EXPERIMENTO # 13 Cromatografa de aminocidos

Objetivos Identificar los componentes de un pptido (de dos o tres residuos de aminocidos), mediante la tcnica de cromatografa de papel Utilizar la ninhidrina como agente revelador de aminocidos en un cromatograma.

Marco terico: Estructura bsica de un aminocido. Un aminocido es una molcula orgnica con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxlico (-COOH; cido). Los aminocidos ms frecuentes y de mayor inters son aquellos que forman parte de las protenas. Dos aminocidos se combinan en una reaccin de condensacin que libera agua formando un enlace peptdico. Estos dos "residuos" aminoacdicos forman un di pptido. Si se une un tercer aminocido se forma un tripptido y as, sucesivamente, para formar un polipptido. Esta reaccin ocurre de manera natural en los ribosomas, tanto los que estn libres en el citosol como los asociados al retculo endoplasmtico. Todos los aminocidos componentes de las protenas son alfa-aminocidos. Por lo tanto, estn formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo, a un grupo amino, a un hidrgeno y a una cadena (habitualmente denominada Radical) de estructura variable, que determina la identidad y las propiedades de los diferentes aminocidos; existen cientos de cadenas R por lo que se conocen cientos de aminocidos diferentes, pero slo 20 forman parte de las protenas y tienen codones especficos en el cdigo gentico. La unin de varios aminocidos da lugar a cadenas llamadas polipptidos o simplemente pptidos, que se denominan protenas cuando la cadena polipeptdica supera los 50 aminocidos o la masa molecular total supera las 5.000 uma.

Estructura bsica de un aminocido.

Materiales y reactivos: Papel whatman para cromatografa, platos Petri, regla, secador de cabello (blower), tijeras, guantes plsticos, atomizador.

Ninhidrina Frmula semi C9-H6-O4 desarrollada Propiedades fsicas Densidad 862 kg/m3; 0,862 g/cm3 Masa molar n/d Punto de 523 K (249,85 C) fusin

cido actico Propiedades fsicas Estado de agregacin lquido Apariencia incoloro o cristales Densidad 1,049 g/cm3 Masa molar 60.05 g/mol Punto de fusin 16,85 C Punto de ebullicin 118,05 C Propiedades qumicas Acidez (pKa) 4,76 Momento dipolar 1,74 D

Propiedades fsicas del butanol Lquido Estado de agregacin 809.8 kg/m3; 0,8098 Densidad g/cm3 74,121 g/mol Masa molar 183,7 K (-89,45 C) Punto de fusin 390,88 K (117,73 C) Punto de ebullicin Propiedades qumicas Solubilidad en Soluble en una proporcin de 79 g agua por litro. Glicina Propiedades fsicas slido blanco 1607 kg/m3; 1,607 g/cm3 75,07 g/mol Masa molar 509 K (235,85 Punto de fusin C) Propiedades qumicas 2,4; 9,8 Acidez (pKa) Solubilidad en agua 225 g/l Apariencia Densidad Fenilalanina Propiedades fsicas 165,19 g/mol Masa molar 556 K (282,85 C) Punto de fusin Propiedades qumicas 1,83; 9,13 Acidez (pKa)

cido clorhdrico Propiedades fsicas Apariencia lquido incoloro o levemente amarillo 1.12 g/cm3 36.46 g/mol (-26 C) (48 C)

Densidad Masa molar Punto de fusin Punto de ebullicin Riesgos: es muy txico para el organismo

Triptfano Propiedades fsicas Densidad 1.340 kg/m3; 1.34 g/cm3 Masa molar 204,23 g/mol Punto de fusin 501 K (227,85 C) Punto de 563,65 K descomposicin Propiedades qumicas Acidez (pKa) 2,38; 9,34 Procedimientos: Mezcla de aminocidos

Cistina Propiedades fsicas

Masa molar Punto de fusin 121,16 g/mol 513,15 K (240 C)

Propiedades qumicas Acidez (pKa) 1,91; 8,14; 10,28 Solubilidad en agua 280 g/l

Glicina
G1 Fenilalanina Triptfano Glicina G2 Cistina Fenilalanina

Mezclar 1 mL de:

Aplicacin de la muestra Permitimos que se sequen las gotas despus de la aplicacin , utilice el secador de cabello para agilizar el proceso de secado Aplicamos a 3 microlitros, procurando que la gota no sea mayor de 1.2mm de dimetro por cada muestra Hacemos un diseo en la libreta del mismo tamao del papel cromatogrfico y marcamos como colocamos las muestras Coloque el papel cromatogrfico con las muestras aplicadas en el recipiente de desarrollo previamente preparado con la mezcla de desarrollo Tape con un plato petri limpio y seco

Aplicacin muestra

de

la

Utilizando guantes plsticos, preparamos una hoja de papel cromatrogrfico con las dimensiones que especific la profesora. Tracemos una lnea tenue con lpiz 1cm del extremo inferior del papel cromatogrfico y marque cmo colocar las muestras.

Desarrollo:

Desarrollo Saque el papel de la cmara y marque rpidamente el frente del solvente con un lpiz Preparamos un vaso qumico de 400mL con 20mL de la mezcla de desarrollo butanol/cido actico /agua

Espere a que el solvente suba por capilaridad en el papel hasta unos 2 cm antes del borde superior

La altura de la mezcla no debe ser mayor de 0.5cm

Introduzca el papel cromatrogrfico suavemente en el recipiente y tape nuevamente

Tape el recipiente con un plato petri para permitir que se sature la cmara con los vapores por 10 min

Revelado

Una vez concluido el desarrollo proceda a aplicar el reactivo de ninhidrina con el atomizador.

Finalmente seque el papel de la cmara y marque rpidamente el fente del solvente con un lpiz.

Resultados:

Fig. # 1 corte del papel de cromatografa.

Fig. # 2 Colocacin de las gotas de aminocidos en el papel.

Fig. # 3 Gota de cada aminocido y de la solucin de los 3 aminocidos.

Fig. # 4 cuadro comparativo del inicio y final de la cromatografa.

Fig. # 4 y # 5 Resultados de la cromatografa en papel.

Rf = a/b (a) = Distancia del punto de aplicacin a la mancha. (b) = Distancia del punto de aplicacin al frente del eluyente Rf de glicina= 2.7/8.6= Rf de fenilalanina= 5.7/8.6= Rf de cistina= Rf de triptfano= no se observ bien el resultado

Rf = Factor de retencin.

Frente de eluyente

Mancha

A+B (a)(b)

Discusiones: Los aminocidos son molculas que poseen, al menos, dos grupos ionizables, un amino y un carboxilo. A un pH adecuado (pH 7,4) toman la forma de ion dipolar. Para el aminocido ms sencillo, la glicina (Gly), la estructura ion dipolar se le denomina glicina isoelctrica, por tener igual nmero de cargas positivas y negativas:

En medio cido, la forma dipolar puede aceptar un protn (H+) en el grupo carboxilato (- COO-), y tambin puede en medio alcalino, perder un protn (H+) del grupo.

Se utiliz la tcnica de cromatografa en capa fina, la cual se basa en la separacin de las molculas absorbidas por el papel mediante el flujo de la columna de la mezcla de solventes de agua, butanol y cido actico. La fase estacionaria es la celulosa y la mvil los disolventes. Segn la solubilidad que tienen los aminocidos de la muestra respecto de las dos fases as fue su movilidad. Las manchas de los aminocidos se observaron sobre la placa desarrollada, por la solucin de ninhidrina rociada sobre el papel. Los aminocidos aparecieron como manchas prpuras sobre un fondo ligeramente amarillento. Se utiliz la ninhidrina debido a que sirve para la determinacin de aminocidos con el grupo amino libre.

La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una coloracin azul-prpura. La ninhidrina reacciona con los aminocidos formando a ductos coloreados segn la reaccin:

El reparto de los aminocidos en el papel se debe a compuestos usados como patrn son:

su naturaleza qumica. Las frmulas de los

El reparto que se obtiene es el siguiente: los aminocidos apolares son los que mejor interaccionan con el solvente y son arrastrados por l. Para el clculo del factor de retencin, Rf, se us la siguiente expresin:

Rf = distancia recorrida por el compuesto distancia recorrida por el disolvente Se tom como distancia del compuesto la distancia comprendida entre la lnea trazada donde se ha depositado el compuesto y el centro de la mancha. A partir del factor de retencin sabremos que sustancia es ms polar, siendo el ms polar aquel que tenga un Rf menor.

CONCLUSIONES Esta tcnica de separacin cromatogrfica es de las ms simples, adems de que nos permiti estudiar esta tcnica y cualitativamente observar la reaccin producida por medio de la ninhidrina que permite identificar aminocidos ya que la reaccin de los aminocidos con ninhidrina se debe a la presencia del grupo NH2 en los mismos observndose as una coloracin morada El factor de retencin depende de la afinidad de los aminocidos con el disolvente o eluyente utilizado y esto mismo depende del tipo de aminocido que se utilice, es decir si son polares, apolares, neutros, etc., por lo cual es importante esta tcnica ya que de esta manera se nos facilitar saber las caractersticas del aminocido que se est utilizando. Utilizamos la ninhidrina como agente revelador de los aminocidos el cual da como resultado una coloracin azul violcea.

BIBLIOGRAFAS:

[2] Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003) Estructura y funcin de las protenas. En: Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa), pp. 41-76. [3] Luisot P (1982). Bioqumica Estructural, 2 Ed. Editorial AC. *4+ Smith I, Feinberg JG (1965) Paper & Thin Layer Chromatography and Electrophoresis. Shandon Scientific Company Ltd. Desarrollo histrico de la tcnica y aplicaciones.

Actividades: 1. Identifique los componentes del pptido con base en los valores de Rf. considere que la muestra es un di pptido y que los aminocidos que lo conforman estn entre los patrones que trabajo el grupo. Presente la(s) estructura(S)

R/: La Fenilalanina es un aminocido. Se encuentra en las protenas como L-Fenilalanina (LFA), siendo uno de los diez aminocidos esenciales para humanos. La Fenilalanina es parte tambin de muchos psicoactivos.

La Glicina es el aminocido ms pequeo y el nico no quiral de los 20 aminocidos presentes en la clula. Su frmula qumica es NH2CH2COOH y su masa es 75,07. La glicina es un aminocido no esencial. Otro nombre (antiguo) de la glicina es glicocola.

La cistina es un dmero de dos cistenas a travs de un puente di sulfuro.Funcin: Tambin interviene en la desintoxicacin, en combinacin con los aminocidos anteriores. La L - Cistina es muy importante en la sntesis de la insulina y tambin en las reacciones de ciertas molculas a la insulina.

Universidad Autnoma de Chiriqu Facultad de Ciencias Naturales y Exactas Escuela de Biologa Licenciatura en Tecnologa medica

Experimento # 13 Cromatografa de aminocidos

Qm 235 Lunes y mircoles de 1:00-3:25 p.m.

Elaborado por: Gloria Gonzlez 4-756-1701 Mairlen Gallardo 4-779-431

Profesora: Ema Obando

II Semestre 2011