UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE BIOLOGIA

ISABELLA CANELLA MESQUITA

LESO MUSCULAR INDUZIDA POR BUPIVACANA EM LINHAGENS DE CAMUNDONGOS PREDISPOSTOS A PERFIL DISTINTO DE CITOCINAS

Niteri 2007

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ISABELLA CANELLA MESQUITA

LESO MUSCULAR INDUZIDA POR BUPIVACANA EM LINHAGENS DE CAMUNDONGOS PREDISPOSTOS A PERFIL DISTINTO DE CITOCINAS

Orientadoras Professora Jussara Lagrota Cndido Professora Thereza Quirico dos Santos

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Dissertao submetida coordenao do curso de ps-graduao em Neuroimunologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos necessrios para obteno do grau de Mestre em Neuroimunologia rea de concentrao: Imunobiologia.

Banca examinadora:

Joseli Lannes Vieira (IOC-Fiocruz)

Mauricio Vercimo (UFF)

Elizabeth Giestal Arajo (UFF)

Vernica Figueiredo Amaral (Suplente e Revisora- UFF)

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A parte experimental deste trabalho foi executada nos laboratrios de Imunopatologia e Patologia Celular do Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense (UFF) e no Laboratrio de Pesquisa em Auto-imunidade e Imuno-regulao (Instituto Oswaldo Cruz Fiocruz).

FICHA CATALOGRFICA

MESQUITA, Isabella Canella Leso muscular induzida por bupivacana em linhagens de

camundongos predispostos a perfil distinto de citocinas Niteri: UFF, 2007. 102 f.

Dissertao Mestrado em Neuroimunologia Universidade Federal Fluminense

1. leso muscular 4. citocinas

2. inflamao

3. Msculo Esqueltico

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Dedico esta tese

Deus, minha famlia, amigos, colegas de trabalho e orientadoras pelo apoio, fora, incentivo, companheirismo e amizade. Sem eles nada disso seria possvel.

vii AGRADECIMENTOS

A Deus por me amparar nos momentos difceis, me dar fora interior para superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas incertas e me suprir em todas as minhas necessidades.

s minhas orientadoras e amigas Profas Jussara Lagrota-Cndido e Thereza Qurico dos Santos, por acreditarem em mim, me mostrarem o caminho da cincia, fazerem parte da minha vida nos momentos bons e ruins, por serem exemplos de profissional e de mulheres as quais sempre faro parte da minha vida.

minha famlia, a qual amo muito, pelo carinho, pacincia e incentivo.

A Dra. Joseli Lannes Vieira por sua ajuda nos momentos mais crticos, por acreditar no futuro deste projeto e contribuir para o meu crescimento profissional e por ser tambm um exemplo a ser seguido. Sua participao foi fundamental para a realizao deste trabalho.

Aos amigos que fizeram parte desses momentos sempre me ajudando e incentivando.

Aos meus colegas de trabalho Douglas, Rafael, Pedro e as tcnicas do laboratrio Nina e Bartira que participaram diretamente deste trabalho e me ajudaram em todos os momentos.

viii Aos meus amigos de laboratrio Paulo Emlio, Gabriele, Cristiane, Guilherme, Fernanda e Jardel que sempre estiveram do meu lado dando fora e apoio.

As colegas do Laboratrio de Autoimunidade da Fiocruz, Jaline, Valeska, Karina, Andra, Luzia, Mrcia, Diego, por me receberem to bem, me ajudarem e participarem deste trabalho.

Aos tcnicos do Biotrio Central da Fiocruz e do NAL pelo apoio tcnico excepcional.

A Dra Andra Fontes do DUBC da Fiocruz pelo apoio e colaborao na utilizao do citmetro de fluxo.

A todos os amigos do Instituto de Biologia pelo carinho e apoio.

todos

os

colegas

professores

da

ps-graduao

em

Neuroimunologia pelo convvio e aprendizado.

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EPGRAFE

"Todo o futuro da nossa espcie, todo o governo das sociedades, toda a prosperidade moral e material das naes dependem da cincia, como a vida do homem depende do ar. Ora, a cincia toda observao, toda exatido, toda verificao experimental. Perceber os fenmenos, discernir as relaes, comparar as analogias e as dessemelhanas, classificar as realidades, e induzir as leis, eis a cincia; eis, portanto, o alvo que a educao deve ter em mira. Espertar na inteligncia nascente as faculdades cujo concurso se requer nesses processos de descobrir e assimilar a verdade."

Rui Barbosa.

SUMRIO Pgina FICHA CATALOGRFICA...................................................................................v DEDICATRIA.................................................................................................... vi AGRADECIMENTOS..........................................................................................vii EPGRAFE.......................................................................................................... ix LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... xii LISTA DE TABELAS..........................................................................................xiv LISTA DE FIGURAS...........................................................................................xv RESUMO...........................................................................................................xvii ABSTRACT.......................................................................................................xviii 1.0 - INTRODUO.......................................................................................... 1 1.1 - Tecido Muscular Esqueltico.....................................................................1 1.2 - Formao do Tecido Muscular.................................................................. 5 1.3 - Reparo do Tecido Muscular...................................................................... 6 1.4 - Progenitores Miognicos........................................................................... 9 1.4.1 - Clulas Satlites........................................................................................ 9 1.4.2 - Contribuio de Outras Clulas Miognicas no Reparo do Tecido Muscular...................................................................................................13 1.5 - Participao da Inflamao no Reparo Tecidual .....................................16 1.6 - Metaloproteinases na Regenerao e Reparo de Tecido Muscular .......23 1.7 - Modelos Animais de Injuria Muscular.......................................................25 2.0 - OBJETIVOS.............................................................................................28 2.1 - Objetivo Geral..........................................................................................28 2.2 - Objetivos Especficos..............................................................................28 3.0 - MATERIAL E MTODOS.........................................................................29 3.1 - Animais.....................................................................................................29 3.2 - Induo da Leso.....................................................................................29 3.3 - Processamento Histolgico......................................................................30 3.4 - Imuno-histoqumica..................................................................................30 3.5 - Histomorfometria......................................................................................32 3.6 - Citometria de Fluxo..................................................................................32 3.7 - RT-PCR....................................................................................................33

xi 3.7.1 - Extrao de RNA Total ........................................................................... 33 3.7.2 - Eletroforese de RNA .............................................................................. 34 3.7.3 - Transcrio Reversa de RNA e PCR...................................................... 35 3.8 - Zimografia............................................................................................... 36 3.8.1 - Preparo do Extrato Tecidual.................................................................. 36 3.8.2 - Gel para Zimografia............................................................................... 36 3.9 - Anlise Estatstica................................................................................... 37 4.0 - RESULTADOS........................................................................................ 38 4.1 - Anlise Histolgica da Leso Muscular ................................................. 38 4.2 - Alteraes no Microambiente da Leso Muscular ...................................42 4.2.1- Colorao de Picrocrius .......................................... ..............................42 4.2.2 - Atividade das Metaloproteases no Msculo Lesionado ..........................47 4.3 - Fenotipagem do Infiltrado Inflamatrio..... ...............................................51 4.4 - Fenotipagem do Linfonodo de Drenagem.......................... .....................53 4.5 - Expresso de RNAm para TGF- no msculo esqueltico.....................62 5. 6. 7. DISCUSSO........................................................................................... 64 CONCLUSES....................................................................................... 72 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................ 73

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LISTA DE ABREVIATURAS

ATP ATPASE B10 B6 BHLH Ca+ CTX DMD DPI ECM FGF GAPDH HGF HMGB1 IGF IL LAP LPS MDSC MHC MMP MRF mRNA NK NO NTX PCNA PCR PGE2 PPARy

Adenosina tri-fosfato Adenosina tri-fosfatase C57BL/10 C57BL/6 Basic-helix-loop-helix Clcio Cardiotoxina Distrofia muscular de Duchenne Dias aps inoculao Matriz extracelular Fator de crescimento de fibroblasto Gliceraldeido-3-fosfatase dehidrogenase fator de crescimento de hepatcito Protena do tipo high mobility group box 1 Fator de crescimento do tipo insulina Interleucina Protena associada latncia Lipopolissacardeo Clulas tronco derivadas de msculo Miosina de cadeia pesada Metaloprotease de matriz Fator de crescimento muscular RNA mensageiro Clula natural killer xido Ntrico Notexina Antgeno nuclear de proliferao celular Reao de polimerase em cadeia Prostaglandina E Receptor de ativao proliferador de peroxossoma gama

xiii RNAse Runx2 SCA-1 SDF SDS SP TGF TGF- TIMP TLR TNF Zn2+ Ribonuclease Fator de transcrio relacionado ao runt tipo 2 Antgeno de clula tronco do tipo 1 Fator derivado de clula do estroma Dodecil sulfato de sdio Side Population Fator de transformao do crescimento Fator de Transformao do crescimento do tipo Inibidor tecidual de metaloprotease Receptor do tipo toll Fator de necrose tumoral alfa Zinco

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LISTA DE TABELAS

Pgina 1. 2. 3. Relao de anticorpos utilizados na imuno-histoquimica....................... 31 Relao de anticorpos utilizados na citometria de fluxo......................... 33 Lista de oligonucleotdeos.......................................................................35

xv LISTA DE FIGURAS

Pgina 1. 2. 3. Estrutura do msculo esqueltico.................................................... Estrutura da fibra muscular.............................................................. Distribuio heterognea das fibras musculares esquelticas..................................................................................... 4. 5. 6. 7. Estgios de regenerao do tecido muscular.................................. Regulao molecular da regenerao do tecido muscular.............. Influncia do microambiente na ativao das clulas satlites ...... Possveis repositores de mioncleos durante a regenerao muscular........................................................................................... 8. Cintica da migrao celular nas fases da leso tecidual............................................................................................... 9. Regulao do desenvolvimento de fibrose na leso tecidual............ 17 23 15 4 9 11 13 2 3

10. Cintica da leso muscular induzida por bupivacana nas linhagens de camundongo................................................................. 11. Painel com fotomicrografias da leso muscular coradas pelo Giemsa............................................................................................... 12. Colorao de picrosrius da leso muscular...................................... 13. Histomorfometria da area da leso ocupada por colgeno............... 14. Atividade de metaloproteinases no msculo esqueltico.................. 15. Atividade das MMP-9 e MMP-2 pr no msculo esqueltico............ 16. Fenotipagem das clulas do infiltrado inflamatorio da leso muscular induzida por bupivacana................................................... 17. Celularidade dos linfonodos de axilar e braquial...... 18. Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos presentes nos linfonodos de drenagem em 4 dpi............................................... 19. Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos t presentes nos linfonodos de drenagem em 4dpi...... 20. Perfis representatives de expresso de CD44, CD25 e CD62L nas clulas TCD4+ de camundondos BALB/c.......................................... 58 57 52 54 49 55 41 44 46 49 50 40

xvi 21. Anlise por citometria de fluxo de expresso dos antgenos CD62L, CD44, CD25 nas clulas CD4+............................................ 22. Perfs representativos de expresso de CD44, CD25 e CD62L nas clulas CD8+ de camundongos C57BL6................ .......................... 23. Anlise pr citometria de fluxo da expresso dos antgenos CD62L, CD44, CD25 nas clulas CD8+......................................................... 24. Expresso de RNA mensageiro para TGF- no msculo esqueltico 61 63 60 59

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RESUMO

Leses musculares so problemas freqentes na medicina esportiva e doenas miodegenerativas. A fase inicial do processo de reparo caracterizada pela necrose do tecido danificado e ativao da resposta inflamatria. O objetivo deste trabalho foi analisar o reparo do tecido muscular aps a induo de leso muscular em linhagens de camundongos com distintos padres de secreo de citocinas. Foram includos pelo menos 3 animais em cada grupo de estudo com padro de citocinas Th1 (C57BL/10, C57BL/6) e Th2 (BALB/c). A injria muscular foi induzida pela inoculao de bupivacana no msculo Trceps bachii. Os camundongos foram sacrificados aps 1, 4, 8 e 12 dias (dpi). As linhagens com predomnio de citocinas Th1 apresentaram maior rea com miofibras regenerando e macrfagos em 4 dpi em comparao com o camundongo BALB/c. Os linfonodos regionais apresentaram aumento significativo da celularidade com aumento percentual de linfcitos T CD3+CD4+ somente nos camundongos BALB/c inoculados com bupivacana. Os camundongos BALB/c mostraram um aumento da deposio de colgeno e menores nveis de MMP-9 associados com maior quantidade de mRNA para TGF-1. Este estudo sugere que o perfil imunolgico do camundongo pode influenciar o processo de remodelagem no msculo esqueltico aps inoculao de bupivacana promovendo regenerao muscular (citocinas Th1) ou mionecrose e deposio de colgeno (citocinas Th2).

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ABSTRACT Muscular lesion is a frequent matter in sportive medicine and myodegenerative diseases. Necrosis of the damaged tissue and activation of inflammatory response characterize the initial phase of muscle repair. This work aimed to analyze the tissue repair after induction of lesion in skeletal muscle from mouse lineages with distinct cytokine secretion patterns. It was included at least 3 mice per group with distinct cytokine pattern: Th1 (C57BL/10, C57BL/6) and Th2 (BALB/c). Muscular injury was performed by injection of bupivacaine (Bp) in the (T. brachii) skeletal muscle. Mice were sacrificed at 1, 4, 8 and 12 days postinjection (dpi). Both Th1-dominant strains presented more areas with regenerating myofibers and macrophages at 4 dpi. Regional lymph nodes showed significant increase of cellularity and relative numbers of CD3+CD4+ in bupivacaine-inoculated BALB/c mice compared to non-inoculated matched mice at 4 dpi. BALB/c mice showed increased collagen expression and decrease of MMP-9 activity associated with more mRNA for TGF-b1. This study shows that the immune background of the mouse may affect the remodelling processes in skeletal muscles that occur in response to bupivacaine injection promoting muscle regeneration (Th1 cytokines) or myonecrosis and collagen deposition (Th2 cytokines).

1. INTRODUO

1.1 TECIDO MUSCULAR ESQUELTICO O msculo estriado esqueltico responsvel pela sustentao e movimentao corporal devido a sua capacidade de contrao e de gerar uma fora que aplicada sobre ossos e articulaes. Na maioria das vezes essa contrao voluntria via estmulo nervoso. O msculo esqueltico formado por clulas cilndricas alongadas e que possuem estriaes transversais. As clulas musculares apresentam caractersticas especficas e por isto seus componentes receberam nomes especiais. O citoplasma chamado de sarcoplasma, o retculo endoplsmtico de retculo sarcoplasmtico e a membrana citoplasmtica de sarcolema. Os ncleos de uma fibra muscular esto todos localizados na periferia da fibra em contato com o sarcolema (Kerr, 2000). Os msculos so formados por um conjunto de clulas que se originam da fuso de mioblastos e se organizam em feixes cilndricos e multinucleados com at 30 cm. Cada fibra muscular revestida por uma camada de tecido conjuntivo chamada endomsio. Tais fibras so ento agrupadas em feixes mantidos juntos por outra camada de tecido conjuntivo, denominada perimsio. Esse grupo revestido ou feixe de fibras denominado fascculo. Os grupos de fascculos com feixes de fibras, cada qual com vasos sangneos e tecido nervoso associados, so mantidos bem unidos por outra camada de tecido conjuntivo denominada epimsio. Os fascculos circundados por epimsio, que percorrem todo o comprimento do msculo esqueltico, so ento

completamente circundados por um tecido conjuntivo denominado fscia (figura 1). A fscia um tecido conjuntivo denso e resistente que recobre todo o msculo e, estende-se alm do msculo formando o tendo fibroso, cuja funo fixar o msculo ao osso. Esta disposio do tecido conjuntivo mantm a organizao das fibras musculares, permitindo que a fora de contrao seja transmitida a outras estruturas como tendes e ligamentos e tambm influencia na distribuio dos vasos sanguneos, linfticos e inervao (Junqueira & Carneiro, 2004).

osso

perimsio sanguneo

Fibra muscular

tendo

epimsio

endomsio

fascculo

Figura 1: Estrutura do msculo esqueltico. http://training.seer.cancer.gov/module_anatomy/unit4_2_muscle_structure.htm (acessado em 20/12/2006)

No interior de uma fibra muscular existe um nmero razovel de unidades estruturais orientadas longitudinalmente chamadas de miofibrilas formadas por filamentos de actina e miosina, as duas principais protenas contrteis do msculo. As miofibrilas so cilndricas, com dimetro entre 1 e 2 m, podendo ser vistas ao microscpio ptico como estriaes transversais

com faixas claras e escuras (Kerr, 2000). A banda I (isotrpica), apresenta-se mais clara porque a luz polarizada atravessa facilmente os finos filamentos de actina que a constituem. A banda A (anisotrpica), apresenta-se mais escura por ser composta por actina e filamentos espessos de miosina, o que dificulta a passagem da luz. No centro de cada banda I aparece uma linha transversal escura, a linha Z. O sarcmero, unidade estrutural do msculo, definido como a regio da miofibra compreendida entre as duas linhas Z. No centro de cada banda A existe uma rea mais clara chamada de banda H, exclusivamente constituda de miosina (figura 2). Ao microscpio eletrnico podemos ver filamentos finos de actina que partem da linha Z at o bordo externo da banda H (Junqueira & Carneiro, 2004).

ncleo
Banda I Banda A Disco Z Mitocndria

Retculo sarcoplasmtico Triad Cisterna terminal Tbulo transversal Sarcolema Sarcoplasma Miofibra

Figura 2 Estrutura da fibra muscular www.adesnivel.pt/treino/musculo.htm (acessado em 16/02/2007)

As miofibras so heterogneas no tamanho, metabolismo e funo contrtil, o que permite uma grande variedade de funes de acordo com a composio das fibras. Inicialmente as fibras foram classificadas como sendo rpidas e lentas baseadas na velocidade de contrao. Esta diviso tambm corresponde a diferenas morfolgicas, com os msculos rpidos sendo brancos em algumas espcies como aves, e os msculos lentos de cor vermelha. O maior contedo de mioglobina e capilares nos msculos vermelhos contribui para a maior capacidade oxidativa dos msculos vermelhos comparados com os brancos. Atualmente, as fibras musculares so classificadas por trs diferentes mtodos: anlise histoqumica para ATPase, identificao da isoforma de miosina e identificao bioqumica de enzimas metablicas (Scott et al., 2001) ver figura 3.

Figura 3: Distribuio heterognea das fibras musculares esquelticas. Anlise do tipo de fibra de sees transversais do msculo soleus de camundongos coradas por hematoxilina-eosina (a), colorao metacromtica da ATPase mostrando fibras tipo I (coradas em azul) e tipo IIA (azul claro), e em (c) imuno-histoqumica usando anticorpo monoclonal que reconhece miosina do tipo I (Bassel-Duby & Olson, 2006).

1.2 FORMAO DO TECIDO MUSCULAR

O msculo esqueltico de vertebrados formado a partir do mesoderma paraxial, o qual se segmenta em somitos em cada lado da notocorda e do tubo neural (Christ & Ordahl, 1995). A poro dorsal do somito originar os msculos dos membros e do corpo, enquanto alguns msculos da cabea so originados da poro anterior no segmentada, mesoderma paraxial e mesoderma pr-cordal (Buckingham et al., 2003). A miognese um processo que envolve uma cascata complexa de eventos incluindo especificao e a diferenciao das clulas precursoras ou mioblastos, que se fusionam para formar os miotubos primrios e secundrios e a subseqente maturao. Todos esses eventos se do sob um controle gentico restrito e envolve a migrao de clulas precursoras (Muntoni et al., 2002). Genes da famlia Pax, caracterizados pela presena de um homeobox e um paired box, esto implicados na proliferao de vrias linhagens de precursores (Pownall et al., 2002; Chen & Goldhamer, 2003; Charge & Rudnicki, 2004). Pax-3 e Pax-7 possuem um papel importante durante o desenvolvimento do msculo esqueltico (Hawke & Garry, 2001; Chen & Goldhamer, 2003; Charge & Rudnicki, 2004). Famlias de fatores de transcrio, como MRF (fatores regulatrios miognicos) que pertencem superfamlia de fatores de transcrio bHLH (basic helix-loop-helix), esto implicados na formao do msculo esqueltico (Charge & Rudnicki, 2004). A famlia MRF consiste de MyoD (Myf-3), Myf-5, miogenina (Myf-1) e MRF4 (Myf6/Herculin) (Sabourin & Rudnicki, 2000). MyoD e o Myf-5 so os fatores primrios e agem na determinao miognica, enquanto a miogenina e o MRF4 so fatores de diferenciao (Sabourin & Rudnicki, 2000). Camundongos duplo

nocaute para Myf-5 e MyoD no conseguem formar msculo esqueltico devido a ausncia de precursores de mioblastos (Rudnicki et al., 1993). Clulas miognicas com proliferao positiva para MyoD e /ou Myf5 formam mioblastos que proliferam e saem do ciclo celular para se tornarem micitos diferenciados. Estes expressam as MRFs, miogenina e MRF4, e subseqentemente genes musculares especficos como a cadeia pesada de miosina (MHC) e creatina quinase muscular (MCK) (Charge & Rudnicki, 2004). Durante o

desenvolvimento muscular, uma populao de mioblastos no se diferencia, permanecendo associada superfcie da fibra em desenvolvimento como clulas satlites musculares quiescentes (Charge & Rudnicki, 2004).

1.3

REPARO DO TECIDO MUSCULAR O msculo esqueltico de mamferos tem a capacidade de realizar

regenerao rpida e extensa em resposta a injria grave devido a defeitos genticos e atividade fsica intensa. A regenerao muscular caracterizada por trs fases: degenerao, reparo e remodelagem (Jarvinen et al., 2005). O evento inicial da degenerao muscular a necrose das fibras musculares. Esse evento iniciado geralmente pela ruptura do sarcolema resultando em aumento da permeabilidade da miofibra. A ruptura da miofibra se reflete pelo aumento dos nveis sricos da protena muscular creatina kinase. A permeabilidade aumentada da fibra muscular a corantes de baixo peso molecular como azul de Evans uma indicao da leso do sarcolema associada a exerccios extensos e doenas degenerativas. Na leso muscular alm de necrose, degenerao e infiltrado de clulas inflamatrias tambm evidente o extravasamento sangneo com formao de hematoma (Charge &

Rudnicki, 2004). Esse processo seguido por uma fase de reparo onde ocorre a fagocitose do tecido lesionado, regenerao das miofibras, formao do tecido cicatricial e revascularizao. Durante a fase seguinte, a fase de remodelagem, ocorre contrao e reorganizao do tecido cicatricial e a recuperao da capacidade funcional do msculo (Peng & Huard, 2004). Na fase inicial da leso muscular geralmente ocorre ativao de clulas mononucleares, principalmente clulas inflamatrias e clulas miognicas. No perodo ps-leso as principais alteraes histolgicas no stio de leso so: necrose da miofibra e aumento do nmero de clulas mononucleares de origem no muscular (Charge & Rudnicki, 2004). Estudos recentes sugerem que fatores liberados por msculos lesionados ativam as clulas inflamatrias residentes que em troca produzem sinais quimiotticos para as clulas inflamatrias circulantes (Warren et al., 2004).

Aps leso muscular induzida por exerccios ou por miotoxinas, os neutrfilos so as primeiras clulas inflamatrias a invadir o msculo lesionado, com aumento numrico nas primeiras 6 horas. Os macrfagos se tornam o tipo celular predominante aps 48h. Macrfagos fagocitam restos celulares e podem afetar outros aspectos da regenerao muscular ativando clulas miognicas (Tidball, 2005). Experimentos de marcao nuclear mostraram a contribuio das clulas satlites como uma fonte importante de novos mioncleos na regenerao de miofibras (revisado em Zammit et al., 2006)). Aps a fase de proliferao miognica, as novas fibras musculares formadas, como na miognese embrionria, sofrem diferenciao e se fusionam a fibras lesionadas j existentes ou formam novas miofibras (figura 4A). As miofibras recm-

formadas so basoflicas, apresentam calibre pequeno, nucleao central (figura 4B) e expressam formas de MHC embrionrio. Em sees longitudinais e em fibras isoladas a nucleao central observada em pores discretas na rea de regenerao ou ao longo de toda a fibra sugerindo que durante a regenerao a fuso celular no difusa, mas focal ao local da leso. Aps a completa fuso das clulas miognicas, as fibras aumentam de tamanho e o mioncleo se move para a periferia da fibra. Sob condies normais o msculo regenerado no pode ser diferenciado morfologicamente nem funcionalmente (Figura 4C) (Charge & Rudnicki, 2004).

Maturao Diferenciao Proliferao Ativao

Dias aps injria

Figura 4: Estgios de regenerao do tecido muscular. A Representao grfica dos estgios de uma cintica de regenerao incluindo ativao de clulas satlites (2 horas aps a injria), proliferao de clulas satlites, diferenciao (caracterizado pelas miofibras centronucleadas) e maturao. B - Corte histolgico de msculo corado por HE 5 dias aps inoculao de cardiolipina (cabea de seta - fibras centronucleadas). Aps 2 semanas (C ) as fibras j restauraram a citoarquitetura e apresentam nucleao perifrica (cabea de seta) (Shi & Garry, 2006)

1.4

PROGENITORES MIOGNICOS

1.4.1 Clulas Satlites: As clulas satlites foram primeiramente descritas em 1961 por Alexander Mauro como mioblastos adormecidos, localizados entre a lmina basal muscular e o sarcolema da fibra muscular, que no sofreram total desenvolvimento embrionrio e que so capazes de retomar esse programa de miognese em resposta a uma leso muscular (Mauro, 1961). As clulas

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satlites ainda so encontradas em abundncia logo aps o nascimento, correspondendo em camundongos a 30% dos ncleos musculares

sublaminares (Cardasis & Cooper, 1975; Chen & Goldhamer, 2003). Contudo, aps o nascimento, essa proporo diminui para menos de 5% no camundongo adulto e continua a cair lentamente aps a puberdade (Chen & Goldhamer, 2003; Charge & Rudnicki, 2004). No msculo normal clulas satlites so normalmente quiescentes e expressam marcadores como Pax-7+, CD34 e M-caderina (revisado em Zammit et al., 2006). Inicialmente, achava-se que Pax-7 era essencial para especificao de clulas satlites, porque camundongos mutantes nocaute para Pax-7 pareciam no possuir clulas satlites porm possuam comprometimento da regenerao muscular. Contudo clulas satlites podem ser detectadas na ausncia de Pax-7, porm sua manuteno e proliferao parece ser defeituosa, sugerindo que Pax-7 possua um importante papel antiapopttico (Relaix et al., 2006). Clulas satlites quiescentes no expressam nveis detectveis de nenhum dos MRFs. Aps a injria e/ou ativao, a expresso de MyoD induzida em 12 horas, antes mesmo da expresso de PCNA (antgeno nuclear de proliferao celular), um marcador para proliferao celular. A expresso de miogenina ocorre tardiamente durante a fuso e diferenciao (Figura 5). Anlise da expresso gnica de clulas satlites individuais ativadas, mostrou inicialmente a expresso de Myf-5 ou MyoD, seguida da coexpresso desses marcadores durante a fase proliferativa e de miogenina e MRF-4 na fase de diferenciao terminal (Cornelison & Wold, 1997; Charge & Rudnicki, 2004). Clulas satlites que mantm a expresso de Pax e diminuem expresso de

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Myo-D, reconstituem o compartimento de clulas satlites (figura 5) (Zammit et al., 2006).

Mioncleo

Fibra muscular

Lmina basal

Clula satlite

Figura 5: Regulao molecular da regenerao do tecido muscular . Durante o crescimento ps-natal e regenerao do msculo adulto, clulas satlites quiescentes tornam-se ativadas, proliferam e se diferenciam em novas fibras musculares ou retornam ao estado de clulas satlites. Este ciclo orquestrado por fatores miognicos como indicado. Na ausncia de Pax-7, as clulas satlites morrem. Modificado a partir de Buckingham, 2006

As clulas satlites miognicas, apesar de serem mais diferenciadas que as clulas tronco ainda apresentam plasticidade. Experimentos in vitro mostraram a capacidade de linhagens mioblsticas expressarem em diferentes condies de cultivo, marcadores caractersticos da diferenciao de tecido sseo e adiposo (Runx2 e PPARy, respectivamente), com diminuio da expresso de MyoD. Isto no s mostra o seu carter plstico, mas a importncia do microambiente para a remodelagem do tecido muscular lesionado (Chen & Goldhamer, 2003).

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A ativao e regenerao do tecido muscular so influenciadas por interaes intercelulares, com a matriz extracelular e fatores secretados. A prpria injria muscular induz a liberao no espao extracelular (Figura 6) de mediadores da resposta inflamatria e outras molculas biologicamente ativas. Estudos in vitro tem evidenciado vrios fatores trficos: membros da famlia FGF (fator de crescimento de fibroblastos), IGFs (fator de crescimento do tipo insulina), HGF (fator de crescimento de hepatcitos, neurotrofinas e citocinas como por exemplo TGF (fator de transformao de crescimento) e Interleucina6 (Hawke & Garry, 2001; Charge & Rudnicki, 2004).

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Resposta imune
LIF IL-6 PDGF Citocinas IGF-I IGF-II FGF TGF- HGF

Outros fatores

Neurnio motor

Macrfagos Neutrfilos Linfcitos T Plaquetas

Testosterona NO

Neurotransmissores Fatores neurotrficos

Clula satlite
EGF PDGF IGF-I IGF-II EGF HGF

IGF-I IGF-II TGF- HGF FGF

Vasculatura

Fatores autcrinos

Figura 6- Influncia do microambiente na ativao das clulas satlites (Hawke & Garry, 2001) EGF - Fator de crescimento para endotlio, FGF - Fator de crescimento para fibroblasto, HGF Fator de crescimento de hepatcito, IGF-I - Fator de crescimento tipo insulina 1, IGF-II - Fator de crescimento tipo insulina 2, IL-6 - Interleucina-6, LIF - Fator de inibio da migrao macrfago, NO - xido Ntrico, PDGF - Fator de crescimento derivado de plaqueta, TGF- Fator de crescimento de transformao-.

1.4.2 Contribuio de outras clulas miognicas no reparo do tecido muscular Nos ltimos anos, vrios trabalhos tm mostrado que outras populaes celulares podem participar da regenerao muscular. Os experimentos de Ferrari e colaboradores mostraram que aps um transplante de medula ssea, clulas derivadas do doador so capazes de participar da regenerao do

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tecido muscular (Ferrari et al., 1998). Apesar das clulas derivadas da medula ssea contribuir bem menos que as clulas satlites, este experimento criou enorme interesse no potencial de diferenciao plstico e na possibilidade de novas estratgias teraputicas. Essas populaes residem no msculo esqueltico ou podem ser recrutadas de compartimentos no musculares em resposta injria e regenerao (figura 7). As SP (side population), caracterizadas pela expresso de Sca-1high e CD45low ,constituem uma populao de clulas progenitoras residentes nos tecidos adultos (medula ssea; msculo esqueltico). Estas clulas aumentam em nmero aps a injria e participam na regenerao (Meeson et al., 2004). MDSC (muscle-derived stem cells) so outra populao de clulas tronco com potencial miognico isoladas do msculo esqueltico adulto expressando os marcadores Sca-1 e CD34 (revisado em Shi & Garry, 2006).

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Clula satlite Miofibra Clulas intersticiais

Progenitores vasculares

Mioncleo

Miofibra Cls de m. ssea

Figura 7: Possveis repositores de mioncleos durante a regenerao muscular. A maioria das clulas satlites (Pax3+/Pax7+) derivada do somito. Clulas progenitoras que tambm contribuem para o pool de clulas satlites e regenerao muscular incluem: clulas intersticiais (muscle derived stem cells ou MDSC, SP, CD45+/Sca-1+, Sca-1+, CD34+); clulas de medula ssea (clulas tronco hematopoticas, clulas tronco mesenquimais, clulas progenitoras adultas multipotentes) e progenitores vasculares (Shi & Garry, 2006)

Existe evidncia experimental que progenitores associados a vasos derivados da aorta dorsal apresentam potencial miognico e so capazes de participar da regenerao muscular. Outros componentes vasculares como progenitores endoteliais e pericitos tambm apresentam potencial miognico (Shi & Garry, 2006). As MDSCs residentes no msculo esto intimamente associadas a vasculatura, especificamente aos capilares ao redor da fibra, apesar de tambm serem encontradas sob a lmina basal das miofibras, um

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stio preferencial das clulas satlites. Tanto as clulas endoteliais como 60% das MDSCs so CD34+Sca1+ sugerindo serem subpopulaes de clulas endoteliais. Essas clulas se diferenciariam em clulas do endotlio vascular e fibras do msculo esqueltico aps serem implantadas no msculo (Peng & Huard, 2004). As clulas precursoras miognicas no somente contribuem para regenerar miofibras no msculo lesionado, mas tambm so capazes de reconstituir o compartimento de clulas satlites. Contudo, a freqncia muito baixa (mesmo na injria) comparando-se com o nmero de mioblastos derivados de clulas satlites. O aumento do recrutamento dessas clulas para a leso atravs do aumento da expresso local de IGF-1 ou SDF-1 no aumentou o nmero de mioncleos originados do doador (Askari et al., 2003; Musaro et al., 2004). Por isto, importante investigar os mecanismos e sinais envolvidos na fuso ou transdiferenciao a fim de propor novas estratgias para aumentar a eficincia da converso de outras clulas precursoras (Long et al., 2005).

1.5

PARTICIPAO DA INFLAMAO NO REPARO TECIDUAL

O dano tecidual inicia uma invaso rpida e seqencial de clulas inflamatrias que persistem por dias ou meses, enquanto ocorre a regenerao e/ou reparo do tecido (figura 8). A participao da inflamao no reparo um fenmeno complexo e nem sempre benfico para o tecido. Mesher e Neff propuseram que a evoluo do sistema imune de mamferos gerou interaes celulares inflamatrias nos stios de injria proporcionando maior defesa contra microorganismos e facilitao do reparo tecidual, embora prejudicando a

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capacidade regenerativa do tecido. A leso normalmente est associada formao de tecido cicatricial e fibrose, sendo este fenmeno um resultado direto das interaes inflamatrias do sistema imune e fibroblastos no stio da injria (Mescher & Neff, 2005).

Coagulao Inflamao Migrao/proliferao

Neutrfilos Plaquetas Macrfagos Nmero de clulas Fibroblastos

Remodelagem

Linfcitos

Dias aps ferida

Figura 8 - Cintica da migrao celular nas fases da leso tecidual (Witte & Barbul, 1997)

Os macrfagos e neutrfilos possuem papel importante na injria, pela sua atividade microbicida e fagoctica de modo a garantir no s a destruio de agentes infecciosos, mas promovendo a remoo de debris celulares que possam amplificar a inflamao e atrapalhar o processo de reparo do tecido. Entretanto, em modelos de leso muscular j foi mostrado que neutrfilos podem promover dano muscular atravs da produo de molculas citotxicas e citolticas (Tidball, 2005). Alm da atividade fagoctica, os macrfagos secretam citocinas, fatores de crescimento e xido ntrico (NO), agentes que

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esto envolvidos em diversos processos necessrios para o reparo em diferentes tecidos como por exemplo: pele, tecido muscular, fgado, endotlio e pulmo (Shi et al., 1997; Cowin et al., 1998; Oliveira et al., 2000; Sandler et al., 2003; Park & Barbul, 2004). Citocinas e fatores de crescimento regulam a quimiotaxia e proliferao de fibroblastos, a sntese de colgeno e a angiognese (Granstein et al., 1987; Gillery et al., 1992; Park & Barbul, 2004). A liberao de NO regula a formao de colgeno, a proliferao celular e a contrao da leso em modelos animais de reparo tecidual (Hesse et al., 2001; Witte & Barbul, 2002; Park & Barbul, 2004). No msculo esqueltico j foi mostrado que macrfagos so essenciais para desencadear o processo de regenerao aps transplante de mioblastos (Lescaudron et al., 1999). Alm disso, meio condicionado de cultura de macrfagos peritoneais pode aumentar a proliferao de mioblastos in vitro bem como o nmero de clulas expressando Myo-D. Entretanto os mecanismos envolvidos nesses processos no so claros (Tidball, 2005). Clulas do sistema imune inato possuem mecanismos para integrar a resposta imune e reparo tecidual, incluindo uma variedade de receptores de superfcie como Toll (TLRs) que reconhecem todas as classes de microorganismos invasores como tambm protenas de choque trmico que so liberadas do tecido necrosado ou danificado. A ligao a tais receptores ativa a sntese de citocinas que amplificam a inflamao, aumentando a resposta a microorganismos e promovendo o reparo tecidual. Receptores Toll foram primeiramente descritos em drosfilas controlando o padro dorsoventral nos embries em desenvolvimento porm TLR de vertebrados possui efeitos alm do reconhecimento imune (Mescher & Neff, 2005), isto porque a

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via TLR de clulas imunes induz a expresso de muitos genes diretamente envolvidos no reparo tecidual, incluindometaloproteases, citocinas e fatores angiognicos (Li et al., 2001). O papel dos linfcitos na inflamao e reparo tecidual complexo e ainda pouco compreendido. No existem evidncias claras da participao direta de linfcitos B no reparo tecidual contudo imunoglobulinas reativas facilitam na remoo do tecido lesionado facilitando a fagocitose e/ou citotoxicidade por macrfagos (Casadevall & Pirofski, 2003; Park & Barbul, 2004). Os linfcitos T podem participar do processo de reparo, tanto propiciando a melhora tecidual como amplificando a leso, direcionando o processo para uma remodelagem no funcional, que peculiar a cada tipo de tecido (Kovacs & DiPietro, 1994; Sandler et al., 2003). Ablao do timo em ratos aumenta a maturao de feridas e a produo de um colgeno mais fibroso com alto grau de hidroxilao (Barbul et al., 1982). Esse efeito inibido por enxerto de timo na cavidade peritoneal. Camundongos nude atmicos, independentemente da linhagem de origem, produzem cicatrizes mais finas, quase indistinguveis do tecido normal adjacente, associadas com a diminuio de clulas T CD8+ das leses (Gawronska-Kozak et al., 2006). Neste sentido, Morrison e colaboradores mostraram que o acmulo de colgeno intramuscular no camundongo mdx, modelo murino de distrofia muscular, muito influenciado pela presena de linfcitos T (Morrison et al., 2000). A contribuio de clulas T CD4+ no reparo tecidual seria principalmente pela secreo de citocinas. Durante a inflamao ou infeco, linfcitos T so polarizados em clulas efetoras Th1 e Th2 com perfis distintos de produo de citocinas. As chamadas citocinas Th1 incluem IFN-, IL-2, IL-12, IL-18 e

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produzem imunidade celular por ativar clulas T citotxicas, NK e macrfagos. Citocinas Th2, notadamente IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 estimulam uma resposta imune humoral. Vrios autores sugerem que citocinas Th1 promovem regenerao da arquitetura do tecido normal, enquanto citocinas Th2 favorecem a ativao de fibroblastos, produo de colgeno e fibrognese (Sime & O'Reilly, 2001; Azouz et al., 2004). Essas citocinas podem ser produzidas tambm por outras clulas incluindo fibroblastos, macrfagos e mastcitos (Sime & O'Reilly, 2001). A influncia do perfil de citocinas na induo de fibrose evidente no modelo de leso heptica, onde camundongos BALB/c com padro Th2 apresentam intensa fibrose aps leso heptica ao contrrio dos camundongos C57BL6 com padro tpico Th1, que apresentam menos fibrose. O envolvimento das citocinas na induo de fibrose foi mostrado pelo tratamento destes animais com anticorpos neutralizantes para IL-4 ou com IFN- exgeno resultando na atenuao da fibrose (Shi et al., 1997). IFN- um potente inibidor da proliferao de fibroblastos e da sntese de colgeno e tambm um regulador positivo da ao dos macrfagos (Shffer & Barbul, 1998). IFN- inibe a sinalizao do TGF-1 que um estimulador de fibrose, sendo assim, reduz a formao de fibrose e aumenta a cicatrizao. Recentemente foi mostrado que a inoculao de IFN- reduz a fibrose e melhora o reparo do tecido muscular no modelo de leso muscular lacerante (Foster et al., 2003). A remodelagem tecidual associada com padro Th2 induz um aumento na produo de colgeno por vrios mecanismos, contudo IL-13 parece ser o mediador crucial atravs da estimulao da produo de TGF-1 por macrfagos. Outro mecanismo provvel de ao de Th1 no reparo

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atravs da induo da expresso de iNOS em macrfagos, uma vez que regula a produo de colgeno (Hesse et al., 2001). TGF-, citocina produzida principalmente por fibroblastos, algumas clulas epiteliais, macrfagos e linfcitos T indiscutivelmente, o regulador de fibrose mais intensivamente estudado (Mescher & Neff, 2005). In vitro, o TGF- um potente quimioatraente para fibroblasto que estimula a sntese de colgeno e fibronectina (Shffer & Barbul, 1998). Existem 3 isoformas de TGF em mamferos TGF-1, -2 e -3. A fibrose tecidual principalmente atribuda a isoforma 1. TGF-1 uma citocina armazenada na forma inativa, como um homodmero que no covalentemente acoplado a uma protena associada latncia (LAP). A ligao da citocina aos seus receptores requer a dissociao do LAP, um processo catalisado por vrios agentes, entre eles plasminognio, trombospondina e MMPs (metaloproteases). Alm da induo da produo de TGF-1 latente, a IL-13 ativa TGF- ao regular a expresso de MMPs que clivam o complexo TGF/LAP. No msculo, a cascata fibrognica tambm iniciada por TGF-1 e recentemente foi mostrado que este induz clulas precursoras miognicas a se diferenciarem em miofibroblastos no msculo lesado (Li et al., 2004). Sabe-se que o TGF- inibe a diferenciao das clulas miognicas e impede a expresso do MyoD (Tidball, 2005). O processo de fibrose uma das etapas patolgicas mais importantes da regenerao muscular. Acredita-se que a fibrose ocorra em resposta ao estmulo de mediadores inflamatrios como o TGF-, que acelera a deposio e sntese da matriz extracelular mas inibe a sua degradao (Li et al., 2004). O aumento da expresso de TGF-1 acarreta na diferenciao de mioblastos em clulas fibrticas mas o tratamento com decorina, um inibidor do TGF-1, evita

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esse processo (Li et al., 2004). O papel do TNF- na leso muscular e regenerao pode variar com o tipo, a gravidade, localizao e estgio da leso.(Tidball, 2005). J foi visto que TNF- capaz de inibir a sntese de colgeno e fibronectina pelos fibroblastos e diminuir a proliferao das clulas endoteliais (Shffer & Barbul, 1998). TNF- tambm aumenta a proliferao e a agregao de mioblastos. Em contraste o TNF inibe a expresso dos fatores de transcrio MyoD e miogenina, que regulam a atividade de genes especficos como genes de protenas de miofilamentos, e bloqueia a sntese de mRNAs de marcadores de diferenciao miognicos como -actina (Szalay et al., 1997). Fibroblastos e outras clulas estruturais expressam o receptor de superfcie CD40 e so por isto capazes de receber ativao adicional por CD40L na superfcie de linfcitos T helper, mastcitos, basfilos eosinfilos e plaquetas. A sinalizao via CD40 em fibroblastos ativa o fator de transcrio NF-b que em fibroblastos estimula a sntese de citocinas adicionais, componentes da matriz extracelular (ECM) e ciclo-oxigenase-2 (COX-2). COX2 em fibroblastos induz a produo de PGE2 (protraglandina E2). PGE2 alm de estimular vrios aspectos da inflamao como dor e febre tambm estimula a produo de citocinas Th2 promovendo a fibrose (revisado em Mescher & Neff, 2005) - ver Figura 9.

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Injria e inflamao Tipo I

Tipo II

Resoluo normal

Fibrose

Fibrose e acmulo de miofibroblastos Deposio de ECM

Destruio da citoarquitetura Alterao de funo

Figura 9 Regulao do desenvolvimento de fibrose na leso tecidual. (Sime & O'Reilly, 2001)

1.6 METALOPROTEASES NA REGENERAO E REPARO DO TECIDO MUSCULAR Durante a degenerao e regenerao do msculo esqueltico ocorre uma remodelagem da ECM. Esse processo coordenado

pelasmetaloproteases (MMP) e serino-proteases endopeptidases dependentes de ons Zn+2 e/ou Ca+2 com estrutura molecular composta por pelo menos de trs domnios: um peptdeo sinal de aproximadamente 20 aminocidos; um propeptdeo que mantm a latncia da protena por possuir uma conformao especfica entre cistenas e um on Zn+2 contendo aproximadamente 80 aminocidos e um stio cataltico de aproximadamente 170 aminocidos

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(Goldman et al., 2003). A expresso e atividade das MMPs so reguladas tanto ao nvel de transcrio pelas citocinas e fatores de crescimento e a nvel pstraduo, pela secreo dessas enzimas em formas latentes (pr-pr-MMP) e ativao de zimognios (pr-MMP) por integrinas e proteases presentes tanto no meio extracelular como as associadas membrana celular (Lafreniere et al., 2004). Existe um balano delicado entre a produo endgena de inibidores teciduais TIMPs (inibidores de MMP no tecido) e a produo de MMP no microambiente determinando a remodelagem fisiolgica ou destruio patolgica do tecido (Nagase et al., 2006). Existem cinco famlias demetaloproteases: as gelatinases, as

colagenases, as estromelisinas, as metaloelastases e asmetaloproteases de membrana que so protenas integrais de membrana. Sua ativao se d em duas etapas. Primeiramente ocorre uma clivagem inicial por ativadores como citocinas, hormnios, fatores de crescimento e NO desestabilizando a coordenao entre o Zn+2 e as cistenas, e em seguida ocorre uma clivagem final geralmente por outra MMP liberando o radical amino terminal da enzima madura (Johnson et al., 1998). Durante o processo inflamatrio as MMPs so produzidas por quase todas as populaes recrutadas, alm estarem aumentadas nas clulas residentes como miofibras prximas a uma leso e em progenitores como as clulas satlites (Kherif et al., 1999). As MMPs participam do processo inflamatrio regulando a atividade das citocinas e quimiocinas e modulando a sua biodisponibilidade, uma vez que estas esto aderidas a matriz extracelular (Roach et al., 2002). Como exemplo podemos citar a MMP-2, que capaz de clivar a quimiocina CCL7. A quimiocina clivada ainda capaz de se ligar aos

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seus receptores, porm perde sua capacidade quimiottica e atua como antagonista de todas quimiocinas que se ligam aos mesmos receptores que a CCL7. Por outro lado a MMP-8 quando cliva a quimiocina CXCL5 gera diversos peptdeos com ao quimiottica para neutrfilos (Parks et al., 2004). As MMP-9 (gelatinase A) e MMP-2 (gelatinase B) constituem as principaismetaloproteases envolvidas no reparo do tecido muscular (Kherif et al., 1999; Carmeli et al., 2004). A MMP-9 est associada com a migrao de clulas inflamatrias e possivelmente ativao de clulas satlites, enquanto a MMP-2 constitutiva do tecido muscular, mas est aumentada durante o processo de regenerao muscular (Kherif et al., 1999). Em camundongos C57BL10 com leso muscular induzida por cardiotoxina, a MMP-9 est muito aumentada durante o auge da inflamao com predomnio de macrfagos e neutrfilos (Kherif et al., 1999). A partir da segunda semana, os nveis de MMP9 diminuem e a MMP-2 atinge o mximo. A expresso de MMP-2, presente de forma constitutiva no tecido muscular, regula a integridade e composio da composio da ECM, e tambm a proliferao e diferenciao de mioblastos (revisado em (Carmeli et al., 2004). A participao de MMP-2 durante a fuso de mioblastos deve-se em parte degradao de colgeno tipo IV como tambm outros componentes da membrana basal como a entactina (Kherif et al., 1999).

1.7

MODELOS ANIMAIS DE INJRIA MUSCULAR Os modelos animais de injria muscular (mecnicos, fsicos ou

qumicos) tm sido utilizados com o intuito de trazer uma melhor compreenso

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na dinmica da leso e reparo do tecido muscular (Hawke & Garry, 2001). O modelo de leso muscular pelo esmagamento muito utilizado para estudar fatores que influenciam a fibrose. Outros modelos tambm muito utilizados so a denervao (Mussuni et al., 1987) e induo de leso por congelamento (Creuzet et al., 1998). Para estudar o processo de regenerao muscular de forma controlada e reproduzvel utilizam-se as miotoxinas, entre elas a cardiotoxina (CTX), notexina (NTX) e bupivacana. Essas toxinas tm uma ampla gama de atividades biolgicas, que no so completamente conhecidas. A cardiotoxina um peptdeo extrado do veneno de cobra que induz a desorganizao do sarcolema. NTX uma fosfatase A2 neurotxica tambm retirado do veneno de cobra que bloqueia a transmisso neuromuscular inibindo a liberao da acetilcolina. CTX induz uma forma bastante reproduzvel de leso muscular, porm ainda no so conhecidos os efeitos dessa toxina sobre os vrios tipos de clulas musculares, incluindo as miognicas progenitoras (Charge & Rudnicki, 2004). Bupivacana, um anestsico muito utilizado em obstetrcia, induz um processo de regenerao muscular com etapas bem definidas de mionecrose e inflamao seguida de regenerao do tecido muscular. Neste modelo normalmente aps 10 dias de induo da injria ocorre estabilizao da arquitetura tecidual (Hawke & Garry, 2001; Sandri, 2001; Charge & Rudnicki, 2004). A regenerao rpida neste modelo devido preservao das clulas satlites, do suprimento sanguneo e da inervao (Nonaka et al., 1983). A bupivacaina induz necrose, e em menor extenso, apoptose das miofibras pelo aumento de clcio intracelular (Zink & Graf, 2004). As clulas satlites parecem

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mais resistentes ao lesiva da bupivacana do que as clulas musculares maduras (Nonaka et al., 1983). Modelos de animais de laboratrio com degenerao anormal devido a desregulao espontnea ou artificial de genes especficos tambm so de grande interesse. Por exemplo, o camundongo mdx comumente usado como modelo animal da distrofia muscular de Duchenne (DMD) e como um modelo alternativo de degenerao para estudo do reparo muscular. Esses animais apresentam uma mutao no cromossoma X o que determina a no expresso de distrofina, uma protena localizada internamente no sarcolema associada ao citoesqueleto, essencial para manter a integridade da fibra muscular. Os camundongos mdx apresentam miopatia inflamatria com ciclos de mionecrose e regenerao do tecido muscular (De la Porte et al., 1999). Ao contrrio dos camundongos mdx, a doena fatal nos humanos, sendo este modelo animal muito utilizado para estudar os fatores que influenciam a regenerao do tecido muscular. Existem ainda outros modelos com particularidades genticas, onde se estuda a regenerao em camundongos deficientes de genes miognicos como Pax7 e MyoD e transgnicos para fatores sistmicos com influncia no crescimento muscular como IGF-1 (Charge & Rudnicki, 2004).

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2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL Analisar a influncia do microambiente no processo de regenerao muscular em linhagens de camundongos com padro de citocinas Th1 ou Th2 utilizando o modelo de induo de leso muscular da bupivacana.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Comparar as alteraes histolgicas na rea da leso induzidas por bupivacana entre as linhagens de camundongos BALB/c e C57.

Analisar a expresso de colgeno na leso atravs da colorao especial de picrosirius

Caracterizar por imuno-histoqumica as clulas mononucleares do infiltrado celular presente na leso.

Caracterizar por citometria de fluxo os subtipos de linfcitos nos linfonodos de drenagem do tecido muscular lesionado

Analisar a atividade das metaloproteases MMP-2 e MMP-9 no msculo lesionado pela tcnica de zimografia

Analisar a expresso do mRNA para citocina TGF- no msculo lesionado atravs da tcnica de RT-PCR.

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3. MATERIAL & MTODOS

3.1 Animais Nos experimentos foram utilizados camundongos machos isognicos na idade de 5 a 6 semanas das linhagens C57BL10, C57BL6, BALB/c. Os animais foram mantidos em ambiente refrigerado (20 C) e aclimatado com ciclo de iluminao 12:12 horas, no Biotrio da Fundao Oswaldo Cruz e no Biotrio de Patologia Celular do Instituto de Biologia da UFF. Os animais foram mantidos em gaiolas de prolipropileno forradas com maravalha peneirada e autoclavada recebendo rao Nuvital (Curitiba, Brasil), suplementao alimentar (farelo de trigo e semente de girassol) e vitamnica (Vitagold), gua filtrada ad libitum.

3.2 Induo da leso muscular A leso muscular foi induzida nos animais saudveis pela inoculao de 34l de cloridato de bupivacana a 0,5% diludo em salina estril (Mussuni et al., 1987) no msculo Triceps brachii de ambos os membros. A inoculao foi realizada com seringa Hamilton de 100L acoplada a dosador mecnico. Os grupos controle e sham foram submetidos s mesmas condies experimentais porm inoculados com PBS. Os animais foram sacrificados com vapor de CO2 1, 4 , 8 e 12 dias aps a induo de leso. O msculo T.brachii foi processado adequadamente para realizao das tcnicas de histologia, imuno-

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histoqumica, zimografia, PCR e western blot e os linfonodos braquial e axilar para citometria de fluxo.

3.3 Processamento histolgico Para o processamento histolgico os msculos foram fixados durante 24 horas em formol tamponado Milloning a 10% pH 7,2. Os tecidos foram desidratados em solues com concentrao crescente de lcool etlico (70%, 80%, 90%) num perodo de 60 minutos cada, passados 3 vezes em lcool absoluto e 3 vezes em Xilol (Reagen). A impregnao e incluso em parafina (paraplast, Sigma, USA) foi efetuada em duas incubaes durante 1 hora a 60 C. Os msculos foram clivados e includos transversalmente com as pores centrais do fragmento posicionadas mais externamente no bloco. Foram feitos em mdia 10 cortes de 5m de espessura no micrtomo Spencer 820 (American Optical, EUA) aps chegar no nvel da leso muscular. Os cortes foram colocados em lminas de microscopia desengorduradas e previamente filmadas com soluo de glicerol-albumina (0,5%), mantidos em estufa a 37C durante 12 horas e submetidos s coloraes histolgicas de hematoxiliaeosina (HE), Picrosrius e Giemsa.

3.4 Imuno-histoqumica O msculo T. brachii foi cuidadosamente removido, congelado em nitrognio lquido e includo em OCT (Sakura, EUA). Cortes de 5 m de espessura foram colocados em lminas desengorduradas e previamente filmadas com poli-L-lisina (Sigma Chem. Co, Mo, EUA). Aps a fixao por 10

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minutos em acetona a -20C, os cortes foram mergulhados em soluo de salina-fosfato tamponada (PBS pH 7,2) por 5 minutos. A inibio da peroxidase endgena foi feita com 3% perxido de hidrognio (Merck do Brasil) por 30 minutos. Os cortes foram hidratados com PBS por 5 minutos e, posteriormente feito o bloqueio de antgenos inespecficos incubando com PBS contendo 2% de albumina bovina (BSA frao V, Sigma Chem. Co., EUA) durante 30 minutos a 37 A seguir os cortes foram incubados com os anticorpos C. primrios diludos em PBS (30l) por 1 hora a 37 C (ver tabela 1). Aps trs lavagens sucessivas de 5 minutos com PBS, os cortes foram incubados em cmara mida com anticorpo secundrio apropriado diludo em PBS (30l) por uma hora temperatura ambiente. Aps novas lavagens com tampo PBS, a revelao da peroxidase foi feita com aminoetilcarbazol (AEC, Sigma Chem. Co., EUA) na presena de 3% de perxido de hidrognio (Merck do Brasil). Todos os cortes foram contra-corados suavemente com hematoxilina de Mayer por 2 minutos e montados em meio de montagem a base de gelatina.

Tabela 1: Relao dos anticorpos monoclonais utilizados na imuno-histoqumica. Anti-CD4.biotina Anti-CD8.biotina Anti-F4-80 Anti-Mac-1.biotina Anticorpos monoclonais rato rato rato rato Origem Caltag Caltag Serotec Pharmingen Fonte 1/80 1/80 1/40 1/30 Diluio

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3.5 Histomorfometria Nas lminas com colorao para Picrosrius foi realizada a quantificao do percentual de rea de depsito de colgeno por rea de leso com o programa Analisys (Soft Image System, Alemanha). Foram escolhidos 3 campos aleatrios em cada anlise.

3.6 Citometria de fluxo Os linfonodos braquiais e axilares dos camundongos controles, sham e inoculados foram cuidadosamente retirados e dissociados com o auxlio de pinas finas e tamiz de nylon em meio de cultivo RPMI 1640 (Sigma Chem. Co., EUA) contendo 2% de soro bovino fetal (Cultilab, So Paulo, Brasil). Aps a determinao da celularidade atravs de contagem em cmara de Neubauer, 106 clulas foram incubadas com PBS contendo 10% de soro normal de camundongo e 2% de soro bovino fetal durante 10 minutos para evitar ligaes no especficas. A tripla marcao foi feita pela incubao das clulas com os anticorpos monoclonais na diluio apropriada previamente determinada (Tabela 2) durante 20 minutos a 4C. As clulas foram ento lavadas duas vezes em PBS contendo 2% de soro bovino fetal, recolhidas em tubos e fixadas em PBS contendo formol 1% e azida sdica 0,05% e analisadas num FACScalibur (Becton Dicknson, San Diego , EUA). A regio de clulas vivas foi determinada usando os parmetros de foward versus side scatter e foram coletados 10000 eventos em cada amostra. Para a anlise dos dados foi utilizado o software Winiwind verso 2,8 (Scion Corporation, EUA).

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Tabela 2: Relao dos anticorpos monoclonais utilizados na citometria de fluxo. Anticorpos monoclonais Anti-CD3 Anti-B220 Anti-CD4 Anti-CD8 Anti-CD25 Anti-CD62L Anti-CD44 Fluorocromo Fitc Fitc Pe Spectral red Fitc Fitc Fitc Fonte Pharmingen Pharmingen Pharmingen Southern Sigma Pharmingen Pharmingen Diluio 1/300 1/400 1/300 1/600 1/5 1/100 1/50

3.7 RT-PCR 3.7.1 Extrao de RNA total O RNA total foi isolado pelo mtodo de TRIzol Reagent (Invitrogen, CA, EUA). Os msculos foram homogeneizados na proporo de 50mg de tecido para 1000l de Trizol e centrifugados a 12.000 xg por 10 minutos a 4 C para remover o fragmento de tecido no dissolvido. Os sobrenadantes foram congelados a -20 at o momento de uso. Aps serem descongelados, foi C adicionado 200l de uma soluo de clorofrmio/ lcool isoamlico na proporo 24:1 (v:v) seguindo-se nova homogeneizao. Aps 10 minutos no gelo, a mistura foi centrifugada a 12.000 xg por 15 minutos a 4 A fase C. aquosa foi coletada e transferida para outro tubo contendo o mesmo volume de isopropanol (Merck do Brasil). As solues foram agitadas at a

homogeneizao, armazenadas a -20 por no mnimo 3 0 minutos e C

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centrifugadas novamente a 14.000 xg por 20 minutos a 4 O pellet foi lavado C. com 600l de etanol gelado a 70% e submetido nova centrifugao de 14.000 xg por 15 minutos a 4 O RNA foi dissolvido em 15 l de H2O livre de RNAse C. e estocado a -70 C.

3.7.2 Eletroforese de RNA Aps a extrao do RNA total, a sua integridade foi verificada em gel desnaturante de agarose-formaldedo 1,2%. A amostra de RNA (5l) foi diluda em 10l de formamida (Merck do Brasil), 4l de tampo MOPS 5X (Invitrogen, Brasil), 1,3l de 37% formaldedo (Merck do Brasil), 1l de (1l/ml) brometo de etdio (Sigma Chem. Co., EUA) e 1l de azul de bromofenol (Merck do Brasil), seguido de incubao por 10 minutos a 65 A mistu ra foi mantida no gelo at C. sua aplicao no gel. A corrida de eletroforese foi feita a 75V por 1 hora em cuba horizontal (Kodak, EUA). A integridade do RNA foi avaliada no transiluminador de luz ultravioleta observando-se a integridade das bandas de RNA ribossomal de 17 e 28S. A pureza e a concentrao do RNA extrado foi determinada atravs de leitura em espectrofotmetro em comprimento de onda 260 e 280nm. Considerando-se que 1 unidade de DO260 equivale a 40 g/mL de RNA, foi realizado o clculo da razo entre a DO em 260 e 280nm para estimar o grau de pureza do RNA total. Somente foi utilizado RNA com a razo entre 1,6 e 2,0.

35

3.7.3 Transcrio reversa do RNA e PCR Foi utilizado o kit SuperScrip One-Step com Platinum Taq (Gibco-BRL Life Tecnologies, NY, EUA), onde se realiza a produo do cDNA e o PCR concomitantemente. Em um tubo contendo 1g de RNA foi adicionado 25 l do Mix de reao 2x, 0,4 l de MgSO4 a 50 mM, 1 l da seqncia de oligonucleotdeos (primer) sense, 1 l do primer anti-sense, 1 l de RT/Platinum Taq Mix e completado o volume para 50 l de gua livre de RNAse (RF). As amostras foram colocadas no termociclador (Amersham, Inglaterra) a 50 por 30min para sntese do cDNA e a 94 por 2 min para C C ativao da Taq e desnaturao do RNA/ cDNA. As amplificaes foram realizadas em 30 ciclos: desnaturao 94 por 15 s , anelamento 60 por 30s C C e sntese em 72 por 3 min. A extenso final foi f eita em 1 ciclo a 72 por 10 C C min. As amostras foram analisadas em gel de agarose 1,7% contendo 1 g/ml de brometo de etdio e visualizadas no transiluminador, e o resultado expresso como razo TGF-/gene constitutivo GAPDH.

. Tabela 3: Lista de oligonucleotdeos:

Sense TGF- GAPDH CAAGGAGACGGAATACAGGGCT GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGA Antisense CGCACACAGCAGTTCTTCTCTGT TGTTAGTGGGGTCTCGCTCCTG

36

3.8 Zimografia 3.8.1 Preparo do extrato tecidual Os msculos inoculados e controles foram coletados e imediatamente congelados e preservados em nitrognio lquido (-165oC). Os msculos foram pesados e homogeneizados (1/10, p/v) em tampo de extrao (100 mM TrisHCl, pH 7,6, 200mM NaCl, 100mM CaCl2 e 1% Triton X-100) 4oC. Aps a centrifugao (15.000 xg), o sobrenadante foi dividido em alquotas de 100 l, e a concentrao protica determinada utilizando-se uma curva padro de albumina pelo mtodo de Lowry (Lowry et al., 1951). A mesma quantidade de protena total foi usada para zimografia (60 g/poo).

3.8.2 Gel para zimografia As zimografias foram executadas segundo protocolo previamente descrito (Heussen & Dowdle, 1980) em gel de poliacrilamida SDS-PAGE a 7,5% contendo gelatina do tipo A de pele suna (Sigma Chem. Co, St. Louis, Mo. EUA) na concentrao de 2 mg/mL e os gis de entrada poliacrilamida 5% (w/v). A eletroforese foi realizada com a concentrao de 60g de protena para cada uma das amostras aplicadas nos gis a 165 Volts por um tempo mdio de 60 minutos (Power Pac 200 Bio-Rad, EUA). Aps a eletroforese os gis foram lavados duas vezes em 2.5% Triton X-100 para total remoo do SDS seguido de incubao a 37C em tampo contendo o substrato (10 mM Tris HCl buffer, pH 7.5, 5 mM CaCl2, ZnCl2 1M ) por 24 horas. SDS o agente responsvel pela ativao das metaloproteases mesmo na forma inativa sem clivagem proteoltica (Talhouk et al., 1991). Os gis foram corados pelo

37

Coomassie blue R250 (Sigma Chem. Co, EUA) e descorados em soluo descorante contendo 50% metanol, 10% cido actico e 40% qsp de H2O. A atividade da gelatinase foi visualizada por bandas no marcadas em um fundo azul representando reas de protelise no substrato de protena. As metaloproteases so secretadas na forma latente e necessitam da clivagem do terminal peptdico NH2 para ativao. A anlise semiquantitativa foi feita usando o programa de anlise de imagem (Scion Program National Institutes of Health, Image Program, EUA).

3.9 Anlise estatstica Microsoft Excel software (Microsoft, EUA) foi usado para calcular mdias e desvios padres. O teste t de Students foi aplicado para acessar o nvel de significncia estatstica das amostras.

38

4. RESULTADOS

4.1 Anlise histolgica da leso muscular

Os animais foram sacrificados 4, 8 e 12 dias aps inoculao (dpi) de bupivacana. Os msculos Triceps brachii foram processados e emblocados em parafina, posteriormente foram feitos cortes de 5 m de espessura no micrtomo manual. Como coloraes de estudo foram escolhidas o H-E pois permite evidenciar mais claramente a citoarquitetura e a nucleao da miofibra, e o Giemsa por evidenciar mais claramente as miofibras regenerando e o infiltrado inflamatrio. Para cada grupo foram utilizados no mnimo 3 animais. A anlise histolgica do msculo esqueltico dos camundongos BALB/c sacrificados no quarto dia aps a inoculao (4dpi), mostrou grandes reas de leso com predomnio de clulas mononucleares no infiltrado inflamatrio, mionecrose e perda da citoarquitetura normal da miofibra (Figura 10D). Os camundongos C57BL6 apresentaram infiltrado inflamatrio mais intenso e menor alterao da citoarquitetura (Figura 10A). Pela colorao de Giemsa, podemos observar um grande nmero de miofibras regenerando evidenciadas pelo citoplasma basoflico e nucleao central principalmente nos camundongos C57BL6. Inclusive, pode-se

evidenciar nestes animais mioblastos se fusionando para formao de novas miofibras (Figura 11A). Em 8 dpi (Figura 10E e 11E) camundongos BALB/c apresentaram miofibras regenerando mas ainda com reas de infiltrado inflamatrio intenso, contudo em camundongos C57BL6 era

39

restrito. Em 12 dpi ambas as linhagens de camundongos apresentaram miofibras regenerando com nucleao central (Figura 10C, 10F, 11C, 11F).

40

B6

Balb/c

4 dpi

A
0,05mm 0,05mm

8 dpi

0,1mm

0,1mm

12 dpi

0,1mm

0,1mm

Figura 10 : Cintica da leso muscular induzida por bupivacana nas linhagens de camundongo Painel com fotomicrografias da leso muscular corada por H-E em 4 (A, D), 8 (B, E) e 12 (C, F) dias aps inoculao de bupivacana nos camundongos C57BL6 (A, B, C) e BALB/c (D, E, F). Infiltrado inflamatrio (seta), clulas musculares regenerando (setas largas). dpi (dias aps inoculao)

41

B6

BALB/c

* * *
0,05mm

4 dpi

*
0,05mm

*
8 dpi

0,1mm

0,1mm

*
0,1mm

12 dpi

0,1mm

Figura 11 : Painel com fotomicrografias da leso muscular coradas pelo Giemsa Fotomicrografias da leso muscular em 4 (A, D), 8 (B, E) e 12 (C, F) dias aps inoculao de bupivacana nos camundongos C57BL6 (A, B, C) e BALB/c (D, E, F). Infiltrado inflamatrio (seta fina), clulas musculares regenerando (asterisco). Setas grossas indicam mioblastos com citoplasma basoflico circundando fibras musculares.

42

4.2 Alteraes no microambiente da leso muscular 4.2.1 Colorao de picrosrius

Confirmadas as diferenas entre as leses musculares nas diferentes linhagens passamos para um estudo mais minucioso das alteraes observadas. Esse estudo essencial para sabermos os possveis mecanismos contribuindo para regenerao muscular. O primeiro fator abordado foi alterao do microambiente quanto produo de colgeno. Este componente da matriz extracelular exerce papel importante durante o processo de reparo, influenciando na migrao de leuccitos e no curso da regenerao, para uma resoluo cicatricial ou mais fisiolgica. Para visualizao do colgeno escolhemos a colorao de picrosirius que marca em vermelho as fibras colgenas. A leso muscular em 1dpi com bupivacana mostrou uma expresso discreta de colgeno entre as fibras musculares tanto na linhagem C57BL6 (Figura 12A) como BALB/c (Figura 12E), porm intenso depsito de colgeno prximo aos vasos no camundongo BALB/c (Figura 12E). Aps 4 dias de inoculao com bupivacana essa diferena era bem evidente. Enquanto os camundongos C57BL6 (Figura 12B) apresentavam maior regenerao, com vrias fibras com nucleao central e discreta deposio de colgeno, os camundongos BALB/c (Figura 12F) apresentavam grandes reas com mionecrose e aumento na deposio de colgeno em relao ao ponto anterior.

43

Em 8 (Figuras 12C e G) e 12 dpi (Figuras 12D e 12H) no foi encontrada diferena na expresso de colgeno entre as miofibras em duas linhagens A quantificao do colgeno utilizado o programa Analysis foi realizada somente dentro das reas de leso, evitando quantificar vasos e as fcias musculares. Os resultados apresentados na figura 13 mostram que em 1 dpi no existe diferena na mdia da expresso de colgeno. Contudo, 4dpi aps inoculao (Figura 13B) foi observado que o percentual da rea de leso ocupada por colgeno no BALB/c era 5,2 vezes maior do que no camundongo C57BL6 (p<0,05).

44

B6

BALB/c

1 dpi

0,1mm

0,1mm

F
4 dpi

0,1mm

0,1mm

8 dpi

0,1mm

0,1mm

12 dpi

0,1mm

0,1mm

45

Figura 12- Colorao de picrosrius da leso muscular Fotomicrografias de Trceps brachii coradas com picrosrius em 1 (A, E), 4 (B, F), 8 (C, G) e 12 (D, H) dias aps inoculao de bupivacana nos camundongos C57BL6 (A, B, C, D) e BALB/c (E, F, G, H). As setas indicam expresso de colgeno na leso e em torno dos vasos prximos a rea de leso. Barra = 0,1 mm; dpi: dias aps inoculao.

46

12

% rea

10 8 6 4 2 0 12

C57BL/06

BALB/C

10

0 C57BL/06 BALB/C

Figura 13: Histomorfometria da rea da leso ocupada por colgeno. Representao grfica da quantificao de colgeno pelo programa Analysis na leso em 1 dpi (A) e 4 dpi (B). As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05.

47

4.2.2 Atividade de metaloproteases no msculo lesionado

Utilizamos a tcnica de zimografia a fim de investigar a atividade da MMP-9 (100 kDa), pr-pr-MMP-2 (66 kDa), pro-MMP-2 (60 kDa) e a forma ativa da MMP-2 (55kDa). Foram coletados os msculos Triceps brachii inoculados com bupivacana de camundongos C57BL6, C57BL10 e Balb/c aps 1, 4 e 12 dpi. Semelhantemente ao encontrado anteriormente (Kheriff, 1999), os animais controles de ambas as linhagens apresentaram atividade da pr-pr MMP-2 (MMP-2PP) e da pr-MMP-2 e nenhuma atividade da MMP-9. A forma ativa da MMP-2 no foi encontrada nas amostras de msculo dos animais controles e inoculados com bupivacana, mas foi evidenciada em amostras de msculo de camundongo distrfico mdx utilizado como controle positivo (Figura 14A). A atividade da MMP-9, normalmente associada com processo inflamatrio, somente foi evidenciada nas leses musculares em 1 dpi (figura 14). Quando a atividade da MMP-9 foi comparada entre as linhagens verificou-se que C57BL10 apresentava um aumento de 3,8 vezes em relao ao BALB/c. A linhagem C57BL6 tambm apresentou nveis mais altos (2,5 vezes) que o BALB/c, porm esta diferena no foi significativa (figura 15A). A anlise da atividade da pro-MMP2 mostrou atividade prxima a encontrada no grupo controle e sem diferena significativa entre as linhagens em 1 dpi, apesar de ser encontrado nveis mais altos no camundongo C57BL10. Aps 4 dias de inoculao da bupivacana, foi evidenciada maior atividade da MMP-2 pro em todas as linhagens em relao a 1 dpi, apesar da forma ativa no ter sido detectada (figura 15B). O estudo comparativo entre

48

as linhagens mostrou que os camundongos BALB/c apresentavam atividade 1,1 vez menor que C57BL10. Entretanto foi observada uma diferena significativa entre as duas linhagens de C57, onde C57BL6 apresentava 1,6 vezes (p<0.05) menos pr-MMP-2. Aps 12 dias de induzida a leso muscular, os nveis da pr-MMP2 diminuram aproximando dos valores do camundongo controle. Entretanto os camundongos C57BL10 e C57BL6 mantiveram nveis mais altos quando comparados com o BALB/c, apesar desta diferena no ser estatisticamente significativa (figura 15C).

49

A
B6c
100 kDa

B6i

B10i

B10i

B10i

BAi

BAi

BAc

mdx

Vaso
MMP-9

66 kDa 60 kDa

MMP 2 PP MMP 2 Pr MMP 2 ativa

BAi
100 kDa

BAi

BAi

BAi

B10i

B10i

B10i

B10i

B6i

B6i

66 kDa 60 kDa

MMP 2 PP MMP 2 Pr

C
B6i B6i B6i B6 i B10i B10i B10i BAi BAi

100 kDa

66 kDa 60 kDa

MMP 2 PP MMP 2 Pr

MMP-2 PP MMP-2 Pro

Figura 14- Atividade de metaloproteases no msculo esqueltico. Zimografia de msculo esqueltico de camundongos controles e aps 1 (A), 4 (B) e 12 (C) dias aps inoculao de bupivacana. B6 = C57BL6, B10 = C57BL10, BA = BALB/c, c = controle, i= inoculado com bupivacana, mdx = camundongo distrfico.

50

UA 40000
30000 20000 10000 0

A
MMP-9
40000

MMP-2 pro

30000

20000

10000

0
MMP9

MMP2pro

UA 40000 *
30000

MMP-2 pro

20000

10000

0
B6 B10 BALB/c

UA

40000

MMP-2 pro
30000 20000 10000 0 B6 B10 Ba

Figura 15: Atividade das MMP-9 e MMP-2 pr no msculo esqueltico Representao grfica da quantificao da atividade das MMPs pelo programa Scion em 1 (A), 4 (B) e 12 (C) dias aps inoculao de bupivacana. As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Coluna vinho (C57BL6), amarela (C57BL10) e lils (BALB/c). Foram includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo significativo valores * p < 0,05. UA = unidade arbitrria.

51

4.3 Fenotipagem do Infiltrado Inflamatrio

As clulas presentes no infiltrado inflamatrio foram caracterizadas pela tcnica de imuno-histoqumica. Utilizamos anticorpos monoclonais especficos para Mac-1 para evidenciar clulas mononucleares, F4-80 para macrfagos, CD4 e CD8 para os linfcitos T. Foram coletados os msculos Triceps brachii de camundongos C57BL6 e BALB/c inoculado com bupivacana em 4 dpi por ser o ponto de maior infiltrado inflamatrio. Foram realizados cortes de 5m de espessura de msculos congelados e emblocados em substncia

criopreservante OCT. Em 4 dias ps-inoculao no encontramos diferenas quanto aos tipos celulares presentes no infiltrado inflamatrio entre as linhagens estudadas (Figura 16). A grande maioria das clulas presentes no infiltrado inflamatrio expressou intensa marcao para Mac-1, um timo marcador de inflamao, expresso em nveis variados em vrios tipos celulares como: macrfagos, neutrfilos e clulas dendrticas (Flotte et al, 1983, Springer et al, 1979). A marcao foi muito similar quando utilizamos o anticorpo F4-80 que especfico para macrfagos. Isto indica que macrfagos representam a maioria das clulas do infiltrado inflamatrio nestes animais. Camundongos BALB/c apresentaram infiltrado inflamatrio com menor quantidade de macrfagos que os camundongos C57BL6 (figura 16). Em contrapartida no observamos uma marcao expressiva para linfcitos T, tanto CD4+ quanto CD8+. Um dado j esperado porque esta uma fase inicial e possivelmente essas clulas ainda no foram ativadas.

52

Mac-1

F4-80

0,05mm

0,05mm

CD4

CD8

0,1mm

0,1mm

Mac-1

F4-80

0,05mm

0,05mm

CD4

CD8

0,1mm

0,1mm

Figura 16: Fenotipagem das clulas do infiltrado inflamatrio da leso muscular induzida por bupivacana. Imuno-histoqumica para os antgenos Mac-1, F4-80, CD4 e CD8 na leso muscular nos camundongos C57BL6 (A) e BALB/c (B). As setas evidenciam as clulas com imunomarcao positiva.

53

4.4 Fenotipagem do Linfonodo de Drenagem

Nesta etapa decidimos investigar se mesmo em um perodo inicial da leso muscular ocorreria alguma interferncia nos rgos linfides de drenagem muscular. Para isso coletamos os linfonodos axilar e braquial que fazem a drenagem do msculo Triceps brachii inoculado com bupivacana e realizamos pela tcnica de citometria de fluxo, a marcao para linfcitos B (B220), linfcitos T CD4+ e linfcitos T CD8+. Alm disto analisamos a expresso dos antgenos CD62L, CD44 e CD25 nas subpopulaes de linfcitos T. Os camundongos C57BL6 apresentaram celularidade significativamente maior que os camundongos C57BL10 e BALB/c (p<0,001 e 0,05

respectivamente). Entretanto os animais BALB/c foram os nicos que apresentaram um aumento (1,9 vezes) significativo (p<0,05) entre os grupos sham e inoculados (Figura 17). Com a finalidade de quantificar os subtipos de linfcitos T e B utilizamos a marcao com anticorpos especficos para B220 e CD3 respectivamente (Figura 18A). No observamos diferena significativa no percentual de clulas marcadas entre os camundongos controle, sham e inoculados. Os

camundongos BALB/c foram os nicos que apresentaram um aumento significativo do nmero absoluto de clulas B220+ e CD3+ talvez devido a maior celuraridade do linfonodo .

54

50

*
n de clulas x 10 40 30 20 10 0 BALB/c
Controle
6

** *

B6
Sham

B10
Bupivacana

Figura 17: Celularidade dos linfonodos axilar e braquial As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05, **p<0,001.

55

100

B220

30 25 n cls x 106

B220

75 percentual

20 15 10 5

50

25

*
BALB/c B6 B10

0 BALB/c B6 B10

C
CD3
100 75 percentual 50 25 0 BALB/c B6 B10
30 25 20 15 10 5 0 BALB/c B6 B10

CD3

Controle

Sham

Bupivacana

Figura 18: Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos presentes nos linfonodos de drenagem em 4 dpi. Em A mostramos um histograma com perfil representativo da marcao para B220 e CD3 num camundongo C57BL6 inoculado com bupivacana. Os grficos dos nmeros relativos e absolutos da marcao de B220 e CD3 so mostrados nos painis B e C respectivamente. As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05.

56

Camundongos BALB/c inoculados com bupivacana (Figura 19B) apresentaram aumento significativo (p<0,05) do percentual de linfcitos T CD4+. Camundongos sham inoculados tambm apresentaram um aumento no nmero relativo de linfcitos T CD4+. No foi observada diferena significativa no nmero percentual de linfcitos T CD8+ entre o grupo dos animais inoculados e no inoculados em ambas as linhagens estudadas.

Dentre os subtipos de linfcitos T CD4+ verificamos quais deles seriam CD62L+, CD44+ e CD25+ (Figuras 20 e 21). O antgeno CD62 uma Lselectina, presente principalmente em clulas virgens, CD25 um receptor de alta afinidade de IL-2 e marcador de clulas ativadas e/ou regulatrias e CD44 receptor de cido araquidnico, um dos marcadores de clulas de memria. No foi encontrada diferena significativa nos percentuais das clulas CD62L+ entre os grupos controle e inoculados (Figura 21). Entretanto o nmero absoluto de CD62L+ foi 1,4 vezes maior nos camundongos BALB/c inoculados com bupivacana do que no controle no inoculado sugerindo um maior influxo de clulas virgens para o linfonodo dos camundongos BALB/c (Figura 21). Foi observado uma diminuio significativa (p<0,05) nos nmeros relativos nas subpopulaes de clulas CD44+ e CD25+ entre os grupos inoculados e no inoculados da linhagem BALB/c (Figura 21). Com relao s clulas CD8+ os nicos resultados que apresentaram um aumento significativo (p<0,05) foram para os linfcitos T CD8+CD62L+ dos camundongos BALB/c inoculados em relao ao grupo sham (Figuras 22 e 23).

57

CD4
100
n de cls x 10 6

CD4
20 15 10 5 0

80 percentual 60 40 20 0

BALB

B6

B10

BALB

B6

B10

100 80 percentual 60 40 20 0 BALB

CD8

CD8
20 15
n cls x 10 6

10 5 0

B6

B10

BALB

B6

B10

Figura 19: Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos T presentes nos linfonodos de drenagem em 4 dpi. A- mostra um perfil representativo da marcao para CD4 e CD8 dentro da populao total no camundongo BALB/c inoculado (i) e controle no inoculado (c) Em B e C mostramos os grficos dos nmeros relativos e absolutos da marcao de CD4 e CD8 respectivamente. As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05. As colunas azuis representam os animais controles, vinho os animais sham inoculados e em amarelo os animais inoculados com bupivacana.

58

Figura 20: Perfis representativos da expresso de CD44 (A), CD25 (B) e CD62L (C) nas clulas T CD4+ de camundongos BALB/c. C= controle no inoculado I = inoculado

59

CD62
100

CD62
40

75 percentual

30 cels x 10 6
Balb B6 B10

50

20

25 0

10

0 Balb B6 B10

CD44
100
40

CD44

75 percentual
30 n cls x 10 6

50

20

25

10

0 Balb B6 B10
0 Balb B6 B10

CD25

CD25
100

10 8

percentual

75

n cls x 10 6

6 4 2 0

50

*
25 0 Balb B6 B10

*
Balb B6 B10

Figura 21: Anlise por citometria de fluxo da expresso dos antgenos CD62L, CD44 e CD25 nas clulas CD4+. So mostrados os nmeros relativos e absolutos da expresso de CD62L (A), CD44 (B) e CD25 (C) As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05. As colunas azuis representam os animais controles, vinho os animais sham inoculados e as amarelas os animais inoculados com bupivacana. ND = no determinado.

60

Figura 22: Perfis representativos da expresso de CD62L, CD44 e CD25 nas clulas T CD8+ de camundongos C57BL6. C= controle no inoculado I = inoculado

61

CD62
100

CD62
40

75

50 25

n cls x 10 6
Balb B6 B10

30

perce ntual

20

10

0 Balb B6 B10

CD44
CD44
100 75 percentual 50 25 0 Balb B6 B10

40 30 20 10 0 Balb B6 B10

CD25
100 75 percentual 50 25 0 Balb B6 B10
40

n cls x 10 6

CD25

30 n cls x 10-6

20

10

0 Balb B6 B10

Figura 23: Anlise por citometria de fluxo da expresso dos antgenos CD62L, CD44 e CD25 nas clulas CD8+. So mostrados os nmeros relativos e absolutos da expresso de CD62L (A), CD44 (B) e CD25 (C) As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05. As colunas azuis representam os animais controles, vinho os animais sham inoculados e as amarelas os animais inoculados com bupivacana. ND = no determinado.

62

4.5 Expresso de RNAm para TGF- no msculo esqueltico

Devido s alteraes com relao a expresso de colgeno entre as linhagens resolvemos verificar a expresso de TGF- pelo seu importante papel durante a fase de inflamao e reparo. Para isso coletamos com 1 dia aps inoculao com bupivacana os msculos Triceps brachii de

camundongos das linhagens C57BL6 e BALB/c. Cada grupo foi formado por no mnimo trs animais. A expresso do RNAm para TGF- foi detectada por RTPCR e sua expresso foi calculada em relao expresso de protena constitutiva GAPDH. Nossos resultados mostraram que em 1 dpi os camundongos C57BL10 e C57BL6 apresentaram expresso de RNAm para TGF- similar aos camundongos controles (figura 24). Com a quantificao (Figura 24C) observamos que os camundongos BALB/c, de perfil Th2 apresentavam uma expresso muito maior (2 vezes em relao ao controle pareado) aps a inoculao de bupivacana. Em 4 dpi, no encontramos a presena de RNAm para TGF- (Figura 24B).

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A
B6 B10 BALB/c

200bp

B6

BALB/c

200bp

200bp
G T G T

G
1,2 Razao TGF/GAPDH 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 B6 controle

TGF-b

B10 inoculado

BALB/c

Figura 24: Expresso de RNA mensageiro para TGF- no msculo esqueltico. Na poro superior mostrado um gel representativo da expresso de RNAm para TGF- (T) e para o gene constitutivo GAPDH (G) no msculo esqueltico aps 1 (A) e 4 (B) dias da inoculao da bupivacana. TGF- = 260bp e GAPDH = 245bp. Em C, grfico representativo da razo da expresso de TGF-/GAPDH nos msculos inoculados com bupivacana e nos msculos controles no inoculados. As barras representam a mdia de trs animais e seu respectivo desvio padro.

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5. DISCUSSO
O reparo tecidual orquestrado por uma seqncia de eventos bioqumicos e celulares organizados de forma a restaurar a integridade tecidual aps a leso. A participao do sistema imune no reparo de feridas tem sido questionada pela seqncia de migrao de neutrfilos, macrfagos e linfcitos (Park & Barbul, 2004). O estudo em camundongos imunodeficientes tem mostrado que a participao dos componentes do sistema imune vai alm da proteo dos tecidos lesionados contra possveis infeces, reforando sua participao na manuteno e reparo pela secreo de citocinas e fatores de crescimento (Park & Barbul, 2004; Gawronska-Kozak et al., 2006). Este trabalho teve como objetivo estudar a leso muscular induzida pela bupivacana em camundongos apresentando padro divergente (Th1, Th2) de produo de citocinas. O modelo de leso muscular induzida pela bupivacana muito utilizado para se estudar as diferentes fases do reparo muscular, porque a leso autolimitada e permite a regenerao do tecido muscular (Sandri, 2001; Charge & Rudnicki, 2004). A imunidade inata no especfica um mecanismo imediato importante caracterizado pela participao de leuccitos (tais como neutrfilos,

macrfagos, moncitos, plaquetas) e seus mediadores. A resposta imune adaptativa mais especfica e duradoura podendo ser classificada em perfil Th1 e Th2, baseada na secreo de citocinas (Mosmann et al., 1986). Nas clulas do tipo Th2 predominam as interleucinas 4, 5 e 13, que favorecem a produo de anticorpos pelos linfcitos B e a sntese de colgeno pelos

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fibroblastos. Em contrapartida as clulas do tipo Th1 secretam grandes quantidades de interferon e ativam produo de citocinas com atividade prinflamatria. Os dois tipos de resposta no agem isoladamente, o equilbrio na produo das citocinas do tipo Th1 e Th2 influenciado pelo padro gentico do indivduo e tambm pelo microambiente, de modo que alteraes nas respostas Th1 e Th2 contribuem para a patognese de diversas infeces, respostas alrgicas e doenas autoimunes (Wynn, 2004). Camundongos C57BL6 e BALB/c, com padro gentico imune distinto quanto produo de citocinas Th1 ou Th2, apresentam fentipo de resistncia ou suscetibilidade infeco e uma cintica de remodelagem tecidual diferente (Hsieh et al., 1995; Mills et al., 2000; Yu et al., 2006). Os linfcitos T dos camundongos C57BL6 produzem preferencialmente citocinas do tipo Th1 com mais interferon- e pouco interleucina 4 enquanto no BALB/c ocorre uma maior produo de citocinas do perfil Th2 (Yu et al., 2006). Neste trabalho, na colorao por HE e no Giemsa, as leses se apresentaram de forma distintas entre as duas linhagens, sobretudo no quarto dia ps-inoculao.

Camundongos da linhagem BALB/c (padro Th2) apresentaram leses com maior predomnio de mionecrose do que camundongos C57BL6 e C57BL10 (padro Th1). Fatores do microambiente poderiam estar protegendo da necrose muscular intensa nos camundongos C57BL10, talvez devido presena in situ de fatores trficos controlando tambm o estresse oxidativo. Neste sentido foi relatado que um paciente com distrofia muscular de Becker e artrite apresentava diminuio da enzima creatina quinase associada com o aumento da produo de citocinas inflamatrias durante as crises de agudizao da artrite (Maegaki et al., 1999). Em outros modelos de reparo

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tecidual, como no sistema nervoso, tem sido mostrado que citocinas produzidas por linfcitos so capazes de induzir proteo da degenerao secundria de neurnios durante a fase do desenvolvimento e aps induo de leso (Otten & Gadient, 1995; Schwartz & Moalem, 2001; Barouch & Schwartz, 2002). Uma outra possibilidade est relacionada ao fato que a capacidade de gerar respostas Th1 ou Th2 no somente dependente de linfcitos T (Mills et al., 2000). Neste sentido, foi visto que aps estimulo com LPS, macrfagos dos camundongos C57BL6 produzem maiores nveis de TNF- e interleucina 12 do que os de camundongos BALB/c. A maior produo de IL-12 aumenta os nveis de IFN- e diminui a produo de IL-13 por linfcitos T CD4+. Alm disso, macrfagos de C57BL6 produzem mais enzimas lisossomais e xido ntrico (Watanabe et al., 2004). A anlise das alteraes no microambiente mostrou que os

camundongos BALB/c apresentaram maior deposio de colgeno em todas as fases analisadas. No quarto dia ps-inoculao, o percentual da rea de leso ocupada por colgeno era 5,2 vezes maior no camundongo BALB/c em relao ao camundongo C57BL6. A influncia do perfil de citocinas na induo de fibrose evidente no modelo de leso heptica, onde camundongos BALB/c com padro Th2 apresentam intensa fibrose ao contrrio dos camundongos C57BL6 com padro tpico Th1, que apresentam menos fibrose. O envolvimento das citocinas na induo de fibrose foi mostrado pelo tratamento destes animais com anticorpos neutralizantes para IL-4 ou com IFN- exgeno resultando na atenuao da fibrose (Shi et al., 1997). Recentemente, foi mostrado que a remodelagem do msculo cardaco em resposta a hipertenso

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tambm est relacionado com camundongos predispostos ao padro Th1 ou Th2 (Yu et al., 2006). Os principais produtores de componentes estruturais da matriz extracelular so os fibroblastos, atualmente reconhecidos como os maiores reguladores da inflamao. Existem trs mecanismos principais envolvidos no controle da atividade local dos fibroblastos durante a inflamao e regenerao. As citocinas produzidas pelos subtipos de linfcito Th auxiliar tambm podem ser sintetizadas por fibroblastos, macrfagos e mastcitos no stio da leso. Os prprios fibroblastos so alvo de vrios fatores e a natureza das citocinas vai definir a proporo entre reparo e fibrose. As citocinas do tipo Th1 geralmente promovem regenerao normal do tecido enquanto as do tipo Th2 levam a ativao de fibroblastos, produo de colgeno e fibrose (Mescher & Neff, 2005). Dentre as citocinas secretadas durante a resposta do tipo Th2 as IL-4, IL-13 e o TGF- so as maiores responsveis pela fibrognese (Wynn, 2004). As alteraes no microambiente da leso muscular nas linhagens C57BL6 e BALB/c foram condizentes com o perfil de citocinas produzidos por estas linhagens bem como pela expresso duas vezes maior de RNAm para TGF- nos camundongos BALB/c. A atividade de TGF-1 tambm pode ser regulada pela liberao de TGF ativo da forma latente por vrios fatores como: plasminognio, trombospondina e metaloproteases (Wynn, 2004). Sabendo-se que o TGF- inibe a diferenciao das clulas miognicas, acelera a deposio e sntese da matriz extracelular (ECM) e inibe a degradao da mesma (Li et al., 2004; Tidball, 2005), podemos sugerir que TGF- possua participao fundamental nas alteraes observadas nos camundongos BALB/c. TGF-1

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est aumentado em vrios tecidos lesionados sendo liberado principalmente por linfcitos, clulas do parnquima local e miofibroblastos (Li et al., 2004). A remodelagem da ECM durante a degenerao e regenerao do msculo esqueltico sugere uma alta regulao da atividade de degradao da matriz durante a regenerao muscular (Carmeli et al., 2004). Nos camundongos C57BL10 com leso muscular induzida por cardiotoxina, a MMP9 est muito aumentada durante os primeiros trs dias aps a inoculao, correspondendo ao pico da inflamao, causada em parte pela presena de macrfagos e neutrfilos (Kherif et al., 1999). As clulas satlites ativadas presentes na periferia do stio de injria so outra possvel fonte de MMP-9 (Roach et al., 2002). Neste trabalho mostramos que na fase mais aguda da inflamao, os camundongos com perfil Th1 (C57) apresentaram maior expresso de MMP9, associada maior degradao de componentes da matriz, facilitando o trnsito de componentes inflamatrios e limpeza dos debris. Isto est condizente com o maior infiltrado inflamatrio e menor deposio de colgeno evidenciado na histologia nos camundongos C57BL6 e C57BL10. Aps o quarto dia da inoculao de bupivacana, os nveis de MMP9 diminuram e a pr-MMP-2 atingiu o auge de sua expresso, talvez pela necessidade da degradao do colgeno tipo IV e outros componentes da membrana basal e a estimulao de clulas satlites, via fatores de crescimento que so liberados durante o processo (Kherif et al., 1999). Camundongos mdx, modelo murino da distrofia muscular de Duchenne, expressam nveis basais da MMP-9 de forma constante, e a MMP-2 est regulada positivamente tanto na sua forma latente (60kDa) e ativa (55kDa). A presena da forma ativa da MMP-2 sugere um desequilbrio entre a produo

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demetaloprotease e seu inibidor (Kherif et al., 1999). A MMP-2 ativa no foi encontrada no modelo de leso muscular por bupivacana possivelmente pelo tamanho reduzido da leso. A resposta inflamatria e imunolgica alm de ajudar na eliminao dos tecidos danificados essencial para iniciar o reparo tecidual, inclusive favorecendo o transplante de mioblastos (Shffer & Barbul, 1998; Sicard, 2002; Henry & Garner, 2003; Prisk & Huard, 2003). Devido a isto, foram realizadas marcaes por imuno-histoqumica para a caracterizao das clulas do infiltrado inflamatrio. Em ambas as linhagens de camundongos estudadas a presena de linfcitos T foi muito escassa na rea de leso muscular. A grande maioria das clulas foram macrfagos, entretanto camundongos BALB/c apresentaram infiltrado inflamatrio com menor quantidade de macrfagos que os camundongos C57BL6. A regenerao muscular mais lenta em animais mais velhos coincidindo com a diminuio de clulas fagocticas e inflamatrias como tambm em linhagens com menor proporo de fagocitose e remoo de debris celulares (Tidball, 2005). Tratamento de cobaias com soro antimacrfagos e esterides para total retirada de moncitos circulantes causou piora na cicatrizao (Park & Barbul, 2004). A resposta imune inata difere entre linhagens de camundongos com resposta imune dominante Th1 e Th2. Macrfagos de camundongos BALB/c apresentam menor atividade bactericida e menor produo de citocinas como IL-12 em relao ao C57BL6 (Watanabe et al., 2004). O papel dos macrfagos durante a leso e a remodelagem complexo, por serem ricas fontes de diversos fatores de crescimento e citocinas, grandes produtores de espcies reativas de oxignio. Eles tambm so clulas

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apresentadoras de antgenos por isso tambm regulam a resposta imune celular. A depleo de macrfagos em camundongos distrficos mdx resulta em uma diminuio de 80% na lise da membrana muscular in vivo (Tidball, 2005). A ablao de macrfagos e moncitos pela irradiao tambm prejudica a regenerao muscular ps transplante de clulas miognicas. Macrfagos fagocitam e removem debris tissulares e clulas mortas, inclusive neutrfilos presentes inicialmente na leso, preparando o ambiente para a formao de uma nova ECM. Ao mesmo tempo essas clulas tambm secretam citocinas com atividade mitognica e angiognica promovendo o reparo do tecido. Meio condicionado de macrfagos peritoneais induz proliferao de mioblasto in vitro assim como a maior expresso de MyoD. Alm disto, xido ntrico (NO) pode ser um importante regulador da inflamao e leso causada por clulas inflamatrias, reduzindo a lise de clulas musculares, a concentrao de superxido no meio e a expresso de molculas de adeso no endotlio vascular (Mills et al., 2000). Camundongos BALB/c apresentaram um aumento da celularidade nos linfonodos de drenagem e um aumento do percentual de clulas T CD4+ expressando CD62L sugerindo aumento do influxo de clulas do tipo virgem, possivelmente por maior ativao das HEV. Diferenas nas respostas imunolgicas e inflamatrias entre reparo e regenerao parece direcionar o curso da resoluo de uma injria tecidual. Linfcitos T, principalmente CD8+ esto associados com fibrose e formao de cicatriz hipertrfica (Castagnoli et al., 1997; Morrison et al., 2000). Alm disso, camundongos nude,

independentemente do seu padro gentico, apresentam uma capacidade

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aumentada de reparo com cicatrizes mais finas e quase indistinguveis dos tecidos adjacentes (Gawronska-Kozak et al., 2006).

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6. CONCLUSES
A compreenso dos processos regulatrios que medeiam a remodelagem muscular pode contribuir para o surgimento de estratgias adequadas nas leses musculares. Em conjunto este trabalho mostra que:

A induo de leso muscular pelo modelo da bupivacana causou nos camundongos C57 com perfil de citocinas Th1 uma leso muscular com predomnio de miofibras regenerando e macrfagos enquanto

camundongos BALB/c (perfil Th2) apresentaram reas extensas com mionecrose.

Camundongos BALB/c apresentaram maior deposio de colgeno na leso muscular associado com menor atividade de MMP-9 em relao aos camundongos C57BL10 e C57BL6. A produo de RNAm para TGF- tambm estava aumentada nos camundongos BALB/c sugerindo maior induo de fibrose nestes animais.

Este trabalho mostra que camundongos com distinto padro imune de citocinas Th1 e Th2 apresentam diferentes remodelagens do tecido muscular esqueltico aps inoculao de bupivacana. Neste contexto, camundongos C57BL6 e BALB/c so bons modelos respectivamente para o estudo da regenerao e fibrose do msculo esqueltico.

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