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Javier Cmara

Qu son los enzimas?


-asa
Los enzimas son biocatalizadores, es decir, sustancias que en una reaccin qumica aumentan notablemente su velocidad. Su funcin no es hacer reacciones imposibles, sino nicamente acelerar las reacciones que espontneamente podran producirse. Las reacciones catalizadas por enzimas llegan a ser desde un milln hasta 100 millones de veces ms rpidas que la misma reaccin no catalizada.

Rendimiento de los enzimas


Enzima Velocidad en ausencia de enzima 1.3 X 10 1 2.6 X 10 5 4.3 X 10 6 3.0 X 10 9 1.0 X 10 11 1.7 X 10 -13 Velocidad de reaccin catalizada 1.0 X 106 50 4300 578 60 95 Rendimiento

Anhidrasa carbnica Corismato mutasa

Triosafosfato isomerasa

Carboxipeptidasa A AMP nucleosidasa Nucleasa estafilococal

7.7 X 106 1.9 X 106 1.0 X 109 1.9X 1011 6.0 X 1012 5.6 X 1014

Caractersticas de los enzimas


- Casi todos son protenas. Los ribozimas, son los nicos enzimas no proteicos. - Tienen elevado peso molecular. - No se consumen durante la reaccin. - Muy activos. Tpicamente, cada molcula de enzima es capaz de transformar cada segundo de 100 a 1000 molculas de sustrato en producto. El nmero de estas molculas transformadas a producto por molcula de enzima en cada segundo, se conoce como el nmero de recambio. - Actan a temperatura ambiente. - Son muy especficos.

Accin enzimtica
La sustancia sobre la que acta el enzima se llama sustrato. El sustrato se une al enzima, formando el complejo sustrato-enzima. Una vez formados los productos el enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reaccin.

S+E

S-E

P+E

Ciclo de un enzima: sacarasa

Formacin del complejo sustrato-enzima


productos

enzima

complejo sustrato-enzima

enzima

La unin se realiza en una regin concreta del enzima, llamada centro activo. El centro activo comprende (1) un sitio de unin formado por los aminocidos que estn en contacto directo con el sustrato y (2) un sitio cataltico, formado por los aminocidos directamente implicados en el mecanismo de la reaccin.

Modelos de unin sustrato-enzima


E
Complejo sustrato-enzima.

Enzima y productos

Modelo llave-cerradura: El sustrato, por su forma espacial, encaja exactamente con el centro activo del enzima.
P E
Proceso de formacin del complejo sustrato-enzima. Complejo sustrato-enzima.

Modelo Ajuste inducido (Koshland) : El sustrato y centro activo no tienen formas complementarias. Al aproximarse, uno de los dos, o ambos, cambian de forma hasta encajar exactamente.

Reaccin con dos sustratos


a) Formacin de un complejo ternario: E-S1-S2
S1 S2 S2 S2 S1 b) E E P Pueden darse dos posibilidades: a) El complejo binario se forma siempre orden. Por ejemplo, primero se forma ES2 y despus se aade el otro sustrato para formar el complejo ternario ES2S1 El complejo binario se forma al azar: unas veces se forma primero ES1 y otras el ES2 . Despus se forma ES1S2 o el ES2S1 respectivamente.

S1 E E

Complejo binario

Complejo ternario

b) Sin formacin del complejo ternario E-S1-S2 : mecanismo ping-pong

S1 + E

S1-E

P1-E

S2 P1

S2- E

P2 + E

Nomenclatura
1.- A los primeros enzimas que se descubrieron se les dio un nombre propio. Este nombre, los relacionaba, o no, con la procedencia anatmica donde fueron descubiertos: ptialina de la saliva, tripsina pancretica, rubisco... 2.- El primer intento de sistematizar la nomenclatura, fue utilizar un nombre con dos partes. La primera parte es el nombre del sustrato especfico o general sobre el que actan y la segunda parte es la terminacin asa: ureasa, lipasa, proteasa... 3.- Al descubrirse que un mismo enzima puede realizar catalizar distintas reacciones, se ampli el nombre, aadiendo la funcin que realiza antes de la terminacin asa, por ejemplo Isoctrico descarboxilasa. Al enzima rubisco, se le denomina ribulosa difosfato carboxilasa o bien ribulosa difosfato oxidasa, segn la reaccin que catalice. 4.- Un nuevo avance el nomenclatura se logra dando informacin complementaria, al indicar el coenzima que utiliza: malato NAD+ oxidoreductasa. 5.- La sistematizacin completa del nombre, se hace, nombrando a los enzimas con un numero clave (E.C.) que caracteriza al tipo de reaccin segn la clase (primer digito), subclase (segundo digito) y subsubclase (tercer digito). El cuarto digito es para lel enzima especifico. Asi, en la E.C. 2.7.1.1: el 2 indica que se trata de una transferasa, el 7 indica que transfiere fosfato, el primer 1 que el alcohol es el aceptor del fosfato y el ltimo 1 indica que es una hexoquinasa o ATPasa. Tambin se le denomina D-hexosa-6-fosforotransferasa, enzima que cataliza la transferencia de fosfato desde el ATP al grupo hidroxilo de carbono 6 de la glucosa.

Tipos de enzimas
Segn su composicin se pueden clasificar en tres grupos: 1.- Ribozimas: compuestos por pequeas molculas de ARN, que tienen actividad cataltica. 2.- Enzimas simples o estrictamente proteicos: son aquellos que estn compuestos exclusivamente por aminocidos. 3.- Enzimas complejos u holoenzimas: son los compuestos por una parte proteica (Apoenzima) y un grupo prosttico, parte no formada por aminocidos, (Cofactor).

HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR

Si es inorgnica se le denomina activador inorgnico. Ej. Mg2+ es necesario para las quinasas. El Zn2+ para las carboxipeptidasas... Si es una molcula orgnica se les denomina COENZIMA

La biotina o vit b8 es coenzima de los enzimas que transfieren CO2

Coenzimas
Son cofactores orgnicos que quedan modificados en la reaccin ya que actan de transportadores de grupos qumicos. Al ser modificados suelen actuar de coenzimas para otros enzimas. En esta segunda reaccin se regeneran y pueden actuar de nuevo de coenzimas para la primera enzima. No suelen ser especficos, suelen unirse a distintos apoenzimas. Las uniones son con enlaces dbiles. Coenzima A: Es un ejemplo de coenzima de transferencia. El CoA tranporta grupos acetil (-CO-CH3)

NAD+ y NADH

FAD+

Si en 1 y 5 se unen H tendremos el FADH2 El NADH2 y el FADH2 y sus formas oxidadas NAD+ y FAD+ son coenzimas de oxido-reduccin. (transportan H+ y e-)

Clasificacin de los enzimas


Clase 1: Oxidorreductasas Clase 2: Transferasas Clase 3: Hidrolasas Clase 4: Liasas Clase 5: Isomerasas Clase 6: Sintetasas

Clase 1: Oxidorreductasas
Catalizan reacciones de oxidorreduccin, es decir, transferencia de hidrgeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro. Segn el sustrato sobre el que actan o los coenzimas utilizados se diferencian 97 subclases diferentes. De ellas las dos ms importantes son: Oxidasas: transfieren slo electrones Deshidrogenasas: transfieren H utilizando coenzimas.

e-

e-

reducido

oxidado

CH3

CH COOH OH
c. lctico

NAD+

e-

e-

oxidado

reducido

CH3

C O

COOH
c. pirvico

NADH+H+

Clase 2: Transferasas
Catalizan la transferencia de un grupo qumico, distinto del hidrgeno, de un sustrato a otro. Hay 9 subclases.

Glucosa

Glucoquinasa

Glucosa 6 fosfato

Pi

Pi

Pi ATP

Pi

Pi ADP

Clase 3: Hidrolasas
Rompen enlaces con la adicin de una molcula de agua. El enzima tambin rompe la molcula de agua, introduciendo el OH en un lado del enlace y el H al otro lado. Hay 13 subclases. OH + H H2O

Maltasa

H2O

Clase 4: Liasas
Rompen enlaces sin la adicin de una molcula de agua. Hay 99 subclases. Generalmente: crean dobles enlace + o rompen dobles enlaces.

Acetacetato descarboxilasa

+
cido acetoactico Acetona CO2

Clase 5: Isomerasas
Catalizan el cambio de posicin de un grupo qumico de una parte a otra del sustrato. Hay 99 Subclases.

Fosfoglicerato mutasa

cido 3 fosfoglicrico

cido 2 fosfoglicrico

Clase 6: Ligasas o sintetasas


Catalizan la unin de molculas o grupos moleculares, con la energa aportada por la desfosforilacin del ATP. Hay 5 subclases.

+
ATP ADP + Pi

ATP ADP + Pi
+

Pptido sintetasa
Glicina c. Glutmico Dipptido

Especificidad absoluta
El enzima slo reconoce a un sustrato.

Fumarato hidrolasa Especfica para el ismero trans- del fumrico y da el producto en su forma isomerica L-

Especificidad de grupo
Actan sobre el mismo grupo qumico de molculas. Por ejemplo, la -glucosidasa reconoce cualquier glcido pero no a los .

fructosa

fructosa

glucosa

glucosa

Especificidad de clase
Actan sobre el mismo tipo de enlace.

Por ejemplo las carboxilesterasas hidrolizan todo tipo de steres, independientemente de la naturaleza de R o R

carboxilesterasas

Ester

cido

Alcohol

Mecanismo de accin I
Segn la teora de las colisiones para que una reaccin qumica se produzca, debe ocurrir simultneamente: Que las molculas reaccionantes colisionen de forma eficaz, es decir, que se encuentren con una orientacin ptima Que choquen con energa suficiente. A esta energa se le denomina energa de activacin.
Con una de las dos condiciones, ejemplo: No eficaz y energa de activacin adecuada Choque

No hay reaccin

Eficaz y energa de activacin adecuada

Hay reaccin

Mecanismo de accin II
Por qu los enzimas aceleran las reacciones qumicas?
Los catalizadores cambian la energa de activacin de una determinada reaccin, y por tanto incrementan la velocidad de reaccin. Reaccin exotrmica
Energa libre de Gibbs
Complejo activado

Reaccin no catalizada Reaccin catalizada


Energa libre de Gibbs

Reaccin endotrmica
Complejo activado

Energa de activacin

Energa de activacin
E.A Productos

E.A Reactivos

H<0
Productos Reactivos

H>0

Transcurso de la reaccin

Transcurso de la reaccin

Cintica enzimtica
Estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.

[ ]

d[ ] v= dt

s t

Si representamos la aparicin de producto, o la desaparicin del sustrato, en funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de velocidad de la reaccin, o simplemente, la cintica de la reaccin.

Modelo de Michaelis-Menten
En 1913 Leonor Michaelis y Maude Menten postulatron la teora general de la accin enzimtica, basada en la formacin del complejo SE.

1.-Deducciones de M-M
Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacin del producto, liberando el enzima libre
K1 K2 K3

S+E

SE

E+P

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinticas individuales de cada proceso y tambin reciben el nombre de constantes microscpicas de velocidad. Segn esto, podemos afirmar que:

v1 = k1 [S][E]

v2 = k2 [SE]

v3 = k3 [SE]

Dado que concentracin total de enzima, [ET] es constante a lo largo de la reaccin y que presenta dos formas: el enzima libre (E) y el enzima unido al sustrato (ES), se puede decir que: [ET] = [E] + [SE] O lo que es lo mismo [E] = [ET] - [SE]

Sustituyendo en la primera ecuacin, la transformamos en la siguiente:

v1 = k1[S] [ET] - k1 [S] [SE]

2.-Deducciones de M-M
De la reaccin:

S + E

K1 K2

SE

K3

E + P

deducimos que la velocidad de formacin del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociacin (v2+ v3), por tanto: v1 = v2 + v3 O lo que lo mismo: k1[S] [ET] - k1 [S] [SE] = k2 [SE] + k3 [SE] [Et][S] (k2+k3)/k1 + [S] [Et][S] Km + [S]

Despejando [SE], queda que:


[SE] =

Si todas las constantes las agrupamos en una: Km = (k2 +k3) / k1 queda:

[SE] =

A la constante KM se le denomina constante de Michaelis-Menten.

3.-Deducciones de M-M
De la reaccin:

S + E

K1 K2

SE

K3

E + P
v = v3 = k3 [SE]

Deducimos que la velocidad de formacin del producto es: Sustituyendo [SE] por su valor v= k3 [Et][S] Km + [S]

Si definimos un nuevo concepto, velocidad mxima como Vmax= k3 [Et] tendremos: V= Vmax[S] Km + [S] Que es la ecuacin de velocidad que explica el comportamiento cintico de los enzimas

Grfica de Michaelis-Menten
v vmax
La representacin grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten, velocidad frente a [S], es una hiprbola La velocidad mxima se logra cuando todos los centros activos estn ocupados Cunto vale la [S] cuando la velocidad es la mitad de la mxima? Vmax/2 = Vmax[S] Km + [S]

Simplificando [S] Km + [S]

1/2 =

vmax 2

Es decir [S] + km = 2 [S]

?
[S] =Km

[s]

despejando Km = [S]

Significado de Km
Km es la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. El valor de Km da idea de la afinidad del enzima por el sustrato. A menor Km, mayor afinidad del enzima por el sustrato. Este hecho tiene fcil explicacin si tenemos en cuenta que Km se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reaccin 1 lo forma. As, si Km es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si Km es pequea, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato). La Km del sustrato natural es menor que la de los sustratos anlogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta Km, el que presente mayor Km tiene menor afinidad por el enzima, y la reaccin transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor Km, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la V = Vmax. Los valores de Km de muchos enzimas son prximos a los de la concentracin fisiolgica de sus sustratos, de forma que pequeas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metablica.

Clculo de Km y de Vmax
Para determinar grficamente los valores de KM y Vmax es ms sencillo utilizar la representacin doble recproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una lnea recta. Esta representacin doble recproca recibe el nombre de representacin Es una recta en la cual: Pendiente= KM / Vmax 1/Vmax
La pendiente es KM/Vmax La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular grficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

1/V

de Lineweaver-Burk.

-1/Km

1/[S]

Si -2=-1/Km Si 3=1/vmax

Km=1/2 Vmax=1/3

Unidades de la velocidad de reaccin


Se define la unidad de actividad enzimtica (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. (1 mol/min). El Sistema Internacional de unidades (SI) define la unidad de actividad enzimtica como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 moles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal = 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submltiplos como el microkatal (kat = 10-6 kat) o el nanokatal (nkat = 10-9 kat).

Regulacin de las reacciones enzimticas


La actividad de los enzimas puede regularse por: 1.- Expresin gnica. 2.- Efecto del pH. 3.- Efecto de la temperatura. 4.- Presencia de inhibidores. 5.- Modulacin alostrica. 6.- Modulacin por proteolisis. 7.- Modulacin isoenzimas.

Regulacin por expresin gnica


Las clulas controlan que los genes que codifican enzimas, se expresen, es decir que se lean, formando el ARN m que permitir la posterior sntesis del enzima, o que no se expresen, es decir que no se forme el ARN m y por tanto se impide la sntesis del enzima. ARN m ADN

Sntesis del enzima Expresin gnica = Sntesis de ARN m Si se expresa el gen que codifica el enzima, se dice que hay induccin enzimtica. Si no se expresa el gen que codifica el enzima, se dice que hay represin enzimtica.

Regulacin por efecto del

pH

Los enzimas, en las cadenas laterales de sus aminocidos, poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.). Segn el pH del medio estos grupos se ionizan de forma distinta, pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra. Como la forma espacial de las protenas depende, en parte, de las cargas elctricas de sus restos, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica. Este es el llamado pH ptimo. V Enzima
Pepsina Ureasa Catalasa Tripsina Fumarasa Arginasa

pH ptimo
1,5 6,8 7,6 7,7 7,8 9,7

100%

Si cambia el pH del medio, cambia la forma espacial del enzima y esto cambia la velocidad de la reaccin.

50%

10

11 12

pH

Regulacin por temperatura


En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima. V 100%
Ts de desnaturalizacin.

50%

-10

10

20

30

(T optima).

40

50

T C

Regulacin por inhibidores


Los inhibidores son substancias que se unen al enzima disminuyendo o anulando su actividad. Hay dos tipos: 1.- Inhibicin irreversible: El inhibidor se fija permanentemente, por medio de enlaces covalentes, al lugar activo de la enzima, o lo desnaturaliza impidiendo su actividad. Por ejemplo, los llamados gases nerviosos actan sobre los enzimas que participan en la transmisin del impulso nervioso, de forma que este proceso no puede tener lugar, producindose parlisis o muerte. 2.- Inhibicin reversible: El inhibidor se fija temporalmente, por medio de enlaces dbiles, al enzima dificultando su accin. Pueden ser de tres tipos: Inhibidores competitivos, no competitivos y acompetitivos

Inhibicin competitiva
Ocurre cuando el inhibidor se une al centro activo, compitiendo con el sustrato. y

1/V

Con inhibidor
Sin inhibidor Pendiente= KM / Vmax

v vmax
Sin inhibidor

1/Vmax

Con inhibidor Aumenta Km No cambia Vmax

-1/Km

1/[S]

Km-I

Km+I

[s]

Inhibicin no competitiva
Ocurre cuando el inhibidor se une a un sitio del enzima distinto del centro activo: no compite con el sustrato. Pero modifica la configuracin del enzima retrasando la unin con el sustrato. 1/V Con inhibidor
Sin inhibidor Pendiente= KM / Vmax 1/Vmax

v vmax
Sin inhibidor

Con inhibidor No cambia Km Disminuye Vmax

-1/Km

1/[S]

Km-I

Km+I

[s]

Inhibicin acompetitiva
Ocurre cuando el inhibidor se une al complejo sustrato-enzima, retrasando la liberacin del producto.

Complejo sustrato-enzima

1/V

Con inhibidor
Sin inhibidor Pendiente= KM / Vmax

v vmax
Sin inhibidor

1/Vmax

Con inhibidor Disminuye Km Disminuye Vmax

-1/Km

1/[S]

Km-I Km+I

[s]

Modulacin alostrica I
El trmino alostrico significa otro sitio y tambin otra forma. Los enzimas alostricos son aquellos, que presentan dos sitios y dos formas. Los sitios son lugares donde se pueden unir sustancias. Uno es el centro activo, al que puede unirse el sustrato y otra el centro regulador, al que puede unirse, de forma reversible, otra sustancia llamada ligando. Las formas son dos conformaciones espaciales, que estn en equilibrio qumico. Una es la tensa, en la que sustrato no se puede unir, forma inactiva y la otra es la relajada, en la que el sustrato se puede unir. Forma tensa
Centro activo sin afinidad al sustrato

Forma relajada
Centro activo con afinidad al sustrato Centro regulador

Centro regulador

Si el ligando y el sustrato son substancias distintas, al enzima alostrico se le llama herotrpico, en caso contrario, es decir, si son la misma sustancia, se denominan homotrpico.

Modulacin alostrica II
El equilibrio puede romperse cuando se une el ligando al centro regulador, dando estabilidad a la forma a la que se una. Si la unin siempre estabiliza la forma relajada al ligando se le denomina efector alostrico. Si la unin siempre estabiliza la forma tensa al ligando se le denomina inhibidor alostrico.
Forma tensa estabilizada Forma tensa Forma relajada Forma relajada estabilizada

Inhibidor alostrico

Efector alostrico

Ambas posibilidades permiten explicar dos tipos de regulacin de una va metablica: Retroihibin o feed back: cuando el producto final, es el inhibidor alostrico del primer enzima de la va. S E1 A E2 B E3 Producto final Induccin enzimtica: cuando el sustrato inicial, es el efector alostrico del primer enzima de la va. S E1 A E2 B E3 Producto final

Inhibidor alostrico

Efector alostrico

Modulacin alostrica III


Los enzimas alostricos, suelen estar formados por varias subunidades o protmeros. En cada una de ellas se diferencia un centro activo y un centro regulador. En estos enzimas, si se une el ligando a una subunidad se produce una transmisin alostrica, por la cual todas las subunidades quedan estabilizadas, es decir que siguen la ley del todo o nada. A este efecto se le denomina cooperativismo.
Sustrato

Ligando

El cooperativismo hace que los enzimas alostricos no sigan exactamente la ecuacin de Michaelis-Menten. Se dice que su cintica es no Michaeliana. La grfica velocidad frente a [S] no es una hiprbola, sino una sigmoide. En la cintica sigmoidea, pequeas variaciones en la [S] en una zona crtica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reaccin.

Variacin V

V/2

KM Variacin S

[S]

Modulacin por proteolisis


Existen enzimas que tienen un mecanismo rpido de regulacin pasando de la forma activa a la inactiva por la rotura reversible o irreversible de enlaces covalentes. Un ejemplo de modificacin covalente reversible es la unin de un grupo fosfato a un OH de un residuo de aminocido de la molcula de enzima que permite la transformacin de una forma en otra. ADP ATP Quinasa O-H
Forma inactiva

Un ejemplo de modificacin covalente irreversible es la transformacin de zimgenos en enzimas activas. En esto enzimas se elimina parte de la cadena proteica y, como consecuencia, la nueva estructura permite la formacin del centro activo en la molcula. Esto ocurre en la transformacin de pepsingeno, tripsingeno o quimiotripsingeno en enzimas proteolticas activas.
Se pierden 6 aminocidos de un extremo Extremo ms corto

O-Pi
Forma activa

Fosfatasa Pi

Tripsingeno: inactivo

Tripsina: activa

Modulacin isoenzimas
Se llaman isozimas o isoenzimas a los enzimas que catalizan la misma reaccin pero que pueden distinguirse por alguna caracterstica fsica, estructural, inmunolgica, etc. Su origen es gentico. Las diferencias que presentan, se traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de forma que cada isozima se adapta perfectamente a la funcin que debe realizar. Se diferencian isoenzimas en funcin de: - el tipo de tejido: Por ejemplo, la Hexokinasa, presenta, al menos, cuatro formas distintas: - Heptica - Cerebral - Muscular - Eritrocitaria - el compartimento celular donde acta: Por ejemplo, la malato deshidrogenasa del citoplasma es distinta de la de la mitocondria. - el momento concreto del desarrollo del individuo: Por ejemplo, algunos enzimas de la glicolisis del feto son diferentes de los mismos enzimas en el adulto.