Aplicaciones de las tcnicas del ADN recombinante

1. Produccin de protenas en gran escala para estudios de investigacin bsica y para su aplicacin en diversos campos (hormonas, anticuerpos, antivirales, vacunas, enzimas hidrolticas, polmeros) 2. Medicina. Diagnstico de enfermedades infecciosas y genticas. Terapia gnica. Medicina forense. 3. Obtencin de organismos transgnicos (transformados) con propiedades particulares 4. Ecologa microbiana. Determinacin de la biodiversidad. Deteccin de microorganismos no cultivables. 5. Evolucin. Establecer relaciones filogenticas entre organismos.

Las tcnicas de ADN recombinante permiten desplazarse experimentalmente desde el gen hasta la protena y desde la protena hasta el gen

Clonado de genes

Aislamiento y amplificacin de un gen de inters para su posterior manipulacin gentica Pasos: 1. Aislamiento y fragmentacin de la fuente de ADN: ADN genmico, ADN copia, producto de PCR. 2. Insercin en vector de clonado 3. Introduccin y amplificacin en organismo husped 4. Identificacin del gen de inters

Enzimas de restriccin (ER)

Son enzimas (endonucleasas) de origen bacteriano que reconocen y cortan secuencias especficas (4-8 pb) en el ADN doble cadena. Pueden dejar extremos romos (blunt ends) o con cohesivos con extremos 3 o 5 de cadena simple (overhangs)

Vectores de clonado
Deben contener ori (replicacin autnoma) y marcador de seleccin (ej. resistencia a un antibitico). Los plsmidos son muy usados Poseen secuencia con sitios de reconocimiento para varias ER (sitio mltiple de clonado o polylinker) Permiten amplificar un fragmento de ADN exgeno (inserto).

Ligacin de un fragmento de ADN (inserto) a un vector

Tratamiento del vector con fosfatasa alcalina para evitar religacin del vector

Se puede clonar un gen especfico a partir de :

- Una genoteca - Mediante amplificacin por PCR, cuando se conocen las secuencias genmicas del organismo.

Genotecas
Coleccin de secuencias de ADN individuales que representan todo o parte del genoma de un organismo.
- Genotecas de ADN copia (ADNc) Incluye los genes expresados en un organismo. No posee intrones. Se generan a partir de ARN total.

- Genotecas de ADN genmico (ADNg) Generadas a partir de ADNg de un organismo. Posee intrones (eucariotas) y secuencias regulatorias

Construccin de una genoteca a partir de ADN genmico.

Colonias de bacterias recombinantes

Bacterifagos: Fago

Los vectores construdos a partir del fago son ms eficientes que los plsmidos para clonar grandes cantidades de fragmentos de ADN y de mayor tamao (~hasta 25 kpb). Se usan para construir genotecas.

Clonado en cromosomas bacterianos artificiales (BACs)

Permiten clonar fragmentos de ADN muy largos (300 kbp). Se usan para construir genotecas y secuenciar genomas completos.

Construccin y anlisis de una genoteca de cADN

Las genotecas pueden analizarse mediante hibridizacin con sondas de oligonucletidos

Diseo de una sonda para detectar el gen de una protena conocida por hibridacin

Manipulacin del gen clonado para: 1. Producir grandes cantidades de la protena para estudios bioqumicos y/o estructurales

2. Modificacin del gen (mutagnesis) e introduccin en clulas u organismos para estudiar la funcin

Expresin heterloga de protenas recombinantes

En bacterias. E. coli Ventajas: - Fisiologa y gentica muy conocida - Fcil manipulacin en laboratorio - Relativo bajo costo

Desventajas: No produce muchas de las modificaciones post-traduccionales requeridas para la expresin de protenas de eucariotas

Expresin heterloga de protenas recombinantes

La secuencia nucleotdica del inserto se debe clonar en fase con el codn de inicio de la traduccin (ATG) del vector.

Elementos tpicos de un vector de expresin bacteriano

Anlisis de la expresin de una protena recombinante producida en E. coli

SDS-PAGE y tincin con azul de Coomassie de las protenas celulares (C) y del medio de cultivo (M) de E. coli recombinante conteniendo el plsmido pET-nepHis6

Vector de expresin que contiene 6 codones para el aa His (poli His 6) en el extremo 5permite generar una protena de fusin clonando el inserto en el mismo marco de lectura. Esta estrategia facilita la purificacin e identificacin de la protena recombinante, ya que se puede purificar en columnas de afinidad con Ni 2+ y detectar en Western blots con anticuerpos anti-His

Protenas recombinantes usadas en Medicina

Clonado de un ADNc en un vector como protena de fusin con un gen marcador o reportero (ej. Protena GFP, green fluorescent protein) o con un epitope tag
a. Fusin a GFP. Permite seguir la localizacin/movimiento de la protena en la clula al microscopio de fluorescencia. Foto gusano nematode C. elegans b. Fusin con un epitope tag (secuencia corta reconocida por anticuerpo monoclonal-Mab-). La protena marcada se puede precipitar con el Mab a partir de un extracto celular. Permite detectar protenas que interaccionen con la protena marcada.

Vectores plasmdicos usados en clulas animales

Transfeccin. Amplificacin de genes clonados en clulas animales. Transfeccin transitoria. Emplea vectores verstiles o lanzadera (capaces de replicarse en dos huspedes diferentes) Para clulas de mamfero, el vector lleva: - ori replicacin viral - Promotor fuerte - ADNc clonado adyacente al promotor - Durante la divisin cel. los plsmidos no son segregados correctamente en cel hijas y con el tiempo algunas cel pierden el plsmido

Transfeccin estable (transformacin). El vector se integra al genoma de la clula husped en forma permanente, se dice que la clula est transformada. El vector lleva gen marcador para diferenciar clulas que han integrado el vector (neor)

Aplicacin de las tcnicas del ADN recombinante en las plantas

Hace posible alterar el perfil nutricional, rendimientos de la cosecha, resistencia a estreses ambientales Introduccin de genes en plantas mediante infeccin con Agrobacterium tumefaciens A. tumefaciens es una bacteria patgena de plantas dicotiledneas que transfiere ADN (ADN-T) a las plantas, causando la formacin de tumores.

Estrategia con dos plsmidos para crear plantas recombinantes

a. Se saca el ADN-T del plsmido Ti, se dejan los genes vir necesarios para la transferencia de ADN desde la bacteria a la planta. b. En el otro plsmido se clona el gen de inters y un gen de seleccin (Kanr), flanqueados por los 25 pb del ADN-T, importantes para la transferencia del ADN. Posee ori para replicacin en la bacteria.

Plantas de tomate modificadas resistentes a larvas de insectos (expresan gen de toxina de Bacillus turingensis)

Clonado en clulas animales

Se realiza sobre cultivos de clulas. La transformacin generalmente requiere la integracin del ADN en el cromosoma del husped. Mtodos de transformacin: - Electroporacin - Microinyeccin. Inyeccin de ADN en el ncleo de clulas con una aguja fina - Liposomas - Vectores virales (retrovirus, adenovirus). Se integran en el cromosoma del husped

Se introdujo el gen de la hormona de crecimiento humana en el genoma del ratn bajo el control de un promotor regulable. Cuando se aliment con dieta + inductor los ratones transgnicos crecieron a un tamao inusual.

Creacin de ratones transgnicos

Terapia gnica
Surge de la investigacin con animales transgnicos. Es una tcnica para reemplazar un gen deficiente por uno normal en individuos con enfermedades genticas

Protocolo para TG ex vivo en humanos