UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUB Programa de Ps-Graduao em Materiais para Engenharia Departamento de Fsica e Qumica - Instituto de Cincias Exatas Dissertao

de Mestrado

BIOSSENSORES DE COLESTEROL BASEADOS NO SISTEMA POLI(LCOOL VINLICO)/FTALOCIANINA

Mayler Martins

Orientador: Prof. Dr. Alvaro Antonio Alencar de Queiroz UNIFEI

Setembro de 2006

Mayler Martins

Biossensores de Colesterol Baseados no Sistema Poli(lcool Vinlico)/Ftalocianina

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado da Universidade Federal de Itajub, como requisito parcial para a obteno do ttulo de mestre em Cincias em Materiais para Engenharia.

rea de concentrao: Polmeros e Cermicas.

Orientador: Prof. Dr. Alvaro Antonio Alencar de Queiroz UNIFEI

Itajub/MG Universidade Federal de Itajub 2006

ii

Dedico este trabalho minha famlia, em especial minha irm, Mireille Martins.

iii

Agradecimentos
Agradeo primeiramente a Deus; minha famlia, pelo constante incentivo e suporte; Em especial, ao Prof. Dr. lvaro A. A. de Queiroz, pelas discusses, apoio, conselhos e amizade, pelo comprometimento com minha formao pessoal e cientfica e por confiar em meu trabalho; Prof. Dr. lcio Rogrio Barrak pelo fundamental auxilio nas anlises trmicas, pelas boas conversas e pela amizade; Prof. Dr. cio J. Frana, pela ajuda com a modelagem molecular; Prof. Dr. Gustavo Abel Abraham (INTEMA), Argentina, pela espectroscopia FTIR; Prof. Dr. Demtrio Arthur Werner Soares, pela utilizao do laboratrio de caracterizao eltrica; Aos demais professores do curso de mestrado em Materiais para Engenharia; Aos professores do IPEN-USP pelas anlises microestruturais; Universidade Federal de Itajub, pela infra-estrutura e suporte; Aos funcionrios da secretaria do ICE-UNIFEI, Matilde, Marlia, Edvandra, Hlio, Roseli e Valdete; s funcionrias da PPG, em especial Maria Alta; Aos demais funcionrios da UNIFEI; Aos colegas do curso, em especial a Nirton Cristi; Ao aluno de IC, Robson E. Faria, pela indispensvel ajuda com os procedimentos experimentais; Jssika Santos, pelo companheirismo, afeto e compreenso; Aos membros da banca, pelas crticas e sugestes que valorizaram este trabalho; CAPES e FAPEMIG, pelo apoio financeiro; A todos que, com seus conhecimentos, incentivos e crticas colaboraram para o desenvolvimento deste trabalho.

iv

SUMRIO

Lista de figuras Lista de tabelas Lista de abreviaturas Resumo Abstract

viii xii

xiii
xv xvi

CAPTULO 1 ASPECTOS GERAIS DO TRABALHO

1.1 O colesterol 1.2 Mtodo clnico tradicional para dosagem de colesterol 1.3 Consideraes finais 1.4 Referncias bibliogrficas

1 4 5 6

CAPTULO 2 BIOCATALIZADORES

2.1 Noes gerais 2.1 Aspectos termodinmicos dos biocatalizadores 2.2 Bioqumica das reaes catalisadas por enzima 2.3 Mtodos de imobilizao de enzimas 2.4 A enzima colesterol oxidase 2.5 Consideraes finais 2.6 Referncias bibliogrficas

7 9 13 16 18 20 21

CAPTULO 3 BIOSSENSORES

22

3.1 Conceitos fundamentais 3.2 Biossensores para monitorao de colesterol 3.3 Consideraes finais

22 24 26

v 3.4 Referncias bibliogrficas 27

CAPTULO 4 BIOFISICA DOS BIOSSENSORES

28

4.1 Transio solgel do sistema PVA/H3BO3 4.2 Termodinmica das reaes qumicas 4.3 Temperatura de transio vtrea e fuso cristalina 4.4 Estabilidade mecnica 4.5 Parmetro de solubilidade 4.6 Mediadores de eltrons 4.7 Consideraes finais 4.8 Referncias bibliogrficas

28 31 33 36 37 38 39 40

CAPTULO 5 FENMENO DE TRANSPORTE DE GUA EM MEMBRANAS POLIMRICAS 42

5.1 Introduo 5.2 Transio de fase volumtrica 5.3 A primeira lei de Fick 5.4 A segunda lei de Fick 5. 5 Determinao do coeficiente de difuso 5.6 Mecanismo de difuso de solvente atravs de uma membrana polimrica 5.7 Parmetros termodinmicos associados ao processo de difuso 5.8 Densidade de reticulaes 5.9 Consideraes finais 5.10 Referncias bibliogrficas

42 42 45 46 49

56 57 58 58 59

CAPTULO 6 MODELAGEM MOLECULAR COMO FERRAMENTA DE PESQUISA EM CINCIA DOS MATERIAIS 61

6.1 Introduo 6. 2 O modelo das Partculas Independentes 6.3 Aproximao de BornOppenheimer

61 62 63

vi 6.4 Aproximao de HartreeFock 6.5 Aproximao LCAO 7.6 Equaes de RoothaanHall 6.7 Limitaes do modelo de HartreeFock 6.8 Mtodos semiempricos 6.9 Modelos grficos 6.10 Consideraes finais 6.11 Referencias bibliogrficas 63 65 67 68 69 70 72 72

CAPTULO 7 CONDUO ELTRICA EM POLMEROS

74

7.1 Orbitais Moleculares 7.2 Transporte eletrnico em sistemas desordenados 7.3 Determinao da condutividade eltrica 7.4 Consideraes finais 7.5 Referencias Bibliogrficas

74 76 78 79 80

CAPTULO 8 OBJETIVOS

81

CAPTULO 9 MATERIAIS E MTODOS

83

9.1 Preparo do biossensor 9.2 Caracterizao fsicoqumica do biossensor 9.2.1 Estudo do transporte de gua em membranas de PVA 9.2.2 Propriedades mecnicas e trmicas dos hidrogis 9.2.3 Caracterizao espectroscpica (UVVis/FTIR) 9.2.4 Anlise microestrutural por MEV 9.2.5 Transporte eletrnico em filmes de PVA/Ftc 9.3 Referncias bibliogrficas

83 85 85 85 90 94 95 97

CAPTULO 10 RESULTADOS E DISCUSSO

99

10.1 Caracterizao fsicoqumica do biossensor 10.1.1 Anlise da microestrutura por MEV

99 99

vii 10.1.2 Difuso de fluido fisiolgico atravs da membrana 10.1.3 Avaliao das propriedades mecnicas 10.1.4 Caracterizao trmica das membranas 10.1.5 Caracterizao Espectroscpica (UV/Vis, FTIR) 10.2 Modelagem molecular do sistema PVA/Ftc 10.3 Caracterizao eltrica do biossensor 10.4 Concluses parciais 10.4 Referncias bibliogrficas 101 109 116 120 125 132 137 137

CAPTULO 11 ANLISE DA PERFORMANCE DO BIOSSENSOR

139

11.1 Anlise da performance 11.2 Concluses parciais 11.3 Referncias bibliogrficas

139 142 142

CAPTULO 12 PERSPECTIVAS FUTURAS

143

viii

Lista de figuras
Figura 1.1: Estrutura qumica da molcula de colesterol (A) e estrutura obtida por modelagem molecular da molcula de colesterol (B).................................................... 1 Figura 1.2: Colapso da parede arterial devido ao acmulo de tecido fibro gorduroso (A)............... 3 Figura 1.3: Figura esquemtica das etapas envolvidas na metodologia tradicional para dosagem de colesterol no sangue................................................................................... 4 Figura 2.1: Estruturas primaria (A), secundria em hlice (B), secundria em folha (C), terciria (C) e quaternria (D) das enzimas.................................................................... 8 Figura 2.2: Barreira de energia para uma reao no catalisada por enzima (A) e para uma reao catalisada por enzima (B).................................................................. 11 Figura 2.3: Mecanismo de ao enzimtica segundo o modelo chave-fechadura (A) e a teoria do encaixe induzido (B)................................................................................ 12 Figura 2.4: Efeito da concentrao do substrato na velocidade de uma reao catalisada por enzima..................................................................................................... 13 Figura 2.5: Grfico Lineweaver-Burk ............................................................................................ 15 Figura 2.6: Ilustrao esquemtica dos mtodos de imobilizao de enzimas. (A) Enzima adsorvida por uma superfcie; (B) enzima ligada covalentemente a uma superfcie; (C) enzima ocluda em um polmero reticulado; (D) enzima confinada por uma membrana semipermevel.......................................... 17 Figura 2.7: Ao da enzima colesterol oxidase............................................................................... 19 Figura 2.8: Ilustrao da estrutura da enzima colesterol oxidase, na forma de fitas....................... 20 Figura 3.1: Representao esquemtica de um biossensor: Transdutor (1), Eletrodo de trabalho (a), Matriz orgnica com enzima imobilizada (b), Eletrodo de referncia (c), Amplificador (2), Processador de sinal (3) e painel anlogo/digital (4)........................ 22 Figura 3.2: Esquema da reao amperomtrica do colesterol para a colestenona .......................... 25 Figura 3.3: Nmero de trabalhos publicados na rea nos ltimos cinco anos. * - Trabalhos publicados at 02 de setembro/2006. Fonte: Science Direct................... 26 Figura 4.1: Figura esquemtica da transio sol-gel: (a) formao de gel particulado e (b) formao de gel polimrico..................................................................................... 29 Figura 4.2: Reao de complexao do sistema PVA/Borato......................................................... 30 Figura 4.3: Grfico esquemtico da variao do volume especfico com a temperatura para um material polimrico......................................................................................... 34 Figura 4.5: Estrutura da molcula de ftalocianina de cobre (Ftc).................................................... 39 Figura 5.1: Figura esquemtica do deslocamento de molculas em uma seo transversal num fluido................................................................................................... 45 Figura 5.2: Figura esquemtica do deslocamento de partculas em uma seo transversal num slido................................................................................................... 47 Figura 5.3: Representao esquemtica da difuso de lquido em uma membrana polimrica.................................................................................................... 50

ix
Figura 5.4: Representao da extenso peridica par da condio inicial...................................... 52 Figura 5.4: Desenho esquemtico do mecanismo de difuso Fickiano (A), anmalo (B) e no Fickiano (C)............................................................................... 57 Figura 7.1: Desenho representativo da formao dos orbitais moleculares................................... 74 Figura 7.2: Esquema da estrutura dos MOs de materiais condutores (A), semicondutores (B) e isolantes (C)............................................................................... 75 Figura 7.3: Mecanismos de conduo possveis em materiais desordenados ................................ 77 Figura 7.4: Curva i versus V tpica de um material hmico............................................................ 79 Figura 9.1: Ilustrao esquemtica do projeto do biossensor para colesterol................................. 84 Figura 9.2: Fotografia do biossensor de colesterol obtido neste trabalho....................................... 84 Figura 9.3: Equipamento (A) e ponta de prova (B) utilizada nos ensaios de TMA........................ 87 Figura 9.4: Equipamento DSC utilizado neste trabalho (INTEMA/CONICET/UnMdP)............... 90 Figura 9.4: Desenho esquemtico de um espectrofotmetro de duplo feixe................................... 92 Figura 9.5: Espectrmetro UV/Vis Varian Serie 643 (A) e Biospectro SP-22 (B) utilizados para obteno do espectro UV/Vis............................................................... 94 Figura 9.6: MEV utilizado neste trabalho (IPEN/CNEN-USP)...................................................... 95 Figura 9.6: Multmetro Keithley modelo K-237 utilizado para a caracterizao eltrica dos filmes de PVA. Ftc e PVA/Ftc................................................................... 96 Figura 9.7: Cmara (A) e compartimento para amostras (B) utilizados na caracterizao eltrica dos filmes de PVA, Ftc e PVA/Ftc................................................................... 96 Figura 10.1: Micrografia MEV de uma membrana de PVA no reticulada. O filme foi seco 25 C sob vcuo............................................................................ 100 Figura 10.2: Micrografia MEV de uma membrana de PVA reticulada com cido brico. A desidratao da membrana ocorreu a 25 C sob vcuo........................................... 100 Figura 10.3: Cintica de intumescimento de membranas de PVA em soluo fisiolgica, pH 7,4, a diferentes temperaturas: 20 C (A), 30 C (B), 40 C (C) e 50 C (D)........102 Figura 10.4: Cintica de intumescimento de membranas de PVAR em soluo fisiolgica, pH 7,4, reticuladas por 25 min, em diferentes temperaturas: 20 C (A), 30 C (B) e 40 C (C)................................................................................................. 103 Figura 10.5: Cintica de intumescimento, em soluo fisiolgica, pH 7,4, de membranas de PVA (A) e membranas de PVAR com diferentes tempos reticulao: 10 min (B), 25 min (C), 40 min (D) e 60 min (E)..................................................... 104 Figura 10.6: Dependncia do coeficiente de difuso com a temperatura para membranas de PVAR (A) e PVA (B)........................................................................................... 107 Figura 10.7: Dependncia do coeficiente de difuso com a densidade de reticulaes das membranas de PVA............................................................................................. 108 Figura 10.8: Profundidade de penetrao versus tempo de exposio das membranas s foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N para a amostra de PVAR (e=1,02x10-5 mol.cm-3) intumescidas, temperatura de 25C.......................................................................... 111

x
Figura 10.9: Profundidade de penetrao versus tempo de exposio das membranas s foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N para a amostra de PVAR (e= 1,09x10-5mol.cm-3) intumescidas, temperatura de 25C.......................................................................... 112 Figura 10.10: Profundidade de penetrao versus tempo de exposio das membranas s foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N para a amostra de PVAR (e=1,12x10-5 mol.cm-3) intumescidas, temperatura de 25C....................................................................... 113 Figura 10.11: Profundidade de penetrao versus tempo de exposio das membranas s foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N para a amostra de PVAR (e=1,20x10-5 mol.cm-3) intumescidas, temperatura de 25C...................................................................... 114 Figura 10.12: Mdulo de Young das membranas intumescidas de PVAR (20C) em funo da densidade de reticulaes. O desvio padro nos pontos de 18,35 MPa.

(PVA)=16,18 MPa.................................................................................................. 115

Figura 10.13: Termogramas DSC de filmes de PVA (A) e filmes reticulados de PVA:

e=1,02x10-5 mol.cm-3 (B), e= 1,09x10-5mol.cm-3 (C), e=1,12x10-5 mol.cm-3 (D), e=1,20x10-5 mol.cm-3 (E)........................................... 117
Figura 10.14: Dependncia da temperatura de transio vtrea (Tg) e da temperatura de fuso (Tm) com a densidade de reticulaes (e) de membranas de PVA................................. 118 Figura 10.15: Dependncia da entalpia de fuso (Hm) e porcentual de cristalinidade (c) da densidade de reticulaes (e) de membranas de PVA........................................... 119 Figura 10.16: Espectro UV/Vis de solues aquosas de Ftc, PVA e PVA/Ftc a temperatura de 25 C............................................................................................ 121 Figura 10.17: Espectro infravermelho na regio de 600 cm-1 a 2000 cm-1 de filmes de PVA (A), PVA/Ftc 5 m/m% (B), PVA/Ftc 17 m/m% (C), PVA/Ftc 30 m/m% (D) e Ftc (E)............................................................................ 123 Figura 10.18: Espectro infravermelho na regio de 3500 cm-1 a 2500 cm-1 de filmes de PVA (A), PVA/Ftc 5 m/m% (B), PVA/Ftc 17 m/m% (C), PVA/Ftc 30 m/m% (D) e Ftc (E)............................................................................ 124 Figura 10.19: Potencial de ionizao mapeado numa superfcie de isodensidade eletrnica para o PVA............................................................................................. 126 Figura 10.20: Potencial de ionizao mapeado numa superfcie de isodensidade eletrnica para a Ftc................................................................................................ 126 Figura 10.21: Potencial de ionizao mapeado numa superfcie de isodensidade eletrnica para o sistema PVA/Ftc.......................................................................................... 127 Figura 10.22: Superfcie de potencial eletrosttico para o PVA................................................... 127 Figura 10.23: Superfcie de potencial eletrosttico para a Ftc...................................................... 128 Figura 10.24: Superfcie do orbital HOMO para o PVA.............................................................. 129 Figura 10.25: Superfcie do orbital HOMO para a Ftc................................................................. 129 Figura 10.26: Superfcie do orbital HOMO para o sistema PVA/Ftc........................................... 130 Figura 10.27: Superfcie do orbital LUMO para o PVA............................................................... 130 Figura 10.28: Superfcie do orbital LUMO para a Ftc.................................................................. 131

xi
Figura 10.29: Superfcie do orbital LUMO para o sistema PVA/Ftc............................................ 131 Figura 10.30: Dependncia de com a temperatura, de filmes de PVA/Ftc com diferentes concentraes: 5 m/m % (A), 0 m/m % (B), 40 m/m % (C), 20 m/m % (D)......... 134 Figura 10.31: Dependncia de com a concentrao de Ftc, de filmes de PVA/Ftc a diferentes temperaturas: 26C (A), 40C (B), 55C (C), 70C (D)...........................135 Figura 10.32: Dependncia de E com a concentrao de ftalocianina de filmes de PVA/Ftc.....136 Figura 11.1: Sinal obtido pelo biossensor para uma soluo de colesterol com concentrao de 2,58 mM, a temperatura de 37C........................................................................ 140 Figura 11.2: Curva de calibrao do sensor para colesterol.......................................................... 141

xii

Lista de Tabelas
Tabela 5.1: Alguns valores da funo sen (n / 2 ) ..................................................................... 53 Tabela 9.1: Fenmenos fsico-qumicos determinados atravs de anlise DSC e suas relaes com a variao da entalpia............................................................................. 89 Tabela 10.1: Valores mdios calculados de n, e valores de Ea e Hi para filme de PVA e PVA reticulado..............................................................................................106 Tabela 10.2: Energias do calor de formao Hf, orbitais HOMO e LUMO e largura da banda proibida, E, para as molculas de PVA, Ftc e PVA/Ftc, calculados pelo mtodo PM3-d............................................................................... 132 Tabela 11.1: Parmetro de solubilidade para o PVA, gua e para o colesterol............................. 140

xiii

Lista de abreviaturas
c Percentual de cristalinidade

Transmitncia e densidade de reticulaes H Variao de entalpia Hf Calor de formao Hm Entalpia de fuso

c H m Entalpia de fuso do polmero 100% cristalino

T Variao de temperatura
[E] Concentrao de enzima [ES] Concentrao do complexo enzima-substrato [S] Concentrao de substrato A Absorbncia CEs Colesterol esterease COx Colesterol oxidase CTC Complexo de transferncia de cargas D Coeficiente de difuso DSC Calorimetria exploratria diferencial E Enzima ES Complexo enzima substrato Ea Energia de ativao EP complexo enzima-produto ES Complexo enzima-substrato FAD Flavina adenina dinucleotdio FH Teoria de Flory-Huggins Ftc Ftalocianina de cobre FTIR Espectroscopia de absoro na regio do infravermelho com transformada de Fourier HDL Lipoprotena de alta densidade

Hi Entalpia associada ao intumescimento

HOMO Orbital molecular mais alto ocupado I(V) Caracterizao eltrica: monitorao da corrente eltrica I em funo tenso V k Constante cintica de uma reao LDL Lipoprotena de baixa densidade LUMO Orbital molecular mais baixo desocupado m massa MEV Microscopia Eletrnica de Varredura MM Modelagem molecular MO Orbitais moleculares

xiv
P Produto PM3 Parametric method 3 POx Peroxidase PVA Poli(lcool vinlico) PVAR - Poli(lcool vinlico) reticulado R Constante dos gases S Substrato T Temperatura t Tempo Tg Temperatura de transio vtrea Tm Temperatura de fuso cristalina TMA Anlise termomecnica UNIFEI Universidade Federal de Itajub UV-Vis Espectroscopia de absoro na regio do ultravioleta-visvel VLDL Lipoprotenas de densidade muito baixa

xv RESUMO

Neste trabalho foi desenvolvido um novo biossensor para determinao de colesterol baseado na imobilizao da enzima colesterol oxidase (COx) em uma matriz de poli(lcool vinlico) (PVA) reticulada com cido brico e com ftalocianina de cobre (Ftc) como mediador de eltrons. O biossensor foi obtido atravs da tcnica da evaporao do solvente a partir de uma soluo contendo Ftc e COx. As membranas reticuladas de PVA foram caracterizadas por calorimetria diferencial exploratria (DSC), anlise termogravimtrica (TMA) e espectroscopia eletrnica (UV/Vis) e vibracional (FTIR). O transporte de gua atravs da membrana do biossensor foi estudada. Os resultados da anlise DSC e TMA indicaram que tanto a temperatura de transio vtrea (Tg) quanto o mdulo de Young cresceram com o aumento da densidade de reticulaes do hidrogel. O coeficiente de difuso de gua diminuiu com o aumento da densidade de reticulaes, indicando que a reticulao das membranas diminuiu a mobilidade da gua na estrutura PVA/Borato. Clculos semi-empircos pela metodologia PM3-d foram realizados no complexo PVA/Ftc. Os parmetros geomtricos, calor de formao, potencial de ionizao e orbitais HOMO-LUMO foram calculados e comparados com a o espectro vibracional (FTIR) e os resultados da caracterizao eltrica. O biossensor desenvolvido foi utilizado para determinao de colesterol com grande eficincia. Sob condies timas, o biossensor apresentou uma resposta linear para concentraes de colesterol de 0.1 mM a 5.17 mM, com uma resposta rpida (12 s) e alta sensibilidade.

xvi ABSTRACT

A new amperometric biosensor for the determining cholesterol based on the immobilization of cholesterol oxidase (ChOx) in a crosslinked poly(vinyl alcohol) (PVA) matrix and the charge transfer mediator copper phtahalocyanine (Ftc) is described. The biosensor was obtained by the complexation-mediated solubilization method, where Ftc was dispersed in high concentration in an organic aprotic solvent for the formation of the electron donor-acceptor complex. The crosslinked PVA membranes were characterized by differential scanning calorimetry (DSC), thermomechanical analysis (TMA), electronic spectroscopy (UV/Vis) and vibrational (FTIR) spectroscopy. The water transport through the biosensor membrane was studied by the equilibrium degree of swelling. The results of DSC and TMA indicate that both, the glass transition temperature (Tg) and Young modulus were increased systematically with crosslinking density of the hydrogel. The water diffusion coefficient decreased with the increase in the crosslinking degree indicating that the water molecules possess a lower degree of translational mobility and are "tightly bound" in the PVA-borate complex structure. Semiempirical calculations using PM3-d have been performed on the Ftc/PVA charge transfer complex. The geometry parameters, heats of formation, ionization potential, HOMO-LUMO energy differences are also reported and compared with the vibrational (FTIR) spectra and conductivity experimental results. The developed biosensor has been used for the determination of cholesterol with an acceptable accuracy. Under optimal conditions, the biosensor shows a linear response to cholesterol in the range of 0.1 mM to 5.17 mM, with a fast response (12 s) and high sensitivity.

1 CAPTULO 1 ASPECTOS GERAIS DO TRABALHO

1.1 - O colesterol

Lipdios so substncias insolveis em gua e de grande importncia para o organismo humano. Os principais lipdios presentes no plasma sanguneo so os cidos graxos, os triglicrides e o colesterol livre e esterificado. O colesterol (Figura 1.1) um precursor dos hormnios adrenal, ovariano e testosterona, dos cidos biliares, da vitamina D, alm de desempenhar importantes funes em membranas celulares, influenciando no estado de ativao de enzimas ligadas as membranas. Em algumas condies os lipdios podem se tornar a principal fonte de energia do organismo, como na falta absoluta de insulina, o que impede a metabolizao de carboidratos. 1-3

(A)

(B)

Figura 1.1: Estrutura qumica da molcula de colesterol (A) e estrutura obtida por modelagem molecular da molcula de colesterol (B).

O transporte de lipdeos no sangue realizado por lipoprotenas. Lipoprotenas so partculas que transportam lipdeos apolares (insolveis em gua) em seu ncleo. Esses complexos so constitudos por quantidades variveis de colesterol e seus steres, triglicrides, fosfolipdeos e apolipoprotenas. Devido a natureza hidroflica da parte protica, as lipoprotenas so solveis em gua. Com base na densidade, as lipoprotenas so classificadas como: quilomcrons, lipoprotenas de densidade muito baixa (VLDL), lipoprotena de baixa densidade (LDL), lipoprotena de

2 alta densidade (HDL). As HDL exercem importante papel no transporte de colesterol dos tecidos perifricos para o fgado, onde catabolizado e eliminado. As HDL funcionam como removedores de colesterol do sangue. Neste caso, est demonstrado pela literatura que a ocorrncia de doenas cardiovasculares maior em indivduos com nveis reduzidos de HDL. As lipoprotenas VLDL transportam colesterol e steres de colesterol do fgado para outros tecidos onde, atravs da perda de triglicerdeos, sofre a reduo do tamanho da molcula e aumento da densidade, transformando em LDL. O colesterol LDL constitui dois teros do colesterol total plasmtico e est diretamente relacionado a doenas vasculares. Cerca de 25% do colesterol plasmtico proveniente da dieta e o restante sintetizado pelo fgado. O colesterol est presente no plasma tanto na forma livre (30% do total) quanto na forma esterificada (70% do total). Nesta ltima forma, a molcula de colesterol est ligada a cidos graxos. Em um indivduo adulto, o valor de referncia para o colesterol total de 5,17 mM. O valor limtrofe de 6,20 mM, sendo que acima deste valor, considerado alto. Dislipidemias so desvios anormais no valor das fraes lipdicas no organismo. Os principais fatores que contribuem para a presena de valores aumentados dos nveis de colesterol HDL (hipercolesterolemia) so a ingesto de bebidas alcolicas, ingesto de colesterol na dieta, diabetes, obesidade, hipotiroidismo e idade. Valores aumentados do colesterol HDL podem ser atribudos tambm a cirrose biliar, hepatite crnica e ingesto de frmacos enquanto valores reduzidos so atribudos ao diabetes melitos, doena renal, obesidade e sedentarismo. Valores aumentados do colesterol LDL podem ser atribudos a anorexia nervosa, diabetes melitos e insuficincia renal. A dislipidemias podem ainda ser causadas por distrbios genticos, que podem se manifestar sob influencia de m alimentao, uso de medicamento ou presena de outras doenas. Valores reduzidos do colesterol so encontrados no hipertireoidismo e desnutrio crnica. Nas ltimas dcadas, a desordem de uma ou mais fraes lipdicas no sangue (dislipidemias) tem sido relacionadas com a mortalidade devido a doenas cardiovasculares e/ou pancretica. Estudo sugerem que cerca de 75% dos casos de enfermidade arterial coronariana (infarto do miocrdio, morte sbita) so atribudos a trs fatores principais: tabagismo, hipertenso e hipercolesterolemia. Esses mesmos fatores de risco so eficazes na aterosclerose cerebral.

3 A aterosclerose caracteriza-se pelo acmulo de lipdeos dentro e ao redor das clulas do espao intimal de um vaso e est associada com a proliferao celular e fibrose que provocam o seu estreitamento. O colesterol presente na parece arterial proveniente principalmente das lipoprotenas LDL. Apesar das placas aterosclerticas serem estruturas complexas, o colesterol-LDL pode ser apontado como uma das causas principais de sua formao. A Figura 1.2 mostra um vaso obstrudo pelo acmulo de tecido fibro gorduroso, representado pela parte mais clara da imagem. 1-4

(A)

Figura 1.2: Colapso da parede arterial devido ao acmulo de tecido fibro gorduroso (A).3

Atualmente existem poucos dados disponveis na literatura quanto aos nveis de colesterol presente no sangue da populao mundial, em especial sobre a brasileira. Estudos da dcada de 1990 indicaram que nos Estados Unidos, cerca de 41% dos indivduos adultos possuem taxas elevadas (> 5,17 mM) de colesterol no sangue, enquanto 18% dos adultos possuem um risco elevado de desenvolverem doena arterial coronariana e cerca de 7% j desenvolveram. Estudos datados de 2002, na cidade do Rio de Janeiro indicaram que, entre os indivduos com valores mais elevados de insulina no sangue, 64,3% apresentam diagnstico de dislipidemia.5-7

4 1.2 Mtodo clnico tradicional para dosagem de colesterol

Em geral, a determinao de colesterol feita por mtodos baseados em espectrofotometria na regio do UV/Vis, envolvendo procedimentos complicados e de elevado custo devido grande quantidade de enzima requerida para efetuar uma nica anlise. O mtodo tradicional enzimtico-colorimtrico para determinao de colesterol total utiliza-se de soro ou plasma sanguneo. Este mtodo envolve uma reao de hidrolise dos steres de colesterol pela enzima colesterol esterease (CEs), formando colesterol livre e cidos graxos. Em seguida, o hemometablito sofre oxidao pela enzima colesterol-oxidase (COx), formando perxido de hidrognio. Este, reagindo com fenol e 4-aminoantipirina, catalisado pela peroxidase (POx) produz um complexo de cor avermelhada. A absorvncia desse complexo, medida por espectrofotometria (=500nm), proporcional a concentrao de colesterol na amostra. Estas reaes se processam de acordo com a Figura 1.3, abaixo.8-9 steres de colesterol CEs Colesterol + cidos graxos Colesterol + O2 COx Colest-4-en-ona + H2O2

H2O2 + fenol + 4-Aminoantipirina POx 4H2O + quinoneimina

Figura 1.3: Figura esquemtica das etapas envolvidas na metodologia tradicional para dosagem de colesterol no sangue.

5 1.3 Consideraes finais

O estabelecimento da relao entre os altos nveis de colesterol no sangue e o risco de desenvolvimento de doenas cardiovasculares alerta para a necessidade do acompanhamento dos nveis de colesterol de cada individuo. O conhecimento do nvel de colesterol sanguneo da populao permite o estabelecimento de medidas para conteno desses nveis, envolvendo a reeducao alimentar e o incentivo a prtica de exerccios fsicos. Entretanto, necessria a disponibilidade de mtodos rpidos, precisos e reprodutveis para a dosagem de colesterol. Os biossensores apresentam uma alternativa interessante aos mtodos tradicionais, por permitir a dosagem de colesterol com grande rapidez e sem a necessidade de mo de obra especializada e grande infra-estrutura laboratorial. As informaes apresentadas neste captulo compem a motivao deste trabalho, que apresenta uma contribuio ao desenvolvimento de biossensores clnicos para monitorao de colesterol. A compreenso da estrutura e mecanismo de ao dos biocatalizadores envolvidos nas reaes para a quantificao de colesterol de fundamental importncia para o projeto dos biossensores, possibilitando o desenvolvimento de projetos que aproveitem ao mximo a capacidade cataltica da enzima. Estes aspectos sero abordados a seguir.

6 1.4 Referncias bibliogrficas

1. Motta, V. T. Bioqumica Clnica para o Laboratrio. 4 edio. Editora mdica Missau. 2003. 2. Port, C. C. Semiologia Mdica. 4 edio. Guanabara Koogan. 2001. 3. Nelson, D. L.; Cox, M. M. Lehninger Princpios de Bioqumica. 3 edio. Sarvier. 2003. 4. Disponvel em <http://virtual01.lncc.br/monografia/monografia0/node8.html>.

Acesso em 26 agosto 2006. 5. Pearson, T. A. The epidemiologic basis for population-wide cholesterol reduction in the primary prevention of coronary artery disease. American Journal of Cardiology. 4 (94), 4F-8F, 2004. 6. Pearson, T. A. Population benefits of cholesterol reduction: epidemiology, economics, and ethics. American Journal of Cardiology. 85 (12A), 20E-3E, 2000. 7. Pozzan, R.; Pozzan, R.; Magalhes, M. E. C.; Brando, A. A.; Brando, A. P. Dislipidemia, Sndrome Metablica e Risco Cardiovascular. Revista da SOCERJ. Abr/Mai/Jun, 97-104, 2004. 8. Metodologia Enzimtica-Colorimtrica para determinao do colesterol no soro ou plasma. Disponvel em <www.goldanalisa.com.br/>. Acesso em 26 agosto 2006. 9. Colesterol Mtodo Enzimtico. Disponvel em <www.laborlab.com.br>. Acesso em 26 agosto 2006.

7 CAPTULO 2 BIOCATALIZADORES

2.1 Noes gerais

Uma das condies fundamentais para a vida a capacidade de catalisar reaes qumicas de forma eficiente e seletiva, frente as necessidade de obter energia e substncias em um curto intervalo de tempo. Em sistemas biolgicos, as molculas encarregadas de catalisar reaes so as enzimas.1,2 As enzimas so protenas globulares e, como toda protena, so heteropolmeros que podem ser constitudos por vinte diferentes aminocidos. Algumas incluem em sua estrutura um grupo no-protico. So molculas com elevado peso molecular, variando entre 5 e 1.000 kDa. Os aminocidos componentes das protenas apresentam em comum um tomo de carbono ligado a uma carboxila, a um grupo amino e a um tomo de hidrognio. O quarto grupo ligado ao carbono uma cadeia (R), especfica de cada aminocido. O que caracteriza cada enzima a quantidade de aminocidos presentes em sua estrutura e a ordem em que eles se encontram. As enzimas, graas sua estrutura complexa, possuem um alto grau de especificidade por seus substratos e funcionam em solues aquosas sob condies timas de temperatura e pH.1,3 Deve-se observar que os aminocidos reagem entre si atravs de seus agrupamentos carboxila e amino, formando uma estrutura polipeptdica que caracteriza a estrutura primria de uma enzima (Figura 2.1 - A). A cadeia peptdica pode se organizar em uma estrutura secundria em hlice (Figura 2.1 B) ou em folha (Figura 2.2 - C), atravs do arranjo paralelo de dois ou mais segmentos de cadeias peptdicas quase totalmente distendidas, atravs de pontes de hidrognio. As enzimas apresentam estas duas estruturas secundrias simultaneamente. A estrutura

tridimensional que as enzimas assumem em soluo descrita pela estrutura terciria (Figura 2.2 - D). Esta estrutura composta por dobras e enrolamentos provocadas pelas interaes hidrofbicas entre os grupos R e a gua. A estrutura quaternria (Figura 2.3 E) a organizao presente nas protenas compostas por mais de uma cadeia polipeptdica e descreve quantos e quais monmeros compem a molcula e como estes monmeros esto associados.

Figura 2.1: Estruturas primaria (A), secundria em folha (B), secundria em hlice (C), terciria (D) e quaternria (E) das enzimas.2

As enzimas podem ser produzidas, industrialmente, a partir de diversas diferentes fontes. Elas podem ser extradas de animais e plantas, porm, as principais fontes so os microorganismos. A produo a partir de fungos e bactrias permite a reduo dos custos de produo, por serem uma fonte de mais fcil reposio atravs de uma origem segura e por oferecerem enzimas de alta pureza. As tcnicas de produo de enzimas geralmente envolvem a fermentao, para a produo de microorganismos em larga escala. A sua purificao pode ser efetuada por mtodos como centrifugao, filtrao e cromatografia. Atualmente, um nmero muito grande de enzimas possuem aplicaes industriais, como nas reas de anlises qumicas e clnicas, produo de detergentes, indstria alimentcia e na construo de biossensores para a monitorao de hemometablitos.2 Para a compreenso do mecanismo de ao das enzimas, fundamental o estudo dos fatores termodinmicos e bioqumicos envolvidos no processo biocataltico.

9 2.1 - Aspectos termodinmicos dos biocatalizadores

Todos os processos que ocorrem no universo esto sujeitos s leis bsicas da termodinmica. As reaes que se verificam nas clulas vivas no so excees. De acordo com a primeira lei da termodinmica, a energia no pode ser criada nem destruda. Em qualquer processo uma forma de energia pode ser convertida em outra, porm a energia total do sistema somada de sua vizinhana permanece constante. Portanto, a primeira lei da termodinmica simplesmente uma lei da conservao da energia. Nada mencionado a respeito da utilidade das diferentes formas de energia ou sobre a direo de um processo ou reao.4 A segunda lei da termodinmica afirma que todos os processos que ocorrem naturalmente evoluem numa direo que leva a um nvel mnimo de energia potencial, isto , a uma posio de equilbrio estvel. Essas reaes espontneas liberam energia medida que tendem ao equilbrio e, teoricamente, a energia pode ser utilizada para produzir trabalho. A variao total de energia do sistema, G, denominada energia Livre de Gibbs. O valor de G, dado pela Equao 2.1, indica o sentido da reao: se menor que zero, a reao ocorre espontaneamente. O fato de uma reao apresentar G < 0 no significa que a reao se processa a alta velocidade.

G = RT ln k

(2.1)

A velocidade de qualquer reao qumica homognea depende da freqncia das colises entre as molculas que reagem entre si. A freqncia das colises, por sua vez, influenciada pela concentrao de molculas reagentes, como tambm pela sua energia cintica. Por sua vez, a energia cintica das molculas influenciada pela temperatura. A freqncia de colises no igual velocidade da reao, pois somente uma pequena parcela das colises ocorre com energia suficiente para provocar a reao. A energia mnima para que uma reao ocorra chamada de energia de ativao, Ea. A relao entre Ea e a temperatura foi formulada empiricamente por Arrhenius em 1887. A relao, denominada como equao de Arrhenius, geralmente descrita como:5
k = Ae Ea / RT

(2.2)

Em sua forma linear, esta equao escrita na seguinte forma:

10
log k = Ea + log A 2,3RT

(2.3)

e em sua forma integrada:

log

E T T k2 = a 2 1 k1 2,3R T2T1

(2.4)

sendo k2 e k1 as constantes de velocidade especficas da reao a T2 e T1, respectivamente. No intuito de explicar a necessidade de uma energia mnima, Ea, para que uma reao possa se processar, Fyring em 1935, props que uma molcula reagente de um substrato (S) deveria ultrapassar uma barreira energtica passando por um estado de transio antes de se transformar no produto (P) da reao (Figura 2.1). Molculas reagentes que atingem apenas uma frao da energia de ativao necessria simplesmente retornam ao seu estado inicial. O estado de transio visto como uma fase a meio caminho, onde as ligaes e orientaes so distorcidas. Uma vez que os reagentes adquirem energia para ultrapassar a barreira energtica e atingem o estado de transio, eles prosseguem para formar os produtos da reao com uma velocidade que independe da temperatura e da natureza dos reagentes, isto , os reagentes passam para o outro lado da barreira energtica, em direo a um estado de menor valor energtico. No caso de uma reao catalisada por uma enzima (E), a reao passa por estados intermedirios constitudos pelos complexos enzima substrato (ES) e enzima produto (EP). Esta reao pode ser representada pela a seguinte relao:1,3,5,6 E+S ES EP E+P (2.5)

Na presena de uma enzima apropriada, temperatura ambiente uma quantidade suficiente de molculas reagentes possuem a energia de ativao necessria para ultrapassar a barreira. Neste caso, as enzimas possuem uma eficincia cataltica extraordinria. Uma reao catalisada por uma enzima pode ser processar a 25C, 108 a 1011 vezes mais rapidamente que a mesma reao no catalisada. Ressalta-se que as enzimas no afetam o G ou keq de uma reao. Elas apenas reduzem a energia de ativao, aumentando a velocidade com a qual a reao alcana o equilbrio. O grfico apresentado pela Figura 2.1 ilustra a energia de uma reao catalisada e no catalisada por enzima.

11 Embora a enzima participe da seqncia da reao, ela no sofre nenhuma transformao. Desta forma, poucas molculas de enzima so capazes de catalisar a converso de milhares de molculas de substrato (S) em produto (P).

Figura 2.2: Barreira de energia para uma reao no catalisada por enzima (A) e para uma reao catalisada por enzima (B).

A preciso da estrutura enzimtica, com geometria apropriada e com grupos funcionais localizados em posies particulares a torna de grande especificidade. Para que a catlise ocorra, o reagente ou substrato deve-se ligar molcula da enzima em uma regio especfica, chamada stio ativo. O stio ativo uma cavidade de forma definida constituda de grupos R de aminocidos prximos uns dos outros, aberta na superfcie da molcula globular da enzima. Para ser reconhecida como um substrato, uma molcula deve possuir a forma apropriada para acomodar-se no stio ativo e grupos qumicos capazes de se ligar aos grupos R ali presentes. Da vem a alta especificidade das enzimas.1,3,7 O alto grau de especificidade das enzimas levou Emil Fischer, em 1894, a introduzir a noo de que as interaes entre uma enzima e seu substrato seriam complementares, atravs do bem conhecido modelo chave-fechadura (Figura 2.3 - A). Este modelo considera tanto o substrato (chave) quanto a enzima (fechadura) como entidades rgidas, o que no representa a realidade. A flexibilidade da estrutura enzimtica um dos fatores que permite que molculas estruturalmente semelhantes

12 apresentem conformaes e orientaes relativas distintas no stio de ligao do receptor e, em conseqncia, atividades e afinidades tambm diferentes. Koshland e colaboradores propuseram uma hiptese, conhecida como teoria do encaixe induzido na qual, atravs da complexao, o substrato induz uma mudana conformacional na subunidade da enzima com a qual interage, isto , posiciona resduos de aminocidos em uma posio espacial correta para ligao do substrato. Esta mudana conformacional pode ser transmitida s subunidades vizinhas, induzindo na enzima a conformao responsvel pelo processo cataltico (Figura 2.3 B). Ao mesmo tempo as enzimas possuem a propriedade de reconhecer uma ou um conjunto de conformaes do substrato. Este, ao provocar uma mudana conformacional na enzima, pode estar induzindo-a a adotar a conformao responsvel pelo seu reconhecimento. Assim como a enzima, o substrato tem a sua conformao tencionada e distorcida. Este o mecanismo que leva a alta eficincia da catalise produzidas pelas enzimas.

Figura 2.3: Mecanismo de ao enzimtica segundo o modelo chave-fechadura (A) e a teoria do encaixe induzido (B).

Para a compreenso dos mecanismos de uma reao catalisada por uma enzima, de grande importncia o estudo da velocidade da reao e como ela se altera em funo de mudanas nos parmetros experimentais. Um dos principais fatores que

13 influenciam na velocidade de uma reao in vitro catalisada por enzima a concentrao do substrato.

2.2 Bioqumica das reaes catalisadas por enzimas

Uma das formas de compreender a bioqumica das reaes catalisadas pelas enzimas atravs do estudo da velocidade da reao. A velocidade da reao sofre forte influencia da concentrao do substrato. Entretanto, estudar os efeitos da concentrao do substrato complicado devido ao fato de [S] variar durante o curso da reao, enquanto o substrato se transforma em produto. Uma abordagem simplificada para o estudo da cintica de uma reao enzimtica medir a velocidade inicial V0 quando [S] muito maior que a concentrao da enzima [E]. Desta forma, para um tempo curto, as variaes em [S] sero desprezveis.1,3,6 A Figura 2.4 mostra o efeito de [S] sobre V0. O aumento de V0 aproximadamente linear para baixas [S]. A media que [S] cresce, V0 cresce a taxas cada vez menores, at alcanar um valor de [S] em que no existe variao significativa no valor de V0. Este valor de V0 muito prximo da velocidade mxima, Vmx.

Vmax

V0 (m/min)

1/2 Vmax

Km

[S] (mM)

Figura 2.4: Efeito da concentrao do substrato na velocidade de uma reao catalisada por enzima.

14 O complexo ES desempenha um papel fundamental para a compreenso do comportamento cintico da reao. Em 1913, Michaelis e Maud Menten desenvolveram uma teoria geral da ao enzimtica. Eles postularam que a ao enzimtica se d em etapas, se iniciando pela rpida formao de um complexo reversvel enzima-substrato:
k1

E+S

k 1

ES

(2.6)

A segunda etapa, mais lenta, a quebra do complexo ES liberando a enzima livre e o produto, P, da reao:
k2

ES

k 2

E+P

(2.7)

A segunda reao, por ser mais lenta, limita a velocidade da reao enzimtica. Desta forma, a velocidade da reao deve ser proporcional a [ES]. A relao entre [S] e V0 (Figura 2.4) possui a mesma forma geral para todas as enzimas. Michaelis e Menten deduziram a forma algbrica desta relao considerando a hiptese bsica de que, no estado estacionrio, a velocidade da reao limitada pela quebra do complexo ES. Esta relao, denominada equao de MichaelisMenten, a equao da velocidade de uma reao enzimtica com um nico substrato, e dada pela relao a seguir:1

V0 =

Vmx [S] k m + [S]

(2.8)

onde km chamada de constante de Michaelis-Menten e dada por:

km =

(k 2 + k 1 )
k1

(2.9)

Nesta equao, a velocidade inicial, V0, a velocidade mxima, Vmx, e a concentrao do substrato, [S], esto relacionados pela constante de Michaelis-Menten. A constante km possui unidade de concentrao. Esta constante permite a avaliao da afinidade de uma enzima por um substrato. De acordo com a equao 2.9, km varia inversamente proporcional a afinidade da enzima pelo substrato. Uma relao interessante pode ser obtida para o caso especial em que V0 vale exatamente a metade de Vmx:

V0 =

Vmx 2

(2.10)

15 Substituindo a Equao 2.10 na equao de Michaelis-Menten e dividindo por Vmx, obtemos a seguinte relao:
1 [S] = 2 k m + [S]

(2.11)

Solucionando esta equao em termos de Km, obtermos: Km = [S] substrato quando V0 equivale a 1/2 Vmx. A equao de Michaelis-Menten pode ser linearizada algebricamente de modo a permitir a determinao experimental de km e Vmx atravs de mtodos grficos. Uma simples transformao a inverso da equao, da seguinte forma: (2.12) Desta forma, Km pode ser interpretado como sendo a concentrao de

1 k m + [S] = V0 Vmx [S]

(2.13)

Atravs de simples transformaes algbricas, esta equao pode ser escrita na forma:

km 1 1 = + V0 Vmx [S] Vmx

(2.14)

Esta forma da equao de Michaelis-Menten chamada de equao de Lineweaver-Burk e permite que km e Vmx sejam determinados graficamente, atravs de uma curva 1/V0 versus 1/[S], como mostrado pela Figura 2.5.

1 V0

1 M/min

Coeficiente Angular =

km Vmx

1 Vmx
1 1 [S ] mM

1 km

Figura 2.5: Grfico Lineweaver-Burk.

16 Em um biossensor para monitorao de colesterol, a enzima colesterol oxidase tem a funo de catalisar a reao de oxidao do colesterol, produzindo perxido de hidrognio. Em um biossensor, a enzima se encontra imobilizada em uma matriz orgnica ou inorgnica. Este fato exerce influencia direta na velocidade da reao enzimtica devido menor disponibilidade de substrato provocada pela necessidade do analito (substrato) se difundir para o interior da matriz onde a enzima est imobilizada. Em uma reao com enzima imobilizada, [S] tende a ser menor que em uma reao com enzima livre. Portanto, de acordo com a equao de MichaelisMenten (Equao 2.19), a velocidade da reao enzimtica ser menor. A metodologia utilizada para a imobilizao da enzima no dispositivo exerce influncia direta no acesso do substrato enzima e determina a velocidade com que a reao enzimtica ir ocorrer. Em conseqncia, o tempo de resposta do biossensor est relacionado metodologia de imobilizao da enzima.

2.3 - Mtodos de imobilizao de enzimas

A performance do biossensor est relacionada ao processo de imobilizao da enzima, o biocatalizador responsvel pela reao qumica na superfcie do eletrodo. Com a imobilizao h um aumento da estabilidade da protena devido ao menor grau de liberdade, menor sensibilidade a interferentes e maior estabilidade quanto s mudanas de pH e elevao de temperatura. As matrizes para imobilizao de enzimas usualmente so polmeros inertes ou materiais inorgnicos insolveis em gua. A matriz utilizada deve permitir a rpida difuso do substrato e produto atravs de si. Os principais mtodos de imobilizao enzimtica so a adsoro fsica em um transdutor, ligao covalente, a ocluso (encapsulamento) em polmero reticulado ou imobilizao em uma membrana semipermevel.2,9 Estes mtodos so ilustrados pela Figura 2.6. A adsoro de enzimas em suportes insolvel um mtodo simples e de grande aplicabilidade. Neste mtodo, a fora motriz para a ligao da enzima ao suporte geralmente fornecida pela combinao de efeitos hidrofbicos com a formao de diversas ligaes por molcula de enzima. O mtodo de imobilizao por adsoro, apesar da simplicidade, no permite uma boa aderncia da enzima ao suporte, devido natureza da fora de interao deste com a enzima.

17 O mtodo da ligao covalente consiste na formao de ligaes qumicas entre o substrato e a enzima. Estas ligaes so geralmente feitas pela reao de grupos funcionais especficos da enzima, os quais no so essenciais para a sua atividade cataltica e no prejudicam a ao de seu stio ativo. Normalmente so utilizados grupos reativos especficos presentes no eletrodo sendo, portanto, necessrio um conhecimento prvio da estrutura qumica da enzima e da natureza da superfcie do eletrodo.

Figura 2.6: Ilustrao esquemtica dos principais mtodos de imobilizao de enzimas.

(A) Enzima adsorvida por uma superfcie; (B) enzima ligada covalentemente a uma superfcie; (C) enzima ocluda em um polmero reticulado; (D) enzima confinada por uma membrana semipermevel.

A imobilizao atravs da ocluso em um polmero reticulado uma metodologia conveniente para processos que envolvem substratos de baixo peso molecular. Este mtodo proporciona uma maior estabilidade quanto alteraes do microambiente da enzima. A enzima no sofre nenhuma alterao em sua estrutura. Entretanto necessrio um rigoroso controle do processo de sntese da matriz a fim de preservar a atividade cataltica da enzima. Neste processo de imobilizao, a atividade

18 enzimtica pode ser prejudicada devido necessidade do substrato se difundir atravs da matriz. A imobilizao em membranas semipermeveis consiste em envolver o biocatalizador em uma membrana impermevel s enzimas, mas que permitam a difuso do substrato e produto. Este mtodo permite a imobilizao simultnea de uma grande variedade de enzimas tornando possvel a ocorrncia de reaes que envolvem muitas etapas. Com o processo de imobilizao, a atividade enzimtica pode ser prejudicada devido a efeitos difusionais do substrato no suporte ou a efeitos eletrostticos entre o substrato e o suporte. Neste trabalho, foi realizada a imobilizao da enzima colesterol oxidase em uma matriz polimrica atravs do mtodo de ocluso. Desta forma, importante conhecer as principais propriedades desta enzima, o que permitir o desenvolvimento de um biossensor que explore a sua mxima atividade, atravs da criao de um micro ambiente favorvel a ao enzimtica.

2.4 A enzima colesterol oxidase

Atualmente est bem estabelecida a relao entre os altos nveis de colesterol na corrente sangunea e o risco de desenvolvimento de doenas cardiovasculares. A necessidade de mtodos precisos e reprodutivos para determinao da concentrao de colesterol tem motivado muitos trabalhos nos ltimos anos. Os mtodos analticos convencionais e os biossensores para quantificao de colesterol, geralmente utilizam trs e duas enzimas, respectivamente. Cerca de 70% do colesterol existente no plasma sanguneo se encontra na forma esterificada. Assim, o procedimento tpico para determinao do colesterol total geralmente se inicia pela quebra dos steres de colesterol pela enzima colesterol esterease, produzindo colesterol livre e cidos graxos. As molculas de colesterol podem ento sofrer a ao da enzima colesterol oxidase, produzindo 4-colesten-3-ona e perxido de hidrognio, como ilustrado na Figura 2.7.9

19

Figura 2.7: Ao da enzima colesterol oxidase.

A colesterol oxidase (COx) pode ser sintetizada atravs de uma grande variedade de microorganismos, em ambientes completamente distintos. Turfitt, em 1994, foi o primeiro a isolar a enzima, a partir do micrbio Nacordia erythropolis e demonstrar seu efeito na oxidao do colesterol.9 Desde ento, a enzima foi encontrada e isolada a partir de um grande numero de microorganismos, em especial a partir da Arthrobacter, Corynebacterium, Nacordia erythropolis, Mycobacterium, Pseudomonas e Rhodococcus sp., entre outros. Alguns microorganismos estocam a enzima em membranas intracelulares, enquanto outros a dispersam em seu meio de cultivo. Algumas linhagens de microorganismos so capazes de promover a oxidao do colesterol a taxas superiores a 70%. O custo da enzima colesterol oxidase se mantm relativamente alto devido, principalmente, baixa produtividade dos microorganismos e pela necessidade de adio de colesterol ao meio de cultura para induzir o aumento da produo da enzima. As propriedades fsicas da COx varia de acordo com o microorganismo de origem. Em geral a atividade da COx tima temperatura de 37 C e pH neutro em soluo aquosa. Dependendo da origem, a COx pode apresentar melhor estabilidade trmica e atividade tima em intervalos de pH entre 4 e 10.9 A COx uma macromolcula de alto peso molecular, em torno de 60 kDa, com um pequeno centro ativo localizado nas proximidades do centro da estrutura. O centro ativo contm um cofator, que um colaborador no protico necessrio para a

20 atividade enzimtica. Na COx o cofator constitudo por Flavina Adenina Dinucletideo (FAD). A estrutura da COx apresentada pela Figura 2.8.

Figura 2.8: Ilustrao da estrutura da enzima colesterol oxidase, na forma de fitas.11

2.5 Consideraes finais

Em um biossensor enzimtico para determinao de colesterol, o papel principal da enzima realizar a catlise da converso do colesterol em 4-colesten-3-ona. Esta converso produz perxido de hidrognio. A atividade enzimtica, em um biossensor, altamente influenciada pela matriz utilizada para a imobilizao da enzima, bem como pela metodologia de imobilizao utilizada. A matriz deve oferecer proteo contra condies ambientais, como pH e temperatura, desfavorveis a estabilidade da enzima. Outro ponto importante do projeto de um biossensor a forma de transduo do sinal gerado pelo eletrodo. Este o assunto discutido no prximo captulo.

21

2.6 Referncias bibliogrficas

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Acesso em 12 julho 2006.

22 CAPTULO 3 BIOSSENSORES

3.1 - Conceitos fundamentais

Biossensores so dispositivos compostos por semicondutores que esto intimamente ligados a um componente biolgico, geralmente uma enzima imobilizada, e que utilizado para medir a concentrao de um substrato especfico. O sinal gerado pelo dispositivo diretamente proporcional concentrao do metablito no fluido biolgico. A Figura 3.1 mostra um diagrama esquemtico de um biossensor. Um transdutor composto por um eletrodo de trabalho (a), uma matriz orgnica ou inorgnica contendo uma enzima imobilizada sobre o eletrodo de trabalho (b) e um eletrodo de referncia (c). Um analito, ao entrar em contato com o transdutor, desencadeia uma reao qumica gerando um sinal digitalizado pelo transdutor. A digitalizao converte a reao qumica em um sinal eltrico. O sinal gerado pelo transdutor ento amplificado (2), processado (3) e apresentado (4).

Figura 3.1: Representao esquemtica de um biossensor: Transdutor (1), Eletrodo de trabalho (a), Matriz orgnica com enzima imobilizada (b), Eletrodo de referncia (c), Amplificador (2), Processador de sinal (3) e painel anlogo/digital (4).

23 Os biossensores so desenvolvidos para as mais diversas aplicaes em biotecnologia, incluindo anlises clnicas e biomdicas, monitorao de processos fermentativos, e anlises ambientais. A indstria de alimentos e farmacutica tem grande necessidade de mtodos rpidos para estimar o tempo de vida, deteriorao e contaminao de seus produtos. Abre-se ento a possibilidade do monitoramento contnuo on line de metablitos, drogas e protenas. Os biossensores eletroqumicos se destacam quanto utilizao nas reas acima mencionadas. Os tipos mais comuns de biossensores so os potenciomtricos, amperomtricos, ticos e os calorimtricos.1,2,3 O biossensor potenciomtrico envolve a medida da diferena de potencial entre um eletrodo de trabalho e um de referncia. A interface da superfcie mediadora do transdutor gera uma espcie carregada, onde um eletrodo sensvel a esta espcie produzir um sinal eltrico de diferena de potencial relacionado espcie carregada. O transdutor pode ser um eletrodo on seletivo, que um sensor eletroqumico baseado em filmes finos ou membranas seletivas. A diferena de potencial entre o eletrodo de trabalho e de referncia proporcional ao logaritmo da atividade inica, ou concentrao, como descrito pela equao de Nernst-Donnam (Equao 3.1).
E = E0 RT ln([i ]) zF

(3.1)

sendo E o potencial lido, E0 uma constante caracterstica da membrana seletiva do biossensor, R a constante dos gases, T a temperatura absoluta, z a carga inica, F a constante de Faraday e [i] a concentrao da espcie inica livre, ou seja, a concentrao do analito. Um biossensor amperomtrico baseado na medida da corrente produzida pela oxidao ou reduo eletroqumica de uma espcie eletroativa. Estes biossensores so geralmente construdos atravs de um eletrodo de trabalho e um de referncia construdos de Pt, Au ou C. O eletrodo polarizado produz uma corrente eltrica relacionada concentrao da espcie eletroativa. Estes biossensores apresentam maior sensibilidade, rapidez e preciso em relao aos potenciomtricos e apresentam resposta linear em uma faixa mais ampla de concentrao do analito, sendo o mais empregado. A corrente i produzida por um biossensor amperomtrico est relacionada com a taxa da reao vA pela seguinte expresso:

i = nFAvA

(3.2)

24 sendo n o nmero de eltrons transferido, A a rea do eletrodo e F a constante de Faraday. Desta forma, a corrente eltrica produzida proporcional a concentrao do analito. Um biossensores tico geralmente constitudo por uma enzima ligada a um cromforo que por sua vez est ligado a uma membrana. Uma alterao de pH gerada pela reao enzimtica altera a cor do complexo cromforo/membrana. O sistema transdutor consiste em um simples fotodiodo acoplado ao sistema. Os biossensores calorimtricos utilizam um dispositivo termistor capaz de registrar as pequenas diferenas de temperatura produzidas por uma reao bioqumica. Geralmente obtida uma resposta linear da temperatura em funo da concentrao do analito, com variaes de temperatura entre 1x10-2 e 1x10-3 C.

3.2 Biossensores para monitorao de colesterol

Biossensores para determinao de colesterol so uma tima alternativa relativamente aos mtodos convencionais, por possuir alta estabilidade operacional, resposta rpida e baixo custo. Estes biossensores so construdos atravs da imobilizao da enzima colesterol oxidase em uma matriz na superfcie de um eletrodo. A funo da enzima colesterol oxidase catalisar a reao de oxidao do colesterol, gerando perxido de hidrognio. O perxido de hidrognio, ao entrar em contato com a superfcie do eletrodo, se dissocia, doando eltrons ao eletrodo segundo a reao: H 2 O 2 O 2 + 2H + + 2e (3.3)

Os eletrodos de trabalho e de referncia so mantidos sob um potencial de aproximadamente 0,6 mV. A corrente gerada pela reao proporcional a concentrao de colesterol no analito, que pode ser quantificada atravs de uma curva de calibrao. A Figura 3.2 mostra esquematicamente as reaes envolvidas no processo de determinao de colesterol.

25

Figura 3.2: Esquema da reao amperomtrica do colesterol para a colestenona.4

Os principais mtodos de imobilizao de enzimas adotados para a construo de biossensores para colesterol so a ocluso em polmero condutor, como o polipirrol e polianilina obtidos por eletropolimerizao,5,6 ocluso ou confinamento em filmes polimricos produzidos pela tcnica de automontagem7,8, ocluso em filmes solgel9,10 e ocluso ou confinamento em membranas hidrogis11. medida que novos dispositivos semicondutores bem como novas tcnicas de imobilizao so desenvolvidas, vo sendo superadas as dificuldades tcnicas para o desenvolvimento de biossensores. O grande potencial de biossensores para aplicaes tecnolgicas, principalmente na monitorao de hemometablitos, tem impulsionado o aumento das publicaes nesta rea nos ltimos anos. O interesse industrial por estes dispositivos em vrios pases, porm, foi maior do que a literatura demonstra, pois muito dos trabalhos desenvolvidos foram mantidos confidenciais. As pesquisas nos ltimos cinco anos evoluram da forma significativa. Conforme se verifica na Figura 3.3, existe um grande crescimento na quantidade de trabalhos publicados na rea de biossensores clnicos. O aumento observado pode ser justificado pelo grande interesse industrial que estes dispositivos tm despertado. Isto se deve principalmente ao baixo custo, facilidade de operao e baixo tempo de respostas dos biossensores. Assim,

26 confirma-se um interesse crescente pelo desenvolvimento de biossensores clnicos em diversas universidades e institutos de pesquisa a nvel mundial.

721*
700

643 527

N trabalhos publicados

600 500 400 300 200 100 0

452 398

2002

2003

2004

2005

2006

Figura 3.3: Nmero de trabalhos publicados na rea nos ltimos cinco anos. * - Trabalhos publicados at 02 de setembro/2006. Fonte: Science Direct.

3.3 Consideraes finais

Os biossensores constituem uma interessante alternativa relativamente aos mtodos tradicionais para monitoramento de colesterol, apresentando diversas vantagens com relao aos mtodos convencionais, como a rapidez e preciso das medidas e a dispensa de mo de obra especializada. Dentre os tipos de biossensores, o amperomtrico de especial interesse por, em geral, apresentar maior sensibilidade, rapidez e preciso, sendo ainda de fcil sntese. Para garantir a mxima eficincia do biossensor necessrio o estudo e controle de suas propriedades fsico-qumicas, a fim de otimizar suas propriedades mecnicas, trmicas e eltricas. Uma tcnica interessante para a sntese do biossensor o mtodo sol-gel, por permitir a sntese temperatura ambiente, preservando a atividade da enzima.

27 3.4 Referncias bibliogrficas

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28 CAPTULO 4 BIOFISICA DOS BIOSSENSORES

4.1 - Transio sol-gel do sistema PVA/H3BO3 Uma tcnica interessante para a obteno de filmes finos para a imobilizao de enzimas o processo sol-gel. O uso do processo de sol-gel para produzir sensores para aplicaes analticas tem atrado considervel interesse devido a numerosos fatores, como a facilidade de fabricao, a flexibilidade do projeto de sntese e o fato das enzimas ocludas na matriz sol-gel manterem a sua atividade cataltica, uma vez que a temperatura de sntese da matriz a temperatura ambiente (25 C). Este processo evita a lixiviao da enzima e dos mediadores de eltrons para a soluo, ao contrrio do que ocorre, na maioria das vezes, com filmes finos ou membranas contendo estes mesmos materiais imobilizados. O processo sol-gel envolve uma rota de sntese de materiais onde num determinado momento ocorre uma transio de um sistema lquido sol (usualmente coloidal) para um sistema slido gel.1 O termo sol empregado para definir uma disperso de partculas coloidais (dimenso entre 1 e 100 nm) estvel em um fluido enquanto o termo gel pode ser visto como sendo um sistema formado pela estrutura rgida de partculas coloidais (gel coloidal) ou de cadeias polimricas (gel polimrico) que imobiliza a fase lquida nos seus interstcios. Os gis coloidais resultam da agregao linear de partculas primrias (Figura 4.1 - A), que s pode ocorrer pela alterao apropriada das condies fsicoqumicas da suspenso. Por outro lado, os gis polimricos so, geralmente, preparados a partir de solues onde se promovem reaes de polimerizao. Neste caso a gelatinizao ocorre pela interao entre as longas cadeias polimricas lineares (Figura 4.1 - B).

29

Figura 4.1: Figura esquemtica da transio sol-gel: formao de gel particulado (A) e formao de gel polimrico (B).

O Poli(lcool vinlico) (PVA) um polmero hidroflico capaz de formar complexos atravs da transferncia de cargas com nions.2 O PVA possui propriedades nicas tais como alta solubilidade em gua e a capacidade de formar gis por condensao. Tais gis constituem uma barreira fsica ideal para o aprisionamento de enzimas. Um on muito interessante para a obteno de hidrogis de PVA o on borato. Acredita-se que o mecanismo da reao de complexao do on borato com o PVA seja a complexao di-diol, formada por duas unidade de diol e um on borato. Por protlise os nions boratos so convertidos em B(OH) , que podem ento reagir com o 4 PVA, formando um gel termorreversvel.3 O mecanismo de complexao do sistema PVA/borato pode ser dividido em duas reaes2, como descrito na Figura 4.2.

30

Figura 4.2: Reao de complexao do sistema PVA/Borato.2,4

As constantes cinticas dessas reaes so respectivamente k1 para a formao do monocomplexo e k 2 para a formao do dicomplexo. A formao do complexo PVA/borato ocorre rapidamente. O sistema entra em equilbrio em poucos minutos, o que no comum no domnio dos gis e complexos polimricos.4,5 A constante de velocidade da reao de complexao do sistema PVA/Borato pode ser representada por uma nica constante cintica K, dada por:3
H

[reticulaes] = K 0 e RT K= [diol]2 [onborato]

v = K [onborato][diol]2

A velocidade, v, da reao dada por:

No processo de reticulao do sistema PVA/Borato uma transio de fase denominada gelificao ocorre aps o processo de reticulao. Essa transio controlada termodinamicamente. Neste sentido, o processo de reticulao exerce uma influncia significativa em grandezas macroscpicas como o mdulo de elasticidade e temperatura de transio vtrea do sistema. A termodinmica desse sistema discutida nas prximas sees.

31 4.2 Termodinmica das reaes qumicas

A energia e a capacidade de realizar trabalho so fundamentais para a ocorrncia de qualquer processo na natureza. Em um organismo vivo, da mesma forma, a energia necessria para a realizao dos diversos trabalhos fisiolgicos. As reaes catalisadas por enzimas podem ser estudadas atravs de uma abordagem termodinmica. Desta forma, possvel entender o que faz com que a reao enzimtica se processe e se complete, em termos das energias envolvidas no processo. Tambm a reao de complexao do sistema PVA/Borato pode ser entendida atravs de uma abordagem termodinmica. Para este estudo importante uma reviso nos conceitos bsicos da termodinmica, como discutido a seguir. Para um sistema fechado, a primeira lei da termodinmica afirma que a variao total de energia interna, E, igual a diferena entre o calor, Q, fornecido ao sistema e o trabalho, W, realizado pelo sistema.6-8

E=Q-W
Esta uma expresso quantitativa do princpio de conservao da energia.

(4.1)

Em um processo qumico, segundo a primeira lei, a diferena de energia entre reagentes e produtos resultar em energia que ser absorvida ou liberada na forma de calor ou trabalho. A variao de energia interna E pode ser dividida em diversos termos, cada um representando a variao de uma forma particular de energia, da seguinte forma:

E=EK+EP+U

(4.2)

onde EK a variao na energia cintica, EP a variao na energia potencial e U a variao na energia interna do sistema. A funo U de energia interna apresenta as energias cintica e potencial das partculas, em um nvel microscpico. Considerando que a energia cintica e potencial do sistema so constantes, como ocorre frequentemente, e substituindo a expresso para E na primeira lei, obtemos a equao:

U=Q-W
onde W o trabalho executado pelo sistema e Q o calor absorvido pelo sistema. Na forma diferencial: dU=dQ-dW

(4.3)

(4.4)

32 Um dos axiomas da termodinmica relata a existncia de uma propriedade chamada entropia, S, que uma propriedade intrnseca de um sistema. Para um processo reversvel, as variaes desta propriedade dada por:
dS = dQ T

(4.5)

De acordo com outro axioma, a segunda lei da termodinmica, a variao da entropia S de um sistema e seu exterior, tomados em conjunto sempre positiva e aproxima-se de zero para um processo que se aproxime da reversibilidade. O trabalho mecnico, em um sistema termodinmico, ocorre quando uma fora agindo sobre o sistema se move ao longo de certa distncia. O trabalho dado por: dW=PdV Combinando as equaes 4.4, 4.5 e 4.6, temos: dU=TdS-PdV (4.7) (4.6)

Esta uma equao geral que relaciona as propriedades de um sistema fechado, da qual deriva as outras relaes importantes. Nesta equao, dU depende de Q e W, que no so propriedades, mas manifestao de processos, ou seja, so variveis de processo. Para o estudo de sistemas no equilbrio, conveniente desenvolver expresses gerais entre propriedades de equilbrio envolvendo apenas variveis de estado. Estas propriedades designam-se por funes de estado. A entalpia, H, uma funo de estado dada por: H=U+PV (4.8)

Considerando pequenas alteraes do estado do sistema, podemos escrever esta equao tomando a sua diferencial: dH=dU+PdV+VdP (4.9)

Atravs das primeira e segunda leis, tomadas em conjunto (equao 4.7) esta equao pode ser escrita como: dH=TdS+VdP+dW (4.10)

Esta expresso geral uma forma alternativa das primeiras e segundas leis da termodinmica tomadas em conjunto. Esta funo de estado, para processos em que ocorre apenas trabalho mecnico e esto presso constante, permite uma medida direta do calor trocado pelo sistema e a sua vizinhana, de uma forma simples. Em uma reao qumica, quando dH negativo, a reao qumica chamada exotrmica. Se dH positivo, ento o calor absorvido pelo sistema e a reao chamada de endotrmica.

33 Outra importante funo de estado a energia livre de Gibbs, G, definida por: G=U+PV-TS=H-TS (4.11)

Considerando pequenas alteraes do estado do sistema, a alterao na energia livre de Gibbs dada por: dG=dU+PdV+VdP-TdS-SdT (4.12)

Da mesma forma, atravs das primeira e segunda leis, tomadas em conjunto (equao 4.7) esta equao pode ser escrita como: dG=-SdT+VdP+dW (4.13)

Esta uma forma alternativa das leis da termodinmica tomadas em conjunto. A energia livre de Gibbs simplifica a descrio de sistemas em que a temperatura e presso so constantes. Para estes sistemas, que incluem reaes qumicas e transformaes de fase, G fornece o trabalho total exercido sobre o sistema, com exceo de trabalho mecnico. O sinal de G indica se uma reao capaz de realizar trabalho, com exceo do mecnico. Se for negativo, o sistema ter perdido energia livre, que pode ter sido utilizada para produzir trabalho. Se for positivo, o sistema ter recebido energia livre, portanto no pode ter realizado trabalho. De acordo com a segunda lei da termodinmica, uma reao espontnea se caracteriza pela perda de energia livre, ou seja, G negativo. Os potenciais termodinmicos apresentados nesta seo so teis para o desenvolvimento de relaes que possibilitaro a compreenso e a interpretao quantitativa do processo de soro de gua e transio de fase volumtrica do biossensor. Estas relaes sero desenvolvidas no prximo captulo.

4.3 Temperatura de transio vtrea e fuso cristalina

A estabilidade trmica dos biossensores pode ser avaliada atravs das temperaturas de transio vtrea e fuso cristalina. A temperatura de transio vtrea, Tg, o valor mdio da faixa de temperatura a partir da qual as molculas da fase amorfa de um material polimrico adquirem mobilidade.10,11 Em geral, os polmeros no reticulados, a temperaturas abaixo da Tg apresentam comportamento mecnico rgido e quebradio e, aps a Tg, comportamento dctil e malevel. A Tg uma caracterstica intrnseca de materiais amorfos, enquanto a temperatura de fuso, Tm, uma

34 caracterstica de materiais cristalinos. Desta forma, polmeros semicristalinos, como o PVA, possuem Tg e Tm. Para compreender as bases moleculares da transio vtrea, necessrio analisar os vrios graus de liberdade que um polmero amorfo possui. Em temperaturas menores que a Tg, as molculas possuem energia trmica, kT, suficiente apenas para o movimento de alguns tomos ou de grupos funcionais ao longo da cadeia principal, e para vibrao dos tomos em torno de suas posies de equilbrio. Em temperaturas a partir da Tg, a energia se torna suficiente para translao de molculas inteiras, o que permite o escoamento, e para movimentos cooperativos de extenso e contrao de segmentos da molcula, que confere elasticidade ao material. Algumas propriedades do material sofrem alterao com a transio vtrea. Estas propriedades podem ento ser utilizadas para determinao da Tg, como o calor especfico, mdulo de elasticidade, ndice de refrao, coeficiente de expanso trmica e volume especfico.10 A Figura 4.3 ilustra a variao do volume especfico com a temperatura para um material polimrico. Neste grfico, a Tg est associada a uma mudana no coeficiente angular da curva. A Tm caracterizada, para um polmero, como uma descontinuidade na curva, da mesma forma que para outros materiais. Assim, a transio vtrea conhecida como uma transio de segunda ordem, enquanto a fuso cristalina conhecida como uma transio de primeira ordem.

Figura 4.3: Grfico esquemtico da variao do volume especfico com a temperatura para um material polimrico.

35 A alterao no coeficiente de expanso trmica, ou seja, do coeficiente angular da curva, na Tg, pode ser compreendida atravs do conceito de volume livre do polmero. O volume livre, vf, definido como a soma de todo o volume vazio contido no polmero, isto :
v f = v v0

(4.14)

onde v o volume especfico do polmero e v0 o volume do polmero no zero absoluto, que pode ser determinado experimentalmente atravs da extrapolao da curva v versus T, entre a Tg e a Tm, at a temperatura de 0 K. O movimento de uma molcula em um polmero depende da presena de vacncias em suas proximidades. O volume livre do polmero aumenta com o aumento da temperatura. Quando a temperatura do material maior que a Tg, o volume livre levado a ponto de conferir mobilidade suficiente s cadeias de modo que elas alcancem uma configurao de equilbrio. Ao baixar a temperatura, a mobilidade das molculas diminui, aumentando o tempo necessrio para o rearranjo das mesmas at a configurao de equilbrio. Em temperaturas abaixo da Tg, o sistema no pode mais alcanar a configurao de equilbrio devido s restries em seus movimentos. Com isso, um decrscimo na temperatura leva a uma reduo menor no volume livre do polmero, causando uma alterao no coeficiente angular da curva.10,11 A fuso cristalina nos polmeros uma transio de fase similar observada em compostos orgnicos de baixo peso molecular, metais e cermicas. A energia livre de Gibbs de fuso dada por: G m = H m TS m (4.15)

O ponto de fuso cristalina, Tm, um ponto de equilbrio termodinmico, Gm=0, logo:

Tm =

H m S m

(4.16)

Hm a energia necessria para vencer a fora de interao entre as cadeias em uma

regio cristalina a uma temperatura e presso constante, e independe do tamanho das cadeias. Quanto menor forem as cadeias polimricas, mais aleatrias elas sero e, conseqentemente, maior ser Sm. Assim, a Tm diminui com o decrscimo do grau de polimerizao. A equao 4.16 tambm indica que polmeros com maior grau de

36 cristalinidade e maior fora de interao entre as cadeias em regies cristalinas, ou seja, com maior Hm, possuem maior Tm. A transio vtrea e a fuso cristalina podem convenientemente ser caracterizadas atravs de tcnicas como a calorimetria exploratria diferencial e anlise termomecnica. Estas tcnicas sero discutidas nos prximos captulos. No projeto de biossensores, importante que a Tg e Tm possuam valores maiores que a temperatura de trabalho do dispositivo, pois desta forma mantido o ambiente ideal para a ao da enzima e seria garantida a resistncia mecnica necessria ao bom funcionamento do dispositivo. Em biossensores construdos com enzima imobilizada por ocluso em polmero reticulado, a Tg e Tm podem ser controladas na etapa de sntese, atravs da escolha de uma densidade de reticulaes adequada. Um biossensor deve possuir tambm estabilidade mecnica. Uma forma de avaliar esta estabilidade atravs do mdulo de elasticidade do material, ou mdulo de Young.

4.4 Estabilidade mecnica

Uma matriz para a imobilizao de enzima para construo de biossensores deve possuir resistncia mecnica suficiente para garantir a integridade do biossensor durante a sua utilizao. A estabilidade mecnica do biossensor pode ser avaliada atravs do mdulo de elasticidade, ou mdulo de Young. Um corpo elstico aquele que volta sua forma original quando as foras que deram origem a uma deformao so removidas. Quando um corpo submetido a uma tenso (trao ou compresso), ele tende a sofrer uma alterao em seu comprimento, na direo da tenso aplicada. Se a deformao do corpo variar linearmente com a tenso aplicada, o corpo se encontra em um regime elstico. No momento em que a relao entre tenso aplicada e deformao sofrida deixa de ser linear, o corpo chegou em seu limite elstico e entra em um regime plstico, em que no retorna s suas dimenses originais depois da remoo da tenso aplicada.12,13 No regime elstico, o comportamento do corpo pode ser descrito pela lei de Hook:
F l = A l

(4.17)

37 onde F a fora aplicada sobre uma rea A, l o comprimento do corpo e l a deformao sofrida pela ao da fora. O mdulo de Young definido como a constante de proporcionalidade, :

F/A tenso = dl / l deformao

(4.18)

um parmetro mecnico que permite avaliar a rigidez de um material.

O valor de calculado para uma tenso de trao sempre o mesmo valor calculado para uma compresso. O mdulo de Young uma caracterstica intrnseca de cada material. Da mesma forma que a Tg e Tm, funo da densidade de reticulao do polmero utilizado na construo do biossensor. Assim, atravs da densidade de reticulao, pode ser controlado.

4.5 Parmetro de solubilidade O parmetro de solubilidade de um polmero, pol., uma varivel termodinmica de interesse especial no estudo da cintica de soro de solvente pela rede polimrica. Sabe-se que um bom solvente para um polmero aquele que possui um valor de parmetro de solubilidade, solv., prximo ao do polmero. Em um biossensor, o parmetro de solubilidade determina a capacidade de soro de analito pelo dispositivo, influenciando diretamente a sua performance. Define-se o parmetro de solubilidade de um solvente solv como:14 solv. H v RT solv. solv. = M solv.

(4.19)

onde Msolv. a massa molecular do solvente e solv a densidade do solvente. Esta expresso conhecida como expresso de Hildebrand. O calor de vaporizao H a energia necessria para evaporar 1 mol de um lquido. O calor de vaporizao est diretamente relacionado a amplitude das foras intermoleculares existentes em um lquido. Quando as atraes moleculares so fortes, as molculas do lquido no podem facilmente escapar para a fase vapor. Quando as foras intermoleculares so fracas, o Hv pequeno e pequeno caso dos polmeros com cadeias flexveis, elastomeros. Quando as foras

38 intermoleculares so fortes, as cadeias so rgidas. Se as foras intermoleculares so muito grandes, os materiais exibem grande resistncia s tenses mecnicas, caractersticas tpicas das fibras, especialmente quando a simetria molecular favorvel para a cristalizao. Costumamos exprimir as unidades de em Hildebrand (H), que significa (cal.cm-3)1/2. O processo de dissoluo de um polmero num solvente um processo lento e que ocorre em duas etapas. Na primeira etapa, as molculas do solvente difundem-se para dentro do polmero, formando-se um gel. Se as interaes entre as molculas de solvente so mais fortes do que as existentes entre as cadeias do polmero (Energia de Gibbs de mistura muito negativa), ento ocorre a segunda etapa do processo, o gel degenera gradualmente numa soluo verdadeira. Este processo pode ser muito lento (semanas a meses) para materiais de massa molecular mdia muito elevada. Em casos em que as foras moleculares atrativas entre as cadeias dos polmeros so muito fortes, como o caso de polmeros reticulados ou com elevada cristalinidade, a segunda etapa no ocorre, ou seja, o material insolvel. Um bom solvente para um dado polmero aquele que possui um valor do parmetro de solubilidade, solv, muito prximo do valor do parmetro de solubilidade do polmero, pol . Como regra de trabalho:

pol 1,1 < solv < pol + 1,1

4.6 Mediadores de eltrons

Mediadores de eltrons so molculas de grande atividade eletroqumica que permitem uma rpida troca de eltrons com o analito e a superfcie do eletrodo.15 O mediador de eltrons age como uma ponte para transporte de eltrons entre o analito e a superfcie do eletrodo. Um mediador de eltrons pode tambm contribuir para as propriedades eltricas da matriz utilizada para construo do biossensor. Em um biossensor, o mediador de eltrons imobilizado na matriz polimrica, juntamente com a enzima, e tem a funo de promover a reduo cataltica do perxido de hidrognio gerado a partir da reao bioqumica. Os eltrons produzidos pela reduo do perxido de hidrognio, atravs do mediador, so elevados superfcie do eletrodo. Alguns dos mediadores de eltrons comumente utilizados na literatura so o polipirrol16,17 e a polianilina18.

39 Neste trabalho foi proposta uma nova classe de materiais para utilizao como mediadores de eltrons em biossensores, a molcula ftalocianina de cobre (Ftc). A Ftc um macrociclo orgnico contendo um tomo central de cobre coordenado por quatro tomos de nitrognio. Esta molcula utilizada como semicondutor intrnseco para opto-eletronica19, por possuir caractersticas ticas singulares, sensores de gases20 e extensivamente utilizado na indstria para a produo de discos pticos21 e como pigmento para tintas22. A molcula de Ftc tem a capacidade de produzir a reduo cataltica do perxido de hidrognio24, alm de possuir grande similaridade com molculas orgnicas como a hemoglobina. Estas caractersticas tornam a Ftc uma molcula interessante quanto sua utilizao como mediador de eltrons em biossensores enzimticos.

Figura 4.5: Estrutura da molcula de ftalocianina de cobre (Ftc).

4.7 Consideraes finais

Hidrogis de PVA constituem uma matriz interessante para a imobilizao de enzimas na construo de biossensores, devido a sua capacidade de formar complexos com H3BO3 a temperatura ambiente, preservando a enzima imobilizada. A Ftc uma molcula interessante para a utilizao como mediador de eltrons no biossensor, por ser um material de baixo custo e capaz de reduzir o perxido de hidrognio.

40 Para a utilizao desses materiais no projeto de biossensores, suas propriedades fsico-qumicas devero ser estudadas. Uma caracterstica dos hidrogis de PVA sua alta capacidade de soro de gua, que essencial para o desempenho do biossensor por permitir a formao do ambiente aquoso ideal para a ao da enzima e facilitar a soro do analito. Esta e outras caractersticas dos hidrogis de PVA sero estudadas nos prximos captulos.

4.8 Referncias bibliogrficas

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42
CAPTULO 5 FENMENO DE TRANSPORTE DE GUA EM MEMBRANAS POLIMRICAS

5.1 - Introduo

A caracterizao do transporte de gua em membranas polimricas possui um importante papel tecnolgico na caracterizao e desenvolvimento de hidrogis para aplicaes em biotecnologia. Quando empregado na construo de biossensores enzimticos, espera-se que o hidrogel apresente uma mxima soro de gua, o que influencia diretamente na performance do dispositivo, j que a reao enzimtica deve se realizar em meio aquoso. Hidrogis, como o PVA, so polmeros com elevada capacidade de soro de gua. Quando um hidrogel submerso em gua, as molculas de gua difundem-se na matriz polimrica causando seu intumescimento. A soro de gua por um hidrogel pode ser justificada em termos da presso osmtica, de acordo com a teoria de Flory-Huggins1. Este modelo pode ser utilizado para justificar a soro da soluo aquosa de cido brico pelo PVA, no momento de sua reticulao, e a soro de soluo de colesterol pelo dispositivo, no momento de sua utilizao. O estabelecimento de um modelo matemtico para o processo de soro de gua por uma membrana polimrica permite a avaliao de propriedades fsicoqumicas deste sistema, como o coeficiente de difuso, a energia de ativao associada ao processo de difuso e o mecanismo de difuso da gua na membrana.

5.2 - Transio de fase volumtrica

Atravs

da

teoria

de

Flory-Huggins

(FH)

do

equilbrio

de

intumescimento, possvel efetuar uma interpretao qualitativa do processo de intumescimento (transio de fase volumtrica) de hidrogis. A teoria de FH no considera efeitos do volume livre e de interaes de hidrognio. Devido a este fato, a teoria de FH no capaz descrever quantitativamente o processo de intumescimento.2 A transio de fase volumtrica de um polmero governada por pelo menos trs diferentes termos de energia livre, ou seja, por alteraes na energia livre de

43
mistura Gm , na energia livre de deformaes elsticas Gel , e alteraes na energia livre de interaes eletrostticas Gi .2,3 G = Gm + Gel + Gi A energia livre de mistura, Gm , dada por: (5.1)

Gm = RT ni ln vi + ni v j ij i< j i
sendo R a constante dos gases e T a temperatura.

(5.2)

Para o sistema PVA/cido brico, o ndice i = 1, 2 e 3 representam o solvente (gua), o PVA e o cido brico (ou colesterol) respectivamente. ij o parmetro de interao entre o polmero e o solvente. Este parmetro indica a alterao da energia de interao quando o polmero e o solvente so misturados, ou seja, indica a interao termodinmica entre o polmero e o solvente. Em um sistema aquoso, quanto maior o valor de ij , menor a interao entre o polmero e a gua e maior a interao entre os grupos hidroflicos do polmero ou entre as cadeias polimricas. ij dado por:4
1 ln (1 2 ) + 2 + eV1 ( 2 / 3 2 2 J 1 )

=1

22

Sendo J a funcionalidade do componente 2 da soluo. A energia livre de alteraes elsticas Gel dada por: 0 3 RT v 2 Gel = 2 NV1 v 2 3 v0 1 ln 2 v 2
2 1 3

(5.3)

0 sendo N o grau de polimerizao, V1 o volume molar de solvente, v 2 a frao de volume de polmero antes do processo de intumescimento e v2 a frao de volume de polmero em equilbrio de inchamento. Para um gel inico fracamente carregado, a energia livre de interaes

eletrostticas Gi dada por: Gi = RT f v2 fv n1 ln 2 N v1 N (5.4)

onde f o nmero mdio de unidades inicas na cadeia. O potencial qumico 1 relativo ao componente puro 1 na soluo dado por:

44
G 1 = n 1 Y , P , n2 , 3
Uma Equao similar existe para os potenciais qumicos 2 e 3 . Substituindo as Equaes 5.2, 5.3 e 5.4 na Equao 5.5 e diferenciando com relao ao nmero de mols de solvente n1 e de molculas de polmero n3 chegamos ao seguinte conjunto de equaes para o excesso de potencial qumico para o solvente e para o polmero nas fases sol e gel:2 v v 1gel v f 02 / 3 = N 1 v 1 / 3 v 2 2 + ln v1 + (1 v1 ) 3 + ( 12 v 2 + 13 v3 )(1 v1 ) 23 v 2 v3 2 2 RT 2 y N (5.6a) 1 1sol = ln (1 ) + 1 + 13 2 RT y (5.6b)

(5.5)

v 1 3gel 1 02 /3 = N 1 v 1 / 3 v 2 + ln v 3 + (1 v 3 ) v1 + ( 13 v1 + 23 v 2 )(1 v 3 ) 2 y yRT 2 y f 12 v1 v 2 v 2 N

(5.6c) 3sol 1 1 2 = ln (1 ) + (1 ) + 13 (1 ) y y yRT (5.6d)

sendo y o nmero de segmentos no componente 3 da soluo e a sua frao volumtrica na soluo. O estado de equilbrio de inchamento de uma rede (fase gel) imersa em uma soluo obtido quando os componentes 1 (solvente) e 3 (cido brico ou colesterol) contidos da rede polimrica esto em equilbrio termodinmico com esses mesmos componentes exteriores a rede. O estado de equilbrio descrito pela igualdade do potencial qumico, , destes componentes em ambas as fases. Ento, no equilbrio de inchamento, se pode escrever: 1gel 1sol = 0
2
gel sol 2 = 0

(5.7a) (5.7b) (5.7c)

3gel 3sol = 0

45
Em termos de presso osmtica , a Equao 5.7a pode ser escrita como:

gel 1

1sol =0 V1

(5.8)

A presso osmtica de um gel determina quando este tende a expandir ou a contrair. Quando diferente de zero, fornece a fora motriz para a difuso de solvente no hidrogel, provocando a sua transio de fase volumtrica. O solvente se move para dentro ou para fora do gel at que se iguale a zero, isto , at que as foras agindo no gel sejam balanceadas. Se positivo a soluo tende a se difundir para o hidrogel, se negativo, a soluo tende a sair do hidrogel.

5.3 - A primeira lei de Fick

A difuso de um solvente em um polmero se d travs do movimento randmico de molculas individuais. Se um gradiente de concentrao estabelecido em uma seo qualquer de um polmero, surge a transferncia de massa na direo da maior para a de menor concentrao. Se o processo de transferncia de massa for estacionrio, ou seja, o gradiente de concentrao for constante, este processo pode ser descrito atravs da primeira lei de Fick. A primeira lei de Fick pode ser deduzida considerando-se a difuso em uma dimenso, como ilustrado na Figura 5.1.5,6

N 0 ( x) N 0 ( x) 2

N 0 ( x + x) N 0 ( x + x) 2

x Figura 5.1: Figura esquemtica do deslocamento de molculas em uma seo transversal num fluido.

De acordo com o deslocamento linear estatstico, durante um intervalo de tempo t metade das partculas esto se movendo x nas duas direes, de tal forma

46
que o fluxo total atravs da rea A em x dado pela diferena entre os nmeros de partculas movendo-se da esquerda para a direita e aquelas movendo da no sentido oposto:
N 0 ( x ) N 0 ( x + x ) 1 2 2 J 0 ( x, t ) = A t

(5.9) e lembrando que a

Multiplicando a Equao 5.9 por x / x concentrao de uma substncia dada por

C0 =
Obtem-se:

N0 Ax

x 2 C0 ( x + x) C0 ( x) J 0 ( x, t ) = 2t x
O coeficiente de difuso definido como

(5.10)

D=

x 2 2t
C x

Tomando o limite para x 0 e t 0 , a Equao 5.9 se torna:

J s = D

(5.11)

ou seja, o fluxo Js de um soluto S proporcional ao gradiente de concentrao. D chamado coeficiente de difuso. Esta Equao anloga a Equao de fluxo de calor entre dois corpos e conhecida como primeira lei de Fick. A primeira lei de Fick aplicvel ao estado estacionrio, onde a concentrao no se altera com o tempo.

5.4 - A segunda lei de Fick

A segunda lei de Fick capaz de descrever o processo de difuso de um solvente em um polmero em um estado no estacionrio, ou seja, onde a concentrao do solvente no interior do polmero varivel com o tempo. A deduo da segunda lei de Fick apresentada a seguir. 5,6 Considerando no interior de um slido, um elemento de volume retangular de espessura x , suficientemente pequena para que a concentrao no varie significativamente com a posio dentro do elemento, como ilustrado na Figura 5.2:

47
superfcie de rea A

J s ( x, t )

J s ( x + x, t )

x + x

Figura 5.2: Figura esquemtica do deslocamento de partculas em uma seo

transversal num slido. O nmero de partculas que passa pela superfcie de rea A, entrando no elemento de volume, na posio x em um intervalo de tempo t dado por J s ( x, t ). A.t . O nmero de partculas que passa pela superfcie de rea A, saindo do elemento de volume, em x + x no mesmo intervalo de tempo pode ser escrito como J s ( x + x, t ). A.t . Portanto, o fluxo lquido de partculas para dentro do elemento de volume (o nmero de partculas que entra menos o nmero de partculas que sai) no intervalo de tempo t dado por: ( J s ( x, t ) J s ( x + x, t )). A.t (5.12)

A variao lquida de partculas dentro do elemento de volume durante o intervalo de tempo t tambm pode ser expressa em termos da concentrao C(x,t) aproximando o nmero de partculas dentro do elemento de volume A.x em qualquer instante de tempo por C ( x + x / 2, t ). A.x . Desta forma, podemos escrever a variao lquida do nmero de partculas dentro do elemento de volume no intervalo t como o nmero de partculas em t + t menos o nmero de partculas em t
(C ( x, x / 2, t + t ) (C ( x, x / 2, t ). A.x

(5.13)

Considerando o princpio da conservao da matria, a variao do nmero de partculas dentro do volume em um intervalo de tempo t dado pela quantidade de partculas que entra menos a quantidade de partculas que sai. Sendo assim, podemos igualar as Equaes 5.12 e 5.13.

48
J s ( x, t ) J s ( x + x, t ) C ( x + x / 2, t + t ) C ( x + x / 2, t ) = x t
A expresso (14) pode ser reescrita como:

(5.14)

J s ( x + x, t ) J s ( x, t ) C ( x + x / 2, t + t ) C ( x + x / 2, t ) = t x
Tomando-se os limites para x 0 e t 0 , a Equao 5.14 toma a forma:

J s ( x, t ) C ( x, t ) = t x
que a Equao da continuidade

(5.15)

Derivando a primeira lei de Fick (Equao 5.11) em relao a x, obtemse:

J s ( x, t ) C ( x, t ) = D x x x
Combinando as equaes 5.15 e 5.16, obtm-se
C ( x, t ) C ( x, t ) = D t x x

(5.16)

(5.17)

que a segunda lei de Fick Se D no depende de x e for constante com o tempo, podemos escrever a Equao 5.17 como:

2 C ( x, t ) C ( x, t ) =D t x 2
Lembrando-se que

(5.18)

2 x 2

a definio do operador Laplaciano em

coordenadas cartesianas em uma dimenso (x). A Equao 5.18 pode ser reescrita na foram geral como:
C ( x, t ) = D 2 C ( x , t ) t

49
5. 5 Determinao do coeficiente de difuso

comum realizar o estudo da difuso de lquidos orgnicos em polmeros atravs do mtodo gravimtrico. Neste mtodo realizada a medida da massa de uma membrana polimrica imersa em um lquido em funo do tempo, em vez de se considerar a transferncia de matria. O estudo do transporte de gua em membranas polimricas pode ser tratado quantitativamente pela segunda lei de Fick (Equao 5.18). A soluo desta equao para membranas permite o clculo do coeficiente de difuso de um solvente em uma membrana. O mtodo para soluo da segunda lei de Fick para uma membrana encontrado na literatura faz uso das funes de Green, o que torna o mtodo complexo.5 Desta forma, o Prof. Luiz F. Pontin, do Departamento de Matemtica da UNIFEI, juntamente com a aluna do curso Materiais para Engenharia, Maria L. C. Falco, desenvolveu uma nova metodologia para a soluo da segunda lei de Fick para uma membrana.7 Esta nova metodologia contorna as dificuldades introduzidas pelas funes de Green e possibilita a sua fcil compreenso. A seguir apresentado o desenvolvimento da soluo da segunda lei de Fick para uma membrana segundo esta nova metodologia, introduzindo algumas modificaes e correes no desenvolvimento das expresses. A segunda lei de Fick pode ser solucionada considerando-se uma membrana semi-infinita imersa em um banho semi-infinito, como mostrado na Figura 5.3. Se o volume do recipiente muito grande em relao s dimenses de amostra, a concentrao da espcie difusora pode ser considerada constante, como tambm a sua concentrao sobre as duas faces principais do filme. A metodologia utilizada para resoluo deste problema o mtodo de separao de variveis acoplado srie de Fourier.8 Este mtodo consiste em propor uma soluo C(x,t), constituda pelo produto de duas funes, sendo a primeira funo apenas de x e a segunda funo apenas de t. Desta forma:

C ( x, t ) = M ( x )N (t )

(5.19)

sendo M(x) uma funo apenas da varivel x e N(t) uma funo apenas da varivel t.

50
y

C1
C(x=-h) = C(x=h) = C1

x
-h h

Figura 5.3: Representao esquemtica da difuso de lquido em uma membrana

polimrica.

A segunda lei de Fick ento assume a seguinte forma:

dN (t ) d 2 M (x ) M (x ) = DN (t ) dt dx 2

Que pode ser reescrita como:

dN (t ) 1 1 d 2 M (x ) = . . DN (t ) dt M ( x ) dx 2

(5.20)

Observa-se que, na Equao 5.20, o primeiro membro depende apenas de

t e o segundo membro apenas de x. Assim, para que a igualdade seja satisfeita ambos os

membros devem ser constantes. Essa constante, denominada constante de separao, por convenincia, ser chamada de -2. Assim, obtm-se as seguintes expresses: 1 dN (t ) . = 2 DN (t ) dt Que pode ser reescrita como:
dN (t ) + D 2 .N (t ) = 0 dt

(5.21a)

e 1 d 2 M (x ) . = 2 2 M ( x ) dx Que pode ser reescrita como:

51
d 2 M (x ) dx
2

+ 2 .M (x ) = 0

(5.21b)

A Equao 5.21a uma Equao diferencial ordinria linear de primeira ordem, cuja soluo geral :
N (t ) = e
2

Dt

A Equao 5.21b uma Equao diferencial ordinria linear de segunda ordem, cuja soluo geral :

M ( x ) = a cos x + b sen x
onde os coeficientes a e b podem ser determinados considerando a condio inicial
C ( x, t ) = 0 ,

-h < x < h

e a condio de contorno
C ( h, t ) = 0 , para t 0

A soluo geral da segunda lei de Fick (Equao 5.18), para uma membrana dada por:
C ( x, t ) = (a cos x + bsenx ).e
2

Dt

(5.23)

A soluo dada pela Equao 5.23 no satisfaz condies de contorno arbitrrias. Assim, para satisfazer condies de fronteira no homogneas, segundo Fourier, deve ser proposta uma soluo do tipo:

C ( x, t ) = a0 + 2 (a n cos n x + bn sen n x ).e n Dt

2

(5.24)

n=1

As constantes an, bn e = n2/P podem ser determinadas atravs das condies de contorno. Como a membrana homognea e simtrica, tem-se que:

C ( x, t ) = C ( x, t ) ,

para h x h e t 0

Assim, a Equao 5.24 pode ser reescrita como:

C ( x, t ) = a0 + 2 (a n cos n ( x ) + bn sen n ( x )).e n Dt

2

n =1

C ( x, t ) = a0 + 2 (a n cos n x bn sen n x ).e n Dt

2

(5.25)

n =1

52
Para que a igualdade acima seja verificada para h x h e t 0 necessrio que bn = 0 para n = 1, 2, 3, ... Desta forma, a Equao 5.24 torna-se:

C ( x, t ) = a0 + 2 (a n cos n x ).e n Dt
2

(5.26)

n =1

Para o clculo da soluo particular da segunda lei Fick, as seguintes condies de contorno podem se aplicadas:
C ( x ,0 ) = 0 ,

-h < x < h

C ( h, t ) = C1
Para se determinar as constantes an e P (perodo da funo), necessrio efetuar a extenso peridica par da condio inicial, ou seja, estender o valor da concentrao C1 at 2h, como mostrado na Figura 5.4. A constante P dada por P = 4h.

P = 4h

-2h -h
P

2h

Figura 5.4: Representao da extenso peridica par da condio inicial.

Os coeficientes an para n = 1, 2, 3, ... so dados por: 2 2 n an = C (x,0). cos P x.dx P P / 2

P/2

(5.27)

53
Sabendo-se que C ( x,0) uma funo par e que P = 4h, a Equao 5.27 pode ser escrita como:
an =

1 n C (x,0). cos 2h x.dx 2h 2 h

2h

2h

C1 / hsen (n / 2h )x + 2 h 1 n | 2h an = C1. cos 2h x.dx = n / 2 h 2h 2 h

an = 2C 2C1 n n senn sen = 1 .sen n n 2 2

(5.28)

Os valores de an podem ser obtidos a partir de uma tabela da funo

n seno. A Tabela 5.1 apresenta o valor de sen para alguns valores de n. 2

Tabela 5.1: Alguns valores da funo sen(n / 2) .

sen(n / 2)
0 1 0 -1 0

0 1 2 3 4

De acordo com a Tabela 5.1, percebe-se que os valores de sen(n / 2) so diferentes de zero apenas para valores de n inteiro e mpar. Para n = 0, tem-se:
C 2 C 1 a 0 = C1dx = 1 | h h = 1 (2h h ) = C1 h h hx h
2h

Assim, a partir da Equao 5.26, a seguinte relao pode ser obtida:

C ( x, t ) = C1

4C1

(2n 1) cos
n =1

( 1)

n +1

(2 n 1) 2n 1 x D 2h .t .e

2h

(5.29)

54
A concentrao de saturao, no tempo de equilbrio (t ), :
C ( x, t ) C1 C
t

Ento, no tempo de equilbrio e para h x h e t 0, a Equao 5.29 pode ser escrita como:
(2 n 1) 2n 1 x D 2h .t .e

( 1) cos ( 4 C ( x, t ) = 1 C n=1 (2n 1)

n +1

2h

(5.30)

Esta equao exprime a razo entre a concentrao de soluo dentro da membrana em uma posio x e tempo t e a concentrao de soluo no tempo de equilbrio. Para se obter a quantidade total de matria absorvida pela membrana por unidade de tempo, M (t ) , basta integrar a Equao 5.30 em toda a espessura da membrana, obtendo-se a seguinte expresso:
2 (2 n 1) 4C1 ( 1)n+1 (2n 1)x .e D 2h .t .dx M (t ) = C ( x, t )dx = C1 (2n 1) cos 2h n=1 h h

2 (2 n 1) n +1 D .t 4C (2n 1)x ( 1) M (t ) = C1dx 1 cos .e 2 h .dx h n=1 (2n 1) 2h h

(5.31) Para solucionar a segunda integral da relao acima, necessrio extrair o somatrio da integral. Para que isto seja realizado, necessrio que a srie seja convergente uniformemente no intervalo [-h, h]. A convergncia dessa srie garantida

(2n 1) 2 t , portanto: pelo termo exp D 2h

M (t ) = 2hC1 4C1

( 1)n+1 e D (2n 1) n=1

(2 n 1) .t h 2h
2

cos

(2n 1)x .dx

2h

(5.32)

Resolvendo a integral existente na relao (5.32), obtem-se:

55
2n-1 (2n 1)x .dx = 2 cos (2n 1)x .dx = 2sen 2h x |h = 4h ( 1)n+1 cos (2n-1) 0 (2n 1) 2h 2h h 0 2h
h h

A Equao 5.32 assume ento a forma:

M (t ) = 2hC1

4C1

(2n 1)
n =1

( 1)

n +1

(2 n 1) D .t e 2h
2

4h ( 1)n+1 = (2n 1)
2

M (t ) = 2hC1

16hC1

(2n 1)2
n =1

(2 n 1) D .t e 2h

(5.33)

Na concentrao de saturao (t ): M (t ) C1 .2h M

t

a Equao 5.33 pode ser escrita como:

Mt 8 = 1 2 M

D(2n + 1)2 2 t exp (2n + 1) 2 (2h )2 n =0

(5.34)

Os termos da Equao 5.34 convergem rapidamente com o crescimento de t. Desta forma, o coeficiente de difuso (D) pode ser calculado, aproximadamente, tomando-se o primeiro termo da srie (n = 0) apresentada pela Equao 5.34. Assim, a seguinte expresso pode ser obtida:
1 Mt 8 = 2 M
D .t .e 2 h
2

Aplicando o logaritmo nesta Equao, obtemos:

M ln1 t M

8 D 2 t = ln 2 h 2

(5.35)

A Equao 5.35 pode ser comparada com a Equao de uma reta em um

M grfico ln 1 t versus t, atravs do qual D pode ser obtido em funo do M

coeficiente angular, , da reta, segundo a relao: D=

h 2 2

(5.36)

56
5.6 Mecanismo de difuso de solvente atravs de uma membrana polimrica.

O mecanismo de difuso em um polmero fenmeno complexo que, a um nvel microscpico, pode ser classificado em trs categorias: 9-13 1 - Difuso Fickiana, ou Caso I (Figura 5.4 - A). Se refere ao processo no qual a taxa de difuso do solvente muito menor que a taxa de relaxao das cadeias polimricas devido a fatores estruturais e mecnicos. Neste mecanismo, o equilbrio de soro rapidamente atingido. O processo de soro independente da cintica de intumescimento. 2 - Difuso no Fickiana, ou Caso II (Figura 5.4 - C). Se refere ao processo no qual a taxa de difuso maior que o processo simultneo de relaxao das cadeias polimricas. O processo de soro fortemente dependente da cintica de intumescimento. 3 Difuso anmala (Figura 5.4 - B). Se refere ao processo no qual a taxa de difuso do solvente comparvel a taxa de relaxao das cadeias polimricas. Neste caso, o processo de difuso no solvente afetado apenas pela presena de porosidades na matriz polimrica. O mecanismo de difuso de um solvente atravs de uma membrana polimrica pode ser estudado atravs da seguinte relao emprica:

Mt = Kt n M

(5.37)

sendo K uma constante que depende das caractersticas estruturais do polmero. n determina o mecanismo de transporte: n = 0,5 mecanismo de Fick e n = 1 mecanismo de difuso no Fickiano. Quando 0,5 < n < 1 a difuso anmala. A Equao 5.37 somente vlida para anlise at os primeiros 60% de intumescimento (Mt/M 0,6) e no pode ser utilizada na anlise nos pontos de inflexo tipicamente observados nas curvas de intumescimento.

57

Figura 5.4: Desenho esquemtico do mecanismo de difuso Fickiano (A), anmalo (B) e no Fickiano (C).

5.7 Parmetros termodinmicos associados ao processo de difuso

A energia de ativao para o processo de difuso de um solvente em um polmero uma medida da energia gasta para vencer as foras coesivas do polmero para que haja a formao de vacncias atravs das quais a difuso ir ocorrer. A energia de ativao (Ea) para o processo de difuso de solvente em um polmero pode ser calculada atravs da equao de Arrhenius. Esta Equao fornece a dependncia do coeficiente de difuso com a temperatura. A Equao de Arrhenius dada por:11,13,15
Ea RT

D = D0 e

(5.38)

onde D o coeficiente de difuso a uma temperatura T, D0 um fator pr-exponencial, Ea a energia de ativao para o processo de difuso e R a constante dos gases.

58
A entalpia, Hi, associada ao intumescimento do hidrogel pode ser calculada atravs da Equao de Gibbs-Helmholtz:8,9,12
d ln( M ) H i = d (1 / T ) R

(5.39)

sendo M a massa da membrana no tempo de equilbrio t de intumescimento, T a temperatura (K) e R a constante dos gases.

5.8 Densidade de reticulaes

A densidade de reticulaes, e, uma importante propriedade dos materiais polimricos. A densidade de reticulaes est intimamente relacionada com as propriedades fsico-qumicas do material, como propriedades mecnicas e trmicas. A expresso:4,12,15 densidade de reticulaes pode ser calculada atravs da

e =

1 / 3
3RT

(5.40)

sendo o mdulo de Young do polmero no equilbrio de intumescimento, a frao de polmero no hidrogel, R a constante dos gases e T a temperatura (K). Por sua vez, dado por:
mb / p mb / p + (ma mb ) / s

sendo ma e mb as massa do filme antes a aps o processo de intumescimento, respectivamente. p a densidade do polmero e s a densidade do solvente. A densidade de reticulao de um polmero dada em unidades de mols de reticulaes por centmetro cbico de polmero.

5.9 Consideraes finais

Neste captulo foi descrita a fenomenologia de transporte de gua em membranas polimricas. Atravs da segunda lei de Fick foram desenvolvidas relaes que permitem o estudo da soro de analito por um biossensor, bem como a descrio deste mecanismo do ponto de vista da fsica-matemtica.

59
Dando prosseguimento ao estudo das bases tericas necessrias para o projeto de um biossensor, no prximo captulo ser apresentada a fundamentao terica da modelagem molecular. Atravs da modelagem molecular possvel uma melhor compreenso da interao entre o polmero e o mediador de eltrons utilizados na construo do biossensor, auxiliando na interpretao das propriedades pticas e eltricas do dispositivo.

5.10 - Referncias bibliogrficas

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60
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61 CAPTULO 6 - MODELAGEM MOLECULAR COMO FERRAMENTA DE PESQUISA EM CINCIA DOS MATERIAIS

6.1 - Introduo

A modelagem molecular (MM), baseada nos mtodos da qumica quntica, constitui uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de novos materiais1. Esta ferramenta permite predizer, por exemplo, a estrutura qumica, propriedades e reatividade de um material antes que este seja sintetizado. A MM utilizada para complementar, interpretar, predizer ou at substituir medidas experimentais com uma conseqente economia de tempo e material, e sem a necessidade de laboratrios especializados. Em conseqncia, encontramos aplicaes em MM em diversas reas, desde a indstria farmacutica, no desenvolvimento de novos medicamentos, at a indstria qumica, no desenvolvimento de catalisadores e novos produtos. As tcnicas de MM permitem criar modelos virtuais de materiais diversos, tanto a nvel molecular quanto a atomstico, atravs da resoluo da equao de Schrdinger. A MM fornece informaes acerca da geometria mais estvel, energia, distribuio de cargas eltricas, dados termodinmicos e cinticos, propriedades espectroscpicas e mecnicas. Neste trabalho, a interao entre o polmero e o mediador de eltrons utilizados na construo do biossensor ser estudada atravs da MM. O estudo da interao entre essas duas molculas permitir a melhor compreenso das caractersticas fsico-qumicas do biossensor. Atravs de mapa do potencial de ionizao das molculas envolvidas, ser estudada a interao entre elas, auxiliando na interpretao de dados espectroscpicos. A localizao e energias dos orbitais de fronteira permitiro a compreenso do mecanismo de transporte eltrico no biossensor. Os procedimentos da MM para calculo de estruturas moleculares e suas energias, podem ser classificados basicamente de duas formas3: Modelos mecnicomoleculares e modelos qumico-qunticos. Os modelos mecnico-moleculares tratam a molcula como um conjunto de tomos e suas ligaes. As interaes so representadas por potenciais clssicos, como osciladores harmnicos. Os modelos qumico-qunticos tratam a molcula como um conjunto de ncleos e eltrons.

62 O desenvolvimento dos modelos qumico-qunticos se d a partir da mecnica quntica, que descreve as molculas em termos das interaes entre ncleos e eltrons, e a geometria molecular em termos do arranjo de menor energia entre os ncleos. A soluo da equao de Schrdinger (Equao 6.1) leva diretamente estrutura molecular e energia, entre outros observveis. Contudo, para solucionar a equao de Schrdinger para sistemas multieletrnicos, so necessrias aproximaes. Estas aproximaes so introduzidas pelo modelo das partculas independentes, levando a simplificaes que permitem o tratamento matemtico da equao de Schrdinger para sistemas multieletrnicos.
h 2 + E p = E 2m

(6.1)

6. 2 O modelo das Partculas Independentes

Na formulao independente do tempo e em unidades atmicas, a equao de Schrdinger descrita como3: H (R, r ) = E (R, r )
^

(6.2)

sendo R e r respectivamente as coordenadas dos M ncleos e dos N eltrons e H o operador Hamiltoniano, dado por: H =
^ eltrons nucleos eltrons ncleos Z Z AZ 1 eltrons 2 1 ncleos 1 1 i 2 M 2A R A + r + R B 2 i i A i< j A< B AB A iA ij

(6.3)

sendo Z a carga nuclear, MA a razo entre a massa dos ncleos, A a massa de um eltron, RAB a distncia entre os ncleos A e B, rij a distncia entre os eltrons i e j e riA a distncia entre um eltron i e um ncleo A. Os termos desta equao so respectivamente, o operador de energia cintica dos eltrons, operador de energia cintica dos ncleos, operador de energia potencial de atrao ncleo-eltron, repulso eltron-eltron e repulso ncleo-ncleo. Nesta expresso observam-se termos (1/rij) onde as coordenadas dos eltrons i e j esto acopladas, termos (1/RAB) onde as coordenadas de ncleos A e B esto acopladas e termos (1/riA), onde as coordenadas dos eltrons i e ncleos A esto acopladas. O Modelo das Partculas Independentes prope a construo de um modelo fsico-matemtico para contornar as dificuldades criadas por estes acoplamentos

63 de variveis atravs da introduo de aproximaes na equao de Schrdinger. As principais aproximaes sero apresentadas a seguir.

6.3 - Aproximao de Born-Oppenheimer

A aproximao de Born-Oppenheimer parte da considerao de que os eltrons e ncleos, interpretados como partculas clssicas, possuem velocidades diferentes (vncleo << veltron). Desta forma, assumimos que o ncleo no se move, o que leva a uma equao de Schrdinger eletrnica.
^ el

H el (R, r ) = E el el (R, r )

(6.4)

Os termos do Hamiltoniano relacionados energia cintica so desprezados e os termos relacionados interao eletrosttica dos ncleos se tornam uma constante. O Hamiltoniano ento assume a seguinte forma:
^ el

eltrons 1 eltrons 2 eltrons nucleos Z A 1 i + 2 i iiA rij i A i< j

(6.5)

O termos relacionados interao eletrosttica dos ncleos devem ser somados a energia eletrosttica total:

E = E el +
A< B

ncleos

Z AZ B R AB

(6.6)

A equao de Schrdinger ainda intratvel e outras aproximaes so necessrias. A obteno da funo de onda eletrnica el(R,r) se d atravs da formulao matemtica desenvolvida por Douglas Hartree e Vladimir Fock, sendo conhecida como mtodo de Hartree-Fock (HF). 6.4 - Aproximao de Hartree-Fock

A dificuldade para solucionar a equao de Schrdinger para sistemas multieletrnicos est associada ao termo de repulso intereletrnica do Hamiltoniano4. Esta dificuldade pode ser contornada substituindo a interao entre um eltron e os demais N-1 eltrons pela interao deste eltron com o campo mdio gerado pelos eltrons restantes3,4. A posio instantnea dos eltrons no considerada. A funo de onda total do sistema de N eltrons escrita na forma de um determinante chamado Determinante de Slater3. O determinante indica que a funo eletrnica deve mudar de

64 sinal quando duas coordenadas so intercambiadas, introduzindo a anti-simetria, que um requisito do princpio da excluso de Pauli.

1 N!

1 (1) 1 (2)

2 (1) ... n (1) 2 (2) ... n (2)

: : : 1 ( N ) 2 ( N ) ... n ( N )

(6.7)

Os elementos i do determinante so chamados spin-orbitais do tomo e definido pelo produto entre a funo espacial, ou orbital molecular, i, e a funo de spin, ou . O termo 1 / N ! e a constante de normalizao da funo de onda6. exprime o orbital molecular como uma combinao linear dos orbitais atmicos. Desta forma obtm-se a dependncia do operador Hamiltoniano com o spin do eltron3. O mtodo de Hartree-Fock busca uma soluo aproximada do estado fundamental de um sistema de eltrons num tomo ou numa molcula considerando apenas um determinante de Slater5. Para obter a melhor aproximao possvel nesta forma monodeterminante preciso desenvolver um critrio de escolha das funes de estado de uma partcula, ou seja, dos spin-orbitais, que comporo o determinante de Slater. Este critrio obtido minimizando a energia E do sistema com relao aos spinorbitais atravs do mtodo variacional. Segundo o mtodo variacional, a energia calculada a partir de uma aproximao de uma funo de onda real, ser sempre maior que a energia real6. Conseqentemente, a melhor funo de onda aproximada ser aquela que leva a uma energia mnima. Como resultado da aplicao deste mtodo expresso para a, obtmse as equaes de Fock3:
F (i ) ( xi ) = i ( xi )
^

(6.8)

(xi) so funes de apenas um eltron com energia , chamadas de funes orbitais. (xi) uma autofuno do operador de Fock f(i), definido como sendo:
^ 1 F (i ) = i2 + ef (i ) 2

(6.9)

onde ef (i ) o potencial mdio gerado pelos N-1 eltrons do sistema. Este termo depende das demais funes (xi) relativas a estes eltrons, existindo portanto acoplamento neste sistema de equaes. O operador de Fock efetivamente o hamiltoniano de um nico eltron de um sistema polieletrnico6.

65 As equaes de Hartree-Fock so uma srie de equaes diferenciais acopladas que envolvem a coordenada de um nico eltron e podem ser resolvidas numericamente3. Como o mtodo de Hartree-Fock obtm-se uma soluo aproximada para a equao de Schrdinger, ou seja, um produto anti-simtrico de funes de um eltron ou orbitais.

6..5 - Aproximao LCAO

J. J. Rothraan sugeriu que os orbitais moleculares fossem expandidos como uma combinao linear de um conjunto finito de funes previstas, conhecidas como funes de base , que representam os orbitais atmicos, ou orbitais de HartreeFock2,3,4. A expanso chamada combinao linear de orbitais atmicos (LCAO Linear Combination of Atomic Orbitals) e pode ser escrita como:

i = c ki k
k

funes. de.base

(6.10)

onde c so coeficientes de combinao linear que representaro os orbitais moleculares

i como combinao linear de funes bases (orbitais atmicos) previamente

escolhidas. Os orbitais atmicos e moleculares so considerados como vetores em um espao no euclidiano4. Por analogia com o espao euclidiano, pode-se imaginar que um vetor qualquer em um espao de k dimenses possa ser escrito como uma combinao linear de vetores ortonormais que formem uma base no espao. Os orbitais atmicos e moleculares apresentam caractersticas vetoriais, mas como so funes matemticas, no esto em um espao vetorial euclidiano. A idia de uma base no espao euclidiano deve ser substituda por uma base construda por funes matemticas linearmente independentes e ortonormais. Desta forma, os orbitais atmicos e moleculares devem ser obtidos como combinao linear dessa base de funes. Considerando que ser sempre centralizado nas posies dos ncleos, eliminamos a necessidade de especificar a sua localizao3. Desta forma, a resoluo das equaes de um eltron obtidas com o mtodo HF transformada em uma lgebra de matrizes, ou seja, requer a determinao do conjunto de coeficientes {Cui}.

66 Um ponto importante do mtodo do Hartree-Fock a escolha das funes base a serem utilizadas para representar os orbitais de Hartree-Fock4. O conjunto de funes base deve fornecer a melhor representao possvel da distribuio eletrnica do sistema e apresentar possibilidade de implementao computacional atravs de expresses matemticas analticas. Ao escolher o conjunto de funes base, devemos considerar basicamente os seguintes aspectos: 1) As funes base devem permitir fcil ajuste com relao ao sistema utilizado e levar a propriedades fsicas compatveis com as observadas

experimentalmente. 2) O nmero de funes de base a ser utilizado deve corresponder ao de uma srie completa, ou to prximo desta quanto possvel. No entanto, a nmero de funes base deve ser o menor possvel. O nmero de integrais de energia cintica e atrao ncleo-eltron cresce na ordem de n2, enquanto que o nmero de integrais de repulso eltron-eltron cresce na ordem de n4, onde n o nmero de funes base. 3) O tipo e o nmero de funes bases devem permitir que todas as integrais necessrias ao clculo de propriedades do sistema sejam obtidas sem grandes dificuldades. Este ltimo aspecto puramente computacional. O tipo de funes base mais comumente utilizada a funo gaussiana do tipo2,4:
B L = T f exp r 2
S

(6.11)

sendo B, L, T e S constantes e f uma funo que caracteriza o tipo de funo gaussiana (s, p, d, f, etc). As funes i possuem um comportamento radial oscilante, dificultando a resoluo de integrais de energia por mtodos numricos. A utilizao de bases gaussianas possibilita que as integrais sejam calculadas analiticamente, contornando este problema e tornando o modelo ideal para ser resolvido computacionalmente2. O produto de duas funes gaussianas G(i,ra) e G(j,rb) centradas respectivamente nas coordenadas A=(Ax, Ay, Az) e B=(Bx, By, Bz), ser uma funo gaussiana G(k,rc) centrada em C=(Cx, Cy, Cz)4. Desta forma, a funo gaussiana possibilita que os produtos de integrais multidimensionais sejam fatorados e reescritos em termos de centros alternativos. As aproximaes de Hartree-Fock e LCAO tomadas em conjunto e aplicadas s equaes eletrnicas de Schrdinger, conduzem s equaes de RoothaanHall3.

67 6.6 - Equaes de Roothaan-Hall Substituindo a Equao 6.8 na Equao 6.10, obtemos4: F cik k = i cik k
k k ^

(6.12)

A soluo da Equao 6.12 obtida pela metodologia de ajuste variacional, obtendo-se os coeficientes de combinao linear em funo da minimizao da energia eletrnica total do sistema, e dada por: FCi=ESCi (6.13)

sendo C a matriz dos coeficientes dos orbitais moleculares da aproximao LCAO, S a matriz de sobreposio (uma medida de quanto as funes de base sentem umas as outras), E a matriz de energias moleculares e F a matriz de Fock (anloga ao Hamiltoniano na equao de Schrdinger). A Equao 6.13 apresenta caractersticas que permitem a aplicao de tcnicas numricas eficientes para determinao dos coeficientes de combinao linear e as energias dos orbitais moleculares. Esta representao matricial denominada de equao secular. Os elementos de F so dados por3:
ncleo Fv = H v + J v K v

(6.14)

Hncleo o chamado hamiltoniano do ncleo, cujos elementos so dados por:

ncleo Z 1 ncleo H v = (r ) 2 A v (r )dr r A 2

(6.15)

Elementos coulombianos e de troca, Jkv e Kkv, so dados por:

J kv = K kv

funesdebase

P ( | ) P ( | )

(6.16)

1 = 2

funesdebase

(6.17)

P a chamada matriz densidade, cujos elementos envolvem a soma, sobre todos os orbitais moleculares ocupados, do produto de dois coeficientes dos orbitais moleculares. Neste caso, P dado por: P = 2
Orbitaismoleculares ocupados i

c c
i

(6.18)

Em geral, P ser a menor energia N, onde N o nmero total de eltrons. A soma, em todos os orbitais, dos produtos de um elemento da matriz densidade e o seu orbital

68 atmico associado leva a densidade eletrnica. (|) so integrais de dois eltrons, dadas pela Equao 6.19. O nmero dessas integrais aumenta com o nmero de funes base.

( | ) = (r1 ) (r1 ) 1 (r2 ) (r2 )dr1dr2

r12

(6.19)

Os mtodos resultantes das solues das equaes de Roothaan-Hall so chamados de modelos Hartree-Fock-Roothaan, que consistem na aplicao da combinao linear de orbitais atmicos usando o modelo de Hartree-Fock. A energia correspondente a um sistema infinito (completo) de bases chamada de energia de Hartree-Fock. O de modelo Hartree-Fock permite que as funes de onda e a energia, como tambm a sua primeira e segunda derivada, sejam calculadas atravs de uma metodologia puramente analtica. Isso desempenha um papel importante em rotinas computacionais para otimizao da geometria (que requere primeiras derivadas) e determinao de freqncias vibracionais (que requere segundas derivadas). Embora o modelo Hartree-Fock permita o clculo das funes de onda e energia analiticamente, este mtodo apresenta algumas limitaoes importantes. Tais limitaes so apresentadas a seguir.

6.7 - Limitaes do modelo de Hartree-Fock

O modelo de Hartree-Fock proporciona resultados com boa concordncia com dados experimentais para determinadas propriedades moleculares, como a geometria molecular, energia de ionizao e outras. Entretanto, o modelo no garante uma descrio adequada de propriedades mais sensveis a qualidade da funo de onda, como propriedades que envolvam diferenas de energia. Isso se deve ao fato de que o modelo de Hartree-Fock no considera a correlao eletrnica4. Os movimentos dos eltrons em um tomo no so independentes. Desta forma o modelo permite a perda da energia proveniente da interao que seria causada pela posio dos eltrons no espao. Os efeitos dessa correlao eletrnica se manifesta em diversas propriedades atmicas, como na polarizabilidade e momento dipolar. Mtodos que levam em considerao a correlao eletrnica possuem um formalismo matemtico complexo, impedindo uma interpretao fsica simples. Uma interpretao mais prximo do qumico sobre a correlao eletrnica envolve os orbitais de fronteira

69 HOMO-LUMO. O orbital molecular HOMO definido com o orbital de mais alta energia que contm eltrons. O orbital molecular LUMO o orbital de mais baixa energia que no contm eltrons. Neste modelo, os orbitais LUMO e suas energias, obtidas atravs da Equao 6.13, no so caracterizados corretamente. O operador de Fock leva em considerao a interao de cada um dos eltrons nos orbitais ocupados com o campo mdio gerado pelos outros eltrons. Desta forma, os orbitais LUMO so obtidos atravs da experimentao da interao de um eltron no orbital desocupado com todos os orbitais ocupados. Em conseqncia os orbitais LUMO apresentam caractersticas mais prximas de um on negativo no estado excitado do que de um sistema neutro. Apesar das limitaes citadas, o modelo de Hartree-Fock oferece uma aproximao consideravelmente boa, que permite a compreenso do comportamento de eltrons e ncleos em tomos e sistemas moleculares, bem com a formao de ligaes qumicas.

6.8 - Mtodos semi-empricos

Os mtodos semi-empricos seguem diretamente o modelo de HartreeFock3. Neste mtodo, novas aproximaes so incorporadas ao modelo Hartree-Fock com o objetivo de reduzir o elevado nmero de integrais de repulso eltron-eltron. O tratamento feito apenas nos eltrons de valncia, eltrons associados ao ncleo so ignorados3. A validade desta aproximao est relacionada ao fato de que os eltrons envolvidos em uma ligao qumica ou em propriedades moleculares de interesse esto localizados na camada de valncia. A principal aproximao, com o objetivo de reduzir o tempo de processamento computacional, considerar que os orbitais moleculares residentes em diferentes centros atmicos no se sobrepem.

d = 0

(6.20)

com k e v em diferentes tomos. Essa a chamada aproximao NDDO (Neglect of Diatomic Differential Overlap). Esta aproximao reduz o nmero de interaes entre eltrons nas equaes de Hoothaan-Hall de N4 para N2, onde N o nmero total de funes de base. Os

70 mtodos semi-empricos NDDO aplicam um conjunto de bases sp, no tratando orbitais d em suas implementaes. Desta forma, esses mtodos no podem ser aplicados na maioria dos metais de transio. Outras aproximaes so introduzidas a fim de promover uma simplificao nos clculos de uma forma mais geral e para permitir a introduo de parmetros semi-empricos. Os mtodos semi-empircos utilizam algumas constantes determinadas experimentalmente, como a massa atmica do istopo mais abundante e o calor de atomizao de cada tomo envolvido. A parametrizao feita de maneira que reproduza uma srie de valores experimentais, como geometria de equilbrio, calor de formao, momento de dipolo e potencial de ionizao. Para facilitar a interpretao dos resultados obtidos atravs da mecnica molecular (MM), foram desenvolvidos modelos que permitem a apresentao dos resultados graficamente.

6.9 - Modelos grficos

Atravs da MM podemos obter informao de uma molcula com relao aos orbitais moleculares, densidade eletrnica, densidade de spin (para radicais ou molculas com eltrons emparelhados), potencial eletrosttico, potencial de ionizao e outros3. Estas informaes podem ser apresentadas graficamente, atravs de modelos relacionados carga e dimenses moleculares e a distribuio de cargas na molcula. As informaes so apresentadas como funes tridimensionais das coordenadas em termos de uma superfcie de valor constante, ou seja, em uma isosuperfcie: f(x,y,z) = constante O valor da constante pode ser escolhido de forma a refletir um observvel fsico de interesse. Como exemplo, ao escolher como constante uma determinada densidade de eltrons, a isosuperfcie representaria a forma da molcula. Uma isosuperfcie pode mostrar apenas uma grandeza fsica. Grandezas adicionais podem ser apresentadas na forma de mapas de cores na isosuperfcie, onde diferentes cores esto relacionadas a diferentes valores. A seguir sero apresentadas as funes responsveis pela gerao de grficos associados a cada um dos principais observveis fsicos.

71 O orbital molecular HOMO mostra quais regies da molcula so mais ricas em eltrons e, conseqentemente, mais sujeitas a ataque eletroflico. Os orbitais moleculares so dados pela seguinte funo:

i = c i

funes . de.base

(6.21)

Os orbitais moleculares e so comumente associados s ligaes e , respectivamente. Porm, isto no corresponde realidade. A razo que os orbitais moleculares so escritos como combinaes lineares de funes de base centradas nos ncleos e sero, em geral, completamente delocalizadas do esqueleto nuclear. A densidade eletrnica (r) uma funo da coordenada r definida de forma que (r)dr o nmero de eltrons contidos no volume dr. Isso o que medido em experimentos de difrao de raios-x. Para uma molcula, (r) escrito em termos da soma dos produtos das funes de base .

(r ) =

funes . de.base

Pk k (r ) (r )

(6.22)

onde P a matriz densidade (Equao 6.18) A densidade eletrnica pode ser exibida atravs de uma isosuperfcie (uma superfcie isodensidade) com o tamanho e forma dada de acordo com um valor escolhido da densidade. O potencial eletrosttico p definido como a energia de interao de um ponto p de carga positiva com os ncleos e eltrons da molcula.
* k (r ) (r )

p =

nucleo

ZA R Ap

funes . de.base

Pk

rp

dr

(6.23)

O primeiro somatrio na equao sobre o ncleo A. Z o nmero atmico e RAp a distncia entre o ncleo e o ponto da carga. O segundo somatrio sobre as funes de base, . P a matriz densidade (Equao 6.18) e a integral reflete a interao coulombiana entre os eltrons e o ponto de carga, onde rp a distncia entre o eltron e o ponto de carga. Potenciais eletrostticos negativos (superfcie de potencial negativa) mostram as regies ricas em eltrons (sujeitas a ataques eletroflicos). Delimita a localizao dos eltrons de maior energia. Potenciais eletrostticos positivos (superfcie de potencial positiva) mostram regies deficientes em eltrons (sujeitas a ataques nucleoflicos).

72 O potencial eletrosttico mostrado como um mapa de cores na isosuperfcie de densidade de eltrons. O potencial de ionizao local I(r) definido como a soma sobre a densidade de eltrons do orbital, i(r), multiplicada pela energia absoluta do orbital, |Ei|, dividido pela densidade total de eltrons, (r):
orbitaismo leculares ocupados

I (r ) =

(r ) E
i i

(r )

O potencial de ionizao representa a facilidade de remoo de eltrons em um local ao redor da molcula. Uma superfcie com baixo potencial de ionizao apresenta uma rea mais facilmente ionizvel. O potencial de ionizao uma alternativa ao potencial eletrosttico como um indicador de reatividade eletroflica da molcula.

6.10 Consideraes finais

A modelagem molecular permite a criao de modelos virtuais de estruturas moleculares atravs da resoluo aproximada da equao de Schrdinger para diversas partculas. Esta ferramenta de grande importncia para pesquisas em cincia dos materiais, por auxiliar na compreenso das propriedades fsico-qumicas dos materiais, alem de possibilitar a previso de suas propriedades. Os mapas de potencial de ionizao permitem investigar a interao qumica entre diferentes molculas, indicando os stios mais provveis de ligao. A modelagem dos orbitais moleculares auxilia na interpretao de propriedades eltricas dos materiais, revelando os possveis mecanismos promotores do transporte eltrico. Estes mecanismos sero abordados no prximo captulo.

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4. de Andrade, J. C.; Custdio, R. Tpicos de Qumica Quntica. Disponvel em: <http://www.chemkeys.com/bra/md/tdqq_4/tdqq_4.htm>. Acesso em: 04 maio 2006. 5. Vianna, J. D. M.; Fazzio, A.; Canuto, S. Teoria Quntica de Molculas e Slidos:

Simulao computacional. So Paulo: Editora Livraria da Fsica, 2004.

6. Leach, A. R. Molecular Modelling: Principles and Applications. 2. ed. Pearson Education, 2001.

74 CAPTULO 7 - CONDUO ELTRICA EM POLMEROS

7.1 - Orbitais Moleculares A formao dos orbitais moleculares em materiais polimricos ocorre da mesma forma que a formao de bandas de energia em materiais cristalinos. Esse processo pode ser descrito atravs de um simples modelo de slido, em uma dimenso, que consiste em uma linha infinita de tomos. A partir de um tomo (Figura 7.1 - A), a medida que aumentamos a quantidade de tomos no sistema, os nveis de energias se sobrepem em um nmero cada vez maior de orbitais (Figura 7.1 - C). Para uma cadeia de poucos tomos, o nmero de energias possveis no sistema finito, mas para grandes nmeros de tomos, que pode ser considerado infinito, como em um slido macroscpico, o nmero de energias possveis infinito, dando origem aos orbitais moleculares (MO) (Figura 7.1 - D).1

Figura 7.1: Desenho representativo da formao dos orbitais moleculares.

O orbital HOMO definido como o orbital molecular de mais alta energia que contm eltrons. O orbital HOMO age como um doador de eltrons, j que este o orbital mais externo que contm eltrons. O orbital LUMO o orbital molecular de mais baixa energia que no contm eltrons, e age como um receptor de eltrons.

75 Atravs de uma analogia teoria das bandas em materiais cristalinos, possvel compreender a conduo eltrica em materiais polimricos. Os eltrons excitados para o orbital LUMO so considerados livres e, assim como os buracos deixados no orbital HOMO, participam do processo de conduo eltrica. A diferena de energia entre os orbitais HOMO e LUMO chamada de banda proibida. A condutividade do material est relacionada largura da banda proibida. Se a largura da banda proibida for nula, como tpico de materiais condutores, uma quantidade de energia muito pequena poder promover eltrons para estados no ocupado no orbital LUMO (Figura 7.2 - A). Desta forma, sob uma pequena diferena de potencial, estes eltrons, que possuem grande mobilidade, podem produzir uma corrente eltrica. Se a largura da banda proibida for diferente de zero, mas ainda pequena, uma quantidade de energia um pouco maior ser necessria par promover eltrons para o orbital LUMO. O material ento se comportar como um semicondutor (Figura 7.2 - B). Se a largura da banda proibida for grande, ser necessria uma grande quantidade de energia, o material ento se comportar como um isolante eltrico (Figura 7.2 - C).1,2

Figura 7.2: Esquema da estrutura dos MOs de materiais condutores (A), semicondutores (B) e isolantes (C).

Independentemente do material se comportar como um condutor ou semicondutor, a energia para excitao de eltrons para estados energticos no orbital LUMO pode ser de origem trmica e, temperatura ambiente, o material poder possuir grande condutividade eltrica. Neste caso, a populao nos orbitais moleculares dada pela distribuio de Fermi-Dirac:

76
P= 1 e ( E ) / kT + 1

(7.1)

sendo o potencial qumico do sistema.

7.2 - Transporte eletrnico em sistemas desordenados

Um conceito fundamental para o entendimento do mecanismo de transporte de cargas em sistemas desordenado o de estados localizado. Um estado localizado descrito por uma funo de onda bem localizada na rede. Os eltrons esto bem presos numa determinada regio do material e no se acoplam com outros estados eletrnicos. Para materiais caracterizados pela presena de estados localizados, a conduo eletrnica se d atravs da locomoo dos eltrons por estes estados. A locomoo dos eltrons realizada atravs de processos de tunelamento, ou saltos. Ou seja, os eltrons saltam atravs dos estados localizados quando recebem energia de fnons ou de campos eltricos externos.3 Os eltrons que participam da conduo por saltos sempre tentaro percorrer a menor distncia de salto e a menor energia de ativao. Porm, essas duas condies no podem ser satisfeitas simultaneamente.4 Contudo, existe uma distncia tima de salto r, onde a probabilidade de salto mxima. Esta probabilidade dada por:
2 r E P ~ exp a kT

(7.2)

sendo k a constante de Boltzmann, T a temperatura e E a energia de ativao envolvida no processo de salto e a raio de localizao dos estados. Existem trs tipos de mecanismos termicamente ativados pelos quais os eltrons saltam atravs de estados eletrnicos localizados. Estes mecanismos so mostrados na figura 1.3-6 O primeiro mecanismo o mecanismo de ativao trmica, onde os eltrons situados nos estados localizados saltam para uma regio de estados estendidos no orbital LUMO, podendo ento participar do processo de conduo (Figura 7.3 - A). Este mecanismo governado pela equao de Arrhenius:
E kT

= 0 exp

(7.3)

77 sendo 0 uma constante pr-exponencial. Este mecanismo tpico de materiais semicondutores com estrutura de bandas bem definida e pode ser chamado de modelo de Arrhenius. O segundo o Mecanismo de ativao trmica entre estados espacialmente mais prximos, onde os eltrons saltam por estados entre os quais existe a superposio das funes de onda (Figura 7.3 - B). Este mecanismo pode ser descrito pela seguinte relao: T = 0 exp 0 T

(7.4)

sendo T0 e so constantes. Para este mecanismo de conduo, vale = 0,5. Este mecanismo de conduo em sistemas desordenado foi proposto por A. L. Efros e B. I. Shklovskii e comumente referido na literatura como mecanismo de Efros. O terceiro mecanismo possvel o de saltos entre estados vizinhos no necessariamente mais prximos, mas entre estados com energia caracterstica mais prxima (Figura 7.3 - C). Este mecanismo pode ser descrito tambm pela Equao 7.2, porm, caracteriza-se por = 0,25. Este mecanismo foi proposto por N. F. Mott e E. A. Davis e comumente referido na literatura como mecanismo de Mott. Este mecanismo tambm chamado de mecanismo de saltos de alcance variado, j que os saltos no ocorrem necessariamente entre os primeiros vizinhos. Esta discusso foi desenvolvida considerando-se os eltrons como portadores de carga, porm, o mesmo raciocnio pode ser aplicado em sistemas cujos buracos so os portadores de carga.

Figura 7.3: Mecanismos de conduo possveis em materiais desordenados.

78 7.3 Determinao da condutividade eltrica

A condutividade eltrica de um material pode ser determinada atravs da anlise de uma curva da corrente em funo da tenso, da forma que se segue. A resistncia eltrica entre dois pontos de um material isotrpico pode ser obtida aplicando-se uma diferena de potencial, ou tenso, V, entre esses dois pontos e medindo-se a corrente eltrica, i, que flui no material. A resistncia eltrica do material dada pela lei de Ohm:

V = Ri

(7.5)

A lei de Ohm indica que a corrente eltrica em um material varia linearmente com a tenso aplicada. A constante de proporcionalidade entre essas duas grandezas a resistncia eltrica R. Os materiais que obedecem a lei de Ohm so chamados materiais hmicos. Rearranjando a lei de Ohm (Equao 7.5), podemos escrever:
i= V R

(7.6)

Esta equao pode ser comparada com a equao de uma reta. Desta forma, atravs da curva i verus V caracterstica de um material (Figura 7.4), possvel obter a resistncia eltrica pelo inverso do coeficiente angular da curva. A resistividade, , uma caracterstica intrnseca do material, ou seja, independe de suas dimenses, e definida por:

VA

(7.7)

onde A a rea superficial da amostra e a sua espessura. A condutividade eltrica, , definida como o inverso da resistividade:

(7.8)

Desta forma, possvel obter a condutividade eltrica de uma material a partir de uma curva i verus V.

79

i=V/R y=a+bx Corrente (A)

=>b=1/R

Tenso (V)

Figura 7.4: Curva i versus V tpica de um material hmico.

7.4 Consideraes finais

Neste captulo foram apresentados os modelos pelos quais o mecanismo de conduo eltrica de um material com estrutura desordenada pode ser interpretado. Os modelos dos orbitais moleculares e de saltos termicamente ativados fornecem abordagens diferentes da conduo eltrica, porm, complementares. Em um biossensor, o mediador de eltrons desempenha um papel importante na condutividade do polmero que constitui a matriz hospedeira. O mediador de eltrons pode promover a criao de estados energticos acessveis dentro da banda de energia proibida do polmero. Isto pode provocar a diminuio da largura da banda proibida, tornando mais fcil a excitao de eltrons para o orbital LUMO, aumentando a condutividade do material. Por outro lado, a criao desses estados pode facilitar a promoo de eltrons de estados localizados para estados estendidos, criando portadores de carga nos estados localizados que podem participar da conduo eltrica, aumento assim; a condutividade eltrica do material.

80 7.5 Referencias Bibliogrficas

1.

Disponvel

em:

<http://www.biophys.leidenuniv.nl/aartsma/hand-outs-B/aa-

chap4x.ppt> Acessado em outubro 2004. 2. Callister, W. D. Jr. Cincia e Engenharia de Materiais: Uma Introduo. Rio de Janeiro, LTC. 5, 328-329, 2002. 3. Chiquito, A. J.; Lanciotti Jr., F. Super-redes semicondutoras: Um laboratrio de Mecnica Quntica. Revista Brasileira de Fsica. 26 (4), 315-322, 2004. 4. Yu, D.; Wand, C.; Wehrenberg, B. L.; Guyot-Sionnest, P. Variable range hopping conduction in semiconductor nanocrystal solids. Physical Review Letters. 92 (21), 2004 5. Shklovskii, B. I.; Efros, A. L. Electronic Properties of Doped Semiconductors. New York: Springer-Verlag. 1984. 6. Mott, N. F.; Davis, E. A. Electronic Processes in Non-Crystalline Materials. London: Clarendon Press Oxford. 1971.

81 CAPTULO 8 - OBJETIVOS

Dispositivos para o controle e a automao de processos analticos no laboratrio clnico ou na monitorao de cirurgias de grande porte so considerados atualmente uma rea estratgica da biotecnologia. Neste sentido, o desenvolvimento de novos materiais para a utilizao no desenvolvimento de biossensores tem recebido importantes investimentos dos rgos governamentais bem como de empresas qumicofarmacuticas dos pases desenvolvidos. O uso potencial de biossensores para aplicaes biotecnolgicas reconhecido desde a dcada de 70 com o surgimento de dispositivos semicondutores acoplados a enzimas para anlise de penicilina e constituintes do fluido biolgico, sendo vrios dispositivos patenteados, ao longo de mais de trs dcadas de pesquisa e desenvolvimento. Ressalta-se que o campo de aplicao dos biossensores estende-se desde a rea clnica at o controle e automao de processos biotecnolgicos que envolvam a produo de frmacos e medicamentos. Um elemento importante quanto ao projeto de um biossensor a matriz orgnica/inorgnica utilizada na imobilizao da enzima, molcula esta responsvel seletivamente pela reao qumica envolvida na anlise do metablito a ser quantificado quanto s suas caractersticas clnicas e biotecnolgicas. O principal objetivo deste trabalho efetuar a obteno de biossensores amperomtricos para monitorao de colesterol baseados no complexo de boro PVA/H3BO3, contendo ftalocianina de cobre como mediadora de eltrons. Estes biossensores sero obtidos via transio de fase sol-gel.

82 Os principais objetivos especficos deste trabalho so: Obteno de um biossensor amperomtrico para determinao de colesterol total no sangue; Caracterizao fsico-qumica do dispositivo, biossensor; Anlise da performance do biossensor, por ensaios in vitro.

83 CAPTULO 9 MATERIAIS E MTODOS

9.1 - Preparo do biossensor

Os biossensores para colesterol foram obtidos atravs da transio solgel do sistema PVA/H3BO3 contendo ftalocianina de cobre (Ftc). A Ftc desempenhar o papel de mediador de eltrons no biossensor. A sntese do biossensor foi realizada atravs de um processo multietapas. Inicialmente, foi preparada uma soluo de PVA (72,0 kDa, Merck-Schuchardt) com concentrao de 0,1g/mL em gua destilada. Uma soluo com concentrao de 50 mg/mL de ftalocianina de cobre (Sigma-Aldrich) em clorofrmio foi preparada simultaneamente. As duas solues foram misturadas e em seguida, aps sonificao, foi aquecida sob agitao constante para evaporao do clorofrmio e disperso da ftalocianina na soluo de PVA. Em seguida, temperatura ambiente (25C) foi acrescentada soluo de PVA/Ftc 100 l de soluo enzimtica composta por colesterol oxidase e colesterol esterease (Laborlab). Aps homogeneizao, foi depositado 10 l desta soluo na extremidade de um eletrodo de alumnio de 0,3 mm x 2,5 cm. Aps a evaporao do solvente temperatura e atmosfera ambiente (90,66 kPa, 25 C), a transio sol-gel do sistema foi promovida atravs da imerso do sensor em soluo de H3BO3 (Merck) 0,64 M temperatura ambiente. Aps a reao de reticulao os sensores foram secos temperatura ambiente (25 C). A Figura 9.1 ilustra a obteno do biossensor de colesterol. A Figura 9.2 apresenta uma fotografia de um dos biossensores obtidos.

84

Figura 9.1: Ilustrao esquemtica do projeto do biossensor para colesterol.

Figura 9.2: Fotografia do biossensor de colesterol obtido neste trabalho.

85 9.2 - Caracterizao fsico-qumica do biossensor

9.2.1 - Estudo do transporte de gua em membranas de PVA

O estudo do transporte de gua em membranas de PVA foi realizado atravs do mtodo gravimtrico. Os ensaios foram realizados em membranas de PVA de espessura entre 220 m e 300 m com tempos de reticulao entre 10 min e 60 min a temperatura de 20 C e em membranas, reticuladas por 25 min, a temperaturas entre 20 C e 50 C. As membranas foram imersas em uma soluo de NaCl 0,9%, para simular as condies fisiolgicas, at atingir o equilbrio de intumescimento. Durante o processo de intumescimento, foi acompanhado o aumento de massa das membranas devido soro de gua. O intumescimento, I, das membranas foi calculado atravs da seguinte expresso:

I=

Mt M0 M0

(9.1)

sendo Mt a massa da membrana no tempo t e M0 a massa inicial da membrana.

9.2.2 Propriedades mecnicas e trmicas dos hidrogis

Diversas aplicaes tm sido propostas para polmeros hidrogis, tais como sistemas de liberao controlada de frmacos, msculos artificiais e lentes de contatos. Os hidrogis possuem ainda, potencial para aplicaes como materiais estruturais. No entanto, suas aplicaes so limitadas devido a suas ms propriedades mecnicas. Vrias propostas tm sido apresentadas para a melhoria das propriedades mecnicas dos hidrogis, entre elas a snteses de compsito orgnicos/inorgnicos1, redes polimricas interpenetrantes2 e atravs do uso de agentes reticuladores3. Esta ultima proposta de especial interesse, por permitir o controle das propriedades mecnicas de um hidrogel de forma simples, bastando variar a quantidade do agente reticulador na sntese do material, e por possibilitar a preservao das caractersticas intrnsecas do polmero. No estado intumescido, um hidrogel apresenta rpida resposta a tenses externas atravs do rearranjo dos segmentos polimricos.4 Este comportamento, tpicos de borrachas, permite a utilizao da teoria da elasticidade da borracha para relacionar o mdulo de Young, , de um hidrogel com a taxa de extenso, , quando submetido a

86 uma e tenso, , aplicada durante um ensaio mecnico, e parmetros estruturais como sua densidade de reticulaes, e (Equao 9.2). Esta relao dada pela seguinte equao: 4-6

3 = 3RT e 1 / 3 2

(9.2)

sendo R a constante dos gases, T a temperatura e a frao de polmero no hidrogel. Atravs da Equao 9.2, percebemos que o mdulo de Young cresce proporcionalmente densidade de reticulaes e inversamente proporcional taxa de extenso do hidrogel quando submetido a uma tenso. As propriedades mecnicas de membranas de PVA no reticulada e com diferentes densidades de reticulaes, no intumescidas e em seu mximo de intumescimento, foram determinadas em um equipamento Metler TMA 40 (Figura 9.3 A) em modo de penetrao. Foi utilizada uma ponta de prova de quartzo cuja rea de seco transversal de 1,428x10-7 m2 (Figura 9.3 - B). O intumescimento das membranas foi efetuado atravs da imerso em soluo fisiolgica a temperatura de 20 C, por tempo suficiente para intumescimento at o equilbrio. As membranas de hidrogis em seu mximo de intumescimento, com espessura entre 0,04 mm e 0,60 mm, foram ento submetidas a foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N temperatura ambiente.

87

(A)

(B)

Figura 9.3: Equipamento (A) e ponta de prova (B) utilizada nos ensaios de TMA.

A estabilidade trmica da matriz utilizada na construo de um biossensor desempenha um papel fundamental para o desempenho do dispositivo. A temperatura de transio vtrea da matriz deve estar a uma temperatura maior que a temperatura de trabalho do biossensor, a fim de manter a sua estabilidade trmica e o ambiente ideal para a enzima. O percentual de cristalinidade da matriz deve ser o menor possvel, j que as regies cristalinas oferecem resistncia a difuso do analito para o interior da matriz do biossensor. Nesta seo, onde discutiremos a determinao das propriedades trmicas do biossensor, as nomenclaturas e abreviaturas seguem o padro sugerido por Ionashiro e Giolito.7,8 A calorimetria exploratria diferencial (do ingls Differential Scanning Calorimetry - DSC) uma tcnica na qual se acompanha a variao de entalpia que ocorre entre a amostra e uma referncia durante um processo de

88 aquecimento ou resfriamento por um programa controlado, o que nos permite observar os principais eventos trmicos ocorridos na amostra.7-11. A tcnica DSC pode ser separada em duas modalidades: 1) DSC com compensao de potncia: Nesta modalidade a amostra e a referncia so mantidas na mesma temperatura atravs de aquecedores eltricos individuais. A potncia dissipada pelos aquecedores relacionada com a energia envolvidas nos processos endotrmicos ou exotrmicos. 2) DSC com Fluxo de calor: No arranjo experimental mais simples desta modalidade, a amostra e a referncia, contidas em seus respectivos suportes, so colocados em um disco de metal, atravs do qual ocorre a troca de calor entre as amostras e o forno. Para uma condio de fluxo de calor no estado estacionrio, a diferena de temperatura, T, entre a amostra e a referncia proporcional ao fluxo de calor, , entre a amostra, A, e a referncia, R, dada pela expresso:

= A R = kT

(9.3)

Para um processo endotrmico, T<0 e >0, enquanto para um processo exotrmico vale o recproco. A constante k deve ser determinada por calibrao, usando-se padres com uma constante fsica conhecida, por exemplo a entalpia de fuso. Caso no ocorra nenhum fenmeno fsico-qumico com a amostra durante a variao de temperatura, a curva DSC ser uma reta horizontal. Quando ocorre um processo endotrmico, surge um pico positivo, enquanto no processo exotrmico, surge um pico negativo. Isto torna necessrio indicar o sentido dos processos na curva. A forma dos picos dependem de parmetros da amostra e do equipamento, como a capacidade calorfica. A rea dos picos em uma curva DSC relaciona-se com as energias dos processos, desta forma o DSC permite a determinao quantitativa de um evento fsico-qumico. Dentre as vrias teorias apresentadas que relacionam as reas dos picos com as energias envolvidas nos processos fsicoqumicos, a Equao 9.4 uma das mais simples:9
2 mH = TdT gk T1

(9.4)

sendo H a variao de entalpia, m a massa da amostra, T a variao de temperatura entre o incio (T1) e final (T2) do processo, g e k so constantes referentes amostra, ao porta amostras e ao equipamento utilizado.

89 O percentual de cristalinidade, c, de uma amostra pode ser obtido comparando-se o seu valor de entalpia de fuso, Hm, com o valor da entalpia de fuso
c do polmero 100% cristalino, H m , como na relao:12

c =

H m
c H m

(9.5)

A temperatura de transio vtrea (Tg) caracteriza-se pelo aumento repentino do calor especfico do material, requerendo maior energia, com relao referncia, para manter a temperatura. A Tg vista na curva DSC como uma mudana de linha base (endotrmica), sem pico. Na fuso cristalina, a fase cristalina da amostra se funde a uma temperatura constante. Durante a fuso, necessria uma maior quantidade de calor para manter a mostra a mesma temperatura que a referncia. A Tm ento se se caracteriza por um pico de fuso endotrmico.11 Tabela 9.1 apresenta alguns exemplos de fenmenos fsico-qumicos que podem ocorrer em uma anlise DSC e suas relaes com a variao de entalpia.10

Tabela 9.1: Fenmenos fsico-qumicos determinados atravs de anlise DSC e suas relaes com a variao da entalpia.9

Variao de entalpia Fenmenos endotrmicos Fuso, vaporizao e sublimao Dessoro e absoro Desidratao Decomposio Reao de xido-reduo Fenmenos exotrmicos Cristalizao Combusto Adsoro Polimerizao Degradao oxidativa

Os termogramas DSC de filmes de PVA reticulados foram efetuados em um equipamento Shimadzu DSC-50. Foram realizadas duas varreduras a uma taxa de aquecimento de 10C/min e taxa de resfriamento de 320C/min. As curvas DSC foram obtidas no intervalo de temperatura de 30C a 250C em atmosfera de nitrognio. A Tg foi determinada durante a segunda varredura. O calor de fuso, Hm foi obtido pela integrao da rea do pico de fuso da curva DSC e o grau de cristalinidade, c,,

90 calculado atravs da Equao 9.5, considerando o calor de fuso do PVA 100%

c cristalino ( H m = 138,6 J/g).13 A Figura 9.4 apresenta o equipamento DSC utilizado

neste trabalho.

Figura 9.4: Equipamento DSC utilizado neste trabalho (INTEMA/CONICET/UnMdP)

9.2.3 Caracterizao espectroscpica (UV-Vis/FTIR)

Neste trabalho, as tcnicas espectroscpicas UV/Vis e FTIR foram utilizadas para verificar a formao de um complexo de transferncia de carga entre o PVA e Ftc. A espectrofotometria nas regies do ultravioleta, visvel e infravermelho so importantes tcnicas de caracterizao de sistemas moleculares. Informaes sobre a estrutura molecular e interaes entre molculas podem ser extradas dos espectros de absoro gerados pela interao da radiao com a matria. A espectrofotometria se trata de um ensaio no destrutivo, j que a radiao no destri ou altera a estrutura da amostra.14

91 A radiao ultravioleta compreende a faixa de espectro eletromagntico com comprimentos de onda entre 3,8x10-7 m e 6x10-10 m , a radiao visvel entre 3,8x10-7 m a 7,8x10-7 m (380 nm a 780 nm) e a radiao infravermelha entre 10-3 m e 7,8x10-7 m.2 A energia total de excitao de uma molcula pode ser descrita como a soma da energia associada rotao da molcula como um todo, vibrao dos ncleos em torno de suas posies de equilbrio e s transies eletrnicas. Assim, podemos distinguir trs tipos de espectros ticos:15,16 Espectro rotacional, rotacional-vibracional e eletrnico. Os espectros rotacionais so atribudos a transies entre nveis rotacionais adjacentes em um estado eletrnico e nvel vibracional particular. Apenas o nmero quntico rotacional, J, sofre alterao. Os espectros rotacionais-vibracionais so atribudos a transies de um estado rotacional de um nvel vibracional para um estado rotacional de um nvel vibracional adjacente, em um mesmo nvel eletrnico. Os nmeros qunticos rotacionais, J, e vibracionais, v, sofrem alterao. Os espectros eletrnicos esto associados a alteraes nas energias eletrnica, vibracional e rotacional da molcula. Um estado eletrnico possui muitos estados vibracionais correspondentes, e um estado vibracional possui vrios estados rotacionais correspondentes. A isso se d o nome de Bandas. O espectro de absoro eletrnico contm todas as bandas vibracionais da transio eletrnica, sendo que todos os nmeros qunticos mudam nessas transies. Na espectroscopia UV/Vis, quando um feixe de luz atravessa um material, a luz incidente ser mais intensa que a luz transmitida. A atenuao da luz incidente pode ser atribuda aos fenmenos de espalhamento pelas partculas em suspenso na amostra, reflexo entre as interfaces e absoro da luz pela amostra. Este ltimo, em solues verdadeiras, o principal fator de atenuao da luz incidente. 14 A espectrofotometria de absoro molecular baseada na medida da frao de luz transmitida (transmitncia), , ou da frao de luz absorvida (absorbncia), A, por uma amostra contida em um recipiente translcido.14,17 A Figura 9.4 mostra um desenho esquemtico de um espectrofotmetro de duplo feixe. O funcionamento do equipamento consiste basicamente na passagem de um feixe de luz monocromtica por uma cubeta contendo a amostra e um feixe de mesma intensidade por uma cubeta contendo uma referncia. A luz transmitida pela amostra e pela referncia detectada e sua diferena calculada e mostrada. A amostra de referncia tem a funo de minimizar

92 o efeito da luz refletida nas medidas, como tambm a de eliminar as bandas de absoro do solvente da amostra.

Figura 9.4: Desenho esquemtico de um espectrofotmetro UV/Vis de duplo feixe.

Desprezando a atenuao da luz incidente proveniente da reflexo e espalhamento, os valores de e A so relacionados com a concentrao c da soluo e pelo caminho ptico b no recipiente pela seguinte expresso: 14,17
A = log = I0 = bc I

(9.6)

sendo a absorvitividade molar, c a concentrao molar, I0 a intensidade da luz incidente e I a intensidade da luz transmitida. A expresso

A = bc
conhecida como lei de Beer.

(9.7)

Um grfico da absorbncia (ou da transmitncia) de uma substncia em funo do comprimento de onda, , da luz incidente chamado de espectro de absoro. A espectrofotometria molecular na regio do UV/Vis consiste na media da absorbncia (ou da transmitncia) de uma amostra em cada comprimento de onda compreendido na regio do espectro do ultravioleta ao visvel (200 nm a 700 nm). A intensidade da absoro de luz monocromtica por uma molcula dependente de sua estrutura. Desta forma, a espectrofotometria UV/Vis pode ser utilizada para identificar uma substncia atravs de seu espectro ou at mesmo para verificar a interao entre duas ou mais substncias. A absoro de luz pela amostra se deve s transies atmicas entre os orbitais moleculares da amostra (espectro eletrnico). Um composto absorve luz na regio do espectro ultravioleta/visvel quando

93 a radiao incidente possui energia da mesma ordem da energia, E, de sua banda proibida. A espectrofotometria na regio do infravermelho uma das tcnicas de maior importncia para a caracterizao da estrutura molecular. O espectro infravermelho de um sistema desempenha o papel de uma impresso digital, podendo ser utilizado para identificao do material.14 Atravs da espectroscopia FTIR possvel observar bandas relativas a ligaes especificas entre tomos do material. Desta forma, a espectroscopia FTIR til, no projeto de um biossensor, para observar interaes entre as molculas da matriz polimrica e do mediador de eltrons, como tambm interaes entre a matriz e a enzima. Todas as substncias orgnicas e algumas inorgnicas absorvem radiao infravermelha. A radiao absorvida afeta os nveis rotacionais e vibracionais da molcula. A faixa do espectro infravermelho compreendida entre 10-3 m e 10-4 m, chamada de infravermelho distante, aplicvel a excitao de espectros rotacionais, enquanto a faixa de comprimentos de onda menores, entre 10-4 m e 10-7 m, chamada infravermelho prximo, aplicvel a excitao de espectros vibracionais.15,16 A freqncia fundamental de vibrao, , de uma molcula pode ser expresso pela seguinte equao:18

1 2c

(9.8)

sendo k a constante de fora, e a massa reduzida, dada por =m1m2/(m1+m2), sendo m1 e m2 as massas dos tomos envolvidos na ligao qumica de interesse. Esta equao simples fornece uma conexo entre a fora de uma ligao covalente, a sua freqncia de vibrao e as massas dos tomos. Porm, ela no considera a repulso e atrao das nuvens de eltrons e no incorpora o conceito de dissociao da ligao em altas absores de energia. Na prtica, um espectro composto de mais que apenas modos normais de vibrao, ou estiramento das ligaes. Deformaes angulares tambm desempenham grande importncia, sendo estes relacionados absoro de radiao de menores freqncias.18 Cada grupo funcional em uma molcula possui sua freqncia de absoro caracterstica. Desta forma, uma anlise qualitativa de um espectro

94 infravermelho nos fornece importantes informaes sobre a presena ou no de grupos funcionais em uma molcula desconhecida. Leves alteraes nas freqncias caractersticas de grupos podem indicar a ocorrncia de eventos fsicos ou qumicos, que podem ser relacionados formao de complexos, solventes e outros efeitos.14 O espectro eletrnico de filmes de PVA, CuFtc e PVA/CuFtc foram obtidos atravs de uma varredura entre 200 nm e 1000 nm a temperatura ambiente (25 C) utilizando um espectrofotmetro UV/Vis Varian Serie 643 (200 nm a 400 nm) e um espectrofotmetro UV/Vis Biospectro SP-22 (400 nm a 100 nm) (Figura 9.5). O espectro infravermelho de filmes de PVA, CuFtc e PVA/CuFtc foram obtidos a temperatura ambiente em um equipamento Mattson Genesis II. Os espectros foram coletados aps 32 varreduras com resoluo de 2 cm-1.

(A)

(B)

Figura 9.5: Espectrmetro UV/Vis Varian Serie 643 (A) e Biospectro SP-22 (B) utilizados para obteno do espectro UV/Vis.

9.2.4 Anlise microestrutural por MEV

A caracterizao morfologia das membranas reticuladas de PVA foi realizada nos laboratrios do IPEN/USP atravs de um microscpio eletrnico de varredura (MEV) modelo Phillips XL 30. A Figura 9.6 ilustra o MEV utilizado neste trabalho.

95

Figura 9.6: MEV utilizado neste trabalho (IPEN/CNEN-USP).

9.2.5 - Transporte eletrnico em filmes de PVA/Ftc

Foram estudadas as propriedades eltricas de filmes PVA, Ftc e filmes de PVA/Ftc com diferentes concentraes de Ftc. Filmes na forma de discos de PVA e PVA/Ftc foram preparados pela tcnica de evaporao do solvente com dimetro de 5,7 mm e espessura entre 0,22 mm e 0,28 mm. As amostras de Ftc foram sintetizadas atravs de prensagem uniaxial com presso de 3 ton durante 15 minutos, produzindo amostras cilndricas com 8 mm de dimetro e espessura mdia de 1,4 mm. Para a realizao do experimento, as amostras foram revestidas com cola prata em ambas as faces, para estabelecimento do contato eltrico na montagem experimental. A caracterizao eltrica das membranas de PVA/Ftc foi realizada em uma cmara escura com temperatura controlada e com vcuo, utilizando-se um multmetro Keithley modelo K-237, interfaceado por computador atravs de um programa construdo no sistema LabView. O multmetro Keithley utilizado para realizao das medidas mostrado na Figura 9.7. A cmara com vcuo e temperatura controlada utilizada apresentada na Figura 9.8, com um detalhe do compartimento da amostra.

96

Interface para computador Multmetro Keithley K-237

Figura 9.7: Multmetro Keithley modelo K-237 utilizado para a caracterizao eltrica dos filmes de PVA. Ftc e PVA/Ftc.

(A)

(B)

Figura 9.8: Cmara (A) e compartimento para amostras (B) utilizados na caracterizao eltrica dos filmes de PVA, Ftc e PVA/Ftc.

97 A condutividade das amostras foram investigadas, em filmes contendo PVA no intervalo de temperaturas de 25 C a 70 C. As amostras de Ftc foram estudadas em temperaturas entre 25 C e 200 C. As amostras foram submetidas a variaes de tenso de 0 V a 5 V, lendo-se a corrente DC em funo da tenso aplicada. O mecanismo de transporte eletrnico em membranas de PVA/Ftc foi investigado atravs da Equao 7.4. Para cada um dos tipos de amostras foram construdos grficos ln() versus 1/T assumindo valores de iguais a = 0,25 e = 0,50. Aps realizar o ajuste de uma reta cada uma das curvas, atravs do mtodo dos mnimos quadrados, o coeficiente de correlao foi comparado. Foi considerado como caracterstico do mecanismo de conduo, para cada tipo de amostra, o valor do coeficiente que permite a maior linearidade (maior coeficiente de correlao) da curva contida no grfico () versus 1/T. A energia de ativao associada ao processo de saltos nos modelos de Mott e Efros foi calculada atravs da Equao 7.3, em analogia ao modelo de Arrhenius.

9.3 Referncias bibliogrficas

1. Hemeda, O. M.; Hemeda, D. M.; Said, M. Z. Some physical properties of pure and doped polyvinyl alcohol under applied stress. Mechanics of Time-Dependence Material. 7, 251-268, 2003. 2. Gan, L. H.; Deen, G. R.; Tam, K. C. Water sorption studies of new pH-responsive Nacryloyl-N-methyl piparazine and methyl metracrylate hydrogels. European Polymer Journal. 37, 1473-1478, 2001. 3. Urushizaki, F.; Yamaguchi, H.; Nakamura, K.; Numajiri, S.; Sugibayashi, K.; Marimoto, Y. Swelling and mechanical properties of poly(vinyl alcohol) hydrogels. International Journal of Pharmaceutics. 58, 135-142, 1990. 4. Anseth, K.S.; Bowman, C. N.; Peppas, L. B. Mechanical properties of hydrogels and their experimental determination. Biomaterials. 17 (17), 1647-1657, 1996. 5. Flory, P. J.; Rehner, J. Statistical mechanics of cross-linked polymer networks II. Swelling. The Journal of Chemical Physics. 11 (11), 521-529, 1943.

98 6. Wang, J.; Wu, W. Swelling behaviors, tensile properties and thermodynamic studies of water sorption of 2-hydroxiethyl methacrylate/epoxy mathacrylate copolymeric hydrogels. European Polymer Journal. 41, 1143-1151, 2005. 7. Ionashiro, M.; Giolito, I. Nomenclatura, padres e apresentao dos resultados em anlise trmica. Cermica. 26 (121), 17-24 1980 8. Ionashiro, M.; Giolito, I. A nomenclatura em anlise trmica Parte II. Cermica. 34 (225), 163-164, 1988. 9. Bernal, C.; Couto, A. B.; Breviglieri, S. T.; Cavalheiro, T. G. Influncia de alguns parmetros experimentais nos resultados de anlises calorimtricas diferenciais DSC. Qumica Nova. 25 (5), 849-855, 2002. 10. Collins, E. A.; Bares, J.; Billmeyer, F. W. Experiments in Polymer Science. New York: Jonh Wiley & Sons, 1973 11. Rosen, S. L. Fundamental Principles of Polymeric Materials. New York: John Wiley &Sons. 2 ed, 1993. 12. Hassan, C. M.; Peppas, N. A. Structure and Applications of Poly(vinyl Alcohol) Hydrogels Produced by Conventional Crosslinking of by Freezing /Thawing Methods. Advances in Polymer Science. 153, 37-65, 2000. 13. Mallapragada, S. K.; Peppas, N. A. Dissolution Mechanism of Semicrystalline Poly(vinyl alcohol) in Water. Journal of Polymer Science: Part B: Polymer Physics. 34, 1339-1346, 1996. 14. Sunshine, Irving. Handbook of Spectrofhotometric Data of Drugs. Flrida: CRC Press, 2000. 15. Alonso, M.; Finn, E. J. Fsica. Madri: Addison-Wesley, 1999. 16. Alcantara, P. Espectrofotometria Molecular. Disponvel Em:

<http://www.ufpa.br/ccen/fisica/didatico/espectrofotometria.pdf>. Acesso em: 12 junho 2006. 17. Disponvel em: <http//www.iqsc.usp.br/iqsc/ensino/graduacao/disc_online/bacharel/ ana_inst_i/eamu.pdf>. Acesso em: 12 junho 2006. 18. Coates, J. Interpretation of Infrared Spectra, A Pratical Approach. Encyclopedia of Analytical Chemistry. R.A. Meyers. 10815-10837. Chichester: John Wiley & Sons, 2000.

99 CAPTULO 10 - RESULTADOS E DISCUSSO

10.1 - Caracterizao fsico-qumica do biossensor

10.1.1 Anlise da microestrutura por MEV

A morfologia da matriz polimrica utilizada para construo do biossensor pode influenciar a estabilidade da enzima ocluda. desejvel que a matriz polimrica apresente uma distribuio de porosidade que permita a difuso do analito e dos produtos da reao atravs da matriz polimrica. As membranas de PVA, aps o processo de reticulao (Figura 10.2), apresentaram uma grande distribuio de poros, ao contrario das membranas no reticuladas (Figura 10.1). A formao de poros nas membranas de PVA reticuladas pode ter ocorrido durante o processo de evaporao do solvente (gua) contida no hidrogel. O processo de formao de poros durante a desidratao est relacionado a diversos fatores, principalmente tenso superficial, estrutura, mecanismo de transporte e contedo de gua.1,2 O aumento da tenso superficial das membranas causada pelo processo de reticulao gera uma barreira para a evaporao de gua das membranas. Os poros podem se formar devido instabilidade superficial provocada pela grande presso osmtica necessria para vencer essa barreira evaporao da gua. O processo de formao de porosidade em hidrogis devido a reticulao um processo complexo cujo mecanismo ainda no foi devidamente esclarecido pela literatura.1

100

Figura 10.1: Micrografia MEV de uma membrana de PVA no reticulada. O filme foi seco 25 C sob vcuo.

Figura 10.2: Micrografia MEV de uma membrana de PVA reticulada com cido brico. A desidratao da membrana ocorreu a 25 C sob vcuo.

101 10.1.2 Difuso de fluido fisiolgico atravs da membrana O meio ideal para que ocorra a reao catalisada pela colesterol oxidase o meio aquoso. Desta forma, o transporte de gua na matriz polimrica influencia a atividade enzimtica e, consequentemente a performance do biossensor. O tempo de resposta do biossensor dependente do tempo necessrio para que ocorra a difuso do analito juntamente com a gua para o interior da matriz polimrica. Os resultados obtidos com relao ao transporte de gua em membranas de PVA reticulado (PVAR) e no reticulado (PVA) so apresentados nas Figuras 10.3 a 10.5. Estas figuras no apresentam curvas obtidas por ajuste, mas apenas curvas de tendncia. A Figura 10.3 mostra a cintica de intumescimento de membranas no reticuladas de PVA a temperaturas entre 20 C e 50 C. A Figura 10.4 apresenta a cintica de intumescimento de membranas de PVAR, reticuladas por 25 min, a temperaturas entre 20 C e 40 C. No foi possvel realizar os ensaios a temperatura de 50C, devido fragilidade da amostra a esta temperatura. Consequentemente, no foi possvel calcular o valor do coeficiente de difuso para esta temperatura (Figura 10.6). Tanto as membranas de PVA quanto as de PVAR apresentaram um aumento da capacidade de soro de gua com o aumento da temperatura. A Figura 10.5 apresenta a cintica de intumescimento de membranas de PVA no reticulado e membranas com tempos de reticulao entre 10 min e 60 min. As membranas apresentaram um decrscimo na capacidade de soro de gua com o aumento do tempo de reticulao. Este comportamento pode ser atribudo diminuio nos graus de liberdade das cadeias de PVA devido ao processo de reticulao. A diminuio dos graus de liberdade das cadeias polimricas prejudica o processo de relaxao e tende a diminuir a capacidade de soro de gua da matriz polimrica.

102

(D)

(C) (A) (B)

Intumescimento (gsolv/gpol)

15

30

45

60

75

90

tempo (min)
Figura 10.3: Cintica de intumescimento de membranas de PVA em soluo fisiolgica, pH 7,4, a diferentes temperaturas: 20 C (A), 30 C (B), 40 C (C) e 50 C (D). O desvio padro mdio de 3%.

103

(B)

(C)

(A)

Intumescimento (gsolv/gpol)

15

30

45

60

75

90

105

120

tempo (min)

Figura 10.4: Cintica de intumescimento de membranas de PVAR em soluo fisiolgica, pH 7,4, reticuladas por 25 min, em diferentes temperaturas: 20 C (A), 30 C (B) e 40 C (C). O desvio padro mdio de 3%.

104

(A) (B) (C) Intumescimento (gsolv/gpol) (D) (E)

2

15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165

tempo (min)
Figura 10.5: Cintica de intumescimento, em soluo fisiolgica, pH 7,4, de membranas de PVA (A) e membranas de PVAR com diferentes tempos reticulao: 10 min (B), 25 min (C), 40 min (D) e 60 min (E). O desvio padro mdio de 3%.

105 A densidade de reticulao, e, das membranas de PVA foi calculada atravs da Equao 5.40. Para tempos de reticulao iguais a 10 min, 25 min, 40 min e 60 min, os valores de e foram respectivamente iguais a 1,02x10-5 mol.cm-3, 1,09x10-5 mol.cm-3, 1,12x10-5 mol.cm-3 e 1,20x10-5 mol.cm-3. A reticulao de membranas de PVA atravs de sua transio sol-gel em soluo de cido brico se revelou uma tcnica de alta eficincia, por produzir membranas com densidade de reticulao comparveis a filmes de PVA reticulados com radiao gama de
60

Co.3 Os valores de e, citados na literatura, obtido atravs da

tcnica de reticulao por radiao gama so de 3,0x10-5 mol.cm-3 a 1,0x10-3 mol.cm-3. O coeficiente de difuso, D, da gua em membranas de PVA foi calculado atravs da soluo da segunda lei de Fick para uma membrana (Equao 5.35). A Figura 10.6 mostra a curva de tendncia do coeficiente de difuso de gua, para membranas de PVA e PVAR (e = 1,09x10-5 mol.cm-3), em funo da temperatura. A saturao do coeficiente de difuso do PVAR a 30 C est associado ao processo de reticulao. A diminuio no nmero de graus de liberdade das cadeias do polmero aps o processo de reticulao com cido brico limita o intumescimento da amostra de PVA, como pode ser observado na Figura 10.5. O coeficiente de difuso para o PVA no reticulado apresentou um aumento exponencial com a temperatura, de acordo com a equao de Arrhenius (Equao 5.38). A Figura 10.7 apresenta a curva de tendncia do coeficiente de difuso de gua em funo da densidade de reticulaes de membranas de PVA. Observa-se a diminuio de D como o aumento da densidade de reticulao do PVA. Este comportamento pode ser atribudo diminuio no nmero de graus de liberdade das cadeias do polmero devido ao processo de reticulao. A Tabela 10.1 apresenta os valores mdios de n calculados para o PVA e PVAR com e entre 1,02x10-5 mol.cm-3 e 1,20x10-5 mol.cm-3, e valores de entalpia, Hi, e energia de ativao, Ea, associada ao processo de difuso, para o PVA e PVAR com

e=1,02x10-5 mol.cm-3.

106 Tabela 10.1 Valores mdios calculados de n, e valores de Ea e Hi para filme de PVA e PVA reticulado. n / Desvio padro a 0,61 / 0,04 1,18 / 0,27 Ea (kJ/mol) b 0,65 21,00 Hi (kJ/mol) b 1,24 3,37

Amostra No reticuladas Reticuladas

a b

valores mdios para membranas com e=1,02x10-5 mol.cm-3 a e=1,20x10-5 mol.cm-3; valores para amostras com e=1,02x10-5 mol.cm-3.

Observou-se um mecanismo de difuso do tipo no Fickiano para o transporte de gua nas membranas de PVAR (Tabela 10.1). Este tipo de transporte indica que o processo de soro de gua pelas membranas fortemente dependente da cintica de intumescimento. A diminuio dos graus de liberdade das cadeias polimricas provocada pelo processo de intumescimento compromete a relaxao das cadeias polimricas, fazendo com que este processo seja mais lento que o processo de difuso de gua nos filmes. Para as membranas de PVA, observou-se um pequeno desvio do mecanismo de difuso Fickiano. O filme de PVA apresentou os menores valores de Ea e Hi, indicando menor energia associada ao processo de soro de gua durante o processo de intumescimento relativamente ao filme de PVAR.

107

11 10 9

28 26 24 22

8 20 7

m /s)

(A)
6 5

18 16 14

D (10

-12

D (10

-12

m /s)

(B)
4

12 10

3 8 2 1 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6 4

T (C)

Figura 10.6: Dependncia do coeficiente de difuso com a temperatura para membranas de PVAR (A) e PVA (B).

108

10

m /s) D (10

-12

1 0,0 1,00 1,05

-5

1,10
-3

1,15

1,20

e (10 mol.cm )

Figura 10.7: Dependncia do coeficiente de difuso com a densidade de reticulaes das membranas de PVA temperatura de 20C.

109 10.1.3 - Avaliao das propriedades mecnicas As Figuras 10.8 a 10.11 apresentam as curvas TMA referente profundidade de penetrao devido a foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N versus tempo de exposio para amostras com densidade de reticulao de e=1,02x10-5 mol.cm-3 (Figura 10.8), e= 1,09x10-5 mol.cm-3 (Figura 10.9), e=1,12x10-5 mol.cm-3 (Figura 10.10) e e=1,20x10-5 mol.cm-3 (Figura 10.11). Para cada e foram analisadas oito amostras diferentes. O desvio padro mdio da profundidade de penetrao para as foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N foram iguais a 1,10, 7,46 e 11,57 m respectivamente. Observou-se que a profundidade de penetrao da ponta de prova diminui com o aumento na densidade de reticulaes das membranas de hidrogis, sugerindo um aumento da resistncia mecnica das membranas com o aumento de e. O mdulo de Young, , das membranas foi calculado atravs das curvas profundidade de penetrao versus tempo, considerando por vez, a profundidade de penetrao aps 30 s devido a duas das foras aplicadas, segundo a relao:

Pi , j li , j

, i=0,1, 0,2, 0,5; j=0,1, 0,2, 0,5, ij

(10.1)

sendo P a diferena de presso exercia pelas foras i e j e l a diferena da porcentagem de deformao provocadas pelas foras i e j. A porcentagem de deformao, l, sofrida pela amostra dada pala relao:

l=

p d

(10.2)

sendo p a profundidade de penetrao da ponta de prova e d a espessura do filme. O mdulo de Young de cada membrana determinado pela media dos valores de obtidos pela equao 10.1. Comumente na literatura o valor de obtido a partir de curvas tenso versus deformao. Porm, neste trabalho o valor de obtido a partir de curvas presso versus deformao. Para pequenas deformaes, a deformao sofrida por uma amostra devido a uma fora de presso possui o mesmo valor que a deformao promovida por uma fora de trao de mesmo mdulo.4 Este fato torna vlida a metodologia de calculo do mdulo de Young realizado neste trabalho. O valor de de membranas de PVA e PVAR (e=1,02x10-5 mol.cm-3), no intumescidas, so respectivamente iguais a 401,87 MPa e 5699,59 MPa. O valor de

110 obtido para membranas de PVA comparvel ao valor encontrado na literatura ( = 120 MPa).5 Os valores do do PVAR e PVA, no seu mximo de intumescimento, em funo da densidade de reticulaes so apresentados pela Figura 10.12. O desvio padro mdio dos valores de 18,35 MPa. Podemos observar que aumenta com o aumento de e. A clara relao linear (R2=0,97) entre essas duas variveis pode ser atribuda ao processo de reticulao das membranas de PVA. Essa relao prevista pela Equao 9.2, como tambm a diminuio de devido ao processo de intumescimento. O alto valor do desvio padro referente aos valores de pode ser atribudo cintica de difuso anmala (Captulo 5.6) das membranas de PVA reticuladas. A cintica de difuso anmala provoca o intumescimento no homogneo nas membranas, fazendo com estas apresentem diferenas de espessura e superfcie no plana. Tambm a perda de gua das membranas durante os ensaios outro fator importante que influencia as propriedades mecnicas das membranas. No projeto do biossensor, a matriz polimrica deve possuir um valor aprecivel de , para garantir a estabilidade mecnica da matriz polimrica, o que facilitaria seu manuseio durante o processo de fabricao e utilizao.

111

0,1 N Profundidade de penetrao (m)

-5

-10

-15

0,2 N

-20

-25

0,5 N
-30

10

15

20

25

30

t (s)
Figura 10.8: Profundidade de penetrao versus tempo de exposio das membranas s foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N para a amostra de PVAR (e=1,02x10-5 mol.cm-3) intumescidas, temperatura de 25C.

112

0,1 N

-5

Profundidade de penetrao (m)

-10

-15

0,2 N

-20

-25

0,5 N

-30

10

15

20

25

30

t (s)
Figura 10.9: Profundidade de penetrao versus tempo de exposio das membranas s foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N para a amostra de PVAR (e= 1,09x10-5mol.cm-3) intumescidas, temperatura de 25C.

113

0,1 N

Profundidade de penetrao (m)

-5

-10

0,2 N
-15

-20

0,5 N
-25

-30

10

15

20

25

30

t (s)
Figura 10.10: Profundidade de penetrao versus tempo de exposio das membranas s foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N para a amostra de PVAR (e=1,12x10-5 mol.cm-3) intumescidas, temperatura de 25C.

114

0,1 N

Profundidade de penetrao (m)

-5

0,2 N
-10

0,5 N
-15

-20

-25

-30

10

15

20

25

30

t (s)
Figura 10.11: Profundidade de penetrao versus tempo de exposio das membranas s foras de 0,1, 0,2 e 0,5 N para a amostra de PVAR (e=1,20x10-5 mol.cm-3) intumescidas, temperatura de 25C.

115

57,5

55,0

Y=A+B*X A=-16,936 6 B=5,948x10 2 R =0,97

52,5

50,0

(MPa)

47,5

45,0

42,5

40,0 1,00 1,05 1,10

-5

1,15
3

1,20

e (10 mol/cm )
Figura 10.12: Mdulo de Young das membranas intumescidas de PVAR (20C) em funo da densidade de reticulaes. O desvio padro mdio de 18,35 MPa. (PVA)=16,18 MPa.

116 10.1.4 Caracterizao trmica das membranas

fato bem conhecido da literatura que o processo de reticulao exerce influencia significativa nas propriedades trmicas de um polmero bem como na temperatura de transio vtrea, Tg, entalpia de fuso, Hm, temperatura de fuso, Tm e percentual de cristalinidade, c. A Figura 10.13 apresenta o termograma DSC de filmes de PVA com diferentes densidades de reticulaes. A partir deste termograma, foi obtido os valores de Hm e c e Tm. A influencia da densidade de reticulaes, e, nos valores da Tg e Tm dos filmes de PVA so apresentados na Figura 10.14. Esta figura no apresenta curvas obtidas por ajuste, mas apenas curvas de tendncia. Verifica-se um aumento tanto da Tm e reduo da Tg com o aumento de e, sugerindo a formao de reticulaes. O aumento da Tm pode ser atribudo diminuio dos graus de liberdade das cadeias devido ao aumento da densidade de reticulaes. Em filmes com elevada densidade de reticulaes, as cadeias polimricas no possuem energia suficiente para que ocorra o movimento de translao de molculas inteiras e os movimentos cooperativos de extenso e contrao de segmentos da molcula necessrios para que ocorra a Tg, provocando uma queda brusca no valor da Tg. Os valores obtidos para a Tg e Tm dos filmes no reticulados de PVA so menores que os valores encontrados na literatura (Tg=85 C e Tm230 C). Isto pode ser atribudo presena de gua nas amostras analisadas, que pode reduzir significativamente o valor da Tg e Tm.6 A curva de tendncia de Hm e c em funo de e apresentada na Figura 10.15. A presena de reticulaes impede o alinhamento das cadeias polimricas necessrio formao de cristalitos, provocando a diminuio da c com o aumento da

e.

117

Tg
(E) (D) (C) (B)

dQ/dT

endo

(A)

60

90

120

150

180

210

240

T (C)
Figura 10.13: Termogramas DSC de filmes de PVA (A) e filmes reticulados de PVA:

e=1,02x10-5 mol.cm-3 (B), e= 1,09x10-5mol.cm-3 (C), e=1,12x10-5

mol.cm-3 (D), e=1,20x10-5 mol.cm-3 (E).

118

120 115 110 105 100 95

220 218 216 214 212 210 208 206

Tm (C)

Tg (C)

90 85 80

204 75 202 70 200 65 0,0 1,00 1,05

-5

1,10
-3

1,15

1,20

e (10 mol.cm )

Figura 10.14: Dependncia da temperatura de transio vtrea (Tg) e da temperatura de fuso (Tm) com a densidade de reticulaes (e) de membranas de PVA.

119

50

40

45 35 40 30 35

Hm (J/g)

30

25

c (%)

25 20 20 15 15

10

10

5 0,0 1,00
-5

1,05
-3

1,10

1,15

e (10 mol.cm )

Figura 10.15: Dependncia da entalpia de fuso (Hm) e porcentual de cristalinidade (c) da densidade de reticulaes (e) de membranas de PVA.

120 10.1.5 Caracterizao Espectroscpica (UV/Vis, FTIR)

Neste trabalho o PVA e a Ftc foram utilizados em conjunto como matriz para o biossensor e mediador de eltrons. possvel que ocorra uma interao entre essas duas molculas, formando um complexo de transferncia de carga (CTC) entre elas. A formao de CTC pode contribuir para as propriedades eltricas do material. Para verificar se ocorreu a formao de CTC entre PVA e Ftc, foram feitas a espectroscopia UV/Vis e FTIR de filmes de PVA/Ftc. A Figura 10.16 apresenta os espectros eletrnicos obtidos de filmes de PVA, Ftc e PVA/Ftc. O espectro da Ftc se origina do sistema aromtico de orbitais com eltrons 18 e da superposio de rbitas no tomo central de cobre. O sistema conjugado leva a uma intensa absoro na regio do visvel. Os picos podem ser atribudos a transies diretas entre bandas do tipo -*. O espectro do PVA apresenta duas bandas de absoro em 280 nm e 318 nm. A banda de absoro na regio de 280 nm pode ser relacionada a transies do tipo - * devido a ligaes insaturadas, como grupos carbonila de alta absoro na regio do UV nas extremidades da cadeia.5,7 A banda de absoro em torno de 318 nm pode estar relacionada a transies do tipo * nos grupos OH das cadeias de PVA. O espectro de absoro dos filmes de PVA/Ftc possui um mximo a 380 nm e esta banda pode ser associada forma de coordenao das molculas de Ftc na matriz de PVA. Este espectro sugere a formao de um complexo de transferncia de cargas. Assumindo a formao deste complexo, os possveis stios de ligao so os grupos OH nas molculas de PVA e os tomos de nitrognio situados nos anis aromticos da Ftc. Esta interao deve ser qualitativamente similar protonao, pois os grupos OH nas molculas de PVA aparentam possuir um forte carter aceitador de eltrons e neste caso esperado um deslocamento no espectro UV/Vis do PVA, conduzindo a um aumento na ordem da ligao C-O nas cadeias de PVA.

121

C u F tc

Absorbncia (u.a)

P V A /C u F tc

PVA

200

300

400

500

600

700

800

900

(n m )

Figura 10.16: Espectro UV/Vis de solues aquosas de Ftc, PVA e PVA/Ftc a temperatura de 25 C.

O espectro vibracional FTIR pode oferecer informaes valiosas a respeito das interaes entre o mediador (Ftc) e a matriz polimrica. Neste trabalho foram estudados o espectro infravermelho (FTIR) de filmes de PVA, Ftc e PVA/Ftc com concentraes de Ftc de 30, 17 e 5 m/m%. Os espectros FTIR foram obtidos a temperatura ambiente (25 C). Lembrando-se que o PVA um copolmero composto de PVA e PVAc, a estrutura do PVA apresenta trs diferentes tipos de ligaes C-H: metil, metileno, e meteno. Cada um desses tipos possui bandas de absoro caractersticas. Uma anlise do espectro FTIR do PVA (Figuras 10.17 e 10.18 - A) revela bandas de absoro tpicas do estiramento da ligao C-H em agrupamento metileno na regio prxima a 2924 e

122 2853 cm-1. Bandas tpicas do estiramento da ligao C-H de agrupamentos metil so observadas na regio de 2964,1451 e 1372 cm-1. Bandas caractersticas da deformao angular da ligao C-H em agrupamentos metileno e meteno so observadas respectivamente na regio de 1451 e 2900 cm-1. Na regio de 1141 observam-se bandas caractersticas das ligaes C-C do esqueleto central da cadeia de PVA. As bandas caractersticas das ligaes O-H encontram-se na regio de 720 a 590 cm-1. Na regio de 870 a 1100 cm-1 localizam-se as bandas de forte absoro, caractersticas do estiramento da ligao C-O associada a lcool secundrio.8-11 A anlise do espectro FTIR da Ftc (Figuras 10.17 e 10.18 - E) revela bandas de absoro caractersticas das ligaes C-C dos anis aromticos mais externos da molcula nas regies de 1530, 1408, 1299, 1000, 793 e 643 cm-1. As bandas relativas s ligaes C-H situam-se nas regies de 2870, 1190, 1152, 1105-1000 e 945 cm-1. As bandas situadas nas regies de 1472, 895 e 760 cm-1 esto relacionadas s ligaes C-NC. Em 643 cm-1 localiza-se a banda caracterstica das ligaes N-Cu-N.8,9,12 Observando-se o espetro FTIR dos filmes de PVA/Ftc, percebe-se o deslocamento de algumas bandas relacionadas s ligaes C-H do PVA e da Ftc: a banda situada em 2925 cm-1 sofreu um deslocamento para 2929 cm-1 na amostra de Ftc 30 m/m%, e foi decomposto em dois picos a 2928 e 2921 cm-1 na amostra 17 m/m%; os picos situados em 2870 cm-1 no espectro da Ftc e 2853 na amostra de PVA sofreram deslocamento para 2868 cm-1 na amostra 30 m/m%, 2858 cm-1 na 17 m/m% e foi decomposto em trs bandas situadas em 2857, 2869 e 2883 cm-1 na amostra 5 m/m%. As bandas relacionadas ligao C-H da Ftc situadas em 1105, 1095 e 1078 cm-1 e a banda relacionada ligao C-O do PVA situada em 1073 cm-1 integradas em uma nica banca localizada em 1078 cm-1 na amostra 30 m/m%, 1076 nas amostra 17 e 5 m/m%. A banda caracterstica da ligao C-N-C da Ftc, situada a 895 sofreu um deslocamento para 879, 875 e 872 cm-1 nas amostras de 30, 17 e 5 m/m% respectivamente. Os deslocamentos de bandas observadas nos espectros dos filmes de PVA/Ftc sugerem a ocorrncia de uma interao entre as duas molculas, formando um complexo de transferncia de cargas. Considerando a formao desse complexo, os possveis stios de interao entre as duas molculas so os tomos de H e N da Ftc com os agrupamentos hidroxilas do PVA. A formao de CTC entre o mediador de eltrons Ftc e o PVA pode ser analisada utilizando a modelagem molecular. Esta anlise importante para a

123 compreenso do mecanismo de formao do complexo e como auxilio na interpretao dos resultados experimentais. A seguir, sero discutidos os principais resultados obtidos neste trabalho.

(A) (B) (C) (D) (E)

Transmitancia (u.a.)

2000

1800

1600

1400

1200

1000
-1

800

600

Nmero de onda (cm )

Figura 10.17: Espectro infravermelho na regio de 600 cm-1 a 2000 cm-1 de filmes de PVA (A), PVA/Ftc 5 m/m% (B), PVA/Ftc 17 m/m% (C), PVA/Ftc 30 m/m% (D) e Ftc (E).

124

(A) (B) (C) (D) (E)

Transmitancia (u.a.)
3500

3250

3000

2750
-1

2500

Nmero de onda (cm )

Figura 10.18: Espectro infravermelho na regio de 3500 cm-1 a 2500 cm-1 de filmes de PVA (A), PVA/Ftc 5 m/m% (B), PVA/Ftc 17 m/m% (C), PVA/Ftc 30 m/m% (D) e Ftc (E).

125 10.2 - Modelagem molecular do sistema PVA/Ftc

Para melhorar a compreenso do mecanismo de conduo nos filmes de PVA/Ftc e de seu espectro infravermelho, a interao entre as molculas de PVA e Ftc foi investigada atravs de modelagem molecular. Os clculos foram realizados de acordo com o mtodo semi-emprico PM3-d, utilizando o software Spartan em um computador Pentium 4 de 2.2 GHz, 1 Gb de memria com o sistema operacional Linux. Foram obtidos parmetros relacionados estrutura eletrnica das referidas molculas, como isosuperfcies de densidade eletrnica e potencial de ionizao, potencial eletrosttico e orbitais moleculares HOMO e LUMO A superfcie de isodensidade de eltrons reflete a forma e o tamanho de uma molcula atravs de sua nuvem eletrnica. Esta superfcie nos revela se realmente existe uma ligao qumica entre todos os tomos de uma molcula. O potencial de ionizao mostra a facilidade de remoo de um eltron de uma regio da molcula. As Figuras 10.19 a 10.21 apresentam o potencial de ionizao mapeado em uma superfcie de isodensidade eletrnica para as molculas de PVA, Ftc e para o complexo PVA/Ftc. Nessas figuras, as cores prximas ao azul mostram regies de alto potencial de ionizao enquanto as cores prximas ao vermelho mostram regies de baixo potencial de ionizao. O mapa de potencial de ionizao para a molcula de PVA (Figura 10.19) mostra baixos valores de potencial de ionizao na regio dos agrupamentos OH e altos valores ao longo da base da cadeia. Para a molcula de Ftc (Figura 10.20), o mapa mostra baixos potenciais de ionizao na regio do tomo metlico central e dos tomos de nitrognio da molcula. A Figura 10.21 apresenta o mapa de potencial de ionizao para o sistema PVA/Ftc. Para produzir este mapa, a posio escolhida para a molcula de Ftc foi a regio central da cadeia de PVA. Observa-se altos valores de potencial de ionizao na regio das ligaes N-C=N e das ligaes C-H na periferia da molcula de Ftc, e na cadeia carbnica central da molcula de PVA. Este mapa revela uma interao entre os grupos OH do PVA (baixo potencial de ionizao) com a e a regio das ligaes C-N-C e das ligaes C-H da periferia da molcula de Ftc (alto potencial de ionizao), sugerindo a formao de um complexo de transferncia de carga atravs da sobreposio dos orbitais das molculas de PVA e CuPhc.

126

Figura 10.19: Potencial de ionizao mapeado numa superfcie de isodensidade eletrnica para o PVA.

Figura 10.20: Potencial de ionizao mapeado numa superfcie de isodensidade eletrnica para a Ftc.

127

Figura 10.21: Potencial de ionizao mapeado numa superfcie de isodensidade eletrnica para o sistema PVA/Ftc.

O mapa de potencial eletrosttico (MEP) reflete a localizao dos eltrons de uma molcula. As Figuras 10.22 e 10.23 mostram o MEP para as

molculas de PVA e de Ftc. O MEP para a molcula de PVA (Figura 10.22) revela uma grande concentrao de carga em torno dos grupos OH. O mapa para a molcula de Ftc (Figura 10.23) mostra uma grande concentrao de cargas em torno dos tomos de N e do tomo de Cu central.

Figura 10.22: Superfcie de potencial eletrosttico para o PVA.

128

Figura 10.23: Superfcie de potencial eletrosttico para a Ftc.

Os orbitais moleculares HOMO e LUMO so de particular interesse, j que esto intimamente relacionados com a condutividade eltrica do material. Estes orbitais so tambm importantes por serem envolvidos em reaes qumicas, j que os eltrons que podem ser doados se localizam no orbital HOMO. A superfcie dos orbitais moleculares podem se estender sobre um ou mais tomos. Superfcies de orbitais moleculares restritas a apenas um tomo so chamadas de orbitais no ligante, enquanto superfcies que se estendem sobre a regio de ligao de tomos vizinhos so chamadas orbitais ligante. A adio de eltrons em um orbital no ligante enfraquece a ligao, aumentando sua distncia, enquanto a remoo de eltrons deste orbital provoca o efeito oposto. A adio de eltrons em um orbital ligante, a ligao entre os tomos iro se fortalecer, diminuindo a distncia de ligao. A remoo de eltrons causa o efeito oposto. As Figuras 10.24 a 10.26 apresentam o orbital HOMO para as molculas de PVA e Ftc e para o sistema PVA/Ftc. A superfcie de cor vermelha indica a parte negativa da funo de onda e a de cor azul, a parte positiva. Na molcula de PVA, o orbital HOMO se concentra na regio das ligaes C=O e/ou C=C na extremidade da cadeia (Figura 10.24). Na molcula de Ftc, o orbital HOMO se localiza em torno dos

129 tomos de N e do tomo de Cu central. O tipo de orbital predominante o no ligante, sendo que existem orbitais ligante apenas em torno de ligaes C=N. No sistema PVA/Ftc, o orbital HOMO se localiza apenas sobre a molcula de Ftc, de forma similar a molcula de Ftc isolada.

Figura 10.24: Superfcie do orbital HOMO para o PVA

Figura 10.25: Superfcie do orbital HOMO para a Ftc.

130

Figura 10.26: Superfcie do orbital HOMO para o sistema PVA/Ftc.

As Figuras 10.27 a 10.29 apresentam os orbitais LUMO para as molculas de PVA, Ftc e para o sistema PVA/Ftc. A superfcie de cor vermelha indica a parte negativa da funo de onda e a de cor azul, a parte positiva. Para a molcula de PVA, o orbital LUMO se localiza na extremidade oposta ao orbital HOMO. Nesta molcula, o orbital LUMO se concentra em torno dos agrupamentos hidroxilas e dos tomos de carbono da cadeia central. Para a molcula de Ftc, o orbital LUMO se localiza em torno dos tomos de carbono. Os orbitais ligantes predominam em torno das ligaes C=C. Para o sistema PVC/Ftc, os orbitais LUMO se localizam apenas sobre a molcula de Ftc, se distribuindo da mesma forma que a molcula de Ftc isolada.

Figura 10.27: Superfcie do orbital LUMO para o PVA.

131

Figura 10.28: Superfcie do orbital LUMO para a Ftc.

Figura 10.29: Superfcie do orbital LUMO para o sistema PVA/Ftc.

A Tabela 10.2 mostra os valores do calor de formao Hf, orbitais HOMO, LUMO e largura da banda proibida, E, para as molculas de PVA, Ftc e PVA/Ftc. As molculas de PVA foram modeladas com grau de polimerizao igual a 20. O calor de formao da molcula de Ftc exotrmico e o do PVA e PVA/Ftc

132 endotrmico. O sistema PVA/Ftc possui o menor calor de formao, indicando que este sistema mais estvel termodinamicamente que as outras molculas. O valor calculado da energia da banda proibida do PVA maior que a energia da banda proibida da Ftc, sugerindo que o PVA possui menor condutividade eltrica que a Ftc. O sistema PVA/Ftc possui menor valor de E que o PVA, mostrando que a molcula de Ftc pode promover o aumento da condutividade em filmes de PVA. O aumento da condutividade da matriz causa um efeito positivo no biossensor, pois facilita o escoamento, para o eletrodo, dos eltrons gerados pela oxidao do perxido de hidrognio pelo mediador. Desta forma, espera-se um aumento na corrente gerada pelo dispositivo quando em funcionamento, o que pode aumentar a sensibilidade do biossensor. Tabela 10.2: Energias do calor de formao Hf, orbitais HOMO e LUMO e largura da banda proibida, E, para as molculas de PVA, Ftc e PVA/Ftc, calculados pelo mtodo PM3-d.

Molcula Ftc PVA PVA/Ftc

Hf (Kcal/mol)
297,753 -521,627 -789,308

HOMO (eV) -8,292 -10,211 -8,650

LUMO (eV) -1,347 -2,178 -1,681

E (eV)
6,945 8,033 6,961

10.3 Caracterizao eltrica do biossensor

A caracterizao espectroscpica e a modelagem molecular mostraram que ocorre a formao de um CTC entre a matriz de PVA e o mediador de eltrons Ftc. A formao desse complexo pode exercer grande influncia nas propriedades eltricas dos filmes de PVA/Ftc. Por sua vez, as propriedades eltricas da matriz do biossensor influenciam em seu desempenho, determinando a ordem de grandeza do sinal obtido e influenciando na sensibilidade do biossensor. A Figura 10.30 apresenta a curva de tendncia da condutividade eltrica de filmes de PVA/Ftc em funo da temperatura. Observou-se um aumento exponencial

133 da condutividade com o aumento da temperatura. As amostras com maior concentrao de Ftc apresentaram maior condutividade eltrica. A curva de tendncia apresentada pela Figura 10.31 mostra a variao da condutividade em funo da concentrao de Ftc para membranas de PVA/Ftc a diferentes temperaturas. Foi observado um grande aumento da condutividade com o aumento da temperatura e da concentrao de Ftc. Estes resultados indicam que a condutividade dos filmes de PVA/Ftc pode ser classificada como por saltos termicamente ativados de estados localizados para estados estendidos na banda de valncia. Os buracos deixados podem contribuir para a conduo atravs de saltos entre estados localizados. O mecanismo de conduo nesse material pode ento ser descrito pelo modelo de conduo por saltos, onde

exp(T0 / T ) . As membranas de PVA e PVA/Ftc com 5 m/m% de Ftc,

apresentaram valores de = 0,25, indicando a predominncia do mecanismo de saltos de alcance variado (mecanismo de Mott). As membranas de PVA/Ftc com 17 e 30 m/m% de Ftc apresentaram valores de = 0,50, indicando a predominncia do mecanismo de saltos entre vizinhos mais prximos (mecanismo de Efros). A Figura 10.32, mostra a dependncia da energia de ativao com a concentrao de Ftc dos filmes estudados. Houve um grande aumento de E com o aumento da concentrao de ftalocianina. Apesar do mecanismo de Mott exigir menor energia de ativao, a maior distncia entre os saltos leva menor probabilidade de tunelamento, ou seja, menor probabilidade de ocorrncia do salto (Equao 7.4). Em conseqncia, tipicamente, o mecanismo de Mott se manifesta em materiais com menor condutividade do que os materiais onde se manifestam tipicamente o mecanismo de Efros, como ocorreu nas membranas de PVA/Ftc.

134

160

140

120

(D)
100

(x10 (.m) )

80

(C)

-6

-1

60

(B) (A)

40

20

0
20 30 40 50 60 70 80

T (C)

Figura 10.30: Dependncia de com a temperatura, de filmes de PVA/Ftc com diferentes concentraes: 5 m/m % (A), 0 m/m % (B), 40 m/m % (C), 20 m/m % (D).

135

1,4

1,2

1,0

(D) (C)

(10 (.m) )

-1 -4

0,8

0,6

0,4

0,2

(B) (A)

0,0 0 5 10 15 20 25 30

Concentrao de ftalocianina (m/m %)

Figura 10.31: Dependncia de com a concentrao de Ftc, de filmes de PVA/Ftc a diferentes temperaturas: 26C (A), 40C (B), 55C (C), 70C (D).

136

2,8

2,6

2,4

2,2

2,0

E (eV)

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0 0 10 20 30

Concentrao de ftalocianina (m/m %)

Figura 10.32: Dependncia de E com a concentrao de ftalocianina de filmes de PVA/Ftc.

137 10.4 Concluses parciais

Os principais resultados obtidos com relao a caracterizao da matriz polimrica do biossensor so: i) A reticulao das membranas de PVA levou formao de poros, o que pode melhorar a estabilidade da enzima ocluda e facilitar a difuso do analito no biossensor; ii) A capacidade de soro de gua das membranas de PVA aumenta com o aumento da temperatura e diminui com o aumento da densidade de reticulaes. iii) O mdulo de Young das membranas cresceu linearmente com a densidade de reticulaes; iv) O grau de cristalinidade diminuiu e a temperatura de transio vtrea aumentou com o aumento da densidade de reticulaes; v) A caracterizao espectroscpica do sistema PVA/Ftc mostrou que ocorre a formao de um CTC entre as molculas de PVA e Ftc. Este resultado foi confirmado atravs da modelagem molecular deste sistema; vi) A Ftc aumentou a condutividade eltrica da matriz (PVA) do biossensor. Este resultado pode ser atribudo formao do CTC. O mecanismo de conduo do sistema PVA/Ftc pode ser classificado com o mecanismo de saltos termicamente ativado, predominando o mecanismo de Mott para baixas concentraes de Ftc e o mecanismo de Efros para concentraes maiores de Ftc. Estes resultados mostram que membranas de PVA/Ftc reticuladas com H3BO3 possuem caractersticas fsico-qumicas que garantem boa funcionalidade e estabilidade quanto sua utilizao no projeto de biossensores clnicos.

10.4 Referncias bibliogrficas

1. Hussain, M. A.; Rahman, M. S.; Ng, C. W. Prediction of pores formation (porosity) in foods during drying: generic models by the use of hybrid neural network. Journal of Food Engineering. 51, 239-248, 2002. 2. Neogi, P. Mechanism of pore formation in reverse osmosis membranes during the casting process. AIChE Journal. 29 (3), 402-410, 2004. 3. Hatakeyema, T.; Yamauchi, A. Studies on bound water in poly(vinyl alcohol). Hydrogel by DSC and FT-NMR. European Polymer Journal. 20 (1), 61-64, 1984. 4. Martnez, P.; Azuaya, M. Medicin del mdulo de elasticidad de Young. Disponvel em:<http://www.fisicarecreativa.com/informes/infor_mecanica/young97.pdf>. Acesso em 14 junho 2006.

138 5. El-Kader, K. A. M.A.; Hamied, S. F. A.; Monsour, A. B. El-Lawindy, A. M. Y. Effect of the molecular weights on the optical and mechanical properties of poly(vinyl alcohol) films. Polymer Testing. 21, 847-850, 2002. 6. Hassan, C. M.; Peppas, N. A. Structure and Applications of Poly(vinyl alcohol) Hydrogels Produced by Conventional Crosslinking or by Freezing/Thawing Methods. Advances in Polymer Science. 153, 37-65, 2000. 7. Mallapragada, S. K.; Peppas, N. A. Dissolution Mechanism of Semicrystalline Poly(vinyl alcohol) in Water. Journal of Polymer Science: Part B: Polymer Physics. 34, 1339-1346, 1996. 8. Coates, J. Interpretation of Infrared Spectra, A Pratical Approach. Encyclopedia of Analytical Chemistry. R.A. Meyers. 10815-10837. Chichester: John Wiley & Sons, 2000. 9. Lopes, W. A.; Fascio, M. Esquema para interpretao de espectros de substncias orgnicas na regio do infravermelho. Qumica Nova. 27 (4), 670-673, 2004. 10. Jayasekara, R.; Harding, I.; Bowater, I.; Christie, G. B. Y.; Lonergan, G. T. Preparation, surface modification and characterization of solution cast stach PVA blend films. Polymer Testing. 23, 17-27, 2004. 11. Sudhamani, S. R.; Prasad, M. S.; Sankar, K. U. DSC and FTIR studies on gellan and polyvinyl alcohol (PVA) blend films. Food Hydrocollois. 17, 245-250, 2003. 12. Li, D.; Peng, Z.; Deng, L.; Shen, Y.; Zhou, Y. Theoretical studies on molecular structure and vibrational spectra of copper phthalocyanine. Vibrational

Spectroscopy. 39, 191-199, 2005.

139 CAPTULO 11 ANLISE DA PERFORMANCE DO BIOSSENSOR

11.1 Anlise da performance

O biossensor para colesterol foi analisado atravs de ensaios in vitro com solues de colesterol de concentraes entre 0 mM e 5,17 mM. A medida da resposta do biossensor foi feita em um multmetro Keithley modelo K-237, lendo-se a corrente gerada pelo dispositivo em funo do tempo. A Figura 11.1 mostra o sinal obtido pelo sensor para uma concentrao de colesterol de 1,3 mM. O biossensor apresentou um sinal na ordem de nA, com vrios picos de corrente ao longo do tempo. O sensor, para as demais concentraes, apresentou um sinal de forma equivalente. A ordem de grandeza do sinal apresentado a mesma dos biossensores comerciais j existentes no mercado. Para a construo da curva de calibrao do biossensor, foi utilizada a mdia dos trs picos de corrente mais elevados no intervalo de 0 s a 12 s, produzidos a partir da reao bioqumica. A Figura 11.2 mostra a curva de calibrao do sensor, onde cada ponto representa a mdia do resultado obtido de quatro diferentes sensores. Observou-se uma boa linearidade (R2=0,96) para concentraes de colesterol entre 0 e 5,17 mM. Neste caso, a concentrao de colesterol pode ser determinada atravs da seguinte relao: i = 3,70 x10 8 + 1,41x10 7 c sendo c a concentrao de colesterol. Para concentraes elevadas de colesterol observou-se um aumento no desvio padro do sinal do biossensor. Esta observao pode ser devido grande diferena entre o parmetro de solubilidade, , do PVA e do colesterol (Tabela 11.1), que pode influenciar na difuso das molculas de colesterol na matriz polimrica do biossensor. Como j visto anteriormente, , determina se uma molcula tem ou no a capacidade de se difundir no polmero. A proximidade dos valores de entre o PVA e a gua indica que existe uma grande fora de interao entre essas duas molculas, o que permite a difuso da gua no polmero. Como o valor de para a molcula de colesterol distante do valor de da gua, ento a fora de interao entre o colesterol e o PVA fraca, prejudicado a difuso do colesterol na matriz do biossensor. (R2=0,96)

140 Tabela 11.1: Parmetro de solubilidade para o PVA1, gua2 e para o colesterol.3

Substncia PVA gua Colesterol

(cal1/2/cm3/2)
19,10 23,40 9,40

375

350

Corrente (nA)

325

300

275 0 2 4 6 8 10 12

Tempo (s)
Figura 11.1: Sinal obtido pelo biossensor para uma soluo de colesterol com concentrao de 2,58 mM, a temperatura de 37 C.

141

1000 900 800 700

Y=-3,70x10 +1,41x10 c R =0,96

2

-8

-7

Corrente (nA)

600 500 400 300 200 100 0 -100 -200 -1 0 1 2 3 4 5 6

Concentrao de colesterol (mM)

Figura 11.2: Curva de calibrao do sensor para colesterol. Cada ponto representa a mdia da resposta produzida por quatro diferentes sensores.

142 11.2 Concluses parciais

Os nveis de colesterol no organismo humano, em um indivduo com dislipidemia, pode chegar a nveis de 6,20 mM.4 Desta forma, o sensor de colesterol obtido possui sensibilidade adequada para a determinao de colesterol no plasma sanguneo. O biossensor apresentou uma boa linearidade (R2=0,96) e intensidade de sinal na ordem de nA. A intensidade de sinal do biossensor obtido comparvel da literatura5,6, como tambm do biossensor comercial para glicose da marca Roche, linha Accu-Chek, testado em nosso laboratrio.

11.3 Referncias bibliogrficas

1. Pandey, L. K.; Saxena, C.; Dubey, V. Modification of poly(vinyl alcohol) membranes for pervaporative separation of benzene/cyclohexane mixtures. Journal of Membrane Science. 227, 173182, 2003. 2. HandBook of Physics and Chemistry. 63 Edition. 1982-1983. 3. King, J. W.; Friedrich, J. P. Quantitative correlations between solute molecular structure and solubility in supercritical fluids. Journal of Chromarographv. 5I7, 349458, 1990. 4. Motta, V. T. Bioqumica clnica para o laboratrio. 4 edio. Editora mdica Missau. 2003. 5. Ram, M. K.; Bertoncello, P.; Ding, H.; Paddeu, S.; Nicolini, C. Cholesterol biosensors prepared by layer-by-layer technique. Biosensors & Bioelectronics, 16, 849856, 2001. 6. Besombes, J. L.; Cosnier, S.; Labb, P., Reverdy, G. Improvement of the analytical characteristics of an enzyme electrode for free and total cholesterol via laponite clay additives. Analytica Chimica Acta. 317, 275-280, 1995.

143 CAPTULO 12 - PERSPECTIVAS FUTURAS

Como foi exposto anteriormente, o nmero de pessoas com dislipidemias grande no Brasil e no mundo. Os altos nveis de colesterol no sangue o principal fator de risco para o desenvolvimento de doena arterial coronariana. Sistemas inteligentes para o monitoramento colesterol representam um elevado potencial de crescimento mercadolgico. Os biossensores j tm sido utilizados para tal finalidade, contudo, ainda grande o nmero de pessoas que ainda no tm acesso ao monitoramento de seus nveis de colesterol, devido ao alto custo dos dispositivos atuais. Neste sentido, espera-se que o presente trabalho possa ter despertado a necessidade do desenvolvimento de biossensores em nosso pas. Porm, reconhecido que o caminho a ser percorrido ainda longo. Algumas etapas necessitam ser estudadas e analisadas

cuidadosamente quanto ao projeto de um biossensor de colesterol genuinamente nacional. Tais etapas, que no foram executadas em nosso trabalho devido ao binmio tempo x instrumentao, sero objetos de trabalhos futuros. Assim, podese dizer que as perspectivas futuras desse trabalho so: 1- Calcular os parmetros cinticos das enzimas imobilizadas e verificar a influncia do processo de imobilizao na atividade enzimtica; 2- Estudar a estabilidade e tempo de vida do biossensor; 3- Considerando-se que um biossensor envolve, alm de um eletrodo enzimtico, um sistema de aquisio de sinais em tempo real, proposto a otimizao e miniaturizao do circuito usado, bem como a elaborao de um software para digitalizao de sinais; 4- Testar o sensor incorporando a enzima glicose oxidase na matriz, criando um sistema multienzimtico para a anlise de glicose simultaneamente ao colesterol; 5- Aplicar os princpios de inteligncia artificial na aquisio e interpretao dos sinais oriundos de um biossensor

multienzimtico; 6- Avaliar as propriedades hemocompatveis do biossensor

desenvolvido com vistas obteno de biossensores implantveis.