UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DECANATO

PROYECTO DE TESIS
TÍTULO : “Efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones
del extracto metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya)
sobre Leishmania braziliensis – peruviana”

AUTOR (es) : Rómulo Aycachi Inga

Juan José Augusto Moyano Muñoz

PATROCINADOR : Mblga. M. Teresa Silva García

APROBADO POR :

PRESIDENTE DEL JURADO MIEMBRO SECRETARIO

MIEMBRO VOCAL JEFE CENTRO INVESTIGACIÓN

JEFE DEPARTAMENTO DECANO

Lambayeque, 22 de abril de 2008.

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGIAS
DECANATO

1
 I. GENERALIDADES:

1. TÍTULO: “Efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones del extracto

metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre Leishmania braziliensis –
peruviana”

2. PERSONAL INVESTIGADOR:

2.1. Autores: Est. Rómulo Aycachi Inga

Est. Juan José A. Moyano Muñoz

2.2. Patrocinador: Mblga. M. Teresa Silva García

3. CARRERA PROFESIONAL/ESPECIALIDAD:

• Carrera Profesional de Biología

• Especialidad de Microbiología y Parasitología

4. TIPO DE INVESTIGACIÓN:
4.1. De acuerdo al fin que persigue : Aplicada

4.2. De acuerdo a la técnica de contrastación: Explicativa

5. RÉGIMEN DE INVESTIGACIÓN: Libre

6. LUGAR DE EJECUCIÓN: Laboratorio de Microbiología y Parasitología

U.N.P.R.G. – Lambayeque.

7. DURACIÓN ESTIMADA: 7 meses

8. FECHAS DE INICIO Y TERMINACIÓN:

8.1. Inicio : 22 de enero de 2008.

8.2. Terminación : 30 de setiembre de 2008.

9. CRONOGRAMA DE TRABAJO:

2008
ACTIVIDADES
E F M A My J Jl A S
FASE DE PLANEAMIENTO

2
 Revisión Bibliográfica X X
Elaboración del proyecto X X
Aprobación del proyecto X
Implementación del proyecto X X
FASE DE EJECUCION
Recolección de muestras X X
Procesamiento de muestras X X
Registro de datos X X
Análisis estadístico de datos X X
FASE DE COMUNICACIÓN
Análisis e interpretación X X
Elaboración del informe final X X
Presentación del informe final X

10. RECURSOS DISPONIBLES:

10.1.Personal:

• Personal docente y administrativo de la Facultad de Ciencias

Biológicas U.N.P.R.G. – Lambayeque.
• Personal de servicio técnico del Laboratorio de Microbiología y
Parasitología U.N.P.R.G. – Lambayeque.

10.2.Equipos e Instrumentos:

EQUIPOS MARCA
Autoclave Vertical Mod. 415 FANEM
Estufa THELLO PRECISION
Horno THELLO PRECISION
Refrigeradora FAEDA
Balanza Digital EXCELL
Centrífuga MANN
Hornilla Eléctrica SURGE
Microscopio binocular ZEISS PRIMO STAR
Pipeta Automática 10 - 100 µL BRAND
Computadora de Escritorio TOSHIBA
Cámara Digital CANON

MATERIALES MARCA
Placas de Petri PIREX
Tubos de ensayo tapa rosca PIREX
Matraz Erlenmeyer PIREX
Balones PIREX
Pipetas de 1 mL y 10 mL PIREX
Embudo PIREX
Viales PIREX
Láminas WHELL BRAND
Laminillas WHELL BRAND

10.3.Materiales y Reactivos:

3
 MATERIAL MARCA
Medio Novy McNeal Nicolle MERCK
Solución Salina Fisiológica LUSA
Penicilina LAB. MEDROCK
Streptomicina LAB. MEDROCK
Lidocaína SHERFARMA
Metanol comercial (CH3OHCl) MERCK
Alcohol de 70º LAB. C y R AKY
Colorante de Giemsa MERCK
Aceite de Cedro MERCK
Agua Oxigenada LAB. ALKOFARMA
Agujas hipodérmicas descartables Nº 21
TERUMO
y 25.
Jeringas descartables de 1, 5 y 10 mL TERUMO
Cámara de Neubauer MARIENFELD
Lanceta TERUMO
Algodón CKF INDUSTRIAL
Pinzas
Papel Watman Nº 3
Gotero
Soporte de Tinción

10.4.Local:

• Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas.

11. PRESUPUESTO:

Bienes ……………………………………… ……………. S/. 950. 00

Material de escritorio ……………… ……………. S/. 100. 00
- 1 millar de papel Bond
- 25 unid. de fólderes Manila
- 4 lapiceros, 2 plumones indelebles, 2
correctores, 2 resaltadores, 2
borradores

Material de laboratorio …………….. ……………. S/. 600. 00

- 50 unid. Tubos de ensayo tapa rosca
- 3 matraces, 3 fiolas
- 1 caja de láminas porta y cubre
objetos
- 1 lb. de agar agar
- 5 lb. De medio NNN
- Penicilina
- Streptomicina
- Lidocaína

4
 Material para procesamiento de datos ……………. S/. 250. 00
- 1 memoria USB Kingstong 1 GB
- 01 caja de CD Room Princo
- 02 cartuchos tinta para impresora
Canon iP1800

Servicios …………………………………... ……………. S/. 1500. 00

Pasajes y Subvenciones …………………. ……………. S/. 500. 00
- 1 viaje a Trujillo, 06 días
- Viajes internos: Lambayeque –
Chiclayo – Distritos (Inkahuasi, Salas)

Publicaciones ……………………………... ……………. S/. 200. 00

- Publicación de información final, 08
ejemplares

Pruebas Moleculares ………………………. ……………. S/. 600. 00

- Identificación de sp. por PCR

Otros ……………………………………….. ……………. S/. 200. 00

- Procesado de fotografías y
Diapositivas
- Imprevistos

TOTAL ……………. S/. 2450. 00

12. FINANCIACIÓN:

• Será financiado por los responsables del trabajo de investigación.

II. PLAN DE INVESTIGACIÓN:

1. REALIDAD PROBLEMÁTICA:

Leishmania braziliensis – peruviana es un protozoario dimórfico,

hemoflagelado, perteneciente a la familia Trypanosomatidae (orden
Kinetoplastida), que junto con otras 20 especies en el mundo, son

5
causantes de la enfermedad conocida como “Leishmaniosis” (Borda et. al.,
2005; Arévalo et. al 2005). Ésta es una enfermedad crónica, de baja
patogenicidad, alta morbilidad, metaxénica y zoonótica que se caracteriza
por comprometer piel, mucosas y vísceras dependiendo de la especie de
Leishmania causante y de la respuesta inmune del huésped. Esta
protozoosis es transmitida por la picadura de un insecto flebotomino hembra
del género Phlebotomus, en Europa, Asia y África, y Lutzomyia en América.
La afinidad de este protozoario por los tejidos hace que se manifieste una
reacción inflamatoria característica (Sánchez et. al. 2004).
La leishmaniosis cutánea y mucocutánea es una enfermedad de alta
prevalencia en muchas áreas tropicales y subtropicales del mundo. Descrita
en 24 países de América, extendiéndose del sur de los Estados Unidos
(Texas) hasta el norte de Argentina. Esta enfermedad constituye un grave
problema de salud pública por los altos costos que representa a nivel
psicológico, socio-cultural y económico y es considerada, conjuntamente
con la malaria, esquistosomiosis, filariosis, tripanosomiosis y hanseniosis,
como una de las seis enfermedades tropicales de mayor importancia en el
mundo (Ampuero, 2000; OPS, 1996).
En el Perú la leishmaniosis constituye la segunda endemia de tipo
tropical y es la tercera causa de morbilidad por enfermedades transmisibles
luego de la Malaria y Tuberculosis, teniendo como zona endémica
aproximadamente el 74% del área total del país, extendiéndose a través de
los Andes y los valles interandinos para la leishmaniosis cutánea y a las
zonas de selva alta y selva baja en la leishmaniosis mucocutánea (MINSA,
2006; Ampuero, 2000).
Además de los problemas en si de la enfermedad, están también los
problemas del tratamiento actual, por los efectos secundarios causados por
los medicamentos utilizados en el tratamiento. Los antimoniales
pentavalentes usados en el tratamiento de la leishmaniosis cutánea
andina (Uta) y como primer tratamiento de la leishmaniosis mucocutánea
(Espundia) a dosis elevadas y/o prolongadas puede causar náuseas,
vómitos, prurito, fiebre, cefalea, mareos, insomnio, nerviosismo, shock
pirogénico, edema y herpes zóster. Es también muy conocida su alta
cardiotoxicidad y, a veces, acompañada de nefrotoxicidad. La anfotericina
B, usado en caso de falla consecutiva del tratamiento con antimoniales en
la leishmaniosis mucocutánea y en los casos de compromiso mucoso
severo, es muy conocido por sus efectos colaterales, siendo los más graves
la aparición de shock anafiláctico, arritmias cardíacas, falla hepática,
mialgias y convulsiones (Rojas, et. al. 2005, MINSA 2006). Se conoce
además, que muchos pobladores usan para su tratamiento, ya sea por su
desconocimiento u otro motivo, todo tipo de agentes corrosivos, estando
entra los más extremos el uso de polvo de pilas, ácido de baterías, petróleo
y aceite quemado.

2. PROBLEMA:

¿Tendrá efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones el

extracto metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre el crecimiento de
Leishmania braziliensis – peruviana?

6
3. HIPÓTESIS:

“El extracto metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) tiene efecto

inhibitorio in Vitro sobre el crecimiento de Leishmania braziliensis –
peruviana”.

4. JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA:

La leishmaniosis cutánea y mucocutánea es una enfermedad de alta

prevalencia en muchas áreas tropicales y subtropicales del mundo y es la
segunda endemia de tipo tropical en el Perú (74% del territorio nacional),
razones que la convierten en una entidad de gran interés nacional
(Ampuero, 2000). Es una enfermedad en la cual quedan aún muchas
interrogantes por resolver. No existe vacuna y para su tratamiento se usan
aún terapias de principios de siglo que consisten en saturar al cuerpo con
inyecciones de antimonio. Además, por las características geográficas de la
enfermedad (selvas y valles interandinos) está mas difundida en gente de
bajos recursos económicos, en la que además de mermar su salud y
economía, también causa indirectamente problemas psicológicos (baja
autoestima) por las deformaciones que genera.
La medicina tradicional o alternativa usa desde hace mucho tiempo
diversos tipos de plantas para el tratamiento de una gran variedad de
enfermedades. Para el tratamiento de Leishmaniosis por estos métodos, se
usan por ejemplo, de acuerdo a la zona, plantas tan diversas como maíz,
eucalipto, sábila, llantén, malva, matico, taya y muchos otros (Rojas et. al.,
2005).
La “Taya” (Caesalpinia spinosa (Mol.) O. Kuntz), también conocida
como “Tara”, es una leguminosa muy utilizada para estos fines, sobre todo
en los departamentos de Amazonas, Cajamarca y San Martín (Basurto,
2003; Llatas, 2005). Esta planta muy utilizada en la actualidad en la
industria por sus altas concentraciones de tanino y ácido gálico, es conocida
además por su alto poder astringente por coagular las albúminas de las
mucosas y de los tejidos, creando una capa aislante y protectora que
reduce la irritación y el dolor; por tal motivo son usados externamente para
detener pequeñas hemorragias locales; en inflamaciones de la cavidad
bucal, catarros, bronquitis, quemaduras, hemorroides, e internamente
contra la diarrea, enfriamiento intestinal, afecciones vesiculares, y como
contraveneno en caso de intoxicación por alcaloides vegetales. (De La
Cruz, 2004; Quispe, 2006). Otras sustancias presentes en esta planta son el
ácido galotánico, pirocatecol, pirogalol, elágicos e hidrocoloides, también de
mucha importancia (López et.al. 1998).
Además, el uso de medicamentos de origen químico para el
tratamiento de enfermedades como la Leishmaniosis ha demostrado un
efecto cada vez más común, la “saturación farmacológica”, sobre todo en
niños y personas de avanzada edad, que llegan a causar, en la mayor parte
de los casos, efectos secundarios graves. Gran cantidad de científicos han
encontrado en el uso terapéutico de flores, raíces, hojas y frutos de las
plantas un valioso aliado, ya que ayudan, de forma contundente, a combatir
todo tipo de trastornos sin que, por ello, aporten ningún tipo de
contraindicación o efecto nocivo para la salud, además de ser un

7
 tratamiento económico y de fácil acceso, sobre todo para la población de
bajos recursos. (Innatia, 2007).

5. OBJETIVOS:

- Aislar e identificar Leishmania braziliensis – peruviana de muestras

clínicas.
- Determinar el efecto inhibitorio del extracto metanólico de C. espinosa
(taya) sobre L. braziliensis – peruviana.
- Determinar la concentración mínima inhibitoria del extracto metanólico
de C. espinosa (taya) sobre L. braziliensis – peruviana.

6. ANTECEDENTES:

La leishmaniosis cutánea y mucocutánea es una enfermedad de alta

prevalencia en muchas áreas tropicales y subtropicales del mundo. En el Perú
constituye la segunda endemia de tipo tropical y la tercera causa de morbilidad
por enfermedades transmisibles, luego de la malaria y al tuberculosis, teniendo
como zona endémica aproximadamente el 74% del total del área del país
(Ampuero, 2000; OPS, 1996; Torres y Barroeta, 1996).
Se usan diferentes esquemas terapéuticos contra las diversas formas
clínicas de leishmaniosis. Aunque muchas investigaciones coinciden en
considerar a los antimoniales pentavalentes como las drogas más efectivas, se
usan además otros medicamentos como: anfotericina B, licochalcone A,
miconazol, isoniazida, dapsona, rifampicina, trimetoprim, sulfametoxazol e
interferón gamma (Pérez et. al. 2005). Estos tratamientos presenta tres
dificultades fundamentales: 1. escases y alto costo de las drogas; 2. elevada
toxicidad y 3. grandes diferencias en la respuesta individual, dependiendo de la
especie de parásito involucrado y sobre todo del estado inmunológico del
hospedador. (Torres y Barroeda, 1996; Muñoz y Pareja, 2003, Monzote et. al.
2004).
Muñoz y Pareja. 2004, reportaron que en la actualidad en el Perú,
pobladores de la sierra y tribus selváticas como los Ashaninkas utilizan plantas
con propiedades curativas contra la leishmaniasis, siendo de gran interés el
valor de éstas como fuentes de agentes medicinales debido a sus
constituyentes químicos , específicamente los metabolitos secundarios. Entre
las plantas reportadas están el tahuarí (Tabebuia serratifolia), piñón (Jatropa
curcas), ojé (Ficus insipida), barbasco (Lonchocarpus nicou), cedro (Cederla
fissilis) y mito (Carica candicans).
Delorenzi et. al. en Monzote et. al. (2004) reportaron el efecto de un
extracto de Pescheria australis frente a promastigotes de L. braziliensis en el
cual obtuvieron un 30% de inhibición del crecimiento al incubar los parásitos
con 100 µg/mL, sin embargo, al purificar el alcaloide indólico coronaridina
obtuvieron un 97% de inhibición del crecimiento de los promastigotes a una
concentración de 12.5 µg/mL.
La maca, Lepidium peruvianum, es una Brassicaceae de los andes
peruanos en la cual se ha determinado la presencia de alcaloides imidazólicos,
benzil glocosinolatos, taninos, flavonoides y saponinas, compuestos, todos
ellos, muy activos frente a Leishmania y a trofozoitos de Giardia intestinales. El

8
efecto leishmanicida podría deberse a la presencia de isotiocianatos
biológicamente activos: benzil-isotiocianato y p-metoxibenzil isotiocianato (Li et.
al. 2001); además se ha demostrado que las concentraciones de dichos
compuestos contenidos el L. peruvianum difieren entre ecotipos y serían las
causas de las diferencias en el efecto leishmanicida (Alzadora et. al 2007).
La tara, Caesalpinia espinosa, es un árbol de hasta 5 m de alto cuyo
hábitat abarca desde Venezuela hasta Bolivia. En el Perú, desarrolla en forma
silvestre o cultivada, en las lomas costeras y en los valles interandinos, entre
1,000 y 3,100 msnm. De esta Caesalpinaceae se obtiene el polvo de tara que
contiene un gran porcentaje de taninos y además ácido tánico, ácido gálico y
ácido galotánico. Los taninos son sustancias que se producen en diversas
partes de la planta, como son: corteza, frutos, hojas, raíces y semillas (Unten
en Bazurto, 2006).
Los taninos tiene la propiedad de formar complejos con macromoléculas,
particularmente con las proteínas; así forman enlaces colocándose entre las
fibras de colágeno de la piel, empleándolos en medicina en tratamientos de
escoriaciones y quemaduras de la piel donde las proteínas forman una capa
protectora antiséptica bajo la cual se regeneran los tejidos, además los
preparados a base de drogas ricas en taninos, como las decocciones, se
emplean para detener pequeñas hemorragias locales; en inflamaciones de la
cavidad bucal, catarros, bronquitis, hemorroides y otros (Siccha en Bazurto,
2006).

7. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:

7.1. Material:

- Una cepa de L. braziliensis – peruviana identificada mediante Pruebas

Moleculares identificadas en el Laboratorio del Instituto de Biología
Molecular de la F. CC. BB. – U.N.P.R.G. – Lambayeque.
- Las vainas y hojas de C. espinosa (Taya) serán recolectadas en la
comunidad de Chiribamba, distrito de Huambos (Región Cajamarca).
- En el laboratorio se procederá a seleccionar las mejores hojas y frutos,
quedando aptos para su procesamiento.

7.2. Métodos:

7.2.1.Población y Muestra de Estudio:

La población objeto de estudio estará representada por cepas

de L. braziliensis – peruviana.
La muestra estará constituida por una cepa de L. braziliensis –
peruviana enfrentada a cinco concentraciones de extracto metanólico
de C. espinosa (Taya) (50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL) y tres tipos
de extracto (de hoja, semilla y hoja + semilla); haciendo un total de
15.

7.2.2.Técnica e Instrumentos de Recolección de Datos:

 Identificación del Parásito (Ampuero, 2000):

9
- Para identificar Leishmania braziliensis – peruviana se
realizarán los siguientes pasos:

o Observación Directa por Frotis de la Lesión: en la cual se

confirmará la presencia del parásito.

Obtención de la muestra:
1. Lavar la lesión con agua y jabón
2. Desinfectar con alcohol al 70% los bordes de la lesión.
3. Presionar con firmeza los bordes de la lesión hasta que
empalidezca; en el borde interno, hacer una pequeña
incisión con hoja de bisturí tratando de levantar la piel, secar
la sangre con gasa y raspar el tejido.
4. Con el material obtenido en la hoja de bisturí, hacer el
frotis en una lámina, procurando que este sea delgado y
evitando pasar dos veces por el mismo sitio.
5. Rotular la lámina y dejar secar al medio ambiente.

Procesamiento de la muestra:
1. Fijar la lámina que contiene el frotis con alcohol metílico
durante 3 minutos. Descartar el alcohol y dejar secar a
temperatura ambiente.
2. Cubrir la lámina con solución de trabajo Giemsa (una gota
de solución Giemsa stock por cada mL de solución buffer pH
7,2 – 7,4) por 30 minutos.
3. Descartar el colorante y lavar ligeramente con agua
corriente.
4. Secar al medio ambiente y hacer la lectura con lente de
inmersión.

o Obtención de cultivos de L. braziliensis – peruviana: la

positividad de la prueba anterior nos permitirá extraer con
seguridad una muestra para la posterior obtención de los
cultivos de L. braziliensis – peruviana, para esto se
realizará el siguiente procedimiento:

1. Lavar la lesión con agua y jabón.

2. Desinfectar la zona elegida con alcohol al 70% y agua
oxigenada.
3. Con una jeringa de tuberculina, la cual, ha sido cargada
previamente con 0,2 mL de solución salina estéril con
antibióticos, se punza y se inyecta el contenido suavemente
dentro del área decolorada de la pápula o dentro del margen
no necrotizado de la úlcera.
4. Enseguida se aspira. La aguja y jeringa son retiradas
aplicando ligera presión hacia atrás, al mismo tiempo que se
gira suavemente hacia derecha e izquierda. El procedimiento
es relativamente indoloro, sin embargo, puede utilizarse un
anestésico local (Lidocaína al 2%).

10
 5. Dos a tres gotas del material aspirado son inoculados en
tubos con tapa rosca que contienen medio de cultivo Novy
McNeal Nicolle (NNN), al cual se le ha añadido 0,1 mL de
solución salina que contiene 500 IU de penicilina y 500 mg
de streptomicina/mL para prevenir la contaminación.
6. Mantener los tubos de cultivo a 24°C y revisarlos
diariamente. Si no se dispusiera de estufa, los cultivos se
pueden mantener a temperatura ambiente, siempre que ésta
no exceda los 26°C.
7. Se realizarán recuentos diarios a fin de determinar la fase
logarítmica del parásito.

o Identificación Específica de Especie por Técnicas

Moleculares: L. braziliensis – peruviana será identificada
específicamente mediante las técnicas de PCR y RFLP.

 Obtención del Extracto Metanólico de Caesalpinia spinosa

(Taya) (Alzadora et. al., 2007):

o Se prepararán extractos metanólicos de hoja, fruto y hoja

y fruto (1:1) de Caesalpinia spinosa (Taya), para lo cual
se seguirá el siguiente procedimiento:
 Se recolectarán las hojas y frutos de “Taya” teniendo en
cuenta su tamaño, color y estado.
 Luego, se obtendrá un kilogramo de muestra fresca, la
cual se pondrá a secar al horno a una temperatura de
45 ºC/24 – 36 h. con la finalidad de eliminar de forma
eficiente la humedad.
 Luego, se procederá a moler las muestras secas
utilizando un mortero, hasta obtener un pulverizado
homogéneo.
 Luego, se pesarán 50 gr de la muestra molida y se
colocará en un balón con 500 mL de metanol comercial
(CH3 OH Cl), para posteriormente llevarlo a maceración
por 10 días.
 Luego se filtrará el macerado utilizando papel Watman
Nº 3 en un matraz estéril para luego colocarlo en un
crisol y llevarlo a estufa de aire circulante a 40 ºC,
hasta obtener ¼ del volumen inicial.
 Luego se secó en estufa a 40 ºC, hasta la evaporación
total del solvente.
 El extracto seco y en polvo será recibido en viales
estériles.

 Estandarización de la Solución Stock (Rimarachín y Vasquéz,

2004):

o Se pesará 4 g de extracto puro en un recipiente estéril y

luego se agregará 5 mL de Solución Salina Fisiológica

11
 Estéril (SSFE), para obtener la Solución Stock cuya
concentración final será 800 mg/mL.
o Luego de obtenida la Solución Stock se procederá a
preparar las concentraciones de 50, 100, 200, 400 y 800
mg/mL.

 Prueba de “Efecto Inhibitorio” in Vitro (Alzadora et. al., 2007):

o Para esta prueba se utilizarán cultivos de promastigotes

de Leishmania braziliensis – peruviana en fase log.
o Pasado 5 días de cultivo a la fase líquida se le añadirá el
extracto metanólico de cada tipo (hoja, fruto y hoja +
fruto).
o Se emplearán concentraciones de 50, 100, 200, 400 y
800 mg/mL de Extracto Metanólico.
o Los ensayos se realizarán por triplicado para cada tipo de
extracto, considerando como controles cultivos sin
Extracto Metanólico.
o El recuento de parásitos se realizará diariamente desde
el primer hasta el quinto día de incubación con el
Extracto Metanólico.
o Para el recuento del parásito se empleará cámara de
Neubauer (400x) lo que además permitirá evaluar la
morfología y la supervivencia del parásito, ésta última,
relacionada con su movimiento.
o El efecto inhibitorio in Vitro del Extracto Metanólico de C.
espinosa (Taya) se demostrará a través de la Actividad
Leishmanicida (reducción en la cantidad de
promastigotes). Ésta se determinará aplicando la
siguiente fórmula:

Actividad
= [100 – (L2/L1)] x 100)
Leishmanicida

o Donde L1 será el número de células viables en el cultivo

control y L2 será el número de células viables después
del tratamiento con los extractos.
o El porcentaje de viabilidad se determinará por
comparación con el número de promastigotes de los
controles.

7.2.3.Diseño de contrastación de Hipótesis:

La investigación a realizar es experimental y

corresponde al diseño de estímulo creciente (Alzadora et. al.,
2007). Para este diseño se utilizará una cepa experimental y
una cepa control. A la cepa experimental se le inocularán dosis
de 50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL del extracto metanólico. La
cepa control quedará sin inocular. Este procedimiento se

12
 realizará para los tres tipos de extracto (hoja, fruto y hoja +
fruto). Se compararán los resultados antes y después de
inocular los extractos metanólicos a través de la determinación
de la Actividad Leishmanicida. Se realizarán 3 repeticiones por
cada tipo de extracto.

7.2.4.Análisis Estadístico de los Datos:

Se utilizará un diseño con arreglo factorial 1 x 5 x 3,

correspondiendo el primer factor al número de cepas, el
segundo factor a las concentraciones del extracto metanólico
(50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL) y el tercer factor a los tipos
de extractos (hoja, fruto y hoja + fruto). El experimento se
realizará con 3 repeticiones (Gráfico Nº 1), lo que harán un
total de 45 unidades experimentales.
El diseño factorial se aplicará para cada tipo de extracto
(hoja, fruto y hoja + fruto).
Para el análisis estadístico de los datos se utilizará la
prueba de “t de Student” y la prueba de Significación de
Tuckey a 0,05 de nivel de significación.
Para la mejor interpretación, los resultados de los datos
serán presentados en tablas y gráficos.

13
8. REFERENCIAS:

- Alzadora, L.; Solis H.; Rojas, M. 2007. Actividad leishmanicida de los

extractos metabólicos de cuatro ecotipos de Lepidium peruvianum,
Chacón (Brassicaceae) Rev. Peru. Biol. Número especial 13(3): 211-214.
- Ampuero, J. 2000. Leishmaniasis. Módulos Técnicos. Serie de
Documentos Monográficos Nº 8. MINSA. 2000. 80 pp.
- Bazurto, L. 2006. Todo sobre la Tara: Caesalpinia spinosa o Caesalpinia
tinctoria. ALNICOLSA del Perú. Universidades Latinoamericanas.
- Monzote, L. y cols. 2004. Propiedades antiprotozoarias de aceites
esenciales extraídos de plantas cubanas. Instituto de Medicina Tropical
“Pedro Kourí”.
- Muñoz, A. y B., Pareja. 2003. Plantas medicinales empleadas en el
tratamiento de la leishmaniasis. Folia Dermatológica Peruana. Círculo
Dermatológico del Perú. 14 pp.
- Organización Panamericana de la Salud. 1996. Epidemiología y Control
de la Leishmaniasis en las Ameritas por País o por Territorio. Cuaderno
Técnico Nº 44. 1 – 3, 18 – 19 pp.
- Pérez, J.; J., Pérez y Castanys, S. 2007. Estrategias terapéuticas y
bases moleculares de la resistencia a fármacos frente a la leishmaniasis.
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra” (CSIC).
- Rimarachín, J. y M. Vasquéz. 2004. Sensibilidad in vitro de Candida
albicans, Sthaphylococcus aureus y Salmonella Typha al extracto
etanólico de Bidens pilosa L. “Amor seco”. Facultad de Ciencias
Biológicas. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Lambayeque.
- Torres, R, y S., Barroeta. 1996. Tratamiento de la Leishmaniasis
Cutánea Localizada con Infiltraciones Perilesionales de Glucantime y
Lidocaína. Facultad de Medicina. Universidad del Zulla.

14
 GRAFICO Nº 1: Diseño experimental para determinar

TIPOS DE EXTRACTO

EXTRACTO METANOLICO EXTRACTO METANOLICO EXTRACTO METANOLICO

HOJA FRUTO HOJA + FRUTO

Leishmania braziliensis - peruviana en fase log

R1
CONCENTRACIONES

50 mg/mL R2
R3

R1
100 mg/mL R2
R3

R1
200 mg/mL R2
R3

R1
400 mg/mL R2
R3

R1
800 mg/mL R2
R3

15