1 Microbiologia Clnica Prof.

Juarez Assis Soares

MEIOS DE CULTURA - preparo e armazenamento

Para a qualidade assegurada dos exames microbiolgicos o funcionamento conforme esperado dos meios de cultura fundamental. Este procedimento fornece instrues gerais para o preparo e armazenamento dos meios de cultura no prprio laboratrio. Seleo dos meios A Microbiologia deve ter uma lista dos meios de cultura em uso: seletivos, indicadores e enriquecidos. A correta eleio dos meios de isolamento extremamente importante. Os critrios para esta escolha so: forma de operar do meio, praticidade, estabilidade, confiabilidade, custo, informaes derivadas do controle interno da qualidade.
gar sangue (AS) meio rico e no seletivo, diferencial para a hemlise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, alm de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espcies de hemfilos e outros fastidiosos;

gar chocolate (AC) meio rico e no seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactrias aerbias e facultativas. Quando incubado em CO2 d suporte tambm ao crescimento dos microaerfilos. Pode-se observar halos esverdeados com colnias alfa- hemolticas;

gar Mac Conkey (MC) meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilizao de lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivos: Lactose positiva (avermelhada) e Lactose negativa: (inalterado). Exceo, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus;

gar Salmonela-Shigella (SS) meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao rsea) e produo de H2S (colorao negra);

gar Hecktoen Enteric (HE) - meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilizao de lactose (colorao alaranjada) e produo de H2S (colorao negra);

2 Microbiologia Clnica Prof. Juarez Assis Soares gar Thayer Martin Modificado (TMM) meio seletivo pela adio de colistina, vancomicina e nistatina. Inibe crescimento de enterobactrias, Gram positivos, fungos e algumas espcies de Neisserias saprfitas. Enriquecido com a adio de complementos para a recuperao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae

Armazenamento e conservao Verificar sempre data de vencimento, e o frasco deve ser guardado em uma temperatura menor que 25C em uma rea de pouca umidade e fora da luz solar direta, longe de autoclaves e estufas Pesagem Ao pesar os meios, verificar as datas e usar os mais antigos primeiro. No usar se o meio estiver hidratado ou escurecido. No misturar lotes antigos com novos. Os meios so higroscpicos e devem ser pesados rapidamente. O frasco deve ser fechado hermeticamente. Dissoluo Usar unicamente artigos de vidro muito bem lavados e enxaguados com gua tipo II sem cloro, cobre, chumbo ou detergentes. Antes de aplicar calor para dissolver os meios, verificar as instrues de uso. Alguns meios no podem ser submetidos a temperaturas maiores que 55C, mas alguns podem ser fervidos. O meio deve ser revolvido para evitar que alguma poro se queime ao ferver, com cautela para evitar formao de espuma e transbordamento. Para evitar isto, preparar o meio em um frasco duas vezes e meia maior que o volume do meio. Evitar a ebulio prolongada. Esterilizao Ler as instrues de uso. Muitos meios no suportam a esterilizao por autoclave. Alguns devem ser esterilizados por filtrao e alguns so to seletivos que no necessitam esterilizao. Filtrao O lquido deve ser passado atravs de um material estril de poros to pequenos que retenham bactrias e vrus. Autoclave O meio deve ser esterilizado sem ciclos excessivos e prolongado. O excesso de autoclavao para um meio, de certo modo, um erro mais grave que a subesterilizao. O controle da esterilidade permite verificar que o meio no foi bem esterilizado, mas a alterao de suas caractersticas bioqumicas nem sempre pode ser avaliada de pronto. aconselhvel aquecer os meios antes da esterilizao para evitar demora em alcanar as temperaturas adequadas. Conservao Os meios preparados devem ser conservados entre 2 e 8 C. Exceo o caldo de tioglicolato, que deve ser armazenado em temperatura ambiente, fora da luz solar direta. O efeito nocivo mais comum do armazenamento a desidratao. Esta ltima no um problema com meios lquidos ou slidos colocados em frascos de rosca hermtica, mas um problema para meios em placa. Os meios em placa devem ser selados com filme plstico, na quantidade usada em um dia. Todos os meios devem ser levados temperatura ambiente antes de serem utilizados

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Enriquecimento Os enriquecimentos que se adicionam aos meios basais devem ser estreis, quase sempre os enriquecimentos so termolbeis e no devem ser submetidos a temperaturas superiores a 50C. O meio basal deve ser esfriado a cerca de 45-50C antes de ser agregado assepticamente o enriquecimento. Se este ltimo frio, no agregar a meios de agar para no formar grumos. Um meio pode ser homogeneizado mais facilmente se o enriquecimento for colocado a 37C previamente, revolvendo suavemente. Para o agar chocolate, o sangue deve ser agregado ao meio basal entre 80 e 85C. O enriquecimento mais comum o sangue. A espcie animal que o fornece crtica pois influi na seletividade e na atividade hemoltica. O sangue de ovelha inibe H. influenzae. Em sangue de carneiro os estreptococos grupo D so alfa-hemolticos, mas em sangue de coelho, cavalo ou homem so beta-hemolticos. O sangue humano vencido de banco de sangue no deve ser usado sem um exame preliminar de atuao pois pode conter oxalato, citrato, antibiticos, Antiestreptolisina-O ou ser excessivamente cido. O uso de sangue humano representa aumento da responsabilidade do controle da qualidade. Meios de cultura para semeadura dos principais materiais clnicos.
MATERIAL Abscesso profundo Ferida cutnea/cirrgica Abscesso cerebral Abscesso pulmonar Bipsia Coprocultura Lquido de dilise Endomtro/Amnitico Escarro piognicos Escarro para tuberculose Esperma/Prosttico Fstula/Dreno Gnglio Lavado Brnquico (BAL) Lquor (LCR) Nasal e orofaringe Osso (bipsia e aspirado) Ocular Ouvido Peritonial/Asctico Pleural Ponta de cateter Sangue/Hemocultura Uretral Urina Vaginal/Endocervical AC AS x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
X e Cled

x x x x x

MC x x x x X e SS x

TIO x x x x

LJ x x

SAB/MYC x x

x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x

x x
X ou TM

x x x x x X e TM X e TM

x x

Lmina 01 01 02 02 02 00 01 01 02 01 01 00 02 01 02 00 01 02 01 01 02 00 01 01 01 01

AC = Agar chocolate, AS = Agar sangue, MC = Mac Conkey, TIO = caldo tioglicolato, TM = Agar Thayer Martin, SS= Agar Salmonella-Shigella, LJ = gar Lowenstein Jensen, SAB = Agar sabouraud, MYC = Mycosel e CLED = Agar Cled.

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Escolha de meios de cultura seletivos em relao ao agente Bordetella pertussis gar sangue Bordet-Gengou Brucella spp Brucella Agar Campylobacter jejuni Campylobacter agar Corynebacterium diphtheriae gar cisitina-telurito Legionella spp gar carvo-extrato de levedura Listeria monocytogenes gar Listeria McBride Mycoplasma/ureaplasma Transporte: Meio B10 Shepard Mycoplasma/ureaplasma Cultura: Meio A7 Shepard Neisserias Thayer Martin Vibrio spp TCBS Obs: existem meios cromognicos especficos para diferentes patgenos: Salmonella spp. e S. typhi, E. coli 0157. Para algumas espcies de Candida, Listeria monocytogenes, etc. Semeaduras em meios de cultura - Qualitativa Selecionar as placas temperatura ambiente, sobre a bancada conforme o material a ser semeado e Identific-las com o nmero da amostra e iniciais do paciente. Separar as lminas para cada exame, a serem preparadas e identific-las. Homogenizar o material lquido ou escolher a poro mais purulenta no caso de secrees ou fezes. Rolar os swabs sobre os meios de cultura, seguindo a sequncia dos mais ricos para os mais seletivos (gar Chocolate, gar Sangue, Mac Conkey). Pode-se utilizar placas com divises de dois e trs compartimentos para racionalizao de gastos. Ex.: hemocultura em placa trplice: gar sangue, gar chocolate e gar Mac Conkey, secrees em placa dupla: gar sangue e gar Mac Conkey. A semeadura para cultivo qualitativo pode ser feito com o prprio swab (do meio de transporte), ou amostra do material removida com ala (estril) flambada e semeada de forma a obter um gradiente decrescente de concentrao do inculo, que permita o isolamento de todas as colnias diferentes. Descarregar o material num canto da placa; Flambar a ala; Esfriar a ala em um canto do gar; Semear partindo da ponta da primeira semeadura. A cada mudana de direo flambar a ala e esfri-la. - Quantitativa Materiais recomendados: Urina, BAL (lavado bronco alveolar), Aspirado traqueal, Secreo prosttica e Cateter (tcnica de Maki e outras) Baseia-se na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do nmero de UFC (unidades formadoras de colnia) obtidas aps incubao. Uso de pequenos volumes: normalmente de 1, 10 ou 100 L. O nmero de UFC obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 1 ml e pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por ala calibrada. No caso da ala, observar a integridade da pelcula formada at deposit-la na parte superior da placa, distribuir o material em linha reta at a outra extremidade e perpendicularmente, distribuir o material por toda a superfcie de maneira uniforme.

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Caractersticas das Colnas Tamanho Puntiforme (<1 mm de dimetro) - colnias muito pequenas; Pequena (at 2 mm de dimetro) Shigella e Yersinia no MaC Conkey; Mdia (at 3 mm de dimetro) Estafilococos; Grandes (mais de 4 mm de dimetro) Klebsiella e Enterobacter, Pseudomonas. Cor A colorao depender do meio de cultura utilizado. Meios no diferenciais: S. aureus - amarelo; Pseudomonas diferentes tons de verde e castanho. Meios diferenciais: Utilizao da lactose no Mac Conkey vermelho Utilizao da lactose no CLED amarelo Utilizao do manitol em gar manitol salgado amarelo Produo de H2S no Hecktoen Enteric e Salmonella-Shigella negro Hemlise Baseada na lise de hemcias contidas no gar Sangue (5%) Lise total denominada beta-hemlise: S. pyogenes, S. agalactiae, Listeria, S. aureus, S. haemolyticcus, Enterococcus. Lise parcial denominada alfa-hemlise: S. pneumoniae, Enterococcus. Ausncia de lise definida como gama-hemlise: Enterococcus,e Estafilococos coagulase negativo. Forma da colnia Redonda E. coli, Klebsiella, Serratia, Acinetobacter, Estafilococos e Estreptococos Irregular Pseudomonas, Proteus, Providencia e Bacillus Produo de vu Proteus e Pseudomonas Filamentosas fungos filamentosos Formando pontas, como estrelas Cndida Com depresso no centro Pneumococo Elevada Klebsiella, Bacillus Chata Enterobacter, Pseudomonas Consistncia Frivel, quebradia - Moraxella Mucide Klebsiella, Pseudomonas e Bacillus Seca E. coli, Citrobacter, S. aureus Butirosa (manteiga) Candida. Cheiro Eikenella corrodens cheiro de cloro Pseudomonas cheiro adocicado Anaerbios cheiro ftido

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Identificao Bacteriana Semeadura em gar sangue (AS) e Mac Conkey (MC): observar quantos tipos de colnia cresceram em cada gar. As colnias que cresceram somente em AS devem ser de microrganismo Gram positivo ou mais exigente. Todas as colnias presentes no MC, microrganismos Gram negativo, devem apresentar correspondente no AS.
Crescimento dos microrganismos nos principais meios de cultura utilizados na rotina
Gram (-), leveduras e enterococo

Gram positivo Gram negativo exigente Haemophilus Anaerbios Referncia

AC + + + + -

AS + + + -

CLED + + -

MC + -

SS + -

TIO + + +

BRASIL/Ministrio da Sade/SNAS. Manual de procedimentos bsicos em microbiologia clnica para o controle da infeco hospitalar. Braslia, 1991. BRASIL/Ministrio da Sade/FNS/CENEPI/CNPS/Centro de Referncia Prof. Hlio Fraga. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. Rio de Janeiro., 2 ed. 1994