Trabajo Prctico III CINTICA ENZIMATICA

Comisin: Frressini Gerpe Natalia; Retondo Marta Introduccin: Los estudios cinticos se llevan a cabo para determinar mecanismos de reaccin y parmetros cinticos. Se sabe que ALA-D es una enzima con cintica michaeliana, con valores de Km entre 7.7 x 10^-5 A 1.0 x 10^ -3 M. En este trabajo evaluamos en primer lugar como varia la formacin de producto en funcin del tiempo de incubacin para concentraciones de sustrato constantes. En el caso de que esto sea as, es valido obtener los valores de velocidades iniciales en funcin de un nico tiempo de incubacin. Por otro lado se estimo el Km y la velocidad mxima de la enzima, a partir del grafico de velocidades iniciales en funcin de distintas concentraciones de ALA, para esto se utiliz la linealizacin de Lineweaver-Burk. Finalmente se hallo la constante de inhibicin (Ki) del cido levulnico(inhibidor de la ALA-D de hgado de cerdo). Debido a la similitud entre ALA y el acido levulnico, este ultimo es un potente inhibidor. Objetivos: Familiarizarnos con el estudio de la cintica bsica de una enzima, conocer sus parmetros michaelianos y estudiar el efecto que ejerce un inhibidor. Metodologa: 1) Formacin de producto en funcin del tiempo: Se empleo un extracto enzimtico (alrededor de entre 0.15 y 0.25 ml), una concentracin de ALA constante de 3 Mm, 3-Me 20 Mm y buffer de incubacin hasta completar un volumen final de 1 ml, luego se incubo a 37 y en aerobiosis durante 0, 10, 20, 30, 45, 60, y 90. La reaccin se detuvo agregando 0.1 ml de solucin saturada de CuSO4 y el producto se cuantifico midiendo la absorbancia, a partir del conocimiento previo del valor de a. 2) Actividad de ALA-D en funcin de concentracin de sustrato: determinacin de Km y Vm: Se determin la formacin de producto (PGB) para distintas concentraciones de sustrato luego de 30 de incubacin. El volumen de incubacin fue de 1 ml y la concentracin de 3Me 20 Mm. Se detuvo la reaccin y el producto se cuantifico midiendo la absorbancia. 3) Estudios de inhibicin por cido levulnico: Se midi la actividad de ALA-D en presencia de 3 concentraciones distintas de inhibidor (0.75, 0.5 y 0.25 Mm) en las mismas condiciones estndar de incubacin descriptas para los estudios 1) y 2). Se detuvo la reaccin y se cuantifico el producto midiendo la absorbancia. Por ultimo se hizo un promedio con los datos de todos los grupos y a partir de esos promedios se realizaron los grficos correspondientes.

Resultados: Figura 1:
(Producto) vs tiempo
0,01 0,009 0,008 0,007 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0 0 20 40 60 80 100 tiempo (minutos) y = 1E-04x + 0,0001 R 2 = 0,9488

Grfico de concentracin de producto en funcin del tiempo Figura 2:

Grafico de inversas
0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 1/V 0,04 0,03 0,02 0,01 0 -1 -0,01 y0 = 0,0005x + 0,0015 y0,75 = 0,004x - 0,0007 y 0,5= 0,0019x + 0,0011 y 0,25= 0,0007x + 0,0038

(p) mg/ml

(I)=0 (I)=0,25 (I)=0,75 (I)=0,5

-6

9 1/(s)

14

19

Grfico de linealizacin de Lineweaver-Burk para cuatro concentraciones de inhibidor distintas

Los parmetros cinticos Km y Vm se estimaron a partir de la tendencia lineal a concentracin de inhibidor igual a cero, siendo 1/ Vm la ordenada al origen y -1/ Km el punto donde la recta corta al eje negativo de las x. Recta estimada: y= 0.0005x + 0.0015 Vm= 666.67 mM / hora Km= 0.333 mM La constante de inhibicin se calculo para las tres distintas concentraciones de inhibidor: A partir de las correspondientes linealizaciones. Siendo ahora -1/Km el punto donde la recta corta el eje negativo de las x y Km= Km (1+ (I)/Ki) de donde sale que Ki= (I)* (Km/ Km) -1^-1 Constante de inhibicin para (I)= 0.75: Km= 5.71 Ki= 0.0464 Constante de inhibicin para (I)= 0.5: Km=1.72 Ki=0.18 Constante de inhibicin para (I)= 0.25: Km=0.184 Debido a que en este caso Km es menor q Km la cuenta no tiene sentido, los resultados no dieron como se esperaba, y da un valor negativo Conclusiones: Debido a que el grafico de concentracin de producto en funcin del tiempo es lineal, a los treinta minutos de incubacin estamos en velocidades iniciales y por esto son validos los valores de Km y Vm calculados a partir de la figura 2. Adems dado que Km es mayor que Km el acido levulinico es un inhibidor competitivo del ALA-D, sin embargo esto no se puedo comprobar para la concentracin de inhibidor de 0.25, quizs por errores de medicin durante la experiencia. Debido a que para calcular la constante de inhibicin usamos el Km estimado y arrastra un error que se ve reflejado en las diferencias sobre los valores estimados de Ki. En general se observa una tendencia a un aumento de Km. Vm debera mantenerse constante, esto no se observa en el grafico ya que las ordenadas al origen no son las mismas a distintas concentraciones de inhibidor. Habra que ver si estas diferencias estn dentro del margen de error considerable o si se deben a errores experimentales.