Instituto Tecnolgico de Durango alimentos

Manual de Prcticas de Aseguramiento de la Calidad Microbiolgica de los M. en C. Patricia Rodrguez Briones

LABORATORIO DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD MICROBIOLGICA DE LOS ALIMENTOS

CURSO AGOSTO - DICIEMBRE DE 2010

PRCTICA #4

ANLISIS BACTERIOLGICO DE AGUA POTABLE Y AGUA PURIFICADA

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INTRODUCCIN Para los fines de control sanitario de la potabilidad de una fuente de abastecimiento de agua, la frecuencia de los anlisis est en funcin de la poblacin, por ejemplo, para una ciudad de cinco millones de habitantes, se considera que la vigilancia sanitaria es satisfactoria con la aplicacin a 500 exmenes mensuales. Las muestras de agua deben ser colectadas en lugares estratgicamente distribuidos dentro de la ciudad. Decir que la vigilancia sanitaria es satisfactoria, significa que los resultados obtenidos son vlidos ya sea que resulten o no positivos a la contaminacin. El proceso de la potabilizacin del agua involucra dos etapas principales: su acondicionamiento fsico y su acondicionamiento microbiolgico. Ocasionalmente se hace necesario eliminar o disminuir la concentracin de algunas sustancias qumicas. El anlisis de laboratorio para el control de la potabilidad del agua desde el punto de vista bacteriolgico incluye tres pruebas: el recuento de bacterias mesoflicas aerobias, la estimacin del NMP (nmero mas probable) de organismos coliformes y la valoracin del cloro residual. El valor de la cuenta de colonias en placa a 35C ha encontrado apoyo y rechazo por diferentes autoridades. Generalmente se acepta que las aguas protegidas contra la contaminacin natural, contienen bajo nmero de bacterias: menos de 100/mL. En consecuencia el hallazgo de cifras elevadas se interpreta como una indicacin de exposicin a cualquier tipo de contaminacin. La tcnica del NMP es, incomparablemente, ms sensible que el recuento en placa, ya que pone de manifiesto unos cuantos grmenes o uno solo, en un gran volumen de muestra, tericamente litros. Por esta razn encuentra aplicacin en el anlisis del agua en donde la presencia de dos
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organismos coliformes en 100mL, ya reclama atencin especial en su sistema de abastecimiento. El hipoclorito de sodio o de calcio y el cloro gaseoso por su efectividad, economa y facilidad de aplicacin y de control se utilizan ampliamente en la desinfeccin del agua. Una concentracin de 0.1 a 0.3 ppm de cloro residual en el agua destinada para el consumo humano es satisfactoria. Con el presente estudio se pretende evaluar los riesgos de contaminacin fecal reciente en el agua distribuida por Aguas de Municipio en la ciudad de Durango as como evaluar la calidad sanitaria de diferentes marcas comerciales de agua embotellada.

FUNDAMENTOS. (En la versin electrnica, comienza a teclear aqu los fundamentos de la prctica) M T O D O. Toma de la muestra. Las muestras de agua que se destinan para examen bacteriolgico deben colectarse tomando las precauciones necesarias para evitar el ingreso de microorganismos ajenos a la fuente de abastecimiento de que se trate; por ejemplo, cuando se colectan muestras de agua de la llave debern limpiarse, previamente con toda escrupulosidad frotando con papel absorbente limpio, el exterior y el interior de esa llave y dejar salir el agua a toda capacidad durante tres minutos. Se dispondr por tanto de frascos estriles de vidrio de tapn esmerilado de 500mL de capacidad, transparente y de boca ancha. En su interior se colocarn, previo a la esterilizacin 0.4mL de solucin de tiosulfato de sodio al 10% a fin de inactivar y detener la accin del cloro que pudiera contener el agua. El frasco con muestra que se va a usar para determinar cloro residual no llevar tiosulfato.

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El agua de estanque o de ro se colocar en frascos de los arriba descritos, la boca del frasco se orientar de manera que reciba directamente la corriente del agua. En el caso del hielo se debe colectar la muestra con un picahielo y cucharilla metlica estriles. En todos los casos es indispensable evitar que el cuello o tapn del frasco se ponga en contacto con los dedos o cualquier otro material. El tapn se retirar del frasco solamente el tiempo Esto deja un iniciarse tan necesario para colectar la muestra. El frasco se llenar a los 2/3 de su capacidad. espacio suficiente para homogenizar la muestra. El examen de la muestra colectada debe rpidamente como sea posible a fin de evitar disminucin o aumento en el nmero de bacterias presentes. No es necesario refrigerar la muestra, pero la recomendacin se hace en el sentido de conservarla, durante el transporte, a la temperatura a la que se encontraba en el momento de la recoleccin. inciertos. En el momento mismo de la recoleccin debe determinarse la concentracin de cloro residual; si no se cuenta con equipo porttil, transportar entonces la muestra lo ms rpido posible al laboratorio. Cuando el examen se inicia 3 horas despus de colectada la muestra, los resultados empiezan a ser

MATERIALES

MEDIOS

DE

C U L T I V O.

Para cada muestra se requiere:

1 Frasco estril de vidrio de tapn esmerilado de 1 litro de capacidad, transparente y de boca ancha. En su interior se colocarn previo a la esterilizacin 0.4mL de solucin de tiosulfato de sodio al 10% con el fin de inactivar y detener as la accin del cloro que pudiera contener el agua.

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1 Frasco de dilucin limpio (sin tiosulfato). 2 Cajas petri estriles para vaciar 15mL de agar para mtodos estndar (AME). 1 Tubo de ensaye limpio para la prueba de cloro residual. 5 2 Tubos con 10mL de caldo lactosado concentracin 200% y Tubos con 10mL de caldo lactosado concentracin sencilla y campana de fermentacin. 2 Pipetas de 10mL estriles. 3 Pipetas de 1mL estriles. 1 Pipetas de 2mL limpias. 7 2%. 1 Caja de petri con agar eosina azul de metileno solidificado. 1 Picahielo estril. 1 Cuchara estril. 1 Colormetro de Taylor y reactivo de ortotolidina. Tubos con 10mL de caldo lactosado verde bilis brillante al campana de fermentacin.

PROCEDIMIENTO
Recuento de bacterias mesoflicas aerobias. Para cada muestra analizada seguir los siguientes pasos: a) Agua potable: Inocular por duplicado 1mL del agua de muestra en el centro de una caja petri estril agregar 15mL de agar para mtodos estndar (AME ) fundido y enfriado a 44 46C. No debe transcurrir ms de 20 minutos entre estas dos operaciones. Inmediatamente incorporar el inculo al medio mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs hacia delante. Evitar el derrame del lquido y su contacto con la cubierta de la caja. Dejar solidificar e incubar a 37C

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durante 48 horas. Contar las colonias desarrolladas en la placa, incluso las puntiformes y reportar como UFC/mL. b) c) Hielo: Dejar fundir la muestra completamente y proceder como con el agua potable. Agua purificada: Limpiar escrupulosamente el exterior de la botella o garrafn, abrir junto al mechero y proceder como con el agua potable.

Nmero ms probable de organismos coliformes (NMPOC ) a) Prueba presuntiva Inocular con 10mL de muestra cada uno de los 5 tubos de fermentacin con caldo lactosado de doble concentracin de 200%. Inocular con 1mL de muestra un tubo de fermentacin de concentracin sencilla. Inocular con 0.1mL de muestra un tubo de fermentacin de concentracin sencilla. Incubar los 7 tubos a 35 37C durante 48 en cualquier cantidad dentro de la
+/-

3 horas. de La

Observar cuidadosamente cada tubo. La presencia de gas campana bacteriano. fermentacin hace positiva la prueba. Adems, el tubo positivo mostrar denso desarrollo ausencia de gas en los tubos hace negativa la prueba.

b) Prueba confirmativa

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Transferir individualmente de cada tubo positivo de 2 a 3 asadas del cultivo a un tubo de fermentacin con caldo verde brillante bilis al 2%.

Incubar a 35 37C durante 48

+/-

3 horas.

La formacin de gas en cualquier cantidad dentro de la campana hace positiva la prueba. La ausencia de gas en los tubos hace negativa la prueba.

Determinar el NMP de organismos coliformes en la muestra de acuerdo con la tabla 4.1

c) -

Prueba complementaria De los tubos que den positiva la prueba confirmativa se toma una asada y se inoculan placas petri con agar EMB previamente solidificado por el mtodo de siembra en estras. Se incuban las cajas de 24 a 48 horas a 35 37C. Observar el tipo de crecimiento. En el medio EMB, las colonias tpicas de coliformes crecen de color caf obscuro o azul obscuro con la porcin central elevada y usualmente aunque no siempre con un brillo metlico o rosa plido o gris y mucosas con o sin estras de brillo metlico.

Determinacin del cloro residual Aplicar el ensayo de las fuentes de agua sujetas a cloracin que no hayan sido sometidas a la accin de carbn activado. Efectuar la prueba en un tubo limpio enjuagando varias veces con el agua por examinar.

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A 1 2mL de la muestra adicionar 2 gotas de reactivo de ortotolidina. Invertir el tubo y comparar el color desarrollado con la escala del colormetro de Taylor.

La tabla 4.1 da lmites para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando son usados 5 tubos con 10mL, y 1 tubo con 1mL y 1 tubo con 0.1mL.

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DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO PARA EL ANLISIS MICROBIOLGICO DEL AGUA POTABLE Agua potable + 0.4 mL de tiosulfato de sodio al 10%

Cuenta estndar

Organismos coliformes tcnica NMP

Inocular 10mL de agua a c/tubo

Vaciado en placa: Inocular 1mL de agua e incorporar 15-20mL de agar para mtodos estndar con movimientos rotatorios. Incubar a 35C por 48 horas **Inocular 1mL de agua Prueba Presuntiva

**Inocular 0.1mL de agua Incubar a 35 C / 48 horas

* Tubos con 10mL de caldo lactosado al 200% **Tubos con 10mL de caldo lactosado al 100%

Pasar a la prueba confirmativa: Inocular 2 3 asadas de los tubos que muestren gas en la campana a tubos con caldo verde brillante bilis al 2%

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Tabla 4.1 Nmero ms probable de organismos serie 5, 1, 1 Nmero de tubos positivos de:
5 tubos de 10mL
0 0 1 1 2 2 3 3 4 4 4 5 5 5 5

NMP/100m L

Lmite de NMP
Inferior Superior
5.9 13 13 14 19 19 29 30 46 48 53 330 370 3700

1 tubo de 1mL
0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1

1 tubo de 0.1mL
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 2 2.2 4.4 5 7.6 8.8 12 15 20 21 38 96 240

0.05 0.05 0.52 0.54 1.5 1.6 3.1 3.3 5.9 6 6.4 12 12 88

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OBSERVACIONES

Nmero de colonias encontradas en la placa con agua potable:

Nmero de colonias encontradas en la placa con agua potable:

Fig 4.2

Morfologa de las Bacterias Mesoflicas aerobias (BMA) en Agar

para Mtodos Estndar.

Nmero de colonias encontradas en la placa con agua purificada:

Nmero de colonias encontradas en la placa con agua purificada:

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Fig. 4.3 Prueba confirmativa del NMP

Fig 4.5 Prueba complementaria del NMP. Observaci de la morfolog Comparaci de intensidad del color de la muestra muestra con el color
Nombre deletro y nmero de control Alumno colonial de los organismos coliformes en EMB

de Taylor

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Fig. 4.6 Escala del colormetro de Taylor

R E S U L T A D O S.

No. de DESCRIPCIN DE generales. muestr LA MUESTRA

a

Tabla 4.2. Resultados PROCEDENCIA

CUENTA CALIFICACIN ESTANDAR NMPOC /100mL SANITARIA UFC /mL

1 2

A. de fresa $16 / l A. de horchata con leche $18 / l A. de horchata $24 / l A. de cebada

" La michoacana " Fijo " Los molletes " ITD Fijo Fracc. La Forestal Ambulante Plazuela Baca Ortiz

7310 290

ms 1,100 3.6

7040

43

910

15

4 5 6
$10 / l A. de horchata $16 / l Ambulante " Que Gorditas " Fijo 900 290

1.

Recuento de bacterias mesoflicas aerobias.

Cuenta estndar de colonias incubadas a 37C durante 48 horas: _____________UFC / mL

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2. Estimacin del nmero ms probable ( NMP ) de organismos coliformes: Para la combinacin: __________, ___________, ___________, de la tabla 4.1. El NMP/100mL de organismos coliformes es de:_________________

3.

Calificacin sanitaria*: _____________________

*Consulta los siguientes documentos: MODIFICACION A LA NORMA Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, Salud ambiental, agua para uso y consumo humano-Lmites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilizacin. NORMA Oficial Mexicana NOM-041-SSA1-1993.Agua purificada envasada. Especificaciones sanitarias.

ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS: (En la versin electrnica comienza a teclear en este rengln el anlisis que hiciste de tus resultados y su respectiva discusin)

CONCLUSIONES: (En la versin electrnica comienza a teclear en este rengln tus conclusiones)

REFERENCIAS. (En la versin electrnica, anota en orden alfabtico las referencias bibliogrficas y de recursos electrnicos que hayas

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consultado para tus fundamentos y para el anlisis y discusin de resultados).

Fecha de realizacin de la prctica: ________________ Fecha de entrega de la prctica: ___________________ Firma del alumno: _________________________ Comentarios del profesor: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

Evaluacin: ___________

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