojar los mismos resultados. La correlacin entre las pruebas de rendimiento propio y de la descendencia es muy alta. A partir de esos resultados se supone que el valor gentico aditivo de los toros es predecible por medio de la prueba de rendimiento propio del hermano mellizo y de los hermanos clones. A travs de ello es posible aprovechar mejor las capacidades de evaluacin de las estaciones de prueba de engorde y faena por medio del empleo de la transferencia de embriones y del clonado que con los mtodos convencionales. TEEPKER y SMITH (1989) llevaron a cabo modelos de clculos de las mejoras de la eficiencia esperable con la aplicacin de la transferencia de embriones. La seleccin clonal puede provocar una mejora de la eficiencia de 1,9 unidades estndar en una ronda de seleccin (tabla 3). Ello correspondera a una eficiencia de lactacin de 1 500 kg, lo que conducira a que el rendimiento de los mejores animales del clon superaran considerablemente los rendimientos de los animales reproductores de la poblacin. Se debe considerar que los resultados de la seleccin de clones posiblemente no puedan ser acumulados como los progresos genticos a largo plazo. El progreso gentico anual de los programas de IA es de 1% aproximadamente, en programas con una buena eficiencia hasta 1,5%. Con programas MOET aplicados en madres de toros o programas de ncleos de produccin se pueden alcanzar progresos genticos de 2 a 2,4%. La seleccin clonal puede posibilitar, por otra parte, un progreso gentico de 20 a 25%. Tabla 3: Modelo de clculo del xito de seleccin (gentico = A y clonal = c) despus de una ronda de seleccin (h2 = 0,25 y correlacin entre hermanos clon = 0,50; segn TEEPKER y SMITH, 1989) Seleccin segn A C C+A Estructura gentica MH mH HC 4-5 1-4 4-5 3-5 2-5 2-4 1,0-1,7 3,1-5,0 1,3-2,5 Elevacin del rendimiento 0,528 1,879 2,339 A Valores relativos C A+C 96 100 98 99 96 100
100 70 96
Uno de los primeros modelos de clculo del progreso gentico anual con la aplicacin del clonado de embriones fue propuesto por NICHOLAS y SMITH (1983). Los autores compararon el xito gentico con la produccin de grandes clones frente al de un programa de inseminacin artificial (fig. 3). A travs de la seleccin de los padres de los clones es posible alcanzar una ventaja inicial de 4 aos (medidos en progreso gentico terico anual) comparado con el programa convencional por medio de IA. Despus de 3 aos se dispone del rendimiento de los clones, los mejores pueden ser seleccionados y destinados a la poblacin. La descendencia nacida el ao siguiente estara 13-17 aos ms adelantada que aquella de un programa de IA. En el mismo ao se cruzan los mejores clones entre s, a fin de disponer de una nueva ronda de seleccin en el 8 ao. Despus de 16 aos la diferencia entre la produccin y empleo de los clones y el sistema de seleccin convencional por medio de la descendencia sera de aproximadamente 30 aos.
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En la evaluacin de las ventajas genticas de los programas de clonado se debe diferenciar entre clones machos y hembras. Los clones machos permiten un progreso gentico seguro y eficiente en las caractersticas de engorde y rendimiento a la faena en razas productoras de carne y de doble propsito. Permiten, adems, un mayor y ms eficiente aprovechamiento de los toros elite, si se produjeron embriones idnticos y uno de ellos fue congelado. Existe la posibilidad de estudiar la disposicin y resistencia a enfermedades cuando se dispongan de mtodos adecuados para su estudio. Con los clones hembra sera posible producir grandes grupos de animales que, bajo condiciones ambientales definidas, estaran 2 desviaciones estndar por encima de la media. Ello significara para una raza lechera como Holstein Friesian una garanta de produccin de 10 000 kg de leche. En la raza Fleckvieh sera posible alcanzar una produccin de 7 000 kg con un buen desarrollo muscular.
44
Cra y uso de los clones seleccionados
36
Subsecuente tasa de respuesta
28
20
Prueba de progenie Padres de toros IA comercial
Posible respuesta
Seleccin de los 12 mejores clones

4
Respuesta alcanzada
Mejora gentica 0 inicial

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Fig. 3: Posible progreso gentico por medio de la produccin y empleo de clones seleccionados en comparacin con el G terico en programas convencionales de seleccin por medio de la descendencia (NICHOLAS y SMITH, 1983) En el futuro, una adecuada combinacin de seleccin clonal y gentica podra provocar una marcada aceleracin del progreso gentico.
Bibliografa NICHOLAS, F.W., C. SMITH. 1983. Increased rates of genetics change in dairy cattle by embryo transfer and splitting. Animal Prod., 36: 341-353. STICEL, S.L., J.M. ROBL. 1989. Current success in cloning mammalian embryos. Age 12: 83-88. TEEPKER, G., C. SMITH. 1989.Combining clonal response and genetic response in dairy cattle improvement. Animal Prod., 49: 163-169.
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Aplicaciones de la transferencia gnica
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APLICACIONES DE LA TRANSFERENCIA GENICA G. Brem Introduccin Durante los ltimos aos se discutieron una serie de reas de aplicacin de la transferencia gnica en los animales domsticos. Hasta el momento slo se pueden modificar, a travs de la transferencia gnica, caractersticas genticas, las cuales estn asociadas a pocos genes (cualitativas). Sin embargo se conocen pocas caractersticas en produccin animal que son afectadas por los conocidos como genes simples (genes principales). En las caractersticas ms importantes de produccin y reproduccin se trata, en consecuencia, de las caractersticas denominadas cuantitativas, que responden a una herencia de tipo polignica. El hecho que el lmite entre las caractersticas cuali- y cuantitativas carece de solucin de continuidad fue plenamente demostrado con la produccin de ratones transgnicos gigantes. El crecimiento, una de las clsicas caractersticas cuantitativas en produccin animal, se convirti en una caracterstica cualitativa cuando el gen de la hormona de crecimiento se transfiri en ratones estableciendo un mecanismo de retroalimentacin independiente. En parte, es posible provocar similares efectos tambin con la aplicacin de somatotrofina bovina en vacas lecheras. A pesar que nuestros conocimientos en esa rea an son insuficientes, los resultados de esos estudios pueden interpretarse, en el sentido de una hiptesis de trabajo, que genes principales pueden provocar efectos gnicos similares a los aditivos determinando el rendimiento de una caracterstica, particularmente debido a la gran variabilidad de los efectos individuales. Segn la definicin de gentica cuantitativa, en el efecto gnico aditivo no es posible reconocer el efecto de un nico gen. Esa definicin se basa en anlisis estadsticos de la distribucin de las caractersticas en la descendencia o la poblacin, sin conocimientos de los efectos gnicos que lo motivan. Es de esperar que estudios posteriores puedan aumentar nuestros conocimientos sobre la determinacin y efecto de ciertas caractersticas. En lo que respecta a las reas de aplicacin de la transferencia gnica en los animales de inters productivo existen perspectivas reales de afectar la eficiencia productiva en forma positiva. Actualmente las actividades en la investigacin se concentran en las reas: crecimiento, resistencia a las enfermedades, calidad de los productos animales, "gen farming" y nuevos mecanismos o caminos metablicos.
Crecimiento El crecimiento es un fenmeno extremadamente complejo que, dependiendo de la determinacin gentica, es influenciado por el efecto conjunto de hormonas y factores auto- paracrinos como tambin alimentacin y factores ambientales. Desde el punto de vista de gentica bsica son especialmente interesantes los genes de protenas de la cascada hormonal de crecimiento, que se originan en el hipotlamo o en la hipfisis y que afectan, va hgado, sus rganos blanco perifricos. Las secuencias de aminocidos y genes para esas hormonas proteicas son conocidas y fueron ya clonadas y secuenciadas. El comienzo del crcuito neuroendcrino de la hormona de crecimiento se encuentra en el hipotlamo. All se sintetizan la hormona estimulante somato-liberina (GHRH = Growth Hormon Releasing Hormone, GHRF = Growth Hormone Realising Factor) y la hormona inhibidora somatostatina (SRIF = Somatotropin Inhibiting Factor Hormone) segn un perodo circadiano y en dependencia de diversos factores, especialmente de la concentracin srica de diversas hormonas (GH, IGFI, etc.). La GHRH es un oligopptido de 43-44 aminocidos con diferente homologa entre las especies que se sintetiza en los ncleos arcuato y ventromedial del hipotlamo. La SRIF no indica, por el contrario,
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especificidad alguna. Est formada por dos diferentes pptidos de 14 y 28 aminocidos de largo y se produce no solo en el hipotlamo sino tambin en el pncreas y en el intestino. La hormona de crecimiento (GH = Growth Hormone, STH = Somatotropes Hormone, Somatotropin) es sintetizada en las clulas acidfilas del lbulo anterior de la hipfisis. La misma est compuesta de 190191 aminocidos y contiene 2 puentes disulfricos intramoleculares. Junto con la forma 22 kDa se encuentran en el hombre otras formas (20, 45 y 80-90 kDA). El pptido de seal, originado en la sntesis primaria, se separa en el retculo endosplasmtico. La homologa entre la hormona de crecimiento del bovino y otras especies corresponde, para el ovino en un 99,5% (un aminocido diferente), cerdo 90,5% (18 diferentes aminocidos) la rata y el ratn 87,9 y 87,4 respectivamente (23 y 24 aminocidos diferentes) y frente al hombre 66,3% (64 aminocidos diferentes). La somatomedina C (IGFI = Insulin-like Growth Factor I), polipptido bsico de 70 aminocidos y 7,5kDa, es un factor mitognico subordinado a la hormona de crecimiento. Se sintetiza en el hgado, rin, pulmn, corazn, glndula mamaria y la epfisis sea. De la misma forma fue encontrado en diferentes clulas tumorales. La somatomedina tiene efectos endcrino, autcrino y parcrino. La homologa de las secuencias polipptidas del IGFI entre las especies ya mencionadas es superior al 90%. El IGFI tiene 2 hormonas precursoras ("prepro" IGFIA e IB) que son el resultado de la separacin alternativa del ARN. Las mismas son idnticas en sus terminales amnicas pero se diferencian en sus terminales carboxiladas. La liberacin de la hormona de crecimiento se produce, como ya fue mencionado, en dependencia de GHRH y SRIF e indica un marcado episodio circadiano de varios picos. La hormona de crecimiento es distribuida en el organismo a travs de la circulacin sangunea y asociada, principalmente, con receptores GH del hgado como as tambin del tejido graso, muscular, renal cardaco y tejido de crecimiento seo. El efecto de la GH vara de acuerdo al balance energtico (KARG, 1988). Bajo un balance energtico positivo, la somatotrofina tiene, junto con la IGFI, un efecto anablico proteico estimulante del crecimiento. Con un balance negativo predomina un efecto lipdico catablico. El factor IGFI tiene un efecto estimulante sobre la sntesis de ADN, la tasa de divisin y la diferenciacin celular como as tambin sobre la sntesis de protena. La aplicacin de hormonas de crecimiento en produccin animal fue estudiada intensamente a partir de la disposicin de somatotrofina producida en forma recombinante. En un gran nmero de trabajos se seal que despus de la administracin de la hormona de crecimiento se alcanzaron efectos positivos en el mejoramiento de los parmetros de rendimiento del crecimiento (aumento de peso diario, conversin del alimento, distribucin de la grasa y de rendimiento lechero). En el ao 1982, como ya fue mencionado, fueron producidos ratones transgnicos con la hormona de crecimiento. En esos ratones se observ un enorme aumento del potencial de crecimiento con una multiplicacin de su velocidad y una duplicacin del peso final. En la actualidad existen numerosas publicaciones sobre animales transgnicos de inters productivo, los cuales contienen y exprimen genes de la familia de la somatotrofina. En la especie bovina no se ha publicado an la produccin de un animal transgnico con efectos comprobados de la hormona GH. Al contrario de los resultados publicados sobre ratones transgnicos con GH y sobre tratamientos de la misma hormona en animales de inters zootcnico se observ, con sorpresa, que los cerdos transgnicos con los genes MT-hGH y MT-bGH no presentaban aumento de crecimiento. El rendimiento de los cerdos transgnicos tendi a ser ligeramente menor que el de los animales control cuando los animales tratados fueron alimentados con una racin normal de 16% de protena cruda. En la actualidad se conoce que para mejorar la eficacia del crecimiento de estos animales transgnicos se los debe alimentar con una racin rica en protena (18% de protena cruda) con el complemento de lisina. Despus de una alimentacin consecuente de la descendencia transgnica con una racin rica en
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protenas se observ que, efectivamente, se produca un aumento de la ganancia de peso de 16,5% (PURSEL y col., 1988; 1989). Otro problema de la aplicacin de la somatotrofina en los animales domsticos se origina en la depresin de la ingesta en aproximadamente un 20% que se contrapone al aumento del crecimiento. Cerdos transgnicos GH muestran una clara mejora de la conversin alimenticia hasta el 18%. El cambio ms marcado es sin duda la reduccin masiva de la grasa corporal. El espesor de la grasa dorsal se reduce de 18-20mm a 7-8mm (HAMMER y col., 1986, PURSEL y col., 1989 y 1990). La redistribucin de los nutrientes (nutrient portioning) es el aspecto ms positivo de los cerdos transgnicos. El crecimiento es el resultado de la hiperplasia de clulas diferenciadas y su posterior hipertrofia. Cuando un tejido se ha diferenciado y su contenido de ADN es relativamente esttico, el crecimiento es el resultado de la concurrencia de la hipertrofia de distintos tejidos y de la disponibilidad de sustancias nutritivas. Segn un modelo de HAMMOND (1952) los tejidos neural y seo tienen prioridad an con baja disponibilidad nutricional. Los tejidos muscular y graso se hipertrofian, de acuerdo a su potencial gentico, frente a una sobreoferta nutricional (STEELE y PURSEL, 1990). La prctica de la produccin animal est concentrada en la obtencin ptima de tejido muscular con reducido contenido de grasa intramuscular y moderado crecimiento del tejido graso. Dado que en nutricin animal existe la sensacin que la capacidad gentica est agotada con los estndares nutricionales actuales, existe vido inters en la aplicacin de la transferencia gnica y en tratamientos con la hormona de crecimiento. No existe, sin embargo, camino seguro mediante el cual se pueda lograr -va transferencia gnica- un mejoramiento de la distribucin grasa intramuscular y con ello del sabor de la carne. El mecanismo de accin de la somatotrofina no est aclarado totalmente. Junto con los efectos directos sobre el metabolismo celular existen una serie de efectos indirectos a travs de mediadores secundarios. El factor IGFI es responsable, por ejemplo, de numerosos efectos anablicos de la hormona de crecimiento. La influencia directa de esta ltima sobre el metabolismo lipdico conduce a una reduccin de la conversin de la glucosa, a la inhibicin de la sntesis lipdica, aumenta el metabolismo lipdico y conduce por esa va a una reduccin del depsito graso de los animales tratados con GH. En forma sincrnica con el efecto inhibidor de la hormona de crecimiento sobre el tejido graso se provoca una estimulacin del crecimiento adicional del msculo por una adaptacin el organismo a su nuevo estatus. Los lpidos destinados originalmente a las reserva grasa son metabolizados para colaborar con la sntesis proteica. En un experimento se emple un promotor de la prolactina bovina con el gen de la hormona de crecimiento de la misma especie en el cerdo. Los cerdos transgnicos producidos tuvieron una concentracin de GHb dentro de los niveles fisiolgicos de 20 ng/ml y su crecimiento fue normal. La liberacin episdica fu lograda a travs de sulpirida, un antagonista de la dopamina y a travs de TRH (Thyreotropin Realising Hormone). Segn ello el transgen est subordinado al mecanismo normal de retroalimentacin de la prolactina (POLGE y col., 1990). Ovejas transgnicas GH y GHRH mostraron un incremento del nivel de hormona de crecimiento pero no un aumento del crecimiento (REXROAD y col., 1990). La aplicacin del promotor de la metalotionina Ia y del gen de la hormona de crecimiento de la oveja condujo, de la misma forma a un aumento del nivel sanguneo de la hormona de crecimiento (NANCARROW y col., 1990). Mientras la velocidad de crecimiento no fue afectada, el contenido graso de la reses ovinas contena menos grasa (5-7%) que los animales controles (25-30%).
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Resistencia a las enfermedades Resistencia, cualidad adquirida genticamente, es la insensibilidad de las especies, razas o animales frente a determinados microorganismos, parsitos o toxinas. Dado que los costos producidos por las enfermedades en los animales de inters productivo corresponde a un 10% del valor de la produccin, cobra importancia junto con la profilaxis tambin la produccin de animales resistentes. Lamentablemente, la seleccin por resistencia a las enfermedades no est libre de dificultades. En muchos casos si bien la variabilidad de la predisposicin a enfermar vara en forma discontinua, no se hereda segn las leyes de Mendel. Con frecuencia la predisposicin a una enfermedad es un caracterstica con valor umbral y una variacin continua pero no reconocible. Los animales con un valor de la predisposicin por debajo del umbral son sanos, aquellos con un valor mayor sern afectados por la enfermedad. Frente a esa situacin se desarrollaron estrategias genticas para la seleccin de la caracterstica "presencia o ausencia". Las mismas tendrn un xito satisfactorio mientras no sea posible producir una caracterstica con varias clases o con una variacin diagnosticable. Los primeros estudios sobre resistencia y predisposicin a las enfermedades se llevaron a cabo hace algunos aos. Una serie de resistencias a enfermedades son caracteres polignicos, como por ejemplo la tolerancia a la tripanosomiasis de algunas razas africanas, las cuales son tambin muy rsticas y resistentes al calor. Por otra parte existen mecanismos de resistencia, que dependen de un solo gen como lo es la resistencia a la diarrea neonatal de los cerdos, provocada por E. coli K 88, y la resistencia a la influenza del ratn. Los mecanismos de defensa contra agentes infecciosos pueden ocurrir, por ejemplo, a travs de la modificacin o prdida de receptores. Esto impide la penetracin del agente patgeno. El ingreso o la reproduccin de los agentes patgenos son afectados por mecanismos generales de respuesta inmunitaria y expresin del MHC. Esas resistencias son en general muy complejas. Diferentes molculas como interferon, neuropptidos, interleuquinas y hormonas fueron estudiadas en sus propiedades inmunomoduladoras. La respuesta inmunitaria humoral puede correlacionarse en forma negativa con la actividad microbicida de los macrfagos. Es conocido que los productos gnicos del MHC desempean un rol importante en la respuesta inmunitaria y que influyen la resistencia y predisposicin frente a enfermedades. Ya se han encontrado asociaciones de haplotipos MHC con determinadas enfermedades en los animales domsticos. El Instituto de investigacin en gentica animal (DLO) de Holanda pretende aumentar la resistencia a la mastitis bovina (especialmente producida por E. coli), aumentando los niveles de lactoferrina en el tejido mamario a travs de transferencia gnica. Para los programas de transferencia gnica se consideran fundamentalmente 5 clases de genes mamferos: MHC del receptor de las clulas T de la inmunoblobulina linfoquina especiales de resistencia a enfermedades.
Un comienzo interesante en el desarrollo de resistencia contra infecciones virales es la denominada "inmunizacin intracelular". La inmunizacin automtica sera posible a travs de la expresin de partes proteicas, integradas como transgenes, con efecto antgeno. Junto con esa posibilidad se podran transferir tambin genes de anticuerpos reorganizados (inmunizacin gentica). En un ejemplo de un antgeno que en condiciones naturales no est presente en ratones, conejos y cerdos se demostr que la expresin de transgenes puede conducir a altos ttulos de anticuerpos (WEIDLE y col., 1991).
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La produccin de animales transgnicos constituye una tcnica particular pero tambin prometedora contra infecciones virales. Los animales transgnicos contienen genes antisense, los cuales actan contra el virus. A travs de la expresin del RNA antisense (RNAas), el cual debe estar presente intracelularmente en abundancia, se produce la hibridacin con el RNA sense y con ello una inhibicin de la replicacin del genoma viral. ERNST y col. (1990) describieron la produccin de conejos transgnicos, los cuales exprimian RNAas contra adenovirus H 5 (Ad 5). An queda por aclarar, en qu medida los animales transgnicos estn protegidos contra la replicacin viral. Al menos en el cultivo celular pudo demostrarse que las lneas celulares, conteniendo el RNA as fueron 90-98% ms resistentes contra Ad 5 que las lneas celulares normales. Actualmente se trabaja en la aplicacin de esa particularidad en los bovinos transgnicos. La transferencia gnica representa, sin lugar a dudas, un interesante y seguramente prometedor mtodo de reducir, en forma exitosa, la disposicin a enfermedades provocadas por determinados agentes patgenos. No obstante debe destacarse que es necesario an llevar a cabo una intensa investigacin bsica en gentica molecular para que dichas tcnicas sean empleadas con xito en la prctica.
Calidad de los productos animales La mejora de la calidad o composicin de productos animales a travs de la transferencia de genes podra abrir nuevos caminos en la produccin animal. Un modelo propuesto por MERCIER (1987) contempla la reduccin del contenido de lactosa en la leche. Con la produccin de vacas transgnicas, que posean el gen de la lactasa acoplado a un promotor especfico de la mama, se podra lograr la metabolizacin de la lactosa en glucosa y galactosa; permitiendo que personas que sufren de intolerancia a la lactosa puedan consumir leche. Ello tendra singular importancia en los pases en vas de desarrollo, donde ms del 90% de la poblacin adulta sufren de intolerancia a la lactosa y los mtodos de separacin son difciles o imposibles de llevar a cabo. BREMEL y col. (1989) discutieron otras posibilidades de modificacin del contenido de la leche (cuadro 1). Adems de la produccin de otras protenas, las cuales pueden ser aisladas independientemente de su localizacin original, se piensa en una modificacin de la composicin de la leche per se. De esta forma sera posible modificarla a fin de poderla emplear con mejores resultados en la alimentacin del beb.
Gene farming Como ya fue explicado, es posible que la expresin gnica puede producirse solamente en un rgano determinado, a travs de la combinacin de genes con elementos reguladores especficos. De esta forma es evidente que genes unidos a promotores de protenas de la leche se expriman en primer lugar en las clulas mamarias.
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Cuadro 1: Posibilidades de modificacin de la composicin de la leche (BREMEL y col., 1989) Objetivo Aumento del contenido proteico Posibilidades de procesamiento Leche libre de -globulina Reduccin del contenido graso Mayor contenido de materia seca Prevencin de mastitis Caseina Variantes de caseina o variantes de caseina manipuladas -globulina anti-sense Acetil-CoA-carboxilasa -galactosidasa, Lactasa Genes de anticuerpos Genes
En consecuencia de ello, si la translacin del RNAm, el transporte de las protenas y la seccin de los pptidos de seal funcionan consecuentemente, la protena codificada por el gen se fracciona en el alvolo mamario y se obtiene, como producto gentecnolgico, en la leche ordeada. De ello surge la pregunta: porqu debe optarse por animales mamferos como "bio-reactores" para la produccin de importantes protenas genticas, en lugar de producir esas sustancias con el cultivo de E. coli u otros microorganismos? Los siguientes argumentos respaldan el empleo de la glndula mamaria como rgano productor de protenas extraas: - Muchas protenas necesitan para su funcionalidad -en parte- amplias modificaciones postranslacionales (por ejemplo: glicosidacin, hidroxilacin o carboxilacin ). En muchos casos ello no es posible en los sistemas recombinantes simples desde E. coli a S. cervesiae o lo es en una forma insuficientemente precisa. Las protenas producidas de esta forma pueden modificase convirtindose en antgenos, por un lado, por el otro pueden faltarles una actividad o tenerla incompleta.Los animales mamferos estn en condiciones, contrariamente a los sistemas procariticos de produccin, de establecer las modificaciones postranslacionales en las protenas nuevas. No fue aclarado hasta el momento en qu medida es posible llevar a cabo esa produccin con clulas in vitro en forma idntica a la de las clulas en sus rganos de origen (p. e.: hgado). - La expresin de protenas extraas en la leche es un sistema en el cual el producto puede obtenerse en forma convencional a travs del ordee y sin perjuicio de los animales empleados. - La capacidad de sntesis de la glndula mamaria es considerable. La concentracin de la suma de protenas lcteas endgenas es de 4-6%. An cuando no sea posible producir 60 g de protena recombinante en un litro de leche, a travs de gene farming, las cantidades de 1 y 2 g/l son suficientes para obtener importantes cantidades de protenas de alto valor farmacutico con vacas de alta produccin. - La leche es un producto de alta pureza e higiene. No deberan presentarse problemas insolubles en la aislacin de las protenas extraas de la leche. Se evita en particular la presencia de restos procariticos y residuales en las protenas purificadas. Para el empleo de la glndula mamaria como bio-reactor es necesario la presencia de los elementos regulatorios clonados. Ya fueron aislados los genes y promotores para la casena alfa s1, caseina , lactoalbmina alfa, lactoalbmina y la proteina whey acidi (WAP) en algunas especies incluida la bovina. Se pudo demostrar que casi todos esos genes se exprimen con especificidad de tejido, an en animales transgnicos de otras especies. Aparte del ratn fue posible comprobar, en parte, alto contenido de protena extraa en conejos, ovejas, cabras y cerdos transgnicos. Es necesario continuar
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con la investigacin, sin embargo la posibilidad bsica de lograr una valorable expresin, traducida en algunos gramos por litro de leche fue comprobada en varios experimentos. De acuerdo a los conocimientos actuales, las protenas segregadas por la glndula mamaria aparentan ser ms activas biolgicamente. La posibilidad y medida de las modificaciones no ha sido aclarada completamente. Se puede suponer que ese sistema significar un importante aporte de protenas de alto valor en medicina.
Nuevas vas metablicas Un rea de importancia, en el cual la transferencia gnica afectar la productividad es la modificacin de las vas metablicas. WARD y col. (1986) pensaron especial-mente en la reconstitucin de vas metablicas presentes normalmente pero perdidas en determinadas especies como as tambin en la incorporacin de nuevas vas que hasta el momento no fueron observadas. Ello significara que los genes necesarios para esa va metablica deben obtenerse de otras fuentes y que antes de la transferencia deben ser preparados para la expresin en organismos mamferos. El inters se concentra en la modificacin de vas metablicas por medio de la introduccin de mtodos biosintticos para elementos esenciales. Se conoce que el aminocido cisteina es un substrato limitante de la sntesis de lana en la oveja y que no es posible aumentar su concentracin srica con medidas nutricionales porque la cisteina excedente es eliminada en el rumen. Por esa razn sera ventajoso si ovejas transgnicas pudiesen sintetizar cisteina. Para ello deben aislarse los genes para la serina transacetilasa y la acetil serin acetilasa de procariotes y transferirse a la oveja con nuevos elementos regulatorios. Las ovejas transgnicas deberan estar en condiciones, de acuerdo a su nueva va metablica transgnica, de sintetizar la cisteina en el epitelio ruminal, empleando H2S, y transportarla a los folculos. Un segundo camino propuesto por WARD y col. (1986) sera la va metablica de glicoxilato, que permitira a los ovinos sintetizar glucosa a partir de acetato. Ello es interesante por que todos los rumiantes emplean la glucosa como fuente energtica para determinados tejidos (cerebro, feto) pero carecen de una fuente suficiente para ese sustrato. En consecuencia los rumiantes deben sintetizar la glucosa a partir de aminocidos y de los cidos libres como propionato. El isositrato se forma a partir de acetato y oxalacetato y bajo la influencia de isotratliasa se forma glicoxilato y succinato. De dos molculas de acetato se origina una de succinato. No debe quedar sin mencionar que la introduccin de estas nuevas vas metablicas no es simple y que deben considerarse y cumplirse una serie de condiciones complementarias. Debe pensarse tan slo en la localizacin y disponibilidad de las enzimas correspondientes. Un interesante hallazgo en relacin con el desarrollo de nuevas vas metablicas se llev a cabo en una lnea de ratones transgnicos, que posean 250 copias de un filamento intermediario del gen de la queratina ovina. En esa lnea murina se observ la cada y crecimiento cclicos del pelo, originados por el desbalance provocado por el aumento del nivel del filamento intermediario queratina y el consecuente nivel reducido de protenas asociadas al filamento (POWELL y ROGERS, 1990). La consecuencia gentica del problema descrito, como consecuencia del origen de mosaicos o mutantes de insercin, es que para la incorporacin de un determinado gen en una poblacin no alcanza la produccin de un slo animal transgnico. Independientemente de que a travs de ello se puedan originar problemas de consaguinidad, las posibilidades de crear una lnea funcional con un slo animal transgnico son muy reducidas. Para que una lnea transgnica pueda ser empleada con xito en produccin animal debe cumplir las siguientes condiciones: Transmisin estable del transgen a la descendencia. Estar libre de mutaciones de insercin y poder producir animales transgnicos homocigotas. Expresin estable del transgen y efecto biolgico positivo de la caracterstica deseada.
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De ello surge que deben producirse por lo menos 5 a 10 animales transgnicos primarios para establecer, con alta probabilidad, lneas transgnicas que respondan a los objetivos. Para la produccin de lneas transgnicas el objetivo gentico y la velocidad en que pueden producirse esos cambios (progreso gentico) son definitivos en el resultado final. Un anlisis de costos, similar a los efectuados en los programas de mejora gentica tradicionales, puede llevarse tambin a cabo para los cambios genticos transgnicos. Si la finalidad gentica de la transgnesis comprende caractersticas que son consideradas en una programa gentico tradicional, es necesario comparar el progreso gentico posible con y sin lneas transgnicas. En las especies bovina y porcina la comparacin indic que en las lneas transgnicas es necesario un aumento del progreso gentico de 5,5 a 16,5%, segn cual sea la caracterstica productiva (BREM, 1989), para alcanzar el progreso gentico adecuado en el mismo lapso que se alcanza con la IA (cuadro 2). Cuadro 2: Progreso gentico necesario en las lneas transgnicas para producir la misma mejora del rendimiento que en los mejores programas de seleccin por medio de la inseminacin artificial (BREM 1989) Promedio Progreso gentico anual esperado % Aos necesarios para producir lneas transgnicas (F3) Efecto transgnico esperado %
Caracterstica
Bovino Cantidad de leche Aumento de peso diario Rendimiento crneo Cerdo Grasa dorsal Aumento de peso diario Rendimiento crneo 20 mm 700 g 57% 2,0 2,5 1,5 4 4 4 8% (0 1,6 mm) 10% (= 70 kg) 6% (0 3,4%) 6000 kg 1200 kg 60% 1,5 1,5 0,5 11 11 11 16,5 (= 960 kg) 16,5 (= 200 g) 5,5 (3,3%)
De ello se concluye que en aquellas caractersticas de trascendencia en programas de mejoramiento gentico por medio de IA, es necesario un alto efecto biolgico del transgen para alcanzar el mismo progreso gentico. Dado que, de acuerdo a la experiencia obtenida, los efectos gnicos tienen con frecuencia efectos colaterales no deseados, la finalidad productiva de los animales transgnicos son las caractersticas que no pueden mejorarse con los programas de mejoramiento tradicionales o lo son en forma insuficiente (como por ejemplo como consecuencia de la baja heredabilidad). Esas caractersticas son las que afectan la resistencia a las enfermedades o a la calidad de los productos animales. La aplicacin de lneas transgnicas para el mejoramiento comercial o nacional no requiere de medidas genticas especiales. Junto con el efecto del transgen el pool gentico inicial (pedigree o poblacin ncleo) es de definitiva importancia. Con los altos costos y esfuerzo que requiere la produccin de lneas transgnicas, la seleccin de los animales para la transferencia gnica es de suma importancia. Como medida de seguridad se recomienda establecer de cada lnea transgnica un banco genmico, en forma de semen y embriones congelados. Las lneas transgnicas se adecuan especialmente para
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las lneas paternas, porque la difusin del transgen es relativamente fcil a travs de la IA o el servicio natural. Particular-mente cuando el alelo transgnico tiene efecto en su forma ms simple (genotipo TO). El desarrollo de un pool transgnico en un rodeo ncleo de produccin o programa de mejoramiento con MOET fue discutido por SMITH y col., (1987). Los conocimientos actuales no son suficientes an como para hacer definiciones sobre los efectos de la acumulacin de los alelos transgnicos en un pool gentico. La produccin de lneas transgnicas exige del esfuerzo tcnico, en laboratorios adecuados para ese, fin y de personal altamente calificado. Firmas productoras de lneas maternas y paternas, como ya existen en las producciones avcola y porcina, como as tambin el trabajo conjunto entre estaciones de IA y Asociaciones de productores deberan estar en condiciones de proporcionar el adecuado marco organizativo y las inversiones necesarias. La incorporacin de otros mtodos biotecnolgicos como la produccin de quimeras de la hilera germinal con clones embrionarios a travs de la transferencia nuclear de embriones totipotentes o de clulas primordiales embrionarias (cap. XIV) en ovocitos enucleados podra tener un efecto importante en el futuro. Esa combinacin unira las ventajas genticas del clon embrionario (cap. 12) con las de las lneas transgnicas (cap. 13).
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PROGRAMA DE NUCLEOS GENETICOS CON LA APLICACION DE METODOS REPRODUCTIVOS BIOTECNOLOGICOS H. Krulich Introduccin. Seleccin tradicional a travs del registro de pedigree El pedigree tradicional fue desarrollado en Inglaterra entre los siglos XVIII-XIX y a partir de all se distribuy por todo el mundo. La poblacin bovina se divide en animales reproductores (Registro de pedigree) y productores. Ello se puede representar en una pirmide (fig.1). El progreso gentico alcanzado a travs del registro de pedigree se transfiere al resto del rodeo por medio de la venta de los reproductores.
Toros Registro de pedigree
Rodeo puro por cruza y general
Fig. 1: Programa tradicional de mejoramiento Las condiciones para un moderno registro de pedigree junto con la definicin de un objetivo productivo uniforme, son: a. Identificacin de los toros, vacas y terneros (caravanas, tatuajes). b. Registro de los servicios naturales (monta), inseminaciones artificiales y los nacimientos (notificacin del nacimiento). c. Registro de la ascendencia a partir de los certificados de servicio y de nacimiento (certificacin a travs de la determinacin del grupo sanguneo o del ADN-fingerprinting). d. Tests de produccin para las caractersticas establecidas en los objetivos. e. Evaluacin fenotpica de acuerdo a los estndares de la raza. f. Seleccin (registro en el libro de pedigree) y apareamiento de los animales, que responden a las exigencias establecidas. Seleccin por medio de la inseminacin artificial En poblaciones con un alto porcentaje de inseminaciones artificiales y con una parte aceptable de su poblacin bovina bajo pruebas de seleccin, se establecieron los programas de seleccin por medio de la inseminacin artificial bajo la base del registro de pedigree. Los programas de seleccin se basan en el modelo de 4 lneas (fig. 2). Los reproductores machos y hembras con cualidades por encima de la
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ncleos
media son destinados a ser los padres de las vacas (PV) y madres de las vacas (MV). El cruzamiento de padres de toros con madres de toros ser para cubrir la prxima generacin de toros de prueba.
Progreso gentico
Madres de toros Padres de toros Padres de vacas Madres de vacas
Descendencia
Fig. 2: Programa de seleccin empleando el modelo de 4 lneas El progreso gentico en programas de seleccin por medio de inseminacin artificial puede ser estimado segn el modelo de RENDEL y ROBERTSON (1950) de la suma del xito de seleccin (SE) de las cuatro lneas de seleccin y de la suma de los cuatro intervalos generacionales: SEPT + SEPV + SEMT + SEMV SE/t = -----------------------------------------------TPT + PV + TMT + TMV SE/t T PT PV MT MV = Exito de seleccin anual = Intervalo generacional = Padres de toros = Padres de vacas = Madres de toros = Madres de vacas
El xito de la seleccin (SE) est influenciado por la intensidad de seleccin (dependiente de la tasa de seleccin), la exactitud del valor de la heredabilidad y la desviacin estndar. SE SE i rAI = i. rAI . sA = Exito de la seleccin por generacin = Intensidad de la seleccin = Desviacin estndar aditiva
La figura 3 muestra el esquema general del programa de seleccin por medio de la inseminacin artificial basado en el modelo de las cuatro lneas. En la produccin de leche las caractersticas de seleccin ms importantes se marcan solamente en las hembras. Por esa razn se emplea el test de las hijas para la estimacin del valor gentico de los toros. (Exactitud del valor gnico= rAI = 0,8 hasta 0,9), a travs del cual el intervalo generacional se prolonga
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de 2-3 a 6-7 aos con servicio natural. En la produccin bovina para carne es posible determinar el valor gentico de los toros y vacas exclusivamente a travs del rendi-miento propio y del test de los hermanos, lo que permite acortar el intervalo generacional (2-3 aos). La tabla 1 da un panorama del progreso gentico para la produccin de bovinos para leche en programas de mejoramiento por medio de inseminacin artificial bajo condiciones adecuadas.
Madres de toros
Madres con registro genealgico Terneros Vacas en produccin Toros sometidos al test de rendimiento propio
Toros test IA
Toros
Semen Padres de toros

Fig. 3: Esquema de un programa de mejoramiento por medio de inseminacin artificial
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ncleos
Tabla 1: Progreso gentico esperado por ao para el ganado lechero Condiciones iniciales Rendimiento promedio Heredabilidad (h2) Coeficiente de variacin 5000 kg 25 % 15 % Seleccin de vacas 50 2
Toros Nmero de padres (rendimiento de la descendencia Nmero de madres (rendimiento propio) Exactitud de la estimacin del valor gentico (rAI) Toros (%) Vacas (%) 50 3
88 66
88 66
Tasa de seleccin (% seleccionado) Toros Vacas Intensidad de seleccin (i) Toros Vacas Intervalo generacional (aos) Toros Vacas Progreso gentico esperado (%)
1:20 1:50 2,1 2,4
1:5 9:10 1,4 0,2
7 6 1,5
7 4
La aplicacin de la transferencia de embriones en programas convencionales de mejoramiento para razas lecheras y de doble propsito se basa fundamentalmente en la lnea madre de toro en test (fig. 2). CUNNINGHAM (1976) concluy que un aumento del numero de terneros de 1 a 10 por madre de toro y por ao conducira a un aumento del progreso gentico anual de 8% en las razas productoras de leche. Dado que los programas de mejoramiento convencionales por medio de inseminacin artificial provocan un progreso gentico de 1,5%, puede considerarse ese aumento como reducido. El estudio sobre el efecto de la transferencia de embriones en programas de mejoramiento por medio de inseminacin artificial para razas bovinas de doble propsito estableci que es posible incrementar entre 5-10% el progreso gentico por ao tanto para la caracterstica produccin de carne como de leche KRULICH (1976). La tabla 2 muestra los valores esperados de progreso gentico comparando el servicio natural con la transferencia de embriones.
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Tabla 2: Progreso gentico esperado anualmente para razas bovinas de produccin de carne Condiciones inciales, aumento diario de msculo Eficiencia media Heredabilidad (h2) Coeficiente de variacin Servicio natural Aumento diario (g) Exactitud de la estimacin del valor gentico (rAI) Descendencia/vaca Intervalo generacional (aos) Toros Vacas Seleccin Toros Vacas Intensidad de seleccin (i) Toros Vacas Progreso gentico esperado por ao (%) 1,4 Msculo (%) Aumento diario (g) 1000 g 30 % 10 % TE Msculo (%) 60 % 30 % 5%
63 1
55
63 4
55
2 3 1:10 1:1
2 3 1:20 1:3
1,8 0,0 0,5 2,6
2,1 1,1 1,0
La tabla 2 indica que con el servicio natural practicado en los bovinos para produccin de carne se logra el mismo progreso gentico en la caracterstica ingesta diaria (casi la misma heredabilidad que rendimiento lechero) que en el ganado lechero bajo un programa de mejoramiento por medio de inseminacin artificial. La causa principal es que el intervalo generacional de los toros es considerablemente ms corto (2 aos en bovinos de carne frente a 7 aos en bovinos lecheros). La transferencia de embriones permite, con tasas de xito aceptables, un aumento del progreso gentico de casi un 100%, como consecuencia de la drstica reduccin de la tasa de seleccin.
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Ncleos de produccin con transferencia de embriones (Programa-MOET, Multiple-ovulationembryo-transfer) La produccin de bovinos en ncleos exige la formacin de rodeos ncleos con toros y vacas elite como as tambin llevar a cabo tests de rendimiento y la seleccin en esos rodeos. Los programas de superovulacin, transferencia de embriones y divisin microquirrgica para la produccin de mellizos idnticos pueden ponerse en prctica de dos maneras: a. Para la formacin del rodeo de excelencia (ncleo), con el objeto de concentrar los mejores genotipos hembra. b. Para aumentar la intensidad de seleccin (i) y la exactitud de la estimacin del valor gentico (rAI) del rodeo ncleo, con el fin de acelerar el progreso gentico. En pases con programas eficientes de mejoramiento con el empleo de IA ser difcil lograr mejoras considerables, a travs de programas de ncleos de produccin, para las principales caractersticas: cantidad y contenido de la leche, consumo diario, peso a la faena (CUNNINGHAM 1976, KRULICH, 1976). Las ventajas de los ncleos de produccin las constituyen en esas razas las caractersticas: conversin del alimento, resistencia a las enfermedades y fertilidad. Esas caractersticas pueden ser controladas con suficiente seguridad slo en establecimientos ganaderos, cuyo manejo y productividad pueden ser programados y dirigidos directamente por el responsable de la produccin (Estaciones de prueba). Ello es comn en ncleos de produccin de empresas productoras de aves o cerdos, no as en las Uniones de productores privados como las Asociaciones de las diferentes razas, organizaciones para la prueba de los reproductores e inseminacin artificial. La TE hace posible trabajar tambin en la produccin animal con ncleos de produccin. Los programas MOET son tambin adecuados para regiones con una reducida concentracin de tests de rendimiento como tambin de inseminaciones, dado que permiten llevar a cabo un programa de seleccin efectivo con progresos genticos aceptables a pesar de la falta de infraestructura. A continuacin se discutirn algunas formas de MOET: - Programas de TE para los rodeos - Programas MOET cerrados para razas bovinas productoras de carne - Programas MOET cerrados para razas lecheras y de doble propsito - Programas MOET abiertos Programas de TE para los rodeos En los programas para rodeos aplicando TE el principal aspecto gentico para la aplicacin de la transferencia de embriones se basa en la lnea madre-hija. Para el sevicio o inseminacin se eligen los mejores toros de la poblacin total de esa raza. Los programas de mejoramiento de los rodeos son especialmente adecuados para productores que quieren mejorar genticamante su rodeo a travs de una rpida reproduccin de las mejores vacas. BREM (1986) desarroll un modelo para la aplicacin de la transferencia de embriones y la divisin microquirrgica para producir mellizos idnticos. Las vacas adecuadas para la recoleccin de los embriones sern donantes destinadas al rodeo seleccionado. Las vacas que, desde el punto de vista gentico, no son adecuadas para la TE sern empleadas como receptoras, las que no son adecuadas para la recoleccin de los embriones sern inseminadas. Finalmente se emplearn las vaquillonas recriadas como receptoras. El xito de la seleccin de este programa empleando siempre el mismo toro y comparndolo con el servicio natural y la inseminacin artificial, depende del nmero de embriones transferibles obtenidos de cada donante, de la tasa de preez y en el caso de la divisin microquirrgica de la tasa de mellizos producidos (fig. 4).
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GT = progreso gentico de la generacin de terneros rIA = exactitud del valor de estimacin de la varianza SA = desviacin estndar gentica aditiva TP = tasa de preez TM = tasa de mellizos Fig. 4: Superioridad gentica de la descendencia empleando transferencia y microciruga de embriones en un rodeo lechero (BREM, 1986) En la tabla 3 se indica la mayor produccin de terneros con el empleo de la transferencia de embriones y de la divisin microquirrgica con diferentes tasas de xito como tambin diferentes tasas de xito del programa de TE, de la preez obtenida y de mellizos producidos. Con el aumento de la tasa de xito de la transferencia de embriones desciende el porcentaje de animales seleccionados, aumenta la eficacia de la seleccin y en consecuencia el xito final del programa.
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Tabla 3: Mayor produccin porcentual de terneros por medio de la aplicacin de TE-MC con diferentes tasas de xito. Nmero de embriones transferibles
Produccin preez 0,5 0,4 12,8 15,4 15,4 18,4 16,5 19,8
de mellizos 0,6 19,2 23,0 23,0 27,7 24,7 29,6
0,5 16,0 19,2 19,2 23,0 20,6 24,7
2 0,6 0,5 4 0,6 0,5 6 0,6
La superioridad gentica de la descendencia aumenta con el incremento de la eficacia de la TE-MC y alcanza, con una produccin de 6 embriones, una preez y produccin de mellizos de 0,5; 68% ms que en un programa sin TE-MC. La divisin microquirrgica posibilita la aislamiento de los blastmeros para la determinacin del sexo por medio del mtodo de PCR. De esta forma pueden ser transferidos en primer lugar embriones hembra y as incrementar el reducido potencial de receptoras disponibles. En general coinciden todos los trabajos publicados sobre programas de mejoramiento de rodeos en que el xito de la seleccin sobre la lnea vaca-vaca empleando la TE puede ser incrementado considerablemente. El factor limitante lo constituyen los costos de la transferencia de embriones (FEWSON, 1989). Programas MOET cerrados para razas bovinas productoras de carne LAND y HILL (1975) fueron los primeros en presentar un modelo de ncleo en bovinos productores de carne, empleando transferencia de embriones, para la seleccin de caracteres en animales en crecimiento. El modelo se basa en el empleo de un nmero fijo de vacas en el ncleo y en el destino como receptoras de las vacas no seleccionadas. La intensidad de seleccin en la lnea de vaca a vaca depende del nmero de terneros obtenidos por donante y del tamao del ncleo (ver tabla 3). Para ambos sexos se establece el principio de seleccin individual y en masa (rendimiento propio) y el intervalo generacional se puede acortar hasta dos aos. La comparacin del progreso gentico entre el programa de ncleo y el convencional de mejoramiento la constituye la caracterstica peso vivo a los 13 meses (h2 = 0,5 desviacin estndar = 40 kg). En el programa de mejoramiento de la British Meat and Livestock Commision (MLC 1971) se esperaba en 1971 un progreso gentico de 9 kg de peso vivo. En un lapso de 20 aos y con una consanguinidad tolerable de 10% (0,5% anual) sera necesario un rodeo de 500 hembras, destinando 1 toro cada 8 donantes. Reduciendo el rodeo a 300 vacas y empleando 4 donantes/toro se logra un 90% del valor mximo del progreso gentico. La fig. 5 representa el progreso gentico esperado con rodeos de diferentes tamaos y con un esquema de apareamientos segn HILL y LAND (1976).
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Fig 5: Comparacin entre esquemas de seleccin convencionales y empleando TE. La respuesta est representada en trminos relativos como la intensidad de seleccin anual (media de la seleccin diferencial entre vacas y toros/ intervalo generacional) y en la prediccin del peso a los 400 das, asumiendo h2 = 0.5 y = 40 kg. La tasa de consanguinidad est expresada para el total de donantes y receptoras (HILL y LAND, 1976)
Programas MOET cerrados para razas lecheras y de doble propsito El primer modelo para un programa de ncleos de produccin para razas lecheras fue presentado por NICHOLAS en el ao 1979. En principio es similar al modelo propuesto por LAND y HILL (1975, ver ms arriba). Resumiendo se puede afirmar que el programa MOET, aplicado en razas productoras de carne para las caractersticas que pueden ser evaluadas en el animal vivo, posibilita un duplicacin del progreso gentico comparado con los programas de mejoramiento convencionales. Para mantener la consanguinidad dentro de un lmite tolerable, el rodeo debe contar con 500 hembras. El intervalo generacional puede reducirse 2 aos. La aplicacin del programa de ncleos de produccin es especialmente de inters en regiones donde los tests de produccin para los programas de mejoramiento, sobre la base de pruebas a campo, no se han establecido an o slo pueden llevarse a
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cabo con dificultades. Los programas MOET son interesantes tambin para empresas privadas de produccin, las cuales pretenden seleccionar un gen determinado (por ej.: "Coulard- Doppellendegen", ausencia de cuernos, animales transgnicos) y desean aplicar mtodo biotcnicos (determinacin del sexo, clonado, anlisis de genoma, transferencia de genes). Los productores de animales de cabaa deben aplicar la TE y la microciruga de embriones para aumentar la intensidad de seleccin de las madres de toros y vacas para continuar luego con los mtodos tradicionales de mejoramiento (programa de seleccin del rodeo). Ello tiene la ventaja de evitar desde el principio los problemas de consanguinidad. Los modelos MOET, en discusin actualmente, se basan en los modelos publica-dos por NICHOLAS y SMITH (1983). En modelos juveniles la seleccin se lleva a cabo en ambos sexos a una edad de 12 meses a partir de la informacin de la familia materna, como el rendimiento lechero de la madre, de las medio-hermanas, hermanas enteras y de la abuela. En los modelos adultos se seleccionan los machos y hembras en base al rendimiento de las hermanas enteras, medio-hermanas y de la madre. En las reproductoras se dispone del rendimiento de su primera lactacin. El intervalo generacional para el modelo juvenil comprende cerca de 2 aos, para el adulto 3,5-4 aos mientras que en el programa de seleccin convencional son necesarios 6,5 a 7 aos. El cuadro 1 contiene informacin sobre el progreso gentico de los programas juveniles y adultos en el momento de la seleccin. Las ventajas del acortamiento del intervalo generacional tienen, sin embargo, como consecuencia una menor exactitud de la estimacin del valor gentico. Cuadro 1: Comparacin entre los esquemas MOET juveniles y adultos segn NICHOLAS y SMITH (1983) Mes 1 13 14-15 23-24 Esquema juvenil NACIMIENTO Seleccin de la generacin inicial segn el pedigree TE de la generacin inicial Nacimiento de la 1o generacin de la descendencia de TE Servicio Destete Esquema adulto NACIMIENTO
34-35 36-37
Primera lactacin concluida Seleccin de la 1o generacin segn el pedigree
Primera lactacin concluida Seleccin de la generacin inicial segn el rendimiento propio y el de las hermanas TE con la generacin inicial
TE con la 1o generacin 44-46 Nacimiento de la 2o generacin. Descendencia de TE
Nacimiento de la 1o generacin. Descendencia de TE
Formacin del ncleo

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La formacin del ncleo se puede llevar a cabo mediante la seleccin de las mejores vacas de la poblacin o la compra de vacas de alto rendimiento productivo (cuadro 2). Para la inseminacin de esas hembras se eligen en general toros de calidad internacionalmente reconocida. Segn BREM (1986) la eleccin de las hijas de las mejores madres como base del ncleo brinda la siguiente superioridad en la poblacin en la misma generacin, expresada en desviaciones estndar genticas, frente a la seleccin de vacas de cabaa (hembras de pedigree): Vacas en la poblacinVacas fundadoras del ncleo 0,53 1,83 Diferencia 1,50
De ello se concluye que la cuidadosa seleccin de las vacas fundadoras del ncleo tiene un significado definitivo en el xito de programa de ncleos de produccin.
Cuadro 2: Formacin de ncleos de produccin
- Formacin del ncleo Seleccin de las mejores hembras Seleccin de los reproductores machos de la poblacin extraa - Ncleo Superovulacin y TE Pruebas de rendimiento Seleccin de reproductores hembras y machos - Transferencia a la poblacin Distribucin de los reproductores machos para el servicio natural o IA
Esquema de un programa de ncleos cerrados de produccin Los modelos para ncleos cerrados publicados hasta el momento parten de 200 a 400 vacas en el ncleo, 16 a 64 donantes elegidas por ao y 4 a 8 toros. La figura 6 presenta el esquema de un programa de ncleo cerrado con 250 vacas en el ncleo, 32 donantes seleccionadas y 8 toros. Este programa requiere la transferencia de 500 embriones por ao.
Valores esperados del progreso gentico con programas MOET cerrados El aumento esperado del progreso gentico, resultante del acortamiento del intervalo generacional, se reduce como consecuencia de la disminucin de la exactitud de la estimacin del valor gentico, la prueba de la descendencia logra la mayor exactitud, el test de las hermanas y del rendimiento propio permiten lograr slo exactitudes medias (cuadro 3). RUANE y SMITH (1988) estimaron que el progreso gentico en un ncleo con un esquema juvenil es, en 20 aos, 55% superior al mejoramiento alcanzado por medio de la prueba de la descendencia. Con un esquema adulto la superioridad es del 20%. Esas estimaciones con modelos deterministas no pudieron ser comprobadas en estudios de simulacin.
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RUANE y THOMPSON (1991) encontraron a partir de estudios de simulacin sobre 6 generaciones que los resultados alcanzan slo el 60% (4 padres en el ncleo) hasta 70% de los valores estimados para el progreso gentico con modelos deterministas. La razn ms importante es la reduccin de la varianza entre familias como consecuencia de la seleccin (efecto Bulmer). Las tasas de consanguinidad en los estudios de simulacin despus de 6 generaciones variaron entre 4,2-4,8% con 8 padres y 7,7-7,9% con 4 toros. Ello implica 1,7 a 2,7 veces mayor tasa de consanguinidad que con modelos deterministas. La consanguinidad puede disminuirse considerablemente empleando ms de 1 toro por familia seleccionada (24-34%).
Reposicin
250 vacas del ncleo bajo control de produccin de leche e ingesta
Las vacas excedentes se destinan a los establecimientos con control de produccin
30 terneras son recriadas. 1er. Parto a los 2 aos
Eliminacin anual
Seleccin anual de las 32 mejores hembras y de los 38 mejores machos para la produccin de embriones
130 toros de ellos se seleccionan a partir del test de las hermanas (1. lactacin) y rendimiento propio
500 embriones
Nacimiento de 130 terneras
Los embriones con transferidos
Nacimiento de 130 terneros
Fig. 6: Ciclo anual de un rodeo-ncleo con un programa de superovulacin y transferencia de embriones
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Cuadro 3: Comparacin de la prueba de la descendencia frente al test de las hermanas para la produccin de leche Aos 1 1/2 3 1/2-4 Prueba de la descendencia Vaca preada con el semen del toro en prueba Prueba de las hermanas Medio-hermanas y hermanas enteras preadas o Lactacin de 4 hermanas 1 enteras y 16 medio-hermanas. Estimacin del valor gentico y seleccin
6 1/2-7
1o de 50 hijas. Estimacin del valor gentico y seleccin Mayor exactitud de la estimacin del valor gentico
Intervalo generacional ms corto
WRAY (1989) desarroll una algoritmia determinista para programas de ncleos de produccin para la especie porcina, que considera los efectos de la seleccin y la consanguinidad sobre la varianza gentica y la exactitud de la estimacin del valor gentico. Los primeros anlisis indican una mayor coincidencia de los valores estimados de ese modelo con los de los estudios de simulacin. Falta todava una comprobacin emprica del alto progreso gentico en programas cerrados de ncleos de produccin. Hasta el momento no se publicaron los anlisis de los datos de esos ncleos. Las ventajas y desventajas de los ncleos de produccin se presentan en los cuadros 4 y 5. Las figuras 7 y 8 ejemplifican un ncleo de produccin bsico y otro para la produccin de 60 toros test respectivamente para ganado Holstein en Sudfrica (DICKS, 1991a y b). Cuadro 4: Ventajas de los ncleos de produccin - Aumento del nivel gentico en la formacin del ncleo - Progreso gentico ms rpido - Mejores controles de los tests y del manejo (se evitan las manipulaciones) - Una seleccin ms orientada al valor econmico - Seleccin de caractersticas, difciles de evaluar a campo (por ej.: conversin del alimento) - Concentracin de los recursos genticos - Posibilita el empleo de tcnicas costosas y complicadas - Los resultados econmicos son alcanzados ms temprano - Menores costos a nivel nacional - Formacin de unidades-ncleos separadas para diferentes objetivos productivos y diferentes ambientes Cuadro 5: Desventajas de los ncleos de produccin - Riesgo de enfermedades (concentracin) - Riesgo como consecuencia de la concentracin de la poblacin en un slo establecimiento ganadero - Posibilidad de una interaccin genotipo-ambiental - Necesidad de capital para la formacin del establecimiento del ncleo - Una comercializacin ms intensiva del los reproductores con las desventajas que ello implica
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ncleos
Donante de embriones Venta 50% Lavaje 30%
Donante de semen
Receptoras
Vaquillas Venta o alquiler
Toritos Venta de hermanos enteros 20% Venta del 10%
Distribucin 50% en el/los Centro/s Registro de produccin
Distribucin 50% en el rodeo Registro de produccin
Toros de prueba
Progenie en test Venta del 80% Destino del 20% a la industria
Venta 90% Lavaje
Seleccin: 10% de las mejores
Vacas en produccin
Seleccin: 10% de las mejores Lavaje
Identificacin del mejor 5% ()
Fig 7: Un programa bsico de ncleo de produccin propuesto para la empresa Taurus stock improvment cooperative limited para ganado Holstein Friesian en Sudfrica (DICKS, 1991a)
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260 embriones 60% de preez 160 preeces (requiere 200 receptoras aprox.)
75
75
55 venta
20
15 venta
60 a
80 embriones Recoleccin de embriones 180 embriones

Fig. 8: Un programa-ncleo para la produccin de 60 toros Holstein para pruebas de rendimiento (DICKS, 1991b) Programas abiertos de ncleos de produccin CHRISTENSEN (1984) y COLLEAU (1985) desarrollaron programas hbridos a partir de programas MOET cerrados y programas de mejoramiento convencionales, aplicando inseminacin artificial. Esos programas se designan en general como programas abiertos de ncleos de produccin. La seleccin se realiza sobre la lnea masculina (padres de vacas y toros, ver figura 2) como en los programas convencionales de seleccin con IA. Los toros test, seleccionados en el ncleo, son sometidos a una prueba de la descendencia a campo. Los mejores toros elegidos de la descendencia (padres de toros) son incorporados al ncleo. El manejo de las madres de toros en el rodeo ncleo bajo un ambiente controlado sirve para impedir su trato preferencial ("preferential treatment") por parte de los cabaeros. Al mismo tiempo el ambiente controlado provoca una mayor heredabilidad como consecuencia de la baja varianza fenotpica. VA h2 =-------; (VA = varianza gentica aditiva; VP = varianza fenotpica) VP Ambas conducen a una mayor exactitud de la estimacin del valor gentico y con ello a una mayor seguridad en la seleccin de las madres de los toros. COLLEAU (1985) desarroll un programa abierto con 3 variantes, de las cuales 2 (A y B) se describen en el cuadro 6. En la variante A la descendencia cuenta con una edad de 9 meses en el momento de la seleccin de las vacas donantes, de forma tal que el intervalo generacional comprende 2 aos. Ese acortamiento del intervalo generacional exige sin embargo la transferencia de los embriones en un
Poblacin
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momento en el cual an no es seguro si la vaca ser elegida como donante. Ello transferencias de los embriones y con ello los costos comparndolo con la variante B, intervalo generacional se duplica frente a la variante A. Comparando con el programa mediante IA la variante A es superior en aproximadamente 10% y en todos los casos variante B. Cuadro 6: Modelos para ncleos de produccin abiertos segn COLLEAU (1985) Edad de la donante en meses 16 18 20 25 29 36 a partir de una lactacin parcial 38 partir de la primera lactacin TE Esquema A ET ET Destete Seleccin Seleccin a Esquema B Concepcin Destete
aumenta las en la cual el convencional mejor que la
COLLEAU (1986) ampli la variante A mediante la importacin de semen congelado de toros probados de otras poblaciones o de embriones congelados. La tabla 4 contiene los resultados ms importantes. Tabla 4: Progreso gentico (%/ ao) en el rodeo-ncleo con el empleo de semen de toros probados de una poblacin extraa frente al mtodo convencional con uso de IA.
Progreso gentico/ao (%) Aos A 0 500 100 1 500 165 130 121 140 120 127 81 29 6 137 151 115 121 120 121 125 133 119 120 121 125 62 75 18 25 3 6 B 100 127 109 119 120 119 120 36 11 2 0-10 10-20 20-30 Inseminaciones de la poblacin extraa 0-10 10-20 20-30
A = Superioridad inicial de los toros extraos (0 1 G) B = Nmero de toros en test/ao en la poblacin extraa En la tabla 4 se parte de la premisa que slo toros elite son seleccionados para el ncleo (los mejores 3 toros por ao). Los resultados muestran que en la superioridad de la poblacin extraa el nivel gentico de esa poblacin con esos toros puede alcanzarse en 10 aos. En una seleccin consecuente los toros
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criados en el ncleo son mejores que los extraos, lo que se destaca en los bajos valores del semen extrao. La transferencia a la poblacin hembra local es, sin embargo, lenta. Despus de 30 aos la situacin gentica de la poblacin, con la aplicacin de un programa abierto de ncleo de produccin, es superior en un 25% comparado con la importacin de semen de una poblacin extraa, en marco de un programa convencional de mejoramiento con IA. CHRISTENSEN (1989) sugiere otra variante en la combinacin entre las pruebas de la descendencia y los programas de mejoramiento con IA para el plan de seleccin de toros elite. En ese plan las hijas, producto del apareamiento de los toros elite (padres de toros) con madres de toros, son superovuladas lo ms temprano posible (14-18 meses). Los embriones recolectados son transferidos frescos, de manera tal que dos aos despus la primera generacin de hembras alcance la pubertad, pueda ser apareada con los toros elite de la siguiente generacin y est disponible para el programa MOET. El cuadro 7 indica que en la 4o generacin 86,5% de los genes de las hembras del ncleo se originan de toros elite. La probabilidad de que ello ocurra sin transferencia de embriones comprende 2,6%. Ese plan tiene la ventaja, que los animales del ncleo no deben ser mantenidos en un rodeo cerrado o en una Estacin para madres de toros. El nico criterio de seleccin es el componente gentico de los toros elite, sobre el cual los tratamientos especiales no tienen efecto y la cra de las madres de toros puede llevarse a cabo en cabaas normales. Sin embargo de esta forma no es posible considerar algunas caractersticas porque no pueden ser controladas a campo, como por ej. conversin del alimento. Cuadro 7: Componente gentico de toros elite segn CHRISTENSEN (1989) Generacin Componente gentico de toros elite aos I a V (%) I = 50 I = 25 III = 50 I = 12,5 II = 25 III = 50 I = 6 II = 12,5 III = 25 IV = 50 I = 3 II = 6 III = 12,5 IV = 25 V = 50 Probabilidad sin MOET (%) 100 40 16
0 1 2
6,4
2,6
El programa de evaluacin de las donantes de la Cooperativa de Produccin de Osnabrck (Repblica Federal de Alemania) sigue un camino totalmente diferente, combinando partes del modelo MOET con los programas convencionales de mejoramiento con IA. El objetivo principal de esa iniciativa es la evaluacin neutral estandarizada del rendimiento de las potenciales madres de toros (Estacin de prueba de toros), para eliminar el efecto del tratamiento especial de las madres de los toros por parte de
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ncleos
los cabaeros y considerar adems otras caractersticas. El intervalo generacional puede mantenerse, a travs de un programa de dos niveles, relativamente corto. En la primera lactacin se lleva a cabo una preseleccin a partir del rendimiento en la cantidad de leche, grasa (%) y protena (%, rendimiento en 100 das). En ese nivel se selecciona 1% de las vaquillonas en prueba y se lleva a cabo la TE. La seleccin inmediata y definitiva de las madres de los toros se lleva a cabo en la 2o lactacin. En el segundo nivel de la seleccin se elegirn 20 madres de toros de 70 vacas en test. La figura 9 muestra el programa de la Cooperativa de produccin de Osnabrck. Segn KANDZI y GLODEK (1987) se puede aumentar con ese programa el progreso gentico tres veces sobre la lnea madre-hijo y 20% en total, eliminado los tratamientos especiales. Los ejemplos acentan en suma, que los programas abiertos de ncleos de produccin no muestran un sistema uniforme sino la integracin de la TE bajo las condiciones dadas en los programas establecidos de mejoramiento gentico mediante IA, con el objeto de optimizar el progreso gentico. Tiempo Progreso selectivo en las madres
10 000 vaquillonas OHG 1 - Prueba de ascendencia - Prueba propia - Clasificacin del tipo - Facilidad de ordee 31 meses: Produccin de embriones 40 meses: Nacimiento de la descendencia TE 100 vaquillonas donantes 300 donantes
Empleo de la descendencia
Reposicin
28 meses: Paricin de vaquillonas
Transferencia de embriones para producir:
42 meses: 2 paricin
70 mejores vaquillonas donantes 2 seleccin Prueba de Estacin de TE: - 2 lactacin - Fertilidad - Estabilidad metablica - Sanidad de la ubre Venta
50 meses: Seleccin de las madres de toros
20 madres para toros de prueba de OHG
20 toros de prueba
Fig. 9: Programa de evaluacin de las vacas donantes de la Cooperativa de Productores de Osnabrck (Repblica Federal de Alemania)
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Krusslich
293
Bibliografa BREM, G. 1986-1990. Mikromanipulation an Rinderembryonen und deren Anwendungs-mglichkeiten in der Tierzucht. Ferdinand Enke Verlag Stuttgart; Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aires. CHRISTENSEN, L.G. 1984. Breeding problems in small cattle populations. 35th Annual Meeting of EAAP, The Hague (C) Session II, 18 pp. CHRISTENSEN, L.G. 1989. Rinderzucht nach 1992. Zchtungskunde 61,428-439 COLLEAU, J.J. 1985. Efficacit gntique du transfert d'embryons dans les noyaux de slection ches les bovins laitiers. Gntique, Slection, Evolution 174, 499-538. COLLEAU, J.J. 1986. Genetic improvement by ET within an open selection nucleus in dairy cattle. Proceedings of the 3rd World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Lincoln, Nebrasca USA, 127-132 CUNNINGHAM, E.P. 1976. The use of egg transfer techniques in genetic improvement. Publication Commission of the European Communities, EUR 5491; 345-35 DICKS, E. L. 1991a. Taurus nucleous herd breeding. The concept. Taurus Kop/ Coop news-nuus. 13 (vol 2): 5-6. DICKS, E. L. 1991b. Nucleeus herd breeding. II. The requeriments. Taurus kop/Co-op news nuus, 13 (vol 4): 6. FEWSON, D. 1989. Economic aspects of MOET breeding schemes. En: KALM, E. und LIBORIUSSEN, T. New Selection Schemes in Cattle: Nucleus Programmes. Publication EAP, No. 44 pp 143-160. Pudoc. Wageningen HILL, W.G., and LAND, R.B. 1976. Superovulation and ovum transplantation in genetic improvement programmes. Proceedings of the EEC Seminar on egg transfer in cattle. L.E.A. Rowson (ed.). 355-368 KANDZI, A. und GLODEK, P. 1987. Zur zchterischen Wettbewerbsfhigkeit des neuen OHG-Zuchtprogrammes mit bisherigen KB-Zuchtprogrammen und neuzeitlichen Nukleussystemen. Die Osnabrcker Schwarzbuntzucht 66, 20-21 KRULICH, H. 1976. Application of superovulation and egg transplantation in AI breeding programmes for dual purpose cattle. Publication Commission of the European Communities, EUR 5491, 333-342 LAND, R.B and HILL, W.G. 1975. The Possible Use Of Superovulation and Embryo Transfer In Cattle To Increase Response To Selektion Anim. Prod. 21;1 - 12 NICHOLAS, F.W. 1979. The genetic implications of multiple ovulation and embryotransfer in small dairy herds. Proceedings of the 30th Annual Meeting of the EAAP, Harrogate CG1.11 NICHOLAS, F.W. and SMITH, 1983. Increased rates of genetic change in dairy cattle by embryo transfer and splitting. Animal Production 36, 341-353. RUANE J. and SMITH, C. 1988. The genetic response possible in dairy cattle improvement by setting up a multiple ovulation and embryo transfer (MOET) nucleus scheme Gntique, Slection, Evolution RENDEL, J. and ROBERTSON, A. 1950. Estimation of genetic gain in milk yield by selection in a closed herd of dairy cattle. J. Genet., 50: 1-8. RUANE and THOMPSON, R. 1991. Comparison of simulated and theoretical results in adult MOET nucleus schemes for dairy cattle. Livestock Production Science 28, 1-20 WRAY, N.R. 1989. Consequences of selection in closed populations with special reference to closed nucleus herds of pigs. PhD. Thesis, University of Edinburgh,
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Transferencia de embriones

Munich, enero de 1993

Palma & Brem

Transferencia de embriones y biotecnologa

BIOTECNOLOGIA EN PRODUCCION ANIMAL

Clement-Sengewald, Palma y Brem

Clement-Sengewald, Palma y Brem

Fig. 1: Modelo de produccin de quimeras a partir de varios embriones

Clement-Sengewald, Palma y Brem

Clement-Sengewald, Palma y Brem

Da 0 (natural o inducido) 07h 5 mg FSH-p 19h 5 mg FSH-p

07h 4 mg FSH-p 19h 4 mg FSH-p 2a dosis* PGF2

07h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2 19h 3 mg FSH-p + 1 dosis PGF2

07h 3 mg FSH-p 19h 3 mg FSH-p + deteccin de celo deteccin de celo e IA

Deteccin de celo Da 0 = celo inducido

Recoleccin de embriones mtodo no quirrgico

Da 0 Colocacin del PRID, esponja intravaginal o implante subcutneo

07h 5 mg FSH-p 19h 5 mg FSH-p

07h 4 mg FSH-p 19h 4 mg FSH-p

19h 3 mg FSH-p + deteccin de celo deteccin de celo e IA IA

Recoleccin de embriones mtodo no quirrgico

FOLICULOS: ............................................. CUERPOS LUTEOS: .................................. RECUPERACION DE EMBRIONES: DIA: ........

1. Pasa sin Dificultad 2. Pasa con Dificultad 3. No pasa

PRIMER TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:

SEGUNDO TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:

TERCER TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:

CUARTO TRATAMIENTO Fecha: Hormona: Dosis:

Cabodevila & Torquati

Comparacin de la respuesta superovulatoria despus de tratamientos con PMSG y FSH-p

Ovocitos y embriones recolectados x DS

KIM y col. (1988)

PMSG (2500 UI) FSH-p (50 mg)

FOOTE y col. (1989)

Cabodevila & Torquati

Transferibles 56 66 56 56 45 34 1 0,4 31 7 1b 2 0,7a 3 6 5 0,2 0,3 3 3 3 3 3 2 NR NR NR

(%) 57 37a 45 35a 52 34a 43 42a 47 36a 40 38b NR NR NR NR 55 34 20 1 38 52 40 41 35 33 40 43 25 15

Autor/es DONALDSON (1984)

25% 50% 100%+ 200%

MAURER y col. (1985)

PAWLYSHYN y col. (1986)

5 mg 10 mg 15 mg 20 mg 25 mg 30 mg 40 mg 1500 UI 3000 UI 6000 UI

ZEITOUN y col. (1988)

Cabodevila & Torquati

No de recolecciones Sin ovocitos y embriones recolectados Sin embriones transferibles

393 12%a 27%a

Cabodevila & Torquati

Cabodevila & Torquati

I **** n= 12 II **** n= 12 III **** n= 12 Control IV **** n= 12

Cabodevila & Torquati

Cabodevila & Torquati

14a 3707 68a

51b 604 58b

Parmetros Nmero de tratamientos CL/tratamiento Embriones transferidos/tratamiento Preeces/tratamiento de preeces

Infeccin uterina 11 10a 2ab 1ab 12

Quistes ovricos 16 4b 0,2b 3 3

Cabodevila & Torquati

Cabodevila & Torquati

Cabodevila & Torquati

Cabodevila & Torquati

Cabodevila & Torquati

Fig. 1: Mtodo transvaginal GODARD SIUR, 1975)

Recoleccin de los embriones

Recoleccin de los embriones

Fig. 5: Circuito cerrado de 3 vas (Cassou, IMV, Francia)

I n= 12 II n= 12 III n= 12 Control IV n= 12